JP2001511017A

JP2001511017A - 子葉植物の処理方法

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Publication number: JP2001511017A
Application number: JP53505798A
Authority: JP
Inventors: ヘインソーン，ジョージ，イー．; ビョーンソン，オーガスト，エス．
Original assignee: ディーシーヴィーインコーポレイテッド
Priority date: 1997-02-12
Filing date: 1998-02-12
Publication date: 2001-08-07
Also published as: EP0969722A2; DE69818648D1; EP0969722B1; AR011794A1; MY127873A; IS5149A; BR9807322A; CA2279502A1; WO1998034464A2; US5726123A; WO1998034464A3; AU6160698A; KR20000070963A

Abstract

(57)【要約】キトサン塩およびキトサンオリゴマーを含有する水溶液を、成長植物の葉に塗布して、野菜、芋類、穀類、果実、および花の収穫量が増加する。

Description

【発明の詳細な説明】子葉植物の処理方法発明の分野本発明は、キトサンオリゴマーおよびキトサン塩を含有する水溶液を植物の葉に噴霧することによって、植物の収穫量、健康状態、および活力を向上させるための子葉植物の処理方法に関する。発明の背景キトサンは、多くの菌類の中に見出される天然に存在する重合体である。これは、Ｄ−グルコサミンとＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの共重合体であってそのモノマー単位の６５〜１００％がＤ−グルコサミンである共重合体として、広く記載されている。これは、弱塩基性のアミンとして知られる化学分類の構成員であるため、鉱酸やカルボン酸などの酸と容易にかつ可逆的に塩を形成する。これらの塩の多くは水溶性である。キトサンおよび酸が存在する系では、（１）電気的に中性であるグルコサミン単位と、（２）グルコサミン単位がプロトン化して、酸に対応する陰イオンと結合する単位との両方が、ｐＨに応じた割合で重合体の鎖中に存在する。通常このような系は、グルコサミン単位がプロトン化した程度に関係なく、キトサン塩と呼ばれる。明確性および簡潔性のため、このような系を本明細書中で以下キトサン塩と呼ぶが、この用語は、遊離アミノ基が存在していてもよい化学種を含むと理解される。穀類の種子にキトサン塩を塗布することによって、表出する植物（ｅｍｅｒｇｅｎｔｐｌａｎｔｓ）の生化学に劇的な変化が生じることが充分に実証されてきた。この変化には、局所的な微生物感染から保護するフィトアレキシンとして知られる化合物種の産生量の増加と、構造強度を付与し感染の広がりを防ぐカロースおよびリグニンの産生量の増加が含まれる。これらの変化は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ酵素をコードする遺伝子の活性化の結果として生じ、この酵素はフェニルプロパノイド代謝経路の律速段階に関わるものである。キトサンは、ジベレリン酸やアブシジン酸などの生長ホルモンの生合成に密接に関係する、テルペノイドフィトアレキシンの合成を誘発することが示されている。キトサンは、双方が真菌阻害剤として知られており、かつ花粉の発生および種子の発芽で役割を果たすことが知られている、キチナーゼ酵素およびグルカナーゼ酵素を生成する遺伝子の活性化を誘発する。キトサンはさらに、虫害からの植物の保護を助けるプロテアーゼ阻害剤を生成する遺伝子の活性化を誘発する。肉眼的には、これらの変化により、根の発達が促進し、倒伏（収穫前に植物が倒れる）が減少し、収穫量が増加し、ある植物病害に対する抵抗性を示すようになる。米国特許第４，８１２，１５９号（Ｆｒｅｅｐｏｎｓ）は、キトサン溶液を用いた播種区域内の土壌の処理、植物種子へのキトサン溶液の塗布、固体キトサンと固体酸の混合物を用いた播種区域内の土壌の処理、および固体キトサン塩を用いた播種区域内の土壌の処理について、詳細に開示している。好ましいキトサン溶液は、キトサン中のアミノ官能基１モル当たり１．５当量より多いグルタミン酸を含有するものである。表出する植物の葉へのキトサン塩の塗布について言及しているが、このような処理を実現するのに必要とされる方法や、それによって得られる結果についての開示は何もない。Ｆｒｅｅｐｏｎｓによるこれらの処理のすべてにおいて、キトサン調製品を作製するのに酸の成分を用いるとき、この酸は、種子の発芽または実生の発育に著しい悪影響を引き起こさないものと定義される非植物毒素性の酸の群から選択しなければならないことが明記されている。米国特許第４，９６４，８９４号は、米国特許第４，８１２，１５９号の一部継続出願であり、グルタミン酸、酒石酸、クエン酸、アジピン酸、塩化水素酸、ギ酸、および硝酸が非植物毒素性の基準を満たすことを注記している。酢酸および酪酸は植物毒素性であり、植物の実生の発育に有害であることが判明した。このためこれらの酸は、Ｆｒｅｅｐｏｎｓの教示による使用には不適切であるとされよう。米国特許第４，８１２，１５９号の教示によれば、種子の処理は、キトサン調製品を種子に塗布することによって、あるいはその調製品に種子を浸漬し、続いて乾燥を行うことによって成される。乾燥は、処理と播種の合間に種子が尚早に発芽するのを防止するため必要である。乾燥の工程がない場合、播種は種子処理から６０時間以内に実施することが推奨されている。種子処理は、開示された方法を用いて小規模で容易に成されるが、その処理プロトコルは、専門装置を考案することなく、あるいはＧｕｓｔａｖｓｏｎ種子塗布機のような穀物オーガー装置などの種子コーティング産業で通常使用される装置に変更を加えることなく、商業的規模の操作に拡張することは困難である。これは、装置の同じ部分を、種子への他の処理剤（例えば殺菌剤）の塗布に用いなければならず、キトサンの使用のみに専ら供することができないため、商業的な種子コーティング操作にとって重大な欠陥である。さらに、この処理は、植物成長のまさに最初期の段階におけるキトサン塩の１回の塗布のみに限定され、開花、種子形成、成熟などの植物成長の他の重要な段階では繰り返すことも強化することはできない。キトサン調製品による播種区域の土壌の処理では、播種する場所にきわめて接近した領域に、この調製品を散布することが必要である。したがって、専門装置は、種子が最終的に発芽する領域の処理を目標とすることが必要とされる。機械化した播種の場合には、これを容易に実施することができるが、この技術は、空中播種または撒布播種などのその他の方法には適合しない。さらに、固体形態のキトサンを利用する２種類の技術では、その固体を非常に小さい粒子の形態(０．５〜１００μＬｍ)で接触させることが必要とされ、したがって、塗布に適する形態にするためにキトサンの手の込んだ予備加工が必要とされる。種子処理の場合と同様に、種子発芽領域内の土壌の処理は、植物の根系を破壊しないように、植物成長のまさに最初期の段階での１回の処理に限定される。表出する植物の葉にキトサンを塗布する方法について何も開示されていないため、この技術が何らかの有益な効果をもたらすかどうかは知られていない。明らかではあるが、この技術は、その処理が植物成長の最も早い段階に拘束されるという制限を他の方法とともに有している。米国特許第４，９６４，８９４号は、上記と同じ技術について再度述べており、次いで非植物毒素性の酸を同定するための手順を述べている。グルタミン酸、酒石酸、クエン酸、アジピン酸、塩化水素酸、ギ酸、および硝酸は、非植物毒素性の基準を満たしていることが判明した。酢酸および酪酸は植物毒素性であり、したがって実生の発育に有害であることが判明した。好ましいキトサン溶液は、キトサンのアミノ官能基１モル当たりグルタミン酸を１．５当量よりも多く含有するものである。その他の技術が米国特許第５，５５４，４４５号（Ｋｉｖｅｋａｓ、Ｓｔｒｕｓｚｅｚｙｋ）に記載されており、これは微結晶質キトサンの液状分散液を種子に噴霧し、続いて乾燥して種子のまわりに重合体の膜を形成することを含む。種子上に適切な膜を形成するため、キトサンは、保水値２００〜５，０００％、水素結合ポテンシャル１０〜２５ｋＪ／モル、および粒径０．１〜１００μｍであるという条件がつけられている。上記の場合と同様に、これらの手順は、専門装置、キトサンの手の込んだ予備加工を必要とし、また植物成長の最初期の段階における１回の処理に限定される。米国特許第４，８８６，５４１号（Ｈａｄｗｉｇｅｒ）は、収穫量を増やし、倒伏を減少させ、根の発達を促進するために、小麦種子へのキトサン調製品の塗布を開示している。この処理は、種子を撹拌して種子上に液体を分布させる方法で、キトサンアセテート水溶液を種子に塗布することにより行われる。推奨される技術は、穀物オーガー装置またはセメント混合装置の使用である。上記に論じたように、この開示の教示によるキトサンの種子への塗布は、商業的な種子コーティングの複雑さおよびコストを増し、植物成長の最初期の段階における１回の塗布に限定される。米国特許第４，９７８，３８１号（Ｈａｄｗｉｇｅｒ）および米国特許第５，１０４，４３７号（Ｈａｄｗｉｇｅｒ）には、種子処理に関して同じ技術が記載されており、この方法を米、オート麦、大麦、ライ麦などのその他の穀類にまで拡げた実施例がさらに提供されている。本出願人の同時係属米国特許出願番号（ＣＶ−００８４）は、収穫量を増やし、耐渇水性をより良好にし、総体的な活力を向上させる、キトサン塩溶液の葉への散布による植物の処理方法を開示している。キトサン塩は、アミノ基に対する酸の当量の比が１．０２〜１．２０になる割合で、分子量が５０，０００ａｍｕ（原子質量単位，ダルトン）より大きいキトサンと、水溶性キトサン塩を形成する酸とから調製される。キトサンは、作物の収穫量を増やす能力以外の目的で、農業に用いられてきた。キトサンは、種々の微生物に対する殺菌剤としての特性も実証し、この性質によって良好な利点が得られる場所に使用されてきた。霜害を阻止するためのキトサンの使用が、ＪＰ０７１７９８４３Ａ（特開平７−１７９８４３）（ＤａｉｉｃｈｅＳｅｉｍｏＫＫ（第一製網）に譲渡された）に開示されており、ここでは、氷核生物であるシュードモナス・シリンジ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇｅ）およびパントエア・アグロメラント（Ｐａｎｔｏｅａａｇｇｌｏｍｅｒａｎｔｓ）を接種したホウレン草の葉をキトサンで処理し、次いで凍結温度にさらしている。処理した葉は、霜害が対照よりも著しく少なかった。さらに米国特許第５，３７４，６２７号は、細菌性軟腐（野菜）、スプリングデッドスポット（芝生）、および細菌性穀物腐敗（米）など、数多くの植物病害から植物を保護するための有効な薬剤として、キトサンを高温かつ酸性触媒で分解することにより調製した分子量１０，０００〜５０，０００のキトサン水解物の使用について開示している。発明の概要したがって、本発明は、野菜、種子、果実、芋類、および花の収穫量を増やすため、成長植物の葉にキトサン塩およびキトサンオリゴマーの両方を含有する溶液を塗布することに関する。このように処理した植物は、健康状態がより良く、耐渇水性がより高くなり、そして多くの植物品種が長い生産期間を享受する。この処理は、植物の成長サイクル全体を通して、特に、開花、種子形成、および成熟などの植物成長の重要な段階において、繰り返すことができる。したがって本発明は、主として成長子葉植物の収穫量、健康状態、および活力を向上させる方法であって、（１）最初の本葉が現れてから植物または果実を収穫するまでの間に、キトサンおよび酸の水溶性塩であって、溶液中でのキトサンに由来するアミノ基に対する酸の当量の比が１．０２〜１．２０である水溶性塩０．０１〜１．５０重量％（水溶液に溶解している）と、キトサン塩の重量（陰イオンを除く）に対してキトサンオリゴマー０．１〜１５．０重量％（水溶液に溶解している）とを含有する水溶液を葉に噴霧すること、（２）植物またはその有用な部分を収穫する前に段階（１）を繰り返すことを含む方法に関する。別の態様において、本発明は上述の処理溶液に関する。さらに別の態様において、本発明は、上述の処理溶液の調製方法であって、（１）キトサン粒子を４５〜８５℃の水中に分散させ、そして、そこに、キトサンと反応したときに水溶性塩を形成する酸を、キトサンに由来するアミノ基に対する酸の当量の比が１．０２〜１．２０となる量で添加することと、（２）そこにキトサンオリゴマーを、該オリゴマーがキトサン塩の重量（陰イオンを除く）の０．１〜１５．０％に等しい量で添加することを含む方法に関する。定義本明細書で用いる「収穫」という用語、およびその種々の形式は、成長植物の有用部分または食用部分を集めることだけではなく、植物全体を採取することも示す。前者の例は、木から果実を採取すること、ツルから豆を採取すること、茎からトウモロコシの穂を採取すること、キャベツやセロリを刈り入れることなどである。後者の例は、ポテト、ビート、およびニンジンなどの根菜類を掘り出すことである。発明の詳細な説明Ａ．キトサンの組成キトサンは、多くの菌類に見出される天然に存在する重合体であるが、豊富でもなく、天然資源から高純度で容易に分離されるものでもない。便宜上、キトサンは、セルロースに次いで２番目に豊富な天然の重合体であるキチンからより容易に得られる。キチンは、甲殻類または昆虫の外骨格から容易に分離され、軟体動物および菌類にも見出される。キチンは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルコサミンとの水不溶性の共重合体であるが、モノマー単位の大部分は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基からなる。キトサンは、同じ２つのモノマー単位の共重合体であるが、モノマー単位の大部分はＤ−グルコサミン残基である。Ｄ−グルコサミン残基は塩基性アミノ官能基を有するため、それらは酸と容易に塩を形成する。これらの塩の多くは水溶性である。高温において濃縮した苛性アルカリでキチンを処理により、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基がＤ− グルコサミン残基に変換し、それによってキチンがキトサンに変換する。甲殼類廃物に見出されるキチンからキトサンを得る便利な方法が、米国特許第３，８６２，１２２号（Ｐｅｎｉｓｔｏｎ）に記載されている。純粋なポリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンと純粋なポリ−Ｄ−グルコサミンの間に組成物の連続体が存在することは可能であるが、キトサンという用語は一般に、Ｄ−グルコサミン残基を６５〜１００％含有する重合体に用いられる。この範囲内の組成物は酸性溶液に可溶であるが、モノマー残基のうちの約３５％より多くがＮ−アセチル− Ｄ−グルコサミンである場合、この重合体は弱酸性溶液に不溶である。市販のキトサンは、一般に甲殻類から調製され、何十万と測定される分子量を有しており、数千のモノマー単位がβ−１，４型で一緒に結合している重合体の鎖に相当する。菌類供給源から得られたキトサンは、一般に分子量がやや低く、５０，０００ａｍｕ（原子質量単位、ダルトン）程度の低い分子量の断片を含有し得る。本発明の目的において、キトサンという用語は、０〜３５％のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基を含有し、５０，０００ａｍｕより大きい分子量を有し、さらに約２５０以上のモノマー単位が一緒に結合している（重合度またはＤＰ＝２５０）重合体の鎖に対応する、Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチル− Ｄ−グルコサミンの共重合体に用いることを意図する。本研究に用いたキトサンは、エビまたはカニの殻から得られ、約７５〜８２％のＤ−グルコサミン残基を含有しており、商業的に生成されたキトサンに典型的なものであった。これは、鉱酸およびカルボン酸の双方の希釈水溶液に容易に可溶であった。Ｂ．キトサンオリゴマーの組成酸または酵素触媒を用いてキトサン鎖を切断する技術は、文献上周知である。鎖切断が生じる程度は、生じる断片がまだキトサンとみなされるのに充分大きいものであるように（ＤＰ＞２５０）、選択した出発材料および反応条件に応じて制御することができる。これとはまったく反対に、生成物がモノマー種のＤ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＤＰ＝１）だけとなるように、厳しい条件下で鎖切断を行うことができる。本発明の目的のため、「キトサンオリゴマー」という用語は、約３２０〜１０，０００ａｍｕの分子量に対応する２〜５０の重合度（ＤＰ）を有する、Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチルＤ −グルコサミンの共重合体を意味することを意図する。このようなキトサンオリゴマーを酸触媒によって調製する手順は、Ｈｏｒｏｗｉｔｚ、Ｒｏｓｅｍａｎ、およびＢｌｕｍｅｎｔｈａｌ（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、７９巻、５０４６〜５０４９頁、１９５７年）に記載されている。このようなキトサンオリゴマーを酵素開裂によって調製する手順は、Ｌｉ、Ｂｒｚｅｚｉｎｓｋｉ、およびＢｅａｕｌｉｅｕ（ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３３巻（５号）、５９９〜６０３頁、１９９５年）に記載されている。本発明の研究に用いたキトサンオリゴマーは、Ｌｉ他の方法に変更を加えて調製した。キトサンオリゴマーおよびキトサン塩の混合物は、これらの材料を適量含有する溶液を噴霧することによって、あるいは当業者に容易に理解されるその他の技術によって、成長植物の葉に塗布することができる。好ましい技術は、分散液の沈澱に関連する問題、あるいは植物に固体を塗布することに関連する吸塵の危険性を排除した、溶液噴霧によるものである。キトサン塩濃度（陰イオンを除く）が０．０１％から１．５％の溶液を用いることが好ましく、０．０５％から０．５０％の濃度の溶液を用いることが最も好ましい。この濃度範囲の溶液は、商業用噴霧装置に適合する粘度を有している。さらにこの溶液は、正しい用量を実現するために１エーカー（約４，０００ｍ²）当たり１回の塗布で５〜５０ガロン（約１９〜１９０リットル）の塗布量を必要とし、これは商業用噴霧装置の通常の操作に適合するものである。キトサンオリゴマーが、溶液中のキトサン塩（陰イオンを除く）の重量に対して、０．０５〜５０％、好ましくは０．１〜１５％に等しい量で存在する溶液を用いることが好ましい。Ｃ．酸水溶性キトサン塩を形成する酸の多くは、それ自体が成長植物に有害であり、高濃度のこれらの酸に植物がさらされるのを防ぐことが重要になる。一方、大量に過剰な酸（キトサン中のアミノ官能基１モル当たりの酸の当量として測定する）を用いてキトサン塩溶液を調製しない限り、キトサンは、周囲温度で酸性溶液に非常にゆっくりと溶解する。このジレンマを解決する１つの技術は、植物への被害を制限しつつ大量に過剰な酸を用いて溶液を形成することができるよう、グルタミン酸などの植物毒性が少ないより高価な酸だけを選択することである。第２の技術は、溶解の工程の際に大量に過剰の酸を用い、次いでその過剰分を、溶解が終了した後に塩基で中和することである。しかしこの手順は、塩基が導入された領域での局所的なｐＨの増大を防止するために非常に多くの注意を払う必要があるため、満足できるものではない。このようなｐＨの増大によって、キトサン塩は、電気的に中性であるキトサンに再び変換されて、溶液中に沈澱する。次に、大量に過剰な酸はもはや存在しないゆえ、この沈澱は再び溶解するのが非常に遅い。したがって、好ましい技術は、非常にわずかに過剰の、安価な酸のみを用いて、高温で溶解の工程を実施することである。用いる酸の過剰量を制限することによって、酸の植物毒性の影響を、検出できないレベルに低減することができる。ほんのわずかに過剰の酸のみを用いた場合であっても、高温で溶解を行うことによって、充分な溶解速度を実現することができる。酢酸を用いることが最も好ましく、キトサン中のアミノ基１モル当たり１．０２〜１．２０モルの比の酢酸では、安価で容易に入手可能である。これは、米国特許第４，８１２，１５９号および米国特許第４，９６４，８９４号の教示、すなわち酢酸が植物毒性であり、したがってこれらの明細書に記載の塗布に使用されるキトサン溶液の形成には適さないことを見出している教示と著しく対照的である。溶解の工程は、５０〜７５℃で実施することが好ましい。この方法では、キトサンを、３〜５時間以内に、２．５％の濃度で溶解することができる。この濃度は、塗布現場への効率的な輸送に適しており、粘度が充分に低いため水による現場での希釈が簡単である。本発明で用いるキトサン塩の形成に適した酸は、キトサンと水溶性塩を形成する酸である。酸自体は水溶性である必要はないが、そのような水溶性の酸はその取扱いが容易であるゆえに好ましい。水溶性キトサン塩を形成する無機酸には、ハロゲン酸および硝酸が含まれる。硫酸およびリン酸は、キトサンと水溶性塩を形成しないため除外する。有機酸が好ましく、次のもの、すなわち乳酸、グリコール酸、グルタミン酸、および酢酸が含まれる。モノ官能性カルボン酸またはポリ官能性カルボン酸のいずれかを用いることができ、これらは、キトサンと水溶性塩を形成する限り、脂肪族化合物または芳香族化合物でよい。Ｄ．添加剤本明細書で用いる「添加剤」という用語は、本発明の効力を増大させるために任意選択で用いることができるがそれ自体は生物活性を持たない材料を示す。これには、界面活性剤、湿潤剤、消泡剤、増量剤、浸透剤、活性剤、展着剤、希釈剤、臭気剤、および増白剤などの材料が含まれる。植物の葉の疎水性表面に一様に分布させ、湿らせるために、組成物中に少量の湿潤剤を用いることが特に好ましい。このような剤は通常、０．０１〜０．１重量％の濃度で用いる。Ｅ．補助剤（ｃｏａｄｊｕｖａｎｔｓ）本明細書で用いる「補助剤」という用語は、キトサン塩の生物活性と同じでも異なってもよい生物活性を有する材料を示す。このような材料には、肥料、殺菌剤、防虫剤、微量の栄養素、殺虫剤、除草剤、およびこれらの混合物が含まれる。得られる水性組成物が噴霧可能である限り、液体と固体両方の補助剤を、水溶性のキトサン塩およびキトサンオリゴマーとともに用いることができる。Ｆ．キトサンオリゴマー／キトサン塩溶液の作製方法処理溶液を作製する好ましい方法は、４５〜８５℃の温度（好ましくは５５〜７５℃の温度）でキトサンの水性分散液を形成し、次いでその分散液に酸を添加することである。これらの反応条件下では、キトサンの粒径は決定的に重要なものではない。大量に過剰の酸を必要とすることなく速い反応速度を得るために、反応温度は少なくとも４５℃であることが好ましい。一方、変色を回避し、水溶性塩の安定性を保証するために、反応温度は８５℃を超えないことが好ましい。キトサンオリゴマー、添加剤、および補助剤は、任意の段階で、反応溶液に添加することができる。それにもかかわらず、あらゆる二次反応も最小限にするために、反応が完了して溶液が冷却した後に、これらを添加することが好ましい。Ｇ．キトサンオリゴマー作製方法キトサナーゼ酵素（放線菌キタサトスポリア（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒｉａ）Ｎ１７４由来）をキトサンアセテート溶液に３７〜５５℃で添加することによって、キトサンオリゴマーを作製した。３１時間後、混合物を８５℃に加熱し、酵素を変性させた。真空下、３５〜４０℃で産物を濃縮し、次いで凍結乾燥した。０．０３Ｍの酢酸および０．２Ｍの硫酸ナトリウムを含有する移動相を用いたＳｕｐｅｌｃｏ−ＴＳＫＣｏｌｕｍｎＧ−０ｌｉｇｏ−ＰＷでのサイズ排除クロマトグラフィーにより、分けられたオリゴマーの４１％は、ＤＰ（重合度）＜７であり、分けられたオリゴマーの５９％は、ＤＰが６〜２８であることが明らかになった。Ｈ．塗布方法本発明の明らかな１つの長所は、広狭双方の農業地域に最も経済的で効率的な塗布方法である液体噴霧により、キトサンオリゴマー／キトサン塩溶液を植物に塗布することができることである。水性組成物は、ブラッシングなどのその他の液体塗布方法によって塗布することができる。しかしそれらは効率的ではない。上述のように本発明の組成物を、成長植物の最初の本葉に塗布し、好ましくは少なくともあと２回、植物の収穫前に、好ましくは開花の際および成熟の開始の際に、塗布する。塗布した溶液を蒸発させることは必要ではない。実際に、キトサン塩およびキトサンオリゴマーの植物への吸着は液体状態より行われるため、蒸発させないことが好ましい。しかしながら、通常の大気条件（温度および湿度）により、通常はこの溶液が蒸発して乾燥する。Ｉ．安全性本発明の別の長所は、キトサン組成物が毒性ではないことである。例えば、ラット（シロネズミのオス５匹、メス５匹）におけるキトサングルタメートの急性経口ＬＤ₅₀値は、５ｇ／ｋｇより高い。さらに、ウサギ（シロウサギのオス５匹、メス５匹）における上記組成物の急性経皮ＬＤ₅₀値は、２ｇ／ｋｇより高い。このように低毒性であるために、本発明の組成物は、鳥、哺乳動物、または人間に有毒ではない。さらに、組成物の低毒性レベルおよび容易な生物分解性は、肥沃な土層の有益な成分への有害な影響が生じないよう作用する。したがって、ＥＰＡは、原料のままの農業商品をつくるのに用いられる場合、ポリ−Ｄ−グルコサミンの残留量許容範囲に対する要求が免除される。Ｊ．試験手順下記の実施例では次の手順を用いた。６０℃の温度で適量の水を激しく撹拌し、そして８０％のＤ−グルコサミン残基を含有するキトサンの小片を、キトサンが湿って液相全体に分散するように添加することにより、キトサンアセテート溶液を調製した。次いで氷酢酸を、キトサン１ポンド（約４５０ｇ）当たり酢酸０．３６ポンド（約１６０ｇ）の割合で添加した。これは、キトサン中のアミノ官能基１モル当たり、酢酸が１．０３当量である割合を示す。この混合物を、ほぼすべてのキトサンが溶解するまで、６０℃で撹拌した。次いで得られた溶液を、粗いチーズクロスを通して濾過し、どのような外来粒子も除去した。水およびキトサンの量は、キトサン濃度（アセテート陰イオンを除く）が５．０％となるように選択した。固体キトサンオリゴマーを、キトサンの重量（陰イオンを除く）の１０％に等しい量で添加し、その混合物を少し撹拌してオリゴマーを確実に溶解した。次いでこの溶液を、水でさらに希釈してキトサン塩濃度を２．５重量％とし、３０４ｇを含む単位に包装して試験現場に輸送した。このパッケージを現場で希釈することによって、２ガロン（約７．６リットル）の園芸用噴霧器に０．１％のキトサン塩および０．０１％のキトサンオリゴマーを含有する溶液を充填するための正確な量のキトサンオリゴマー／キトサン塩溶液を得た。種子または塊茎として植えた作物（カボチャ、トウモロコシ、豆、ポテト）の場合、植物がその最初の本葉の組をつくり出して間もなく、処理を開始した。本葉は、表出した葉（子葉）の次に続くものであり、その形状は成熟した植物の葉に類似している。株立ちした温室の実生として得られた作物（トマト）の場合、戸外に移植するときに処理を開始した。どちらの場合も、成長時期を通して、２週間から３週間の間隔で処理を繰り返した。処理プロトコルは、葉の表面の最上部が完全にぬれて溶液が葉の先から滴るまで、植物の葉に噴霧することであった。処理される植物にもたらされる液体分が対照に比べて実質上相違がないように、灌水直後に、可能な限りこの処理を行う。植物のサイズが大きくなると、葉をぬらすためにより多くのキトサンオリゴマー／キトサン塩溶液を用いることが明らかに必要であった。処理量は、初期処理には５〜１０ガロン／エーカー（約０．００５〜０．０１リットル／ｍ²）であり、処理の終了時には２０〜４０ガロン／エーカー（約０．０２〜０．０４リットル／ｍ²）と見積もられた。カボチャなど、成熟段階前において最適条件で収穫した作物については、増加した生産高の測定として、果実の全重量よりも果実の数を用いた。豆やトウモロコシなど、成熟期に収穫した作物については、増加した生産高の測定として、作物の全重量を用いた。Ｋ．処理可能な植物この処理が上記の手法で実施される限り、本発明の方法によって広く様々な子葉植物を有利に処理することができる。このような植物には、Ａｌｌｉｕｍ（アリウム）属、Ａｐｐｉｕｍ（アピウム）属、Ａｓｐａｒａｇｕｓ（アスパラガス）属、Ｂｅｔａ（フダンソウ）属、Ｂｒａｓｓｉｃａ（アブラナ）属、Ｃａｐｓｉｃｕｍ（トウガラシ）属、Ｃｉｔｒｕｌｌｉｓ（スイカ）属、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ（カボチャ）属、Ｄａｕｃｕｓ（ニンジン）属、Ｆｒａｇｅｒｉａ（イチゴ）属、Ｌａｃｔｕｃａ（アキノノゲシ）属、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（トマト）属、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ（インゲン）属、Ｓｏｌａｎｕｍ（ナス）属、Ｓｐｉｎａｃｈｉａ（ホウレンソウ）属、およびＺｅａ（トウモロコシ）属のメンバーが含まれる。これらの属の野菜のメンバーの中には、アスパラガス、豆、ビート、ブロッコリ、ニンジン、セロリ、トウモロコシ、ナス、レタス、メロン、タマネギ、エンドウ豆、コショウ、ポテト、ホウレン草、カボチャ、イチゴ、およびトマトがある。実施例実施例１１９９６年５月下旬、単に土を掘り返してその土塊をくずすことにより調製した土壌中に、カボチャ（ＢｕｒｐｅｅＹｅｌｌｏｗＳｕｍｍｅｒ）を、各々に３つの苗を含む畝にして、並べて植え付けた。成長の間必要に応じ、すべての畝を同一の方法で栽培し、潅水を行った。上述の手順によって一方の畝をキトサンオリゴマー／キトサン塩溶液で処理し、他方を対照とした。７月９日から８月８日までの間に好ましいサイズに達した実を収穫した。穿孔虫により荒らされたため、８月８日に調査を終了した。対照が２８個の実をつけていたのに対し、処理済みの植物は４０個の実をつけていた。これは、収穫量が４３％増加したことを示している。実施例２１９９６年５月下旬、土を掘り返して土塊をくずし、平らにならして調製した土壌に、同じ方法で、サヤインゲンを平行な畦にして植えた。両方の畦を栽培し、成長の間必要に応じて灌水した。一方の畦をキトサンオリゴマー／キトサン塩溶液で上述のように処理し、他方の畦を対照とした。この植物が消費されたと判断された８月２６日まで、１週間の間隔で作物を収穫した。対照の畦では１１ポンド６オンス（約５ｋｇ）の豆が産出されたのに対し、処理済みの畦では１３ポンド６オンス（約６ｋｇ）の豆を産出した。これは、収穫量が１８％増加したことを示す。実施例３１９９６年６月２日、土を耕し平らにならして調製した土壌に、実生のトマト（Ｂｒａｎｄｙｗｉｎｅ）を戸外に移植した。この植物の半分を、上述のようにキトサンオリゴマー／キトサン塩溶液で処理し、残りの半分を対照とした。成長時期全体を通して必要に応じ、両方の群を同等の方法で栽培し、潅水し、支柱し、そしてそれらが熟したときに実を収穫した。これらの植物の対照群からは合計７４個の実を収穫したのに対し、処理済みの群からは合計８６個の実を収穫した。これは、収穫量が１６％増加したことを示している。実施例４耕して平らにした土壌に、スイートコーン（ＳｅｎｅｃａＳｔａｒ）を２つの９０フィート（約２７ｍ）の畦にして植えた。一方の畦を、上述のようにキトサンオリゴマー／キトサン塩溶液で処理し、他方の畦を対照とした。これらの畦を同一条件下で成長させ、１９９６年７月２０日〜７月２９日の間に収穫した。処理済みの畦では５７．２５ポンド（約２６ｋｇ）（１１０穂）の産物を収穫量であり、対照の畦では４３．５０ポンド（約２０ｋｇ）（１１０穂）の産物を収穫量であった。これは、収穫量が３２％増加したことを示している。実施例５１００畝のレッドポテトを、それぞれ５０畝の試験群と対照群に分け、試験群を上述のようにキトサンオリゴマー／キトサン塩溶液で処理したこと以外は同一条件下で生育した。芋類を定期的に調査し、目標とするサイズに達したらすぐに収穫した。試験群の場合、これが１９９６年８月５日までに生じたと判断され、その結果、試験植物からはポテト９７．５０ポンド（約４４ｋｇ）（平均重量＝０．１５ポンド（約６８ｇ））の収穫量が得られた。対照群を１９９６年８月１４日に収穫し、ポテト８２．１５ポンド（約３７ｋｇ）（平均重量＝０．１２７ポンド（約５７ｇ））を得た。これは、９日少ない生育日数で収穫量が１９％増加したことを示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年３月２６日（１９９９．３．２６）【補正内容】キトサンは、作物の収穫量を増やす能力以外の目的で、農業に用いられてきた。キトサンは、種々の微生物に対する殺菌剤としての特性も実証し、この性質によって良好な利点が得られる場所に使用されてきた。霜害を阻止するためのキトサンの使用が、ＪＰ０７１７９８４３Ａ（特開平７−１７９８４３）(ＤａｉｉｃｈｅＳｅｉｍｏＫＫ（第一製網）に譲渡された)に開示されており、ここでは、氷核生物であるＰ．シリンジ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇｅ）およびＰ．アグロメラント（Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｔｓ）を接種したホウレン草の葉をキトサンで処理し、次いで凍結温度にさらしている。処理した葉は、霜害が対照よりも著しく少なかった。さらに米国特許第５，３７４，６２７号は、細菌性軟腐(野菜)、スプリングデッドスポット(芝生)、および細菌性穀物腐敗（米）など、数多くの植物病害から植物を保護するための有効な薬剤として、キトサンを高温かつ酸性触媒で分解することにより調製した分子量１０，０００〜５０，０００のキトサン水解物の使用について開示している。発明の概要したがって本発明は、野菜、種子、果実、芋類、および花の収穫量を増やすため、成長中の植物の葉にキトサン塩およびキトサンオリゴマーの両方を含有する溶液を塗布することに関する。このように処理した植物は、健康状態がより良く、耐渇水性がより高くなり、そして多くの植物品種が長い生産期間を享受する。この処理は、植物の成長サイクル全体を通して、特に、開花、種子形成、および成熟など、植物成長の重要な段階中に繰り返すことができる。１．最初の本葉を有する成長子葉植物の収穫量を向上させる方法であって、（１）（ａ）５０，０００より大きい分子量を有するキトサンと酸とを４５〜８５℃の温度で反応させることによって調製したキトサンの陰イオン性塩であって、溶液中でキトサン中のアミン基に対する酸のモル比が１．０１〜１．２０である該キトサンの陰イオン性塩０．０１〜１．５重量％と、（ｂ）陰イオンを除いたキトサン塩の重量に対して、３２０〜１０，０００の分子量を有するキトサンオリゴマー０．０５〜５０％とが溶解した水溶液を、前記植物の葉の露出表面に塗布する段階と、（２）植物を収穫する前に、段階（１）を少なくとも１回繰り返す段階とを含むことを特徴とする方法。２．最初の本葉を有する子葉植物を処理する組成物であって、（ａ）５０，０００より大きい分子量を有するキトサンと酸とを４５〜８５℃の温度において反応させることにより調製したキトサンの陰イオン性塩であって、溶液中でキトサンに由来するアミノ基に対する酸の当量の比が１．０２〜１．２０である該キトサンの陰イオン性塩０．０１〜１．５重量％と、（ｂ）陰イオンを除いたキトサン塩の重量に対して、３２０〜１０，０００の分子量を有するキトサンオリゴマー０．０５〜５０％とを含有する水溶液を含むことを特徴とする組成物。３．（ａ）５０，０００より大きい分子量を有するキトサンの微細粒子を水中に分散し、該分散液の温度を４５〜８５℃に調節することによって、キトサンの水性分散液を形成する工程と、（ｂ）分散液中のアミン部分に対する酸部分のモル比が１．０１〜１．２０となるような量で、工程（ａ）の加熱した分散液に酸を添加する工程と、（ｃ）キトサンと酸との反応を完全に行うのに充分な時間、撹拌しながら、工程（ｂ）の酸性化溶液の温度を４５〜８５℃で維持し、これによって反応溶液中に溶解した陰イオン性キトサン塩を形成する工程と、（ｄ）分子量３２０〜１０，０００のキトサンオリゴマーを、撹拌しながら、工程（ｃ）のキトサン塩溶液に添加する工程であって、該キトサンオリゴマーを、溶解したキトサン塩の０．０５〜５０重量％に相当する量で添加する工程と、（ｅ）必要に応じ、工程（ｄ）のキトサン塩／キトサンオリゴマー溶液の含水率を、該溶液中のキトサン塩の濃度が０．０１〜１．５重量％となる含水レベルに調節する工程とを含むことを特徴とする請求項２に記載の水性処理溶液の調製方法。４．前記酸の当量がカルボン酸から得られることを特徴とする請求項１に記載の方法。５．前記カルボン酸が、酢酸、グルタミン酸、乳酸、グリコール酸、およびこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。６．前記植物の少なくとも一部がヒトによって食されることを特徴とする請求項１に記載の方法。７．前記植物が食用野菜であることを特徴とする請求項６に記載の方法。８．前記植物の属が、アリウム属、アピウム属、アスパラガス属、フダンソウ属、アブラナ属、トウガラシ属、スイカ属、カボチャ属、ニンジン属、イチゴ属、アキノノゲシ属、トマト属、インゲン属、ナス属、ホウレンソウ属、およびトウモロコシ属からなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。９．前記植物が、アスパラガス、豆、ビート、ブロッコリ、ニンジン、セロリ、トウモロコシ、ナス、レタス、メロン、タマネギ、エンドウ豆、コショウ、ポテト、ホウレン草、カボチャ、イチゴ、およびトマトからなる群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の方法。１０．前記植物が豆であることを特徴とする請求項９に記載の方法。１１．前記植物がトウモロコシであることを特徴とする請求項９に記載の方法。１２．前記植物がカボチャであることを特徴とする請求項９に記載の方法。１３．前記植物がポテトであることを特徴とする請求項９に記載の方法。１４．前記植物がトマトであることを特徴とする請求項９に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．最初の本葉を有する成長子葉植物の収穫量を向上させる方法であって、（１）（ａ）キトサンと酸との反応によって調製したキトサン塩であって、溶液中でキトサンに由来するアミノ基に対する酸の当量の比が１．０２〜１．２０である該キトサン塩０．０１〜１．５重量％と、（ｂ）陰イオンを除いたキトサン塩の重量に対してキトサンオリゴマー０．０５〜５０％とが溶解した水溶液を葉の露出表面に塗布する工程、および（２）植物を収穫する前に、段階（１）を少なくとも１回繰り返す工程を含むことを特徴とする方法。２．最初の本葉を有する子葉植物を処理する組成物であって、（ａ）キトサンと酸との反応により調製したキトサン塩であって、溶液中でキトサンに由来するアミノ基に対する酸の当量の比が１．０２〜１．２０である該キトサン塩０．０１〜１．５重量％と、（ｂ）陰イオンを除いたキトサン塩の重量に対してキトサンオリゴマー０．０５〜５０％とを含有する水溶液を含有することを特徴とする組成物。３．（ａ）キトサンと酸との反応により調製したキトサン塩であって、溶液中でキトサンに由来するアミノ基に対する酸の当量の比が１．０２〜１．２０である該キトサン塩０．０１〜１．５重量％と、（ｂ）陰イオンを除いたキトサン塩の重量に対してキトサンオリゴマー０．０５〜５０％とを含有する水溶液の調製方法であって、４５〜８５℃の水中にキトサンの粒子を分散させること、および、該水中に、キトサンに由来するアミノ基に対する酸の当量の比が１．０２〜１．２０となるような量の酸と、キトサンの重量の０．０５〜５０％に相当するキトサンオリゴマーとを添加することを含むことを特徴とする方法。４．本葉が、キトサンと酸の反応により調製されたキトサン塩であって、溶液中でキトサンに由来するアミノ基に対する酸の当量の比が１．０２〜１．２０である該キトサン塩を含有する、陰イオンを除いたキトサン塩の重量に対してキトサンオリゴマー０．０５〜５０％も溶解している、水溶液の層を有することを特徴とする成長子葉植物。５．前記酸の当量がカルボン酸から得られることを特徴とする請求項１に記載の方法。６．前記カルボン酸が、酢酸、グルタミン酸、乳酸、グリコール酸、およびこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の方法。７．前記植物の少なくとも一部がヒトによって食されることを特徴とする請求項１に記載の方法。８．前記植物が食用野菜であることを特徴とする請求項７に記載の方法。９．前記植物の属が、アリウム属、アピウム属、アスパラガス属、フダンソウ属、アブラナ属、トウガラシ属、スイカ属、カボチャ属、ニンジン属、イチゴ属、アキノノゲシ属、トマト属、インゲン属、ナス属、ホウレンソウ属、およびトウモロコシ属からなる群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の方法。１０．前記植物が、アスパラガス、豆、ビート、ブロッコリ、ニンジン、セロリ、トウモロコシ、ナス、レタス、メロン、タマネギ、エンドウ豆、コショウ、ポテト、ホウレン草、カボチャ、イチゴ、およびトマトからなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。１１．前記植物が豆であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。１２．前記植物がトウモロコシであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。１３．前記植物がカボチャであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。１４．前記植物がポテトであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。１５．前記植物がトマトであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。１６．前記キトサン塩溶液中の酸の当量がカルボン酸から得られることを特徴とする請求項４に記載の子葉植物。１７．前記カルボン酸が、酢酸、グルタミン酸、乳酸、グリコール酸、およびこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１６に記載の子葉植物。１８．少なくとも一部がヒトによって食されることを特徴とする請求項４に記載の子葉植物。１９．アリウム属、アピウム属、アスパラガス属、フダンソウ属、アブラナ属、トウガラシ属、スイカ属、カボチャ属、ニンジン属、イチゴ属、アキノノゲシ属、トマト属、インゲン属、ナス属、ホウレンソウ属、およびトウモロコシ属からなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の子葉植物。２０．食用野菜であることを特徴とする請求項１９に記載の子葉植物。２１．アスパラガス、豆、ビート、ブロッコリ、ニンジン、セロリ、トウモロコシ、キュウリ、ナス、レタス、メロン、タマネギ、エンドウ豆、コショウ、ポテト、ホウレン草、カボチャ、イチゴ、およびトマトからなる群から選択されることを特徴とする請求項２０に記載の子葉植物。２２．前記植物が豆であることを特徴とする請求項２１に記載の植物。２３．前記植物がトウモロコシであることを特徴とする請求項２１に記載の植物。２４．前記植物がカボチャであることを特徴とする請求項２１に記載の植物。２５．前記植物がポテトであることを特徴とする請求項２１に記載の植物。２６．前記植物がトマトであることを特徴とする請求項２１に記載の植物。