JP2001510796A - ドーパミン作動性及びｇａｂａ作動性障害の治療法 - Google Patents

ドーパミン作動性及びｇａｂａ作動性障害の治療法

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Abstract

(57)【要約】 ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質または模倣剤が表現型の特異性を越えて新しい活性を有することがここで示される。１４．５日目の胚（Ｅ１４．５）の拉致腹側中脳由来の培養を用いて、我々はｈｅｄｇｅｈｏｇまたは模倣剤はドーパミン作動性ニューロンに対し栄養的であることを示す。興味深いことには、ｈｅｄｇｅｈｏｇまたは模倣剤はドーパミン作動性ニューロンの生存を推進するだけでなく、中脳ＧＡＢＡ免疫反応性ニューロン（ＧＡＢＡ−ｉｒ）の生存も促進する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 技術背景 パーキンソン病の個々の症状はＧａｌｅｎの時代より内科医により記述されて
きた、しかし、その事象は１８１７年まで疾病として認識されなかった。その年
、ロンドンの内科医であるＪａｍｅｓ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎは、数点の異なる運
動性症状が、独自の状況を形成する集団として統一的にみなせる可能性があると
議論したエッセーを出版した。彼の観察は、その結論が正しかったからだけでな
く、その観察の一部をロンドンの通りにおけるパーキンソン病の犠牲者達の移動
を距離をおいて見ることにより行ったために、興味深い。パーキンソン病は異な
る時代には、振動麻痺またはそのラテン語相当語であるＰａｒａｌｙｓｉｓ ａ
ｇｉｔａｍｓと呼称された、しかし疾病の本質を認識したＪａｍｅｓ Ｐａｒｋ
ｉｎｓｏｎの栄誉により疾病の名称を再定義すべきと主張したＪｅａｎ Ｃｈａ
ｒｏｔによりその一般名称は付けられた。
【０００２】 パーキンソン病は相当に一般的であり、その発生率は人口比０．１から１．０
％と評価されている。これはまた数多くの他の理由から相当に興味深い。第一に
、疾病は黒質の退化、及び細胞核で生産される神経伝達物質であるドーパミンの
減少に関連すると考えられている。そのため、疾病はその脳幹核の役割及び移動
制御における神経伝達物質に対し、重要な見識を提供する。第二に、パーキンソ
ン病に対する様々な薬理学的治療により、症状の異なる特徴がある範囲に収めら
れたため、疾病は一般的側面における運動性疾患の薬理学的治療を理解するモデ
ルを提供する。第三に、パーキンソン病は実存疾病として記述されたにも拘わら
ず、症状は人により異常に大きく変化し、その結果、運動の要素と共にその複雑
性を明らかにすることは大量の議案を生産することになる。第四に、パーキンソ
ン病の症状の多くは、老化の結果として起こる運動活性において著しく類似に変
化するため、疾病が老化における神経変化の一般的問題に対し間接的見識を提供
する。
【０００３】 パーキンソン病には３つの大きな型がある：突発性、後脳炎性及び薬物誘因性
。パーキンソン病はまた動脈硬化症の結果としても生じ、一酸化炭素またはマン
ガン中毒による害に続いて発生し、または梅毒または腫瘍の成長の結果生じる。
その名に示されたように、突発性の場合のパーキンソン病は不明である。その起
源は家族性、または老化過程の一部の可能性があるが、しかしウイルス性起源を
有するとも広く考えられている。これは５０歳以上の人々に最も頻繁に起こる。
後脳炎性は１９１６−１９１７年の冬に現れ、１９２７年に消失した眠り病に起
源を有する。症状の配列はとまどうほどに多様で；どの二人の患者も同様とは言
えないほどであるが、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎ ｖｏｎ Ｅｃｏｎｏｍｏは、疾病
により死んだ患者の脳におけるウイルス感染に伴う脳損傷の独自のパターンを作
成した。影響を受けたものの三分の一は、昏睡または不眠状態における眠り病の
急性症状において死んだ。多くの人々は疾病から完全に回復したように見受けら
れたが、ほとんどはその後に神経性または精神性の疾患及びパーキンソン病を発
病した。最初及びその後の発病の間の潜伏期は、十分に説明されなかった。パー
キンソン病患者における活性粒子またはウイルス特異的産物の詳細な探索により
、ウイルス性の原因の証拠は皆無であると明らかにされた。パーキンソン病の三
番目の大きな原因は、より最近であり、様々な薬剤、特に多くはレセルピン及び
幾つかのフェノチアジン及びブチロフェノン誘導体を含む精神安定剤の摂取に関
連している。症状は通常逆にできる、しかし真性疾患から判別するのは困難であ
る。
【０００４】 近年、外用薬が極めて急速に症状を引き起こすことが判明した、Ｌａｎｇｓｔ
ｏｎ及び共同研究者は、薬物使用者により摂取された場合、合成ヘロイン、ＭＰ
ＴＰの汚染はドーパミン作動性細胞に対し極めて毒性であるＭＰＰに変換される
と報告した。多くの若年薬剤使用者は、汚染薬剤使用の後、完全なパーキンソン
病を示すことが発見された。この発見は、他の基質が同様の効果を与えることを
示唆した。バンクーバー及びヘルシンキの都市における患者承認の人口統計学的
研究により、４０歳以下の年齢で疾病の患者になる事象が増加していることが示
される。これは水質及び大気が、ＭＰＴＰと同様の方法で機能する環境性毒物を
含有する可能性があるという示唆を与える。
【０００５】 パーキンソン病患者は疾病の原因に基づき臨床集団に分類することが可能であ
るが、症状を生み出す機構は共通の起源を有することがありそうである。急性ま
たは後脳炎性の場合に起きるように黒質が損害を受けている、またはその細胞の
活性が抑えられている、または薬剤誘因性パーキンソン病において起きるように
その細胞が死んでいる。黒質の細胞は暗い色素を有しており、パーキンソン病に
おいてはその領域は、その領域のメラトニン含有神経の分解により色素が失われ
る。黒質の細胞は、基底神経節前頭外皮及び脊髄に向かう繊維の起点である。こ
れら投影のシナプスにおける神経伝達物質はドーパミンである。パーキンソン病
により死んだ患者の脳の生物解析、及びドーパミン、尿で排出されるホモバナル
酸の代表的代謝の解析により、脳ドーパミンは９０％以上が減少しており、しば
しば検出できない量にまで減少していることが明らかにされた。その結果、パー
キンソン病の原因はドーパミンの欠落として、また薬剤誘因性の場合はドーパミ
ン活性の欠落を伴い、ある程度の確実性を持って検出できた。
【０００６】 パーキンソン病を治療する企てが行われた。パーキンソン病の治療を目的とし
たものの一つは、ＤｕＰｏｎｔ Ｍｅｒｃｋ Ｐｈａｒｍａｃｒｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．より入手可能なカルビドーパ及びレボドーパの混合物を含有する持続放出
錠剤であるＳｉｎｅｍｅｔ ＣＲである。その他のパーキンソン病の治療を目的
としたものは、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．
より入手可能なセレフィリン塩酸を含有する錠剤であるＥｌｄｅｐｒｙｌである
。その他のパーキンソン病の治療を目的としたものは、Ｓａｎｄｏｚ Ｐｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより入手可能なメシル酸臭化
クリプチンを含有する錠剤であるＰａｒｌｏｄｅｌである。
【０００７】 本発明の概要 本出願の一側面は、インビトロまたはインビボにおいて、ｈｅｄｇｅｈｏｇ治
療剤またはｐｔｃ治療剤を用い、細胞に接触することにより、ｈｅｄｇｅｈｏｇ
治療剤またはｐｔｃ治療剤の実行が行われなかった場合と比較し、ニューロン細
胞の生存率を増加させる効果量においてドーパミン作動性またはＧＡＢＡ作動性
ニュ−ロンの生存を誘導する方法に関連する。
【０００８】 本出願の一側面は、インビトロまたはインビボにおいて、ｈｅｄｇｅｈｏｇ治
療剤またはｐｔｃ治療剤を用い、細胞に接触することにより、ｈｅｄｇｅｈｏｇ
治療剤またはｐｔｃ治療剤の実行が行われなかった場合と比較し、ニューロン細
胞の生存率を増加させる効果量において黒質ニューロンの生存を誘導する方法に
関連する。
【０００９】 その他の態様において、主題の方法は、哺乳類のドーパミン作動性及び／また
はＧＡＢＡ作動性ニュ−ロンを神経変質より保護するため；神経変質疾患を妨げ
るまたは治療するため；パーキンソン病治療のため；ハンチントン病治療のため
；及び／またはＡＬＳ治療のために用いることが可能である。ｐｔｃ治療剤によ
り治療される患者に関する態様において、その治療剤は望ましくは、ｐａｔｃｈ
ｅｄを介するシグナルにおけるｈｅｄｇｅｈｏｇ効果を模倣する小有機分子であ
る。
【００１０】 ｈｅｄｇｅｈｏｇ治療剤を用いて行われる主題の方法に関し、ｈｅｄｇｅｈｏ
ｇ治療剤は望ましくは、少なくとも生物活性のあるｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質
の細胞外領域を含有するｈｅｄｇｅｈｏｇの一部を含むポリペプチド、例えば、
ｈｅｄｇｅｈｏｇの一部はｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質のＮ端半分の少なくとも
５０、１００または１５０アミノ酸残基を含む。望まれる態様において、ｈｅｄ
ｇｅｈｏｇの一部は少なくともｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の細胞外領域の１９
ｋｄに対応するｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の一部を含む。
【００１１】 望まれる態様において、一覧としたこれらの配列と同一の配列を加えることも
、本方法において有用であると意図されるが、ｈｅｄｇｅｈｏｇの一部は少なく
とも６０、７５、８５または９５パーセントの、配列番号１０−１８または２０
のいずれかのｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質と同一のアミノ酸配列を有する。ｈｅ
ｄｇｅｈｏｇの一部は、ストリンジェントな条件下で配列番号１−９または１９
のいずれかの核酸配列とハイブッリド形成する核酸によりコードされることが可
能である、例えば、ｈｅｄｇｅｈｏｇの一部は脊椎動物のｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝
子、特にヒトｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子によりコードされることが可能である。
【００１２】 他の態様において、主題の方法は遺伝子活性化構築物を投与することにより行
われる、遺伝子活性化構築物は、患者の遺伝子ｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子と組み換
わり、ｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子を符合とする配列と結合して効能を発揮する異型
転写制御配列を提供する。
【００１３】 さらに他の態様において、主題の方法は、ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドをコ
ードする遺伝子治療構築物の投与により実施され得る。例えば、遺伝子治療構築
物はウイルス粒子、リポソーム、及びポリ陽イオン性核酸結合剤の組換え産物か
らなる集団より選択された組成物において提供される。
【００１４】 本発明の他の側面は、様々なヒトｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子、例えばヒトＤｈｈ
及びＩｈｈ、のクローニングに関連する。望まれる態様において、単離された及
び／または組換えにて生産された、配列番号１６または１７により提示された配
列または生物活性のある細胞外断片と少なくとも９５パーセント同一なポリペプ
チドを提供する。その他の態様において、単離された及び／または組換えにて生
産された、配列番号１６及び配列番号１７を含有する集団より選択された配列と
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされたポリペ
プチドを提供する。望まれる態様において、ポリペプチドは薬理学的に受容可能
な保有者において定式化される。
【００１５】 望まれるヒトＤｈｈ及びＩｈｈの生物活性のある断片は、各々概ね配列番号１
６の２８−２０２及び配列番号１７の２３−１９８残基を含む。より長いまたは
より短い断片は、例として断片のＮ末端及びＣ末端の一方または両方において５
、１０、１５または２０アミノ酸短いものを意図している。
【００１６】 ある態様において、ポリペプチドは少なくとも、乾燥重量で８０％、より望ま
しくは乾燥重量で９０または９５％にまで精製される。
【００１７】 本発明のその他の側面は、配列番号１６及び配列番号１７または生物活性のあ
る断片からなる集団より選択されたｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質と少なくとも９
５％同一のｈｅｄｇｅｈｏｇアミノ酸配列を含むポリペプチド、例えば、（ｉ）
ｐａｔｃｈｅｄタンパク質に結合する、（ｉｉ）ニューロン細胞の分化を制御す
る、（ｉｉｉ）分化したニューロン細胞の生存を制御する、（ｉｖ）軟骨細胞の
増殖を制御する、（ｖ）精巣生殖系列細胞の増殖を制御する、または（ｖｉ）ト
ランスジェニック ショウジョウバエにおいてショウジョウバエ ｈｅｄｇｅｈ
ｏｇを機能的に置換される、またはこれらの組み合わせであるｈｅｄｇｅｈｏｇ
アミノ酸配列、をコードする単離された核酸を提供する。
【００１８】 その他の望まれる態様において、単離された核酸は、ストリンジェントな条件
下で配列番号７及び配列番号８からなる集団から選択された核酸配列とハイブリ
ダイズする核酸によりコードされたｈｅｄｇｅｈｏｇアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードし、ポリペプチドのｈｅｄｇｅｈｏｇアミノ酸配列はｈｅｄｇ
ｅｈｏｇタンパク質の自然なタンパク質分解産物に対応する。そのようなポリペ
プチドは望ましくは、（ｉ）ｐａｔｃｈｅｄタンパク質に結合する、（ｉｉ）ニ
ューロン細胞の分化を制御する、（ｉｉｉ）分化したニューロン細胞の生存を制
御する、（ｉｖ）軟骨細胞の増殖を制御する、（ｖ）精巣生殖系列細胞の増殖を
制御する、及び／または（ｖｉ）トランスジェニック ショウジョウバエにおい
てショウジョウバエ ｈｅｄｇｅｈｏｇを機能的に置換される、またはこれらの
組み合わせである。
【００１９】 望まれる態様において、核酸は配列番号１６及び配列番号１７からなる集団よ
り選択されたｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質と同一のｈｅｄｇｅｈｏｇアミノ酸配
列をコードする。
【００２０】 その他の望まれる態様は、生物活性のあるｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質をコー
ドするヒトｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子のコード配列を含む、単離された核酸を提供
する。
【００２１】 本発明のさらに他の側面は、少なくとも原核細胞及び真核細胞において複製可
能な、上記のＤｈｈまたはＩｈｈをコードする核酸を含む、発現ベクターに関連
する。
【００２２】 本発明はそのような発現ベクターに感染した宿主細胞、及び、ｈｅｄｇｅｈｏ
ｇポリペプチドを発現する細胞培養培地においてそのような細胞を培養すること
により組み換えｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドを生産し、細胞培地から前述のｈ
ｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドを単離する方法を提供する。
【００２３】 本発明のさらに他の側面は、例えば、（ｉ）真核細胞においてＨｅｄｇｅｈｏ
ｇポリペプチドの発現を生じさせるための転写制御配列に機能的にに結合する、
ヒトＩｈｈまたはＤｈｈタンパク質をコードする配列を含む遺伝構築物、及び（
ｉｉ）前述の遺伝子構築物を細胞に運搬し、前述の遺伝構築物を細胞に感染させ
る遺伝運搬用組成物を含有する、遺伝子治療に有用である、組換え感染系を提供
する。例えば、遺伝導入組成物は組換えウイルス粒子、リポソーム、及びポリ陽
イオン性核酸結合剤からなる集団より選択される。
【００２４】 本発明の他の側面は、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ
／プライマーを提供する、前述のオリゴヌクレオチドは配列番号７または８また
はそれらの天然に生じた変異体のセンスまたはアンチセンス配列の少なくとも１
０の連続するヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌ
クレオチド配列の領域を含む。望まれる態様において、プローブ／プライマーは
それに結合し、検出可能な標識集団を含む。本発明は、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｍＲ
ＮＡ転写産物を含む細胞を検出する試験用キットをも提供し、そのようなプロー
ブ／プライマーをも含む。
【００２５】 本発明におけるさらに他の態様は、核酸が（ｉ）合成オリゴヌクレオチドであ
る、（ｉｉ）一本鎖である、（ｉｉｉ）直鎖状である、（ｉｖ）長さにおいて２
０から５０ヌクレオチドである、及び（ｖ）ヌクレアーゼ分解に対して耐性なＤ
ＮＡ類似体である、の一つである、生理的条件下でヒトＩｈｈまたはＤｈｈ ｈ
ｅｄｇｅｈｏｇタンパク質をコードする遺伝子と特異的にハイブリダイズし、発
現を抑制するアンチセンス核酸の精製調製物を提供する。
【００２６】 本発明の詳細な説明 軸決定分泌タンパク質である、ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）は脊
椎動物胚発生初期に脊索及び腹側神経管において発現する。この場において、こ
れはＣＮＳの全長にわたり腹側ニューロンの表現型の詳細を決定する役割を演じ
る。例えば、Ｓｈｈは脊髄における運動神経及び脳中部におけるドーパミン作動
性ニューロンの分化を誘導する。しかし、Ｓｈｈの発現はこの誘導時期を超えて
持続する。我々は本明細書においてＳｈｈが表現型を詳細に決定する以上の新規
の活性を有することを示した。１４．５日胚（Ｅ１４．５）ラット腹側中脳由来
の培養細胞を用い、我々はＳｈｈがドーパミン作動性ニューロンの栄養にもなる
ことを示す。興味深いことに、Ｓｈｈはドーパミン作動性ニューロンの生存を誘
導するだけでなく、脳中部のＧＡＢＡイムノエラクティブ（ＧＡＢＡ―ｉｒ）神
経の生存も誘導する。Ｅ１５―１６線由来の培養細胞において、Ｓｈｈは他の細
胞を除き、ＧＡＢＡ―ｉｒ介在ニューロンの生存を誘導する。Ｅ１５―１６腹側
脊髄由来の培養細胞は、Ｓｈｈが、多くはＧＡＢＡ―ｉｒであり一部はＬｉｍ―
１／２核マーカーを発現する介在ニューロンの栄養に再びなるが、運動神経の生
存の支援を行うようには見えないことを明らかにした。Ｓｈｈは交感神経または
背側神経節根神経の生存を支援しない。最終的に脳中部培養細胞を用い、我々は
、高度に特異性のある神経毒であるＭＰＰ＋存在下で、Ｓｈｈが通常では起こる
ドーパミン作動性ニューロンの死を防ぐことを示す。
【００２７】 これらの発見の一部に基づき、我々はＳｈｈ及びｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質
の他の形態は、神経退化障害、特にドーパミン作動性及び／またはＧＡＢＡ作動
性神経の欠損に由来する障害、または黒質からの一般的な組織欠損、の治療及び
予防における保護的薬剤として有用であると決定した。下記に相当に詳細に記載
したように、例示の障害（”候補障害”）はパーキンソン病、ハンチントン病、
筋萎縮性側方硬化症及びその類似物を含む。
【００２８】 本発明は、培養、例えば、ドーパミン作動性及びＧＡＢＡ作動性ニューロンの
培養において分化した神経の維持のための細胞培養添加物として、ｈｅｄｇｅｈ
ｏｇ及びｈｅｄｇｅｈｏｇアゴニストを利用する。主題の方法及び組成物は動物
におけるそのような神経細胞の移植を増加するために用いることが可能である。
治療の期間において、ひとたび患者が候補障害の症状を経験したら、治療法の目
標はさらなる神経機能障害の予防である。
【００２９】 Ｉ、通覧 本出願は、脳に対する虚血障害、例えば発作の結果、の予防及び治療のための
組成物及び方法を指示する。本発明は、少なくとも一部において、”ｈｅｄｇｅ
ｈｏｇ”タンパク質と呼ばれるものによる、動物発作モデルに対する守護的効果
の観察に由来する。端的には、付加された実験において記載されたように、我々
は小脳中部動脈の永続的閉塞に使用される、病床小脳虚血のラットモデルにおけ
る、ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の神経守護能力を調べた。媒体（対照）または
Ｓｈｈ（ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ）の静脈注射は、閉塞３０分後に開始し
３時間投与され、その結果、閉塞２４時間後に計測すると対照と比較して、全梗
塞の大きさは７０％減少していた（Ｐ＝０．００３９）。動脈血圧、血液気体、
グルコース、ヘマトクリット、及び浸透度の測定では媒体及びＳｈｈ処理動物の
間に差異は明らかにされなかった。これらの結果は、静脈ｈｅｄｇｅｈｏｇタン
パク質が発作による神経障害を減少させることを示す。
【００３０】 一つの側面において、本発明は小脳虚血を防ぎ／治療する、及び活性成分、ｈ
ｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドまたはその模倣物を類似利用する、薬理学的調製物
及び方法を提供する。
【００３１】 主題のｈｅｄｇｅｈｏｇ療法はこれらの条件に苦しむヒト及び動物被検体の両
者に効果的である。本発明に対する動物被検体は、ペットとしてまたは商業目的
で育てられた、家庭動物及び家畜の両者に適応可能である。例は、イヌ、ネコ、
ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ及びヤギである。
【００３２】 しかし、いかなる特定の理論により結合することを望む以外、本研究における
梗塞の大きさの減少は少なくともｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の、遺伝子発現の
ｐａｔｃｈｅｄ媒介制御及びｐａｔｃｈｅｄ遺伝子により媒介される他の生理学
的効果を中和する（直接または間接）能力の一部による可能性がある。細胞表層
タンパク質であるｐａｔｃｈｅｄ遺伝子産物は、神経細胞発達において関与する
様々な遺伝子の転写を制御するシグナル通過経路であると考えられている。ＣＮ
Ａ及び他の組織において、ｈｅｄｇｅｈｏｇの誘導はｐａｔｃｈｅｄによるこの
抑制を除去し（脱抑制する）、特定の遺伝子プログラムの発現を行う。
【００３３】 従って、本発明はｐａｔｃｈｅｄシグナルに対するｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク
質の効果を模倣することが可能である他の薬剤、例えば、下記に記載される薬剤
スクリーニング解析により単離されたような薬剤、の使用を意図する。
【００３４】 ＩＩ、定義 便宜上、本明細書において採用したある単語、例、及び付記される請求項をこ
こに集めた。
【００３５】 ”ｈｅｄｇｅｈｏｇ治療剤”という単語は、様々な形態のｈｅｄｇｅｈｏｇポ
リペプチド及び神経細胞に対し神経守護的であり、特にドーパミン作動性及びＧ
ＡＢＡ作動性ニューロンの生存を増強するペプチド模倣物を言及する。これらに
は天然に発生するｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の形態及び、分子生物学技術、化
学合成等により生産される修飾または変異形態を含む。望まれる態様においてｈ
ｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドは脊椎動物相同物由来である一方、文献において報
告される種交差活性は無脊椎動物由来のｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの使用も
同様に支持する。天然及び非天然に発生するｈｅｄｇｅｈｏｇ治療剤は、本明細
書において神経守護剤として、模倣するまたは天然に発生するｈｅｄｇｅｈｏｇ
タンパク質の効果を可能にする（集団的には”苦しめる”）、”アゴニスト”と
して言及される。加えて、”ｈｅｄｇｅｈｏｇ治療剤”という単語は遺伝子内の
ｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子の発現を活性化することが可能である分子を含む。この
単語は、インビボにおいてｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの発現を起こす遺伝子
治療構築物、例えば組換えｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドをコードする発現構築
物及び、相同性組換えにより遺伝子内ｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子の制御配列を変え
るトランス活性化構築物、も含む。
【００３６】 特に、”ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチド”という単語はｈｅｄｇｅｈｏｇタン
パク質及びそのペプチド断片を含む。
【００３７】 本明細書中で使用されている”生理活性断片”という単語は、ｈｅｄｇｅｈｏ
ｇタンパク質の一部を指すとともに、全長ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の一断片
を指し、野生型ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質を介した神経保護を特異的に妨げる
。ｈｅｄｇｅｈｏｇ生理活性断片は、ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の可溶性細胞
外部分であることが好ましく、可溶性とは生理学的に融和性の溶液を指す。具体
例としての生理活性断片は、ＰＣＴ刊行物ＷＯ９５／１８８５６とＷＯ９６／１
７９２４で述べられている。
【００３８】 ”ｐｔｃ治療剤”は、自然に起きているｐａｔｃｈｅｄシグナル伝達における
ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の効果を模倣する薬剤を指す。ｐｔｃ治療剤は、た
とえばペプチド、核酸、炭水化物、小有機分子、または自然産物抽出物（あるい
はその画分）で成しうる。
【００３９】 本方法によって処置される”患者”または”対象”は、人を含め哺乳類である
。
【００４０】 例えばｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤の本処置方法についての”効果量
”は、本治療方法に関して、望ましい投与量管理の一環として適用したとき、そ
の処置のための、またはある種の障害を防ぐための医療的に許容し得る標準に基
づき、神経細胞集団の生存増加をもたらす調製物での治療の量を指す。
【００４１】 ”変性を防ぐ”とは、（例えばアポトーシスによって）細胞の損失を減らすこ
と、またはドーパミン作動性神経の場合のドーパミンの放出のような細胞機能に
障害が出るの減ずることを意味する。
【００４２】 ｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤おける”栄養因子”とは、たとえばドー
パミンまたはＧＡＢＡ作動性神経などのｈｅｄｇｅｈｏｇ応答細胞の機能または
生存に、直接あるいは間接的に影響を与える分子である。
【００４３】 ｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤おけるの”栄養量”は、例えばドーパミ
ンまたはＧＡＢＡ作動性神経などのｈｅｄｇｅｈｏｇ応答細胞の機能的ふるまい
、または生存率の増加をもたらすのにその状況下で十分な量である。
【００４４】 ”相同性”および”同一性”の各々は、二つのポリペプチド配列間での配列類
似性を指し、同一性はより厳密な比較である。相同性と同一性は各々、比較の目
的で並列してよい各々の配列部位の比較によって決定してよい。比較配列部分が
同じアミノ酸残基によって占められているとき、その部位でポリペプチドは同一
であると言ってよい。等価な部位が同じアミノ酸で占められる（例えば同一な）
とき、または類似の（例えば電化および／または立体的配置の性質が類似な）ア
ミノ酸で占められるとき、その分子はその部位において相同であると言ってよい
。 配列間の相同性あるいは同一性の割合はその配列によって共用される一致あるい
は相同な部位の数の関数である。”無関連の”または”非相同的な”配列は同一
性が４０％以下であるが、本発明のＡＲ配列の同一性が２５％以下であることが
望ましい。
【００４５】 ”一致する”という語は、あるポリペプチドあるいは核酸配列について言うと
き関心のある配列が、一致すると言われている関連配列と同一あるいは相同であ
ることを示す。
【００４６】 ”組換えタンパク質”、”異形タンパク質”、および”外来性タンパク質”と
いう語は本明細書を通して互換可能で使用されており、一般的に、異形タンパク
質を生産するために宿主細胞を形質転換することに順番に用いられる好適な発現
コンストラクト中へポリペプチドをコードするＤＮＡが挿入された、組換えＤＮ
Ａ技術によって生産されたポリペプチドを指す。
【００４７】 ”キメラタンパク質”または”融合タンパク質”は、ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペ
プチドをコードする最初のアミノ酸配列と、ｈｈタンパク質のどのドメインとも
実質的に相同でなく、および外来性であるドメインを決める二番目のアミノ酸配
列の融合である。キメラタンパク質は、異なる生物種によって発現されるタンパ
ク構造の”種間””遺伝子間”などの融合でよく、または最初のタンパク質も発
現する生物で（たとえ他のタンパク質中であっても）見られる外来ドメインを提
示してよい。一般的に、融合タンパク質は、ｈｈがｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質
の一部または全てを提示する、一般形式（Ｘ）ｎ−（ｈｈ）ｍ−（Ｙ）ｎによっ
て提示されてよい。ＸおよびＹ各々は独立に、ｈｅｄｇｅｈｏｇ配列 とつなが ったポリペプチド鎖として自然界で見つからないアミノ酸配列を示し、ｍは１ま
たは１より大きい整数であり、および各々出現するｎは独立に０または１または
１より大きい整数である（ｎおよびｍは５または１０より大きくないことが望ま
しい。） 本明細書中で使用される”ベクター”という語は、それとつながっている別の
核酸を運搬することのできる核酸分子を指す。”発現ベクター”という語は、例
えばそのベクターで運ばれるおのおのの組換え遺伝子によってコードされる対象
ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドを、合成することができるプラスミド、コスミド
、またはファージを含む。好ましいベクターは自己複製およびそれとつながった
核酸を発現することのできるものである。本明細書中で、”プラスミド”および
”ベクター”は、プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの型であるもの
として、互換可能で用いられている。さらに本発明は、実質的にこの点に関して
当該技術分野において知られるようになり、および等しい機能を持つような発現
ベクターのたの型を含むことを意図している。
【００４８】 ”転写制御配列”は操作可能に連結されたタンパク質をコードする配列（また
はアンチセンス）の転写を誘導あるいは制御する、開始シグナル、エンハンサー
、およびプロモーターのようなＤＮＡ配列、またポリアデニル化部位も指し、本
明細書を通じて使用される遺伝学的単語である。好ましい態様では、組換え遺伝
子の転写は、発現が意図されるタイプの細胞のなかで、組換え遺伝子の発現を制
御するプロモーター配列（または他の転写制御配列）の制御下にある。同様に理
解されることは、組換え遺伝子は、自然発生する型の制御タンパク質の転写を制
御する配列と同じあるいは異なる転写制御配列の制御下にあってよい。
【００４９】 ”操作可能な連結”という語は、転写可能な配列からの転写率を制御してよい
転写制御因子のような、他の転写可能な核酸配列に関係した転写制御因子の組み
合わせを指す。
【００５０】 ＩＩＩ．方法と組成物の例示的な適用 本発明の一面は、例えば屈性量のｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤と細胞
を接触させることによるｈｅｄｇｅｈｏｇ反応性の神経細胞の生存促進などの、
分化状態の維持方法と関係する。例えば、分化した神経細胞の維持におけるタン
パク質の屈性効果と思われる本発見の観点から、本方法はインビトロ、インビボ
の両方で、異なる神経組織の維持に使用してよい。屈性薬剤がｈｅｄｇｅｈｏｇ
タンパク質である場所で、精製タンパク質として培養細胞または動物に提供され
てよく、または、自然に一つまたはそれ以上のｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質を生
産する組換え体の細胞または細胞群または外殖組織によって分泌されてよい。例
えば、胚からの外殖神経管、特にフロープレート組織は、分化の維持に適切なも
のとして患者に移植してよいかまたはさもなくば提供してよい、Ｓｈｈポリペプ
チド源を提供してよい。
【００５１】 本方法は細胞培養技術に適用し得る。 インビトロの神経培養系は、神経成長 因子（ＮＧＦ）、繊毛栄養因子（ＣＮＴＦ）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮ
Ｆ）のような神経栄養因子の同定だけでなく、神経発達についての研究の基礎的
および欠くことのできない手段であると確証されている。ひとたび神経細胞が最
終分化を遂げると、典型的には他の最終分化細胞型に変化しないだろう。しかし
ながら、神経細胞はそれにもかかわらずたやすく分化状態を失い得る。このこと
は、成体組織からの細胞を培養中で生育させるとき、および再生の間に芽体を形
成するときに一般的に観察される。本方法は、ドーパミンおよびＧＡＢＡ細胞の
分化状態の維持のために適切に制限された環境を保証するための手段を提供し、
および例えば他の栄養因子の特異的活性を検証するために設計された細胞培養中
で使用してよい。
【００５２】 本方法のそのような態様において、ドーパミンおよび／またはＧＡＢＡ細胞を
含む分化した細胞の培養物は、分化の損失を防ぐことによって最終分化神経細胞
の培養物の完全性を維持するためにｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤と接触
させてよい。培養中でのｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤源は、例えば細胞
培養倍体へ直接添加した、または代わりに、そのタンパク質とともに投与され、
および様々な神経細胞の成長を支持する重合体装置から支持および／または放出
された、精製または未精製組成物に由来してよい。栄養ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペ
プチド源は例えば、神経細胞とともに培養される細胞であってもよい。代わりに
、供給源は組換えｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質を生産するよう設計された神経細
胞そのものであってよい。そのような神経培養は治療処置のための移植可能な細
胞源としてだけでなく、便利な定量系として用いてよい。
【００５３】 本方法は、例えば原または幹細胞などの神経前駆体の分化を誘導する薬剤と共
に、ドーパミンまたはＧＡＢＡ作動性神経へと用いてよい。
【００５４】 細胞は、いかなる動物の胚、出生後、若年または成体神経組織から得てもよい
。 いかなる動物とは、神経組織を持つ多細胞動物を意味する。より特異的には、魚
類、は虫類、鳥類、両生類または哺乳類などを意味する。最も望ましい供与体は
、特にヒトおよびヒト以外の霊長類である豚、牛、および齧歯動物が望ましい。
【００５５】 大脳内神経移植は、ＣＮＳ治療の付加的可能性として、最近行われている。例
えば、損傷を受けた脳を修復する一試みは、動物の胎児または新生児から得た細
胞の成体脳への移植を含む（Ｄｕｎｎｅｔｔ（１９８７）Ｊ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ
１２３：２６５ー２８９；ａｎｄ Ｆｒｅｕｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９８５）
Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ５：６０３−６１６）。様々な脳領域からの胎児脳は、
成体脳へ着実に導入することができ、およびそのような移植は行動障害を解消し
てよい。例えば、大脳基底核へのドーパミン投射障害によって引き起こされる運
動障害は、胚性ドーパミン作動性神経の移植により防いでよい。新皮質の損傷後
障害を受ける複雑な認知機能も、胚の大脳細胞の移植によって部分的に修復され
る。ドーパミン作動性神経の前駆体を含む胚の脳細胞の移植は、パーキンソン病
の治療として成功であると考察されている。この病気の動物モデルおよび患者に
おいて、胚脳細胞の移植は、運動異常の減少という結果になっている。そればか
りか、移植した胚ドーパミン作動性神経は周囲の宿主神経とシナプスを形成する
と見られる。しかしながら、当該技術分野において胚脳細胞の移植は、例えば移
植神経前駆体の生存時間およびそれから生じる分化神経の限界のため、限界があ
る。本発明は、移植片中のドーパミンおよび／またはＧＡＢＡ作動性神経細胞の
生存増進によってそのような移植片の有用性を拡大するための手段を提供する。
【００５６】 パーキンソン病の特殊な場合では、ｈｅｄｇｅｈｏｇの活性増加による干渉は
、異常なまたは内因性の手段によって、胚および成体のドーパミン作動性神経の
生存をインビボで増進してよく、およびそれゆえにこの疾患のより効果的な治療
を提供してよい。ある種の疾患の治療のために移植される細胞は、移植片中でｈ
ｅｄｇｅｈｏｇの発現を増加するためにインビトロで遺伝的に修飾してよい。本
発明の典型的な態様において、Ｓｈｈポリペプチドの投与は、パーキンソン病の
治療において外科的な組織移植と共に用いてよい。
【００５７】 異種由来の供与動物の場合、その動物は安楽死されてよく、および脳および特
に関心のある領域は無菌操作によって切除されてよい。特に関心のある脳の領域
は、ドーパミンまたはＧＡＢＡ作動性神経細胞を分化の上で提供する、それから
前駆細胞を獲得可能ないかなる領域をも含む。これらの領域は、パーキンソン病
患者において減退が認められる黒質緊密部を含む中枢神経系（ＣＮＳ）の領域を
含む。
【００５８】 ヒトの異種神経前駆細胞は、随意選択的な中絶から得られた胎児組織、または
出生後、若年または成体組織供与者由来でよい。自家移植神経組織は、生検、ま
たはてんかん手術の間のように神経組織が切除される神経手術を受けた患者から
得てよい。
【００５９】 細胞は、接着する組織の細胞外マトリックスから独立の細胞の分離によって供
与体の組織から得てよい。分離は、トリプシン、コラゲナーゼなどのような酵素
で処理、または鈍器によるような物理的手法での分離を含め、既知のいかなる手
段を用いて得てよい。胎児細胞の分離は組織培養媒体中で行われる一方、若年お
よび成体細胞の分離に好適な媒体は人工大脳脊髄液（ａＣＳＦ）である。通常の
ａＣＳＦは、１２４ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．３ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，２ｍＭ ＣａＣｌ2，２６ｍＭ ＮａＨＣＯ3，および１０ｍＭ Ｄ−ｇｌｕｃ
ｏｓｅを含む。低Ｃａ2+ ａＣＳＦはＭｇＣｌ2を３．２ｍＭ濃度で、およびＣ ａＣｌ2を０．１ｍＭ濃度であることを除き、同じ成分からなる。
【００６０】 分離された細胞は、グルタミンおよび他のアミノ酸、ビタミン、ミネラルおよ
びトランスフェリン等のような有用なタンパク質のような細胞の代謝に要求され
る補助物質を含有する、ＭＥＭ，ＤＭＥＭ，ＲＰＭＩ，Ｆ−１２などを含めた細
胞増殖を支持し得るいかなる既知の培養媒体中へ置いてよい。媒体はまた、ペニ
シリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン等のように、酵母、バクテリアお
よび菌類の汚染を防ぐ抗生物質を含む。ある種の場合、媒体は、ウシ亜科、ウマ
科、鶏などの血清を含んでよい。細胞に特に好適な媒体は、ＤＭＥＭとＦ−１２
の混合物である。
【００６１】 培養条件は、生理的条件に近くすべきである。培養媒体のｐＨは、生理的ｐＨ
に近くすべきで、ｐＨ６−８が好適であり、ｐＨ７がより好適であり、さらにｐ
Ｈ７．４がより好適である。細胞は、生理的音頭に誓い温度で培養されるべきで
あり、３０℃−４０℃の間が好適であり、３２℃−３８℃の間がより好適であり
、および最も好適なのは３５℃−３７℃の間である。
【００６２】 細胞は固形の基質上または溶液中で生育させてよいが、しかし前駆体の増殖は
、”神経球”の形成によって多数の細胞数を生産する溶液中で行うのが好ましい
。（例えばＲｅｙｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５
：１０７０−１７０９；およびＰＣＴ刊行物 ＷＯ９３／０１２７５，ＷＯ９４
／０９１１９，ＷＯ９４／１０２９２，およびＷＯ９４／１６７１８を参照）細
胞溶液を増殖（あるいは分裂）させる場合、フラスコはよく振とうし、および神
経球がフラスコの底の角に位置するようにする。神経球は次ぎに５０ｍｌ遠心管
へ移し、低速度で遠心する。媒体は吸引され、細胞は成長因子とともに少量の媒
体で再懸濁し、および細胞は機械的に分離および別途の等分量の媒体に再懸濁す
る。
【００６３】 基質無しでは、細胞はフラスコの底を離れ、溶液中で未分化細胞の中空の球を
形成しながら増殖を続ける。およそインビボで３−１０日後、増殖集団（神経球
）は２−７日毎に栄養添加され、および特に、２−４日毎に緩やかな遠心および
成長因子を含む培養液中に再懸濁する。
【００６４】 インビボで６−７日後、神経球中の個々の細胞は、鈍器で物理的に神経球の分
離をすることによって、特にピペットで神経球を突き砕くことによって分けてよ
い。分離した神経球からの一つの細胞は、成長因子を含む培養媒体中で再懸濁し
、および細胞の分化は、例えば本発明のｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤の
ような分化を持続させ得る因子の存在下に細胞を置く（あるいは再懸濁する）こ
とによって誘導してよい。
【００６５】 本発明において有用な幹細胞は一般的に知られている。例えば、いくつかの神
経稜細胞は同定されており、その一部は多分化能であり、中立の神経稜細胞を代
表する。そのような幹細胞の培養のために本方法に適用されているｈｅｄｇｅｈ
ｏｇタンパク質の役割は、約束された前駆細胞の分化、および／またはドーパミ
ンまたはＧＡＢＡ作動性神経細胞の最終分化を維持することである。タンパク質
は単独で用いてよく、または神経前駆細胞の特異的な分化運命を特により増進す
る他の神経栄養因子と組み合わせて用いてよい。
【００６６】 機能的ｈｅｄｇｅｈｏｇ活性の存在下で培養された細胞の移植、および上述の
他のインビトロでの使用に加え、本発明のなお他の面は、ドーパミンまたはＧＡ
ＢＡ作動性神経細胞のインビボでの生存を増進する、ｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐ
ｔｃ治療剤の治療的適用である。ドーパミンまたはＧＡＢＡ作動性神経細胞の分
化を維持するｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の能力は、あるｈｅｄｇｅｈｏｇタン
パク質が成体組織のこれらの神経細胞型の制御を、維持、機能的ふるまい、老化
およびある病的条件における分化の欠如に起因する減退および未成熟死を妨げる
点に関して促進していると正当に期待されることを示す。この解釈の観点におい
て、本発明は（１）ドーパミン細胞の損失、（２）ＧＡＢＡ作動性神経細胞の損
失、および／または（３）黒質神経の損失から引き起こされる神経条件の（過酷
さを防ぐおよび／または減少する）処置のために本方法を適用することを特に企
図する。この点について、本方法は、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、ア
ミロトロフィック側硬化症などを含む神経系の慢性神経変性疾患の治療において
有用である。
【００６７】 多くの神経障害は、神経単位の不連続な集団の減衰を伴い、本発明に基づくｈ
ｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤を含む治療的摂生を施してよい。不随の例で
述べられているように、ｈｅｄｇｅｈｏｇは、黒質ドーパミン作動性神経におい
て栄養的および生存促進活性を発揮する。インビボにおいて外来ｈｅｄｇｅｈｏ
ｇまたは本発明の他の組成物による処置は、黒質神経のドーパミン作動性神経的
表現型を刺激し、軸索切断またはドーパミン作動性神経毒によって引き起こされ
る機能折損を修復すると期待され、および、ドーパミン作動性神経の損失によっ
て特徴づけられる神経変性疾患であるパーキンソン病の治療に使用されてよい。
それゆえ一つの態様において本方法は、動物のドーパミン作動性神経の生存率を
増加するために効果的なｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤の量で、パーキン
ソン病の影響を受けた、またはパーキンソン病に発展する危険性のある動物を処
置することを含む。好ましい態様では、この方法は、ＭＰＴＰが５ｍｇ／ｋｇよ
り好ましくは２ｍｇ／ｋｇ，５ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ，２０ｍｇ／ｋｇま
たは５０ｍｇ／ｋｇ、およびさらに好ましくは１００ｍｇ／ｋｇの量で処置され
たときＭＰＴＰを介した毒性からさもなくば黒質を保護する効果のある量のｈｅ
ｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤で動物を処置することを含む。
【００６８】 ハンチントン病は峡間および皮質コリン作動性神経およびＧＡＢＡ作動性神経
の変性を含む。そのような変性条件に苦しむ患者の治療は、例えばＧＡＢＡ作動
性神経の損失を起こすアポトーシスを制御するために（例えば存在する神経の生
存を増進するために）本発明のｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤の適用を含
んでよい。
【００６９】 最近、あるＡＬＳ患者とモデル動物において、脊髄運動神経の損失に加えて中
脳ドーパミン作動性神経の著しい損失が起きていると報告された。例えば、文献
は、家族性アミノトロフィック側硬化症の患者の黒質の変性を述べている。Ｋｏ
ｓｔｉｃ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ｌ４１：４９７−
５０４．本発明に記載の栄養量のｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤は、ＡＬ
Ｓ を患っている、または悪化の危険性のある動物に適用してよい。
【００７０】 一般的に、本発明の治療方法は、ドーパミン作動性および／またはＧＡＢＡ作
動性神経細胞の生存を促進する効果のあるｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤
の量で動物を処置する段階を含むものとして特徴づけてよい。適用形式およびの
量の摂生は、治療される変性障害の深刻さによって多様であり、例えば量は予防
と治療とでは異なってよい。好ましい態様では、ｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ
治療剤は、長期治療のための手段として最初に全身的に、後に局所的に処置する
。ある態様では、ｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤源は変性領域の内または
近辺で定位固定して提供する。
【００７１】 本方法は神経に有害な結果となる手術を処置または防ぐことに特に有用である
ことも分かる。例えば、ある脳手術は本方法を適用してよい神経集団の変性をも
たらす。
【００７２】 他の態様では、本方法は、ＭＰＴＰ化合物（１−メチル−４−フェニル−１，
２，３，６−テトラヒドロピリジン）のようなある薬剤の使用から引き起こされ
る神経変性条件を防ぐあるいは治療するために使用してよい。
【００７３】 さらに他の態様では、本方法は、例えば神経保護剤として低酸素症の防止およ
び／または治療に用いてよい。例えば、本方法は、高山性低酸素症によって引き
起こされる神経細胞死を減少するために予防的に使用してよい。
【００７４】 ”神経保護の”方法は、ドーパミン作動性およびＧＡＢＡ作動性細胞の場合、
ｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤での治療無しで起きる表現型と関連した細
胞損失の減少をもたらす。
【００７５】 さらなるほかの態様では、本方法は、成長および／または栄養因子の処理と連
合して実行してよい。例えば、その組み合わせた治療は、神経成長因子、繊毛神
経栄養成長因子、シュワノーマ由来成長因子、グリア成長因子、スチアタル由来
神経栄養因子、血小板由来成長因子および拡散因子（ＨＧＦ−ＳＦ）のような栄
養因子を含んでよい。抗分裂促進剤も、例えばシトシン、アラビノシド、５ーフ
ルオロウラシル、ヒドロキシウレア、およびメトトレキセートとして用いてよい
。
【００７６】 ｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤の、例えば十分に神経保護する、治療に
有効な量および予防的効果のある量の決定は、類似の環境下で得られた結果を観
察することによって、および既知の技術を用いることによって、当該技術分野に
おいて熟練した者である医者または獣医（”医師として在籍する臨床研究者”）
によって予め成されてよい。投与量は、関与する医師の判断における患者の要求
、治療される状態の深刻さ、ＣＮＳへの更なる変性の危険、および導入される特
種な薬剤に依存して多様であってよい。治療に有効な栄養量または投与量、およ
び予防における効果量または投与量の決定において、多数の要素が、：変性状態
の特異的原因およびその治癒または悪化の可能性；特種な薬剤の薬力学性質およ
びその適用の仕様および道程；治療の時間経過の混乱；哺乳類の種；その体格、
年齢、および全般的健康状態；個々の患者の応答；処置された特殊な化合物；処
置された調製物の生物学的利用能の性質；選択された投与量の摂生；並行治療の
種類（例えば、共処置された治療とｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤との相
互作用）および他の関連する環境を含めて、これらに限ることなく、関与する医
師によって考察される。
【００７７】 治療は薬剤の最適投与量より少ない、少量で始めてよい。その後、投与量はそ
の環境下で最適な効果に達するまで小増加率で増加すべきである。便利にするた
めに、日の投与合計量は、もし望まれるならば一日の間に一部を分割して処置し
てよい。ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの治療に有用な栄養量および予防に有用
な神経保護量は、例えばおよそ、一日当たり、体重１キログラム当たり、０．１
ｎグラム（ｎｇ／ｋｇ／ｄａｙ）からおよそ１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙまで多様
であると予想される。
【００７８】 以下で述べられるようなｈｅｄｇｅｈｏｇおよびｐｔｃ治療剤の可能性は、い
かなる多数のよく知られる動物疾患モデルによって検証してよい。例えば、パー
キンソン病の場合、選択された薬剤はＭＰＴＰで処置された動物において評価し
てよい。ＭＰＴＰ化合物（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラ
ヒドロピリジン）およびその代謝物であるＭＰＰ+は実験的パーキンソン症状を 誘導するのに用いられた。ＭＰＰ+は、進行したパーキンソン症状の合理的モデ ルを作り、黒質のドーパミン作動性神経を冒す。Ｔｕｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，
（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３４９：４１４ 例えば犬、げつ歯類などの動物でドーパミン作動性およびＧＡＢＡ作動性神経
などの変性の防御または治療に効果があるとされる化合物は、ヒトの変性の治療
においても有用である。ヒトにおけるそのような変性の当該分野における治療に
熟練した者は、ヒトに対して化合物の正しい投与量および処置の道程を、動物研
究で得られたデータから導くだろう。一般的に、ヒトにおける投与量および処置
の道程の決定は、動物における処置の決定に使用されたのと同様であると期待さ
れる。
【００７９】 ドーパミン作動性および／またはＧＡＢＡ作動性神経の変性によって特徴づけ
られる障害の予防処置が必要な患者の識別は、当該技術分野において熟練した者
の能力と知識の十分範囲内である。危険な状態にある患者および本方法によって
治療してよい患者の識別のための方法の確実性は、ある疾患状態の進展の家族史
、およびその患者の疾患状態の進展に伴う危険因子の存在のように、医療におい
て高く評価されている。当該技術分野において熟練した医師は、例えば臨床試験
、理学実験および医療／家族史などを用いることによって、そのような患者の候
補を予め識別してよい。
【００８０】 ＩＶ．ｈｅｄｇｅｈｏｇ治療化合物の例 主題となる方法のｈｅｄｇｅｈｏｇ治療組成物は天然に存在するタンパク質、
組換えによって作成されたタンパク質、および合成化学の精製を含む様々な技術
のいずれによっても作成されえる。ｈｅｄｇｅｈｏｇ治療剤のポリペプチド形態
は脊椎動物のｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質に由来する、すなわち、脊椎動物由来
の天然に存在するｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質またはその断片に対応する配列を
持つことが望ましい。しかしながら、ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドは、任意の
後生生物中に存在するｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質（またはその断片）に対応し
えることが許容されえる。
【００８１】 主題の治療剤が由来しえる、天然に存在する様々なｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク
質は、シグナルペプチド、高度に保存されたN−末端領域、およびより多様なＣ −末端ドメインにより特徴づけれられる。ｈｅｄｇｅｈｏｇ前駆体タンパク質は
、分泌経路中でのシグナル配列の解裂（Ｌｅｅ，Ｊ．ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９
２）Ｃｅｌｌ７１：３３−５０；Ｔａｂａｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）
Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２６３５−２６４５；Ｃｈａｎｇ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．
（１９９４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０：３３３９−３３５３）に加えて
、通常、Ｃ−末端部分における保存された配列に依存する内部自己タンパク質分
解性解裂を受ける（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６
：１５２８−１５３７；Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７４：３６３−３６６）。この自己解裂は、１９ＫＤのＮ−末端ペプチドお
よび２６−２８ ｋＤのＣ−末端ペプチドをもたらす（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（
１９９２） ｓｕｐｒａ；Ｔａｂａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ｓｕｐｒａ
；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ｓｕｐｒａ；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（
１９９４）ｓｕｐｒａ；Ｂｕｍｃｒｏｏｔ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５
）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １５：２２９４−２３０３；Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ｓｕｐｒａ；Ｅｋｋｅｒ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１
９９５）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ． ５：９４４−９５５；Ｌａｉ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２１：２３４９−２３６０）。Ｃ
−末端ペプチドはｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で自由に拡散し
えるのに対し、Ｎ−末端ペプチドは、それが合成された細胞の表面に強く結合し
たままである（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ｓｕｐｒａ；Ｂｕｍｃｒｏｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ｓｕｐｒａ；Ｍａｒｔ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９９
５） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２１：２５３７−２５４７；Ｒｏｏｅｌｉｎｋ
．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｅｌｌ８１：４４５−４５５）。正確に通常
の内部解裂部位で終結するＲＮＡによりコードされた、短縮型のｈｅｄｇｅｈｏ
ｇは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ｓｕｐｒａ
）およびｉｎ ｖｉｖｏ（Ｐｏｒｔｅｒ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｃ
ｅｌｌ８６，２１−３４）において拡散性であるから、のＮ−末端ペプチドの細
胞表面での保持は自己解裂に依存する。ｈｅｄｇｅｈｏｇ前駆体タンパク質の自
己タンパク質分解性解裂は、続いて求核置換において解裂される、内部のチオエ
ステル中間生成物を介して進行することが、生化学的研究によって示された。求
核試薬は、Ｎ−ペプチドのＣ−末端に共有結合して（Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ
．（１９９６）ｓｕｐｒａ）これを細胞表面につなぎとめる小さな親脂質性分子
、とくにはコレステロールであることが、示唆される。
【００８２】 脊椎動物のｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子ファミリーは少なくとも四つのメンバー、
すなわち単一のショウジョウバエｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １
９）遺伝子のパラログを含む。本明細書においてＤｅｓｅｒｔ ｈｅｄｇｅｈｏ
ｇ（Ｄｈｈ）、Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ）、Ｉｎｄｉａｎ ｈｅ
ｄｇｅｈｏｇ（Ｉｈｈ）と呼ばれる、このメンバーうちの３つは、魚、鳥、およ
び哺乳類を含む全ての脊椎動物中に明らかに存在している。本明細書においてｔ
ｉｇｇｉｅ−ｗｉｎｋｌｅ ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｔｈｈ）と呼ばれる４つ目のメ
ンバーは魚に特異的であるように見える。付録の配列リストによれば（表１も見
よ）ニワトリＳｈｈポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１によりコードされ、
マウスＤｈｈポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２によりコードされ、マウス
ＩｈｈポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３によりコードされ、マウスＳｈｈ
ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４によりコードされ、ゼブラフィッシュＳ
ｈｈポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５によりコードされ、ヒトＳｈｈポリ
ペプチドはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６によりコードされ、ヒトＩｈｈポリペプチド
はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７によりコードされ、ヒトＤｈｈポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８によりコードされ、ゼブラフィッシュＴｈｈはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９によりコードされる。
【００８３】
【表１】 表１ 配列リストにおけるｈｅｄｇｅｈｏｇ配列の案内 ヌクレオチド アミノ酸 ニワトリＳｈｈ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０ マウスＤｈｈ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１ マウス ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２ マウス ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３ ゼブラフィッシュ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４ ヒト ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５ ヒト ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６ ヒト ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７ ゼブラフィッシュ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８ ショウジョウバエ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１９ ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０ 様々なｈｅｄｇｅｈｏｇホモログ間の配列の多様性に加えて、ｈｅｄｇｅｈｏ
ｇタンパク質は前駆型、全長成熟型、およびいくつかの、その切断された断片を
含む数多くの子となる形で天然に存在することが明らかである。前駆型は、細胞
外ドメインの指向性の分泌のためのＮ−末端シグナルペプチドを含むが、全長成
熟型はこのシグナル配列を欠いている。
【００８４】 上記のように、いくつかの場合、成熟型のさらなる切断が起き、このタンパク
質の生物学的に活性のある断片がえられる。例えば、ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈ
ｏｇは付加的なタンパク質分解性の切断を受け、約１９ｋＤａおよび２７ｋＤａ
の二つのペプチドがえられる。この１９ｋＤａ断片は成熟タンパク質のタンパク
質分解性Ｎ−末端部位に対応する。細菌により生産された（糖鎖付加されていな
い／コレステロール付加されていない）型のタンパク質が天然タンパク質の生物
学的活性のいくらかを保持し続けるが、脊椎動物ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質は
また、タンパク質分解性の断片化に加えて、糖鎖付加および／またはステロール
（例えばコレステロール）付加などの翻訳後の修飾をも受けえる。本発明のｈｅ
ｄｇｅｈｏｇポリペプチドの生物学的活性のある断片は例えばＰＣＴ出版ＷＯ９
５／１８８５６およびＷＯ９６／１７９２４において作成され、詳細に記載され
ていた。
【００８５】 さらに、例えば治療または予防の効率または安定性（例えばｅｘ ｖｉｖｏで
の貯蔵寿命およびｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質分解性分解に対する耐性）を増
幅する目的で、修飾されたｈｈポリペプチドを作製するために突然変異の導入が
用いられ得る。そのような修飾されたペプチドはたとえばアミノ酸置換、欠失、
または付加により作製され得る。修飾されたｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドはま
た天然に存在するｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質と比べて変更された翻訳後修飾、
例えば変更された糖鎖付加、コレステロール付加、プレニル化、およびその類似
物を受けた物をも含み得る。
【００８６】 一つの態様においては、ｈｅｄｇｅｈｏｇ治療剤は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１
−９または１９のうちの一つまたはそれ以上において表されたｈｅｄｇｅｈｏｇ
をコードする配列に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌク
レオチド配列にコードされ得るポリペプチドである。例えば約４５℃で６．０ｘ
塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）の後に、５０℃で２．０ｘＳＳ
Ｃでの洗浄を行うというような適切なストリンジェンシーの条件は、当該技術分
野の技術を有する者には知られているか、または、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見られ得る
。例えば、洗浄の段階での塩濃度は約２．０ｘＳＳＣで５０℃の低いストリンジ
ェンシーから、０．２ｘＳＳＣで５０℃の高いストリンジェンシーまで選択され
得る。加えて、洗浄の段階における温度は室温約２２℃の低いストリンジェンシ
ーの条件から約６５℃の高いストリンジェンシーの条件まで増大され得る。
【００８７】 文献に記載されたように、例えば他の動物に由来する、その他のｈｅｄｇｅｈ
ｏｇタンパク質に対する遺伝子が、当該技術分野において良く知られた技術によ
り、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ試料から得られえる。例えば、ｈｅｄｇｅｈｏ
ｇタンパク質をコードするｃＤＮＡは、例えば哺乳類細胞、またはヒト細胞のよ
うな、胚性細胞を含む細胞から全mＲＮＡを単離することにより、得られえる。 そして、全mＲＮＡから二本鎖cＤＮＡが調製され、続いて、数多くの既知の技術
のいずれかを用いて、適切なプラスミドまたはバクテリオファージベクターに挿
入されえる。ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質をコードする遺伝子はまた、確立した
ポリメラーゼ連鎖反応技術を用いてクローニングされえる。
【００８８】 望ましい核酸は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８から１４からなる集団より選択され
たアミノ酸配列に対して少なくとも６０％相同、より望ましくは７０％相同、最
も望ましくは８０％相同なアミノ酸配列を含むｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドを
コードする。ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０から１８または２０のうちの一つに表わ
されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、より望ましくは少なくとも約
９５％、および最も望ましくは少なくとも約９８から９９％の相同性をもつポリ
ペプチドをコードする核酸もまた、本発明の視野に含まれる。
【００８９】 本発明により望まれるｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドは天然型のｈｅｄｇｅｈ
ｏｇタンパク質に加えて、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０から１８または２０のいず
れかに表わされるアミノ酸配列に少なくとも６０％の相同性、より望ましくは７
０％の相同性、および最も望ましくは８０％の相同性を示すものである。ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．１０から１８または２０からなる集団より選択された配列に、少
なくとも９０％、より望ましくは少なくとも９５％、および最も望ましくは少な
くとも９８から９９％の相同性を示すポリペプチドもまた、本発明の視野に含ま
れる。唯一の必須条件は、ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドが、例えばドーパミン
作動性および／またはＧＡＢＡ作動性神経に対してトロフィックであるというよ
うに、神経細胞を損傷から防護することができることである。
【００９０】 ”組換えタンパク質”という語は、組換えＤＮＡ技術により作成された本発明
のポリペプチドを指し、そこでは一般的に、ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドをコ
ードするＤＮＡが適切な発現ベクターに挿入され、それが次に宿主細胞を刑質転
換してヘテロタンパク質を生産させるのに用いられる。さらに、組換えｈｅｄｇ
ｅｈｏｇ遺伝子に関する”由来する形”という句は、天然型のｈｅｄｇｅｈｏｇ
タンパク質のアミノ酸配列、または、天然に存在する形のタンパク質への、置換
および欠失（短縮を含む）を含む、突然変異により作成された、これに類似する
アミノ酸配列を含むことが意図される。
【００９１】 本発明の方法はまた、天然に存在するｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの派生形
、例えば突然変異による派生形を用いても行われえる。 当該技術分野において知られるように、ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドは標準的
な生物学的技術により作成されえる。例えば、主題のポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列の発現を指示する核酸ベクターにより形質転換された宿主細胞
が、ペプチドの発現が起こりえる適切な条件下で培養されえる。ポリペプチドｈ
ｅｄｇｅｈｏｇは分泌され得、細胞および組換えｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチド
を含む培地の混合物から、単離されえる。あるいは、組換えｈｅｄｇｅｈｏｇ遺
伝子からシグナルペプチド配列を除去することにより、ペプチドが細胞質に保持
され得、細胞が集められ、溶解されてタンパク質が単離されえる。細胞培養物は
宿主細胞、培地およびその他の副産物を含む。細胞培養の適切な培地は、当該技
術分野において良く知られている。組換えｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドは、細
胞培養培地、宿主細胞またはその両方から、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル
ろ過クロマトグラフィ、超ろ過、電気泳動、およびそのようなペプチドに特異的
な抗体を用いた免疫親和性精製を含む、タンパク質精製のための、当該技術分野
において知られた技術を用いて単離されえる。望ましい態様においては、組換え
ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドは、その精製を可能にするドメインを含む、ｈｅ
ｄｇｅｈｏｇ／ＧＳＴ融合タンパク質のような、融合タンパク質である。宿主細
胞は任意の原核または真核細胞でありえる。
【００９２】 組換えｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子は、ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質またはその一
部をコードする核酸を、原核細胞または真核細胞またはその両方における発現に
適したベクターに連結することにより作成されえる。主題のｈｅｄｇｅｈｏｇポ
リペプチドの組換え型の生産のための発現ベクターは、プラスミド、およびその
ほかのベクターを含む。例えば、ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの発現に適した
ベクターは、種々のプラスミドを含む、すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核細
胞における発現のための、ｐＢＲ３２２−由来のプラスミド、ｐＥＭＢＬ−由来
のプラスミド、ｐＥＸ−由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ−由来のプラスミド、お
よびｐＵＣ−由来のプラスミドである。
【００９３】 酵母における組換えタンパク質の発現のための、数々のベクターが存在してい
る。例えば、ＹＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２、ｐＹＥＳ２、お
よびＹＲＰ１７が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに遺伝的構築物を導入するのに有
用な、クローニングおよび発現用の媒体である（例えば、本明細書に参考文献と
して含まれる、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｉｏｎ，ｅｄ．Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐ．８３におけるＢｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８３）を見よ
）。これらのベクターは、ｐＢＲ３２２ ｏｒｉの存在により、Ｅ．ｃｏｌｉ中
で、酵母２ミクロンプラスミドの増殖決定因子のためにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅの中で複製しえる。描写的な態様においては、ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチド
は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１から９または１９に表わされるｈｅｄｇｅｈｏｇ遺
伝子のうちの一つをコードする配列をサブクローニングすることにより作成され
た発現ベクターを用いて、組換え技術により生産される。
【００９４】 望ましい哺乳動物の発現ベクターは、細菌中での増殖を可能にする原核配列お
よび、真核細胞中で発現する一つまたはそれ以上の真核転写単位の両方を含む。
ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐ
ｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ
、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ、およびｐＨｙｇに由来するベクターは真核細胞
中での形質転換に適した哺乳類発現ベクターの例である。これらのベクターのう
ちいくつかは、ｐＢＲ３２２のような細菌プラスミドからの配列により修飾され
て、真核および原核細胞の両方において複製および薬剤耐性を可能にされる。あ
るいは、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン−バーウィ
ルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ−由来のもの、およびｐ２０５）のようなウィルス
の 誘導体が真核細胞でのタンパク質の一時的な発現に用いられえる。プラスミドの
調製および、宿主生物の形質転換に用いられた様々な方法は、当該技術分野にお
いて良く知られている。原核および真核細胞の両方に対する適切なその他の発現
系および一般的な組換えの手順は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｈ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ： １９８９）１６および１７章を
見よ。
【００９５】 いくつかの例においてはバキュロウィルス発現系を用いて組換えｈｅｄｇｅｈ
ｏｇポリペプチドを発現することが望ましいことがありえる。そのようなバキュ
ロウィルス発現系の例は、（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４
１のような）ｐＶＬ−由来のベクター、（ｐＡｃＵＷ１のような）ｐＡｃＵＷ−
由来のベクター、および（ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩを含むβ−ｇａｌのような）
ｐＢｌｕｅＢａｃ−由来のベクターを含む。
【００９６】 シグナルペプチドを欠く短縮変異体である、Ｎ−末端部位を欠いた型のような
、ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の一部のみを発現することが望ましい場合、発現
されるべき望ましい配列を含むオリイゴヌクレオチド断片に開始コドン（ＡＴＧ
）が加えられることが必要でありえる。当該技術分野においては、Ｎ−末端部位
のメチオニンがメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）という酵素の使用によ
り酵素的に解裂されえることが良くしられている。ＭＡＰはＥ．ｃｏｌｉおよび
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍからクローニングされており（
Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔｅｔ ａｌ．（１９８７） ＰＮＡＳ ８４：２７１８−
１７２２）そのｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性は組換えタンパク質に対して示されて
いる（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８７） ＰＮＡＳ ８４：２７１８
−１７２２）。したがって、Ｎ−末端メチオニンの除去は、望まれるならば、Ｍ
ＡＰを生産する宿主中（例えばＥ．ｃｏｌｉまたはＣＭ８９またはＳ．ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）でのｈｅｄｇｅｈｏｇ誘導体ポリペプチドの発現によりｉｎ ｖ
ｉｖｏで、または精製されたＭＡＰの使用によりｉｎ ｖｉｔｒｏで（例えば、
Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａの方法による）。
【００９７】 あるいは、ポリペプチドをコードする配列は、異なるポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列を含む融合遺伝子の一部として含まれえる。融合タンパク質
もまたタンパク質の発現を可能にすることが広く受け入れられており、、したが
って、本発明のｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの発現に用いられえる。例えば、
ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドはグルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ−融合）
タンパク質として作成されえる。このようなGＧＳＴ−融合タンパク質は、例え ばグルタチオン誘導体基質の使用により、ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの容易
な精製を可能にしえる（例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（
Ｎ．Ｙ．：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９１）を見よ）。別の態
様においては、ポリ−Ｈｉｓ／エンテロキナーゼ解裂部位配列のような、精製誘
導配列が、天然にはｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の（例えば、Ｎｉ２＋金属樹脂
を用いた親和性クロマトグラフィによるポリ（Ｈｉｓ）−ｈｅｄｇｅｈｏｇタン
パク質の精製を可能にするために、その前駆型の）Ｎ−末端に存在するシグナル
配列の代わりに配置されるために用いられえる。精製誘導配列は続いてエンテロ
キナーゼ処理により除去されえる（例えばＨｏｃｈｕｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９
８７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ４１１；および１７７；Ｊａｎｋｎｅ
ｃｈｔ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ８８：８９７２を見よ）。
【００９８】 融合タンパク質を作成する技術は、当該技術分野における技術を有するものに
しられる。要するに、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の
連結は、連結のための平滑末端またはstagger末端化、適切な末端を提供するた めの制限酵素消化、適切なように粘着末端をフィルインすること、望ましくない
連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的な連結を用いる
、慣用的な技術にしたがって行われる。
【００９９】 別の態様においては、融合遺伝子は自動ＤＮＡ合成機を含む慣用的な技術によ
り合成されえる。あるいは、後にキメラ遺伝子配列を作成するために連結されえ
る、二つの連続した遺伝子間に相補的にかぶさる、アンカープライマーを用いて
遺伝子断片のＰＣＲ増幅が行われえる（例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅ
ｌ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２を見よ）。
【０１００】 ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドはまた、グリコシル基、コレステロール、イソ
プレノイド、脂質、リン酸、酢酸基およびその類似物のような他の化学的部位と
共有結合または凝集的結合を形成することにより化学的に修飾されてｈｅｄｇｅ
ｈｏｇ誘導体を作成しえる。ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の共有結合誘導体は、
タンパク質のアミノ酸側鎖上の機能基または、ポリペプチドのＮ−末端またはＣ
−末端に、化学的部位を連結することにより調製されえる。
【０１０１】 例えば、ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質は、タンパク質に通常関連する配列以外
に、細胞外基質成分に結合し、類似物の細胞表面への局在を増幅する部位を含む
ように作成されえる。例えば、Ｒ−Ｇ−Ｄ−Ｓ ４ペプチド配列の様な、フィブ
ロネクチン”ＩＩＩ型反復配列”に由来する配列（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９：３０−３；およびＫｏｒｎ
ｂｌｉｈｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９８５）ＥＭＢＯ ４：１７５５−９）が、
ＥＣＭ成分への結合を介してキメラ分子の細胞への結合を支持するために、ｈｅ
ｄｇｅｈｏｇポリペプチドに加えられえる（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ ｅｔ ａｌ．
（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：４９１−４９７；Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃ
ｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１７２９
４−８；Ｈｙｎｅｓ（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：５４９−５４；およびＨｙｎ
ｅｓ（１９９２）Ｃｅｌｌ ６９：１１−２５）。
【０１０２】 望ましい態様においては、その他の細胞タンパク質、特に通常ｈｅｄｇｅｈｏ
ｇポリペプチドに結合していえるようなその他の細胞外または細胞表面タンパク
質から単離または有意に遊離している。”他の細胞または細胞外タンパク質から
有意に遊離している”という語（本明細書において”混入タンパク質”とも呼ば
れる）または”有意に純粋、または生成された調製物”という語は、（乾燥重量
で）２０％以下の、混入タンパク質を、望ましくは５％以下の混入タンパク質を
含む調製物を指すものとして定義される。”精製”することにより、示された分
子が、その他のタンパク質のような他の生物学的巨大分子の有意な存在なしに、
存在することを意図される。本明細書において用いられる”精製された”という
語は、存在する同種の生物学的巨大分子の望ましくは乾燥重量で少なくとも８０
％、より望ましくは重量で９５から９９％の範囲で、および最も望ましくは少な
くとも重量で９９．８％を意味する（しかし、水、緩衝溶液、およびその他の小
分子、特に分子量５０００以下のものは存在しえる）。本明細書において用いら
れる”純粋な”という語は、上記の”精製された”と同一の数量的制限を有する
ことが望ましい。
【０１０３】 組換えポリペプチドについて上に記載されたように、単離されたｈｅｄｇｅｈ
ｏｇポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０から１８または２０み表わされた
アミノ酸配列、またはそれに相同な配列の全てまたは一部を含みえる。主題のｈ
ｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の望ましい断片は、成熟タンパク質のＮ−末端および
Ｃ−末端タンパク質分解断片に対応する。ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの生物
学的活性のある断片は、ＰＣＴ出版ＷＯ９５／１８８５６およびＷＯ９６／１７
９２４に詳細に記載される。
【０１０４】 ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの生物学的活性のある断片に対応する望ましい
ｈｅｄｇｅｈｏｇ治療剤は、ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの少なくとも５０ア
ミノ酸残基、より望ましくは少なくとも１００、およびさらにより望ましくは少
なくとも１５０を含む。
【０１０５】 ｈｅｄｇｅｈｏｇ治療剤に含まれえる別の望ましいｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプ
チドは、約１９ｋＤａの分子量をもつ、成熟タンパク質のＮ−末端断片である。
望ましいヒトｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５の２４
から１９７残基目、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６の２８から２０２残基目、および
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７の２３から１９８残基目におよそ対応するＮ−末端断
片を含む。” およそ対応する”により、問題の配列が参照される配列に比べて、最大２０ア
ミノ酸までの長さがことなる事を意味するが、最大５、１０、または１５アミノ
酸の長さまでであることがより望ましい。
【０１０６】 さらに他のｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドは化学式Ａ−Ｂに表わされるアミノ
酸配列を含む。そこでは、（ｉ）ＡはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２１の１から１６８
残基目のにより示されるアミノ酸配列の全体または一部を示し、ＢはＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．２１の１６９から２２１残基目に示されたアミノ酸配列の少なくとも
１アミノ酸残基を表わす；（ｉｉ）ＡはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５の２４から１
９３残基目によって表わされるアミノ酸の全てまたは一部を表わし、ＢはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５の１９４から２５０残基目により表わされるアミノ酸配列の
少なくとも１アミノ酸残基を表わす；（ｉｉｉ）ＡはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３
の２５から１９３残基目によって表わされるアミノ酸の全てまたは一部を表わし
、ＢはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３の１９４から２５０残基目により表わされるア
ミノ酸配列の少なくとも１アミノ酸残基を表わす；（ｉｖ）ＡはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１の２３から１９３残基目によって表わされるアミノ酸の全てまたは一
部を表わし、ＢはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１の１９４から２５０残基目により表
わされるアミノ酸配列の少なくとも１アミノ酸残基を表わす；（ｖ）ＡはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２の２８から１９７残基目によって表わされるアミノ酸の全て
または一部を表わし、ＢはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２の１９８から２５０残基目
により表わされるアミノ酸配列の少なくとも１アミノ酸残基を表わす；（ｖｉ）
ＡはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６の２９から１９７残基目によって表わされるアミ
ノ酸の全てまたは一部を表わし、ＢはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６の１９８から２
５０残基目により表わされるアミノ酸配列の少なくとも１アミノ酸残基を表わす
；（ｖｉｉ）ＡはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７の２３から１９３残基目によって表
わされるアミノ酸の全てまたは一部を表わし、ＢはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７の
１９４から２５０残基目により表わされるアミノ酸配列の少なくとも１アミノ酸
残基を表わす。ある望ましい態様においては、ＡおよびＢは共に示された配列に
隣接するポリペプチド配列を表わし、Ａは示された配列の少なくとも２５、５０
、７５、１００、１２５、または１５０アミノ酸を表わし、Ｂは配列リストにお
ける対応する導入により示されたアミノ酸配列のうち少なくとも５、１０、また
は２０アミノ酸残基を表わし、ＡおよびＢはともに、配列リストにおける導入に
対応する隣接する配列を表わすことが望ましい。他のｈｅｄｇｅｈｏｇからの同
様の断片、例えば、上に数え上げられた配列リスト導入からの望ましい断片の対
応する断片もまた、意図される。
【０１０７】 ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の単離されたペプチジル部位は、そのようなペプ
チドをコードする核酸の対応する断片から組換え技術により生産されたペプチド
を検索することにより得られえる。加えて、慣用的なメリーフィールド固相ｆ−
Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学のような、当該技術分野においてしられた技術を用
いて化学的に、断片が合成されえる。例えば、本発明のｈｅｄｇｅｈｏｇポリペ
プチドは、断片に重複のない望ましい長さの断片に任意に分割され、または、望
ましくは望ましい長さの重複した断片に分割されえる。野生型（例えば”本来の
”）ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の類似物として機能しえるそれらのペプチド断
片を認識するために、断片群は（組換え技術または化学合成により）生産され、
試験されえる。例えば、Ｒｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｅｕｒ Ｊ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ ２２２：６５−７３は、大きなタンパク質からの短く重複した合
成ペプチドを用いた結合ドメインを同定するための競合結合試験の利用を記載す
る。
【０１０８】 本発明の組換えｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドはまた、例えば潜在的な解裂配
列を変更する突然変異により、タンパク質分解解裂に耐性をもつ派生的なタンパ
ク質または、タンパク質に伴う酵素的な活性を不活化する派生的なタンパク質の
ような、本来のｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の相同物をも含む。本発明のｈｅｄ
ｇｅｈｏｇ相同物はまた、本来のタンパク質とは事なる様式で翻訳後に修飾され
たタンパク質をも含む。ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の誘導体の例は、糖鎖付加
部位を欠くポリペプチド（例えば糖鎖が付加されないタンパク質をつくるため）
、コレステロール化部位を欠くもの、および／またはＮ−末端、および／または
Ｃ−末端配列を欠くものを含む。
【０１０９】 主題のｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの構造の修飾はまた、治療または予防効
率または安定性（例えばｅｘ ｖｉｖｏ貯蔵寿命および、ｉｎ ｖｉｖｏでのタ
ンパク質分解への耐性）の増幅のような目的でありえる。そのような修飾された
ペプチドは、このタンパク質の天然に存在する形態での活性の少なくとも一つを
保持するように設計された場合、本明細書により詳細に記載されたｈｅｄｇｅｈ
ｏｇポリペプチドの機能的な等価物と考えられる。このような修飾されたペプチ
ドは例えばアミノ酸置換、欠失、または付加により生産されえる。
【０１１０】 例えばあるアミノ酸残基を他の関連するアミノ酸に置き換える（すなわち等立
体および／または等電荷変異）ような、ある種の単離されたアミノ酸の置き換え
はその結果できる分子の生物学的な活性に主要な影響を及ぼすことなく行われえ
ることが当該技術分野においてはよく知られている。保存的な置換は、側鎖が関
連するアミノ酸のファミリー内で行われるものである。遺伝的にコードされたア
ミノ酸は４つのファミリーに分類されえる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グル
タミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝ア
ラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチ
オニン、トリプトファン；および（４）非電荷極性＝グリシン、アスパラギン、
グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、
トリプトファン、およびチロシンはあわせて芳香族アミノ酸と分類されることが
ある。同様に、アミノ酸は（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）
塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）脂肪族＝グリシン、アラニン
、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、（所望により、セリ
ンおよびスレオニンは別に脂肪族水酸化として分類される）；（４）芳香族＝フ
ェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；（５）アミド＝アスパラギン、グ
ルタミン；および（６）含硫黄＝システインおよびメチオニン、と分類されえる
。（例えばＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｅｄ．ｂｙ Ｌ．Ｓｔ
ｒｙｅｒ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．：１９８１を見よ）。
【０１１１】 アミノ酸配列の変更がｈｅｄｇｅｈｏｇの（野生型を模倣または拮抗するよう
に働くという意味で機能的な）機能的相同物を産するか否かは、派生ポリペプチ
ドの、野生型タンパク質と同様な反応を細胞に引き起こす、またはそのような反
応を競合的に阻害する、能力を見積もることによって用意に決定されえる。一つ
以上の置換が起きたポリペプチドは同様の方法で容易に試験されえる。
【０１１２】 本発明の方法が、天然に存在するｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の相同物を用い
て行われえることが、特に意図される。ある態様においては、本発明は、組み合
わせ変異導入により作成されたｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドを用いることを意
図する。そのような方法は、当該技術分野において知られるように、点および短
縮変異の両方の作成に便利であり、ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質に対する受容体
への結合において機能的な、潜在的な派生的配列（例えば相同物）の同定に特に
有用でありえる。そのようなコンビナトリーライブラリーの検索の目的は、例え
ば、神経防護試薬として働きえる新規のｈｅｄｇｅｈｏｇ相同物の作成である。
顕著なことに、ｈｅｄｇｅｈｏｇ相同物は本発明の方法により修飾されて、神経
防護活性を保持しつつ、Ｐａｔｃｈｅｄのようなｃｏｇｎａｔｅ受容体に対する
より効率的な結合を提供しえる。さらに、本方法によるｈｅｄｇｅｈｏｇのある
種のドメインの操作は、細胞外基質に由来する、および／または細胞外基質成分
に結合するその他のタンパク質の一部を含むもののような、融合タンパク質にお
ける使用により適したドメインを提供しえる。
【０１１３】 組み合わせ変異導入技術の状態をさらに描写するために、１９９０年代初期の
コンビナトリーライブラリー技術の状態を記載する、Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ
．（１９９４）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７：１２３３の概論記事は注目される
。とくに、Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．は１２３９ページにおいて”類似ライブ
ラリーの検索は、活性配列の最小サイズの決定および、結合に決定的であり、置
換に不寛容な残基の同定を助ける”と述べている。加えて、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ． ＰＣＴ 出版ＷＷＯ９０／０２８０９、Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ
．米国特許番号５，２２３，４０８、およびＭａｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｐ
ＣＴ 出版ＷＯ９２／１５６７９は、ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの特定の活
性を保持する派生物／断片の同定のために迅速に検索されえる、ｈｅｄｇｅｈｏ
ｇ派生物のライブラリーを、当該技術分野において技術を有するものが作成する
ために利用しえた特異的な技術を記載する。これらの技術は技術の例であり、関
連する派生物／短縮物の大きなライブラリーが作成され得、過度に実験すること
なく、特定の派生物を単離するために検査されえることを示す。Ｇｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３：６５３、およびＢａｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃ
ｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｓ ８：３０９−３１４はまた、ｈｅｄｇｅｈ
ｏｇポリペプチドの突然変異性派生物の作成のための方法に応用されえる技術分
野からの技術の他の例をも記載する。
【０１１４】 事実、どの残基が生物学的機能に決定的であるかのいかなる事前の観念なしに
、ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の大規模な変異導入を行い、等価な生物学的活性
を有する広範囲な派生物を作成することは、組み合わせ変異導入の技術からは容
易である。実際、決定的な残基に体する事前の知識の一切の必要なく、解析を通
じて１０億もの異なる派生物を検索することが、組み合わせ技術の能力である。
例えば、ｈｅｄｇｅｈｏｇ相同物集団または他の関連するタンパク質に体するア
ミノ酸配列が、望ましくは可能な限り最も高い相同性を促進するように並べられ
る。このような派生物の集団は、例えば、一つ以上の種からのｈｅｄｇｅｈｏｇ
相同物を含みえる。並べられた配列の各々の部位に現われるアミノ酸は、組み合
わせ配列の縮重集合を作成するために選択される。望ましい態様においては、ｈ
ｅｄｇｅｈｏｇ派生物の不規則なライブラリーは核酸レベルでの組み合わせ変異
導入により作成され、ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ遺伝子ライブラリーによりコードさ
れる。例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物は、潜在的なｈｅｄｇｅｈｏｇ
配列の縮重集合が、個々のポリペプチドとして、またはそのなかにｈｅｄｇｅｈ
ｏｇ配列を含む、より大きな融合タンパク質（例えばファージ提示のためのもの
）として発現されるような遺伝子配列に、酵素的に連結されえる。ＰＣＴ出版Ｗ
Ｏ ９５／１８８５６に描かれるように、派生物の集合の配列を解析するために
、問題のアミノ酸配列は配列の相同性によって並べられえる。特定の派生物の並
べられた配列に由来するアミノ酸配列の存在、または不在は、実際、または人為
的出ありえる、参照配列の、選択された共通の長さにより比較される。
【０１１５】 描写的な態様においては、各々のＳｈｈクローンのエキソン１、２、およびエ
キソン３の一部をコードする配列（例えば成熟タンパク質のＮ−末端約２２１残
基）の配置は、以下の一般的化学式に表わされる縮重する一群のＳｈｈポリペプ
チドを産する：
【０１１６】
【化２】
【０１１７】 ここで、縮重部位”Ｘ”はヒト、マウス、ニワトリ、またはゼブラフィッシュ
Ｓｈｈ駆ローンのその部位に存在するアミノ酸でありえるか、または、ライブラ
リーを拡大するためには、それぞれのＸは、天然に各々の部位に見られるアミノ
酸に対して保存的な置換となるアミノ酸残基のなかから選択されえる。例えば、
Ｘａａ（１）はＧｌｙ、Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒまた
はＴｒｐを表わす；Ｘａａ（２）は、Ａｒｇ，ＨｉｓまたはＬｙｓを表わす；Ｘ
ａａ（３）はＧｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，ＳｅｒまたはＴｈｒを
表わす；Ｘａａ（４）はＧｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｓｅｒまた
はＴｈｒをあらわす；Ｘａａ（５）はＬｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ，ＡｓｎまたはＧ
ｌｎをあらわす；Ｘａａ（６）はＬｙｓ，ＡｒｇまたはＨｉｓをあらわす；Ｘａ
ａ（７）はＳｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｙｒ，ＴｒｐまたはＰｈｅをあらわす；Ｘａａ（
８）はＬｙｓ，ＡｒｇまたはＨｉｓをあらわす；Ｘａａ（９）はＭｅｔ，Ｃｙｓ
，ＳｅｒまたはＴｈｒをあらわす；Ｘａａ（１０）はＧｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，
Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，ＳｅｒまたはＴｈｒをあらわす；Ｘａａ（１１）はＬｅｕ，Ｖ
ａｌ，Ｍｅｔ，ＴｈｒまたはＳｅｒをあらわす；Ｘａａ（１２）はＨＩｓ，Ｐｈ
ｅ，Ｔｙｒ，Ｓｅｒ，ＴＨｒ，ＭｅｔまたはＣｙｓをあらわす；Ｘａａ（１３）
はＧｌｎ，Ａｓｎ，ＧｌｕまたはＡｓｐをあらわす；Ｘａａ（１４）はＨＩｓ，
Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，ＧｌｕまたはＡｓｐをあらわす；Ｘ
ａａ（１５）はＧｌｎ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｍｅｔまた
はＣｙｓをあらわす；Ｘａａ（１６）はＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｃｙｓ，Ｌｅｕ，Ｖａ
ｌまたはＭｅｔをあらわす；Ｘａａ（１７）はＡｒｇ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｉｌｅ
，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ，Ｓｅｒ，ＴｈｒまたはＣｙｓをあらわす；
Ｘａａ（１８）はＡｒｇ，Ｌｙｓ，ＭｅｔまたはＩｌｅをあらわす；Ｘａａ（１
９）はＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｃｙｓ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，Ｓｅｒ，Ｔ
ｈｒまたはＭｅｔをあらわす；Ｘａａ（２０）はＡｌａ，Ｇｌｙ，Ｃｙｓ，Ａｓ
ｐ，Ａｓｎ，ＧｌｕまたはＧｌｎをあらわす；Ｘａａ（２１）はＡｒｇ，Ｌｙｓ
，Ｍｅｔ，Ｉｌｅ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，ＧｌｕまたはＧｌｎをあらわす；Ｘａａ（
２２）はＬｅｕ，Ｖａｌ，ＭｅｔまたはＩｌｅをあらわす；Ｘａａ（２３）はＰ
ｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｈｒ，ＨｉｓまたはＴｒｐをあらわす；Ｘａａ（２４）はＩｌ
ｅ，Ｖａｌ，ＬｅｕまたはＭｅｔをあらわす；Ｘａａ（２５）はＭｅｔ，Ｃｙｓ
，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｖａｌ，ＴｈｒまたはＳｅｒをあらわす；Ｘａａ（２６）は
Ｌｅｕ，Ｖａｌ，Ｍｅｔ，ＴｈｒまたはＳｅｒをあらわす。さらにより拡大され
たライブラリーにおいてはそれぞれのＸは任意のアミノ酸から選択されえる。 同様に、それぞれの、ヒト、マウス、ニワトリおよびゼブラフィッシュｈｅｄｇ
ｅｈｏｇクローンの配置は、以下の一般化学式に表わされる縮重ポリペプチド配
列を提供する：
【０１１８】
【化３】
【０１１９】 ここで、上記のように、それぞれの縮重する”Ｘ”は野生型クローンのうちの
一つの対応する位置に存在するアミノ酸でありえ、それはまた、保存的に置換さ
れえるアミノ酸を含みえ、またはそれぞれのＸは任意のアミノ酸残基でありえる
。例としての態様においては、；Ｘａａ（１）はＧｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅ
ｕ，Ｉｌｅ，Ｐｒｏ，ＰｈｅまたはＴｙｒをあらわす；Ｘａａ（２）はＧｌｙ，
Ａｌａ，Ｖａｌ，ＬｅｕまたはＩｌｅをあらわす；Ｘａａ（３）はＧｌｙ，Ａｌ
ａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ，ＨｉｓまたはＡｒｇをあらわす；Ｘａａ
（４）はＬｙｓ，Ａｒｇ，またはＨｉｓをあらわす；Ｘａａ（５）はＰｈｅ，Ｔ
ｒｐ，Ｔｙｒまたはアミノ酸ギャップをあらわす；Ｘａａ（６）はＧｌｙ，Ａｌ
ａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅまたはアミノ酸ギャップをあらわす；Ｘａａ（７）
はＡｓｎ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，ＡｒｇまたはＬｙｓをあらわす；Ｘａａ（８）はＧ
ｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，ＳｅｒまたはＴｈｒをあらわす；Ｘａ
ａ（９）はＧｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，ＳｅｒまたはＴｈｒをあ
らわす；Ｘａａ（１０）はＧｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｓｅｒま
たはＴｈｒをあらわす；Ｘａａ（１１）はＳｅｒ，Ｔｈｒ，ＧｌｎまたはＡｓｎ
をあらわす；Ｘａａ（１２）はＭｅｔ，Ｃｙｓ，Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅ
ｕ，Ｉｌｅ，ＳｅｒまたはＴｈｒをあらわす；Ｘａａ（１３）はＧｌｙ，Ａｌａ
，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，ＩｌｅまたはＰｒｏをあらわす；Ｘａａ（１４）はＡｒｇ，
ＨｉｓまたはＬｙｓをあらわす；Ｘａａ（１５）はＧｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌ
ｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｒｏ，Ａｒｇ，ＨｉｓまたはＬｙｓをあらわす；Ｘａａ（１６
）はＧｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，ＰｈｅまたはＴｙｒをあらわす
；Ｘａａ（１７）はＡｒｇ，ＨｉｓまたはＬｙｓをあらわす；Ｘａａ（１８）は
Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，ＡｓｎまたはＧｌｎをあらわす；Ｘ
ａａ（２１）はＡｒｇ，ＨｉｓまたはＬｙｓをあらわす；Ｘａａ（２２）はＡｓ
ｐまたはＧｌｕをあらわす；Ｘａａ（２３）はＳｅｒまたはＴｈｒをあらわす；
Ｘａａ（２４）はＧｌｕ，Ａｓｐ，ＧｌｎまたはＡｓｎをあらわす；Ｘａａ（２
５）はＧｌｕまたはＡｓｐをあらわす；Ｘａａ（２６）はＡｒｇ，Ｈｉｓまたは
Ｌｙｓをあらわす；Ｘａａ（２７）はＧｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，ＬｅｕまたはＩ
ｌｅをあらわす；Ｘａａ（２８）はＧｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，
ＴｈｒまたはＳｅｒをあらわす；Ｘａａ（２９）はＭｅｔ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ａ
ｓｎ，Ａｒｇ，ＬｙｓまたはＨｉｓをあらわす；Ｘａａ（３０）はＡｒｇ，Ｈｉ
ｓまたはＬｙｓをあらわす；Ｘａａ（３１）はＴｒｐ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ａｒｇ
，ＨｉｓまたはＬｙｓをあらわす；Ｘａａ（３２）はＧｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，
Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，ｔｙｒまたはＰｈｅをあらわす；Ｘａａ（３
３）はＧｌｎ，Ａｓｎ，ＡｓｐまたはＧｌｕをあらわす；Ｘａａ（３４）はＡｓ
ｐまたはＧｌｕをあらわす；Ｘａａ（３５）はＧｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ
またはＩｌｅをあらわす；Ｘａａ（３６）はＡｒｇ，ＨｉｓまたはＬｙｓをあら
わす；Ｘａａ（３７）はＡｓｎ，Ｇｌｎ，ＴｈｒまたはＳｅｒをあらわす；Ｘａ
ａ（３８）はＧｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｍｅ
ｔまたはＣｙｓをあらわす；Ｘａａ（３９）はＧｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ
，Ｉｌｅ，ＴｈｒまたはＳｅｒをあらわす；Ｘａａ（４０）はＡｒｇ，Ｈｉｓま
たはＬｙｓをあらわす；Ｘａａ（４１）はＡｓｎ，Ｇｌｎ，Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖ
ａｌ，ＬｅｕまたはＩｌｅをあらわす；Ｘａａ（４２）はＧｌｙ，Ａｌａ，Ｖａ
ｌ，ＬｅｕまたはＩｌｅをあらわす；Ｘａａ（４３）はＧｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ
，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｓｅｒ，ＴｈｒまたはＣｙｓをあらわす；Ｘａａ（４４）は
Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，ＴｈｒまたはＳｅｒをあらわす；Ｘ
ａａ（４５）はＡｓｐまたはＧｌｕをあらわす。
【０１２０】 縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なｈｅｄｇｅｈｏｇ相同ライブラリー
を作成するために多くの方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学的な合成は、自
動ＤＮＡ合成機において行われ、そして、合成遺伝子は適切な発現ベクターに連
結されえる。縮重した遺伝子群の目的は、一つの混合物中に、潜在的なｈｅｄｇ
ｅｈｏｇ配列の望まれる集団をコードする配列の全てを提供することである。縮
重オリゴヌクレオチドの合成は、当該技術分野において良くしられている（例え
ば、Ｎａｒａｎｇ，ＳＡ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔ
ａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ （１９８１） Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐ
ｒｏｃ ３ｒｄ Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃ
ｕｌｅｓ．ｅｄ．ＡＧ Ｗａｌｔｏｎ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｖｉｅｒ ｐｐ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒ
ｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８
４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を見よ）。そのような技術は他
のタンパク質の指向された進化においても用いられている（例えば、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉ
ｒｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＰＮＡＳ ８７：６３７８−６３８２；およ
び米国特許番号５，２２３，４０９、５，１９８，３４６および５，０９６，８
１５を見よ）。
【０１２１】 点変異により作成されたコンビナトリーライブラリーの遺伝子産物の検索、お
よび特定の性質をもつ遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーの検索のための広範な
技術は当該技術分野において知られている。このような技術はｈｅｄｇｅｈｏｇ
相同物の組み合わせ変異導入により作成された遺伝子ライブラリーの迅速な検索
に、一般に適用されえる。大きな遺伝子ライブラリーの検索に最も広く用いられ
る技術は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクロー
ニングすること、その結果できるベクターのライブラリーによって、適切な細胞
を形質転換すること、および、望まれる活性の検出が、検出された産物に対する
遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を可能にする条件下で組み合わ
せ遺伝子を発現することを含む。以下に記載される描写的な試験は、組み合わせ
変異導入技術により作成された多数の縮重ｈｅｄｇｅｈｏｇ配列を検索すること
が必要であるため、高仕事量解析に対して従うべきである。
【０１２２】 一つの態様においては、コンビナトリーライブラリーは分泌されるように設計
され（例えば、ライブラリーのポリペプチドが全てシグナル配列を含むが、膜貫
通または細胞質ドメインを持たない）、神経細胞と共に培養されえるような真核
細胞を形質転換するために用いられる。コンビナトリーライブラリーを発現する
細胞により分泌される機能的なｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質は近隣の神経細胞に
拡散し、ＭＰＴＰ処理された場合の細胞死からの防護の様な特定の生物学的応答
を誘導する。防護のパターンは勾配関数に類似し、標的神経細胞に対する神経防
護試薬として活性のあるｈｅｄｇｅｈｏｇ相同物を生産する細胞の単離を可能に
する。 例えば、標的神経細胞は、２４穴マイクロタイタープレート中で培養される。他
の真核細胞が組み合わせｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子ライブラリーにより形質転換さ
れ、マイクロタイタープレートの穴に合うことができるような細胞培養挿入物（
例えばＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ
． Ｃａｔａｌｏｇ ＃４０４４６）中で培養される。細胞培養挿入物は、挿入
物中の細胞により分泌された組換えｈｅｄｇｅｈｏｇ相同物が、挿入物の多孔性
底面を等して拡散し、マイクロタイタープレート穴中の標的細胞に接触しえるよ
うに、配置される。機能型のｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質が標的細胞に、神経防
護のような測定可能な応答を引き起こすのに十分な時間の後、挿入物は除去され
、標的細胞に対する派生ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の効果が決定される。活性
について陽性であった穴に対応する挿入物由来の細胞は分離され、いくつかの挿
入物上で再培養され、この過程が活性のあるクローンが同定されるまで繰り返さ
れる。
【０１２３】 さらに別の検索試験においては、候補ｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子産物は、細胞ま
たはウィルス小胞の表面に提示され、特定の細胞またはウィルス小胞の、この遺
伝子産物を介して（Ｐａｔｃｈｅｄタンパク質または他のｈｅｄｇｅｈｏｇ受容
体のような）ｈｅｄｇｅｈｏｇ結合部位に結合する能力が、”定位試験”におい
て検出される。そのような定位の段階は胚から培養された細胞について行われえ
る。例えば、遺伝子ライブラリーは細菌細胞の表面タンパク質に対する遺伝子に
クローニングされ、結果産する融合タンパク質は定位により検出されえる（Ｌａ
ｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏ ８８／０６６３０；Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．
（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７１；および
Ｇｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２） ＴＩＢＳ １８：１３６−１４０）
。同様に、ｈｅｄｇｅｈｏｇに結合する蛍光標識された分子が、潜在的に機能の
あるｈｅｄｇｅｈｏｇ相同物を計測するために用いられえる。細胞は視覚的に検
査され、蛍光顕微鏡下で分離されるか、または、細胞の形態が許せば、蛍光活性
化細胞分離機により分離されえる。
【０１２４】 代替的な態様においては、遺伝子ライブラリーは、ウィルス小胞の表面に融合
タンパク質として発現される。例えば、繊維状ファージの系においては、外来ペ
プチド配列は、感染性のファージの表面に発現されえ、そのことにより二つの有
意な利点を付与しえる。一つ目は、これらのファー時は非常に高い濃度で親和性
基質に投与されえるため、一度に多数のファージを試験することができる。二つ
目は、それぞれの感染性ファージがその表面に組み合わせ遺伝子産物を提示する
ため、あるファージが親和性基質から低い収量でしか回収されなかった場合でも
、さらに感染させることで増幅されえる。ほぼ同一のＥ．ｃｏｌｉ繊維状ファー
ジＭ１３、ｆｄおよびｆｌは、ファージｇＩＩＩまたはｇＶＩＩＩ被覆タンパク
質のいずれかが、ウィルス小胞の究極的な構造を破壊することなく融合タンパク
質を作成するのに使用されえるため、最も頻繁にファージ提示ライブラリーにお
いて用いられる（Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＣＴ出版ＷＯ ９０／０２９０
９；Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ出版ＷＯ ９２／０９６９０；Ｍａ
ｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６００
７−１６０１０；Ｇｒｉｆｆｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５−７３４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕ
ｒｅ ３５２：６２４−６２８；およびＢａｒｂｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）
ＰＮＡＳ ８９：４４５７−４４６１）。
【０１２５】 描写的な態様においては、組換え抗体系（ＲＰＡＳ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃ
ａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ ２７−９４００−０１）がｈｅｄｇｅｈｏｇコン
ビナトリーライブラリーの発現および検索における使用のために容易に修飾され
える。例えば、ＲＰＡＳキットのｐＣＡＮＴＡＢ ５ファージミドは、ファージ
ｇＩＩＩ被覆タンパク質をコードする遺伝子を含む。ｈｅｄｇｅｈｏｇ コンビ
ナトリー遺伝子ライブラリーは、それがｇＩＩＩ融合タンパク質として発現され
るようにｇＩＩＩシグナル配列に隣接するファージミドにクローニングされえる
。ライゲーションの後に、形質転換可能なＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞を形質転換
するために、ファージミドが用いられる。続いてファージミドおよびその候補ｈ
ｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子挿入物を救助するために、形質転換された細胞は、Ｍ１３
Ｋ０７ヘルパーファージによって感染される。結果生じた組換えファージは特異
的な候補ｈｅｄｇｅｈｏｇをコードするファージミドＤＮＡを含み、一つ以上の
コピーの対応する融合被覆タンパク質を提示する。ｈｅｄｇｅｈｏｇ受容体に結
合しえる、ファージに提示された候補ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質が選択され、
定位によって増幅される。例えば、ファージライブラリーはｐａｔｃｈｅｄタン
パク質を発現する細胞に投与され、結合しないファージは細胞から洗浄除去され
える。そして、結合したファージは単離され、組換えファージが少なくとも１コ
ピーの野生型ｇＩＩＩ被覆タンパク質を発現するならば、それらは、Ｅ．ｃｏｌ
ｉに感染する能力を保持しえる。したがって、Ｅ．ｃｏｌｉ感染および定位の連
続する循環はｈｅｄｇｅｈｏｇ相同物を強く増大せしめ、それにたいして今度は
、類似物と拮抗物を区別するためのさらなる生物学的活性についての検索が行わ
れえる。
【０１２６】 組み合わせ変異導入は、変異タンパク質の、例えば１０の２６乗分子のオーダ
ーの、非常に大きなライブラリーを作成する能力をもつ。この大きさのコンビナ
トリーライブラリーは、ファージ提示のような高仕事量検索試験を用いても、技
術的に検索が困難でありえる。この問題を克服するために、無作為なライブラリ
ーの非機能タンパク質の大部分を避け、機能タンパク質の頻度を単純に増大させ
、したがって、配列空間の有用なサンプリングに必要な複雑さを減少させる、循
環アンサンブル変異導入（ＲＥＭ）という新しい技術が近年発達した。ＲＥＭは
、適切な選択または検索法が用いられる場合にライブラリーにおける機能的な変
異の頻度を増幅するアルゴリズムである（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ
， Ｎａｔｕｒｅ，２．，Ｉｎ Ｍａｅｎｎｅｒ ａｎｄ Ｍａｎｄｅｒｉｃｋ
，ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ａｍｓｔｅｒｄ
ａｍ，ｐｐ．４０１−４１０；Ｄｅｌｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｅｍｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２７−３３１）。
【０１２７】 本発明はまた、例えば天然に存在するｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの神経防
護活性を模倣しえる、ペプチドまたは非ペプチド試薬のような模倣物の作成のた
めのｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の還元を提供する。したがって、上記のような
変異導入技術はまた、例えば主題のｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの、その受容
体のような他の細胞外基質成分への結合のような、関与するタンパク質間相互作
用に参加するｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の決定因子のマッピングにも有用であ
る。例えば、ｐａｔｃｈｅｄのようなｈｅｄｇｅｈｏｇ受容体の分子的認識に関
与する主題のｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの決定的な残基が決定され、その部
分に競合的に結合するｈｅｄｇｅｈｏｇ由来のペプチド模倣剤を作成するために
用いられえる。例えば、他の細胞外基質への結合に含まれる、それぞれの主題の
ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質のアミノ酸残基をマッピングするために走査変異導
入を用いることにより、相互作用を可能にするｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の残
基を模倣するペプチド模倣化合物が作成されえる。類似物と、拮抗物の区別の後
、そのような類似的模倣物は、ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の、ドーパミン作動
性およびＧＡＢＡ作動性神経にトロフィックである正常な機能を模倣するのに用
いられえる。例えば、そのような残基の非加水分解性ペプチド類似物はベンゾジ
アゼピン（例えばＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ
： Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ
ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎ
ｄｓ．１９８８を見よ）、アゼピン（例えばＨｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ． ｉ
ｎＰｅｐｔｉｄｅｓ：ｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍ
ａｒｓｇａｌ ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅ
ｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８を見よ）、置換されたガンマラクタム環（例えば
Ｇａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ． ｉｎＰｅｐｔｉｄｅｓ：ｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎ
ｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｇａｌ ｅｄ．，ＥＳＣＯＭ ｐｕｂｌ
ｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８８を見よ）、ケト
−メチレン偽ペプチド（Ｅｗｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２９：２９５； およびＥｗｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｐｒｏｃｅｅ
ｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ９ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｓ
ｙｍｐｏｓｉｕｍ）Ｐｉｅｒｅｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｒｏｃｋｌａｎ
ｄ，ＩＬ，１９８５）、β−ターンジペプチド核（Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．（
１９８５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ２６：６４７；およびＳａｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １：１２３１）、およびβ−アミノアルコール（Ｇｏｒｄｏｎｅｔ ａｌ．（１
９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ１２６：４１
９；およびＤａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １３４：７１）を用いて作成されえる。
【０１２８】 組換え技術によって作成された形態のｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質は、例えば
人為的に少なくとも一つの転写調節配列に連結されたｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプ
チドをコードする核酸を含む発現ベクターを用いて作成されえる。人為的な連結
は、核酸配列の発現を可能にするような方法で、ヌクレオチド配列が調節配列に
連結されることを意味することが意図される。調節配列はartrecognizeされ、ｈ
ｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの発現を指示するように選択される。したがって、
転写調節配列という語は、プロモーター、エンハンサー、およびその他の発現調
節要素を含む。そのような調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｃｉｅｇｏ，ＣＡ
（１９９０）に記載される。例えば、人為的に連結された場合にあるＤＮＡ配列
の発現を調節する配列である、様々な発現調節配列のうちのいずれかが、これら
のベクターにおいて、ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を
発現するために用いられえる。このような有用な発現調節配列は、例えば、molo
ny murine白血病ウィルスのＬＴRのようなウィルスLTＲ、ＳＶ４０の初期および
後期プロモーター、アデノウィルスまたはサイトメガロウィルスの最初期プロモ
ーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、Ｔ７ポリメラーゼにより
発現が制御されるＴ７プロモーター、λファージの主要オペレーターおよびプロ
モーター領域、ｆｄ被覆タンパク質の調節領域、３−ホスホグリセレートキナー
ゼまたはその他の解糖酵素のプロモーター、例えばＰｈｏ５のような酸脱リン酸
化酵素のプロモーター、酵母α接合因子のプロモーター、バキュロウィルス系の
ポリヘドロンプロモーター、および原核または真核細胞またはそれらのウィルス
の遺伝子の発現を調節する事がしられているその他の配列、およびそれらの様々
な組み合わせを含む。
【０１２９】 発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択および／または発
現が望まれるタンパク質の種類などの要因に依存しえることが理解されるべきで
ある。さらに、ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力、抗性物質マーカ
ーのようなベクターにコードされる任意の他のタンパク質の発現もまた考慮され
るべきである。
【０１３０】 ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの精製のための容易な材料を提供することに加
えて、本発明の遺伝子構築物はまた、神経防護型のｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチ
ドのいずれかをコードする核酸を投与する遺伝子治療プロトコールの一部として
も用いられえる。したがって、本発明の別の側面は、神経組織においてｈｅｄｇ
ｅｈｏｇポリペプチドの異所発現を引き起こすような、特定の細胞種に対するｈ
ｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ形質転換のための発現ベクターを
特徴とする。
【０１３１】 そのような発現構築は、例えばｉｎ ｖｉｖｏで組換え遺伝子を細胞に効果的
に送り届けることが可能な任意の製剤または組成物のような、任意の生物学的に
効果のある坦体中で投与されえる。手法は、組換えレトロウィルス、アデノウィ
ルス、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、ｐＥＭを含むアデノ関連ウィルス、およびヘ
ルペスッシンプレックスウィルス１、を含むウィルスベクター、または組換え細
菌または真核プラスミド中のｈｅｄｇｅｈｏｇコード配列の挿入を含む。ウィル
スベクターは細胞を直接形質転換する；プラスミドＤＮＡは、例えば陽イオン性
リポソーム（リポフェクチン）またはポリリジン結合物誘導体（例えば抗体に共
役されたもの）、グラマシディンＳ、人工ウィルス外殻またはそのような細胞内
坦体の補助のもとに、および遺伝子構築の直接注入またはｉｎ ｖｉｖｏでのＣ
ａＰＯ４沈殿により投与されえる。適切な細胞に形質導入することが遺伝子治療
の決定的な始めの段階であることは受け入れられえるため、特定の遺伝子投与系
は、意図される標的の表現型、例えば局所またはsysytemicallyといった投与の 経路のような要因に依存しえる。さらに、ｈｅｄｇｅｈｏｇ発現のためのｉｎ ｖｉｖｏ形質導入のために提供される特定の遺伝子構築物はまた下記のｅｘ ｖ
ｉｖｏ組織培養系における利用のような、細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入にお
いても有用であることが認識されえる。
【０１３２】 核酸をｉｎ ｖｉｖｏd細胞に導入する望ましい手法は、例えば望ましいｈｅ ｄｇｅｈｏｇポリペプチドの特定の型をコードするｃＤＮＡのような核酸を含む
ウィルスベクターの利用による。ウィルスベクターによる細胞の感染は、標的細
胞の大部分が核酸を受け取るという利点をもつ。付加的に、例えばウィルスベク
ター中に含まれるｃＤＮＡによりウィルスベクター内にコードされる分子はウィ
ルスベクター核酸を取り込んだ細胞中に効率的に発現される。
【０１３３】 レトロウィルスおよびアデノ関連ウィルスベクターは、特にヒトに対するｉｎ ｖｉｖｏでの外来遺伝子の転移のために選択されえる組換え遺伝子投与系であ
ると、一般に理解される。これらのベクターは細胞への遺伝子の効率的な投与お
よび、転移された核酸が宿主の染色体ＤＮＡに安定に取り込まれることを提供す
る。レトロウィルスの使用の主要なprequisiteは、特に野生型ウィルスが細胞集
団中に広がる可能性を考慮した、その使用の安全性を保証することである。増殖
欠損レトロウィルスだけを生産するような特異化した細胞株（パーッケージング
細胞と呼ばれる）の発達が遺伝子治療におけるレトロウィルスの有用さを増大さ
せ、遺伝子治療目的の遺伝子転移のために欠損レトロウィルスがよく特徴づけら
れてきた（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１の概
説を見よ）。したがって、組換えレトロウィルスは、レトロウィルスのコードす
る配列の一部（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）がｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドをコ
ードする核酸により置き換えられ、レトロウィルスの増殖に欠損をもたらすよう
に構築されえる。増殖欠損レトロウィルスはそして、ヴィリオンにパッケージ化
され、それが標準的な技術によるヘルパーファージの利用によって標的細胞に感
染するために用いられえる。組換えレトロウィルスの作成およびそのようなウィ
ルスによってｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞を感染させるプロト
コールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）Ｇｒｅｅ
ｎｅ ＰｕｂｌｉｓｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔ
ｉｏｎｓ ９．１０−９．１４ および他の標準的な研究室マニュアル中に見ら
れえる。適切なレトロウィルスの例は、当該技術分野において良く知られた、ｐ
ＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、およびｐＥＭを含む。エコトロピックおよびアンフォ
トロピック両方のレトロウィルス系を調製するための適切なパッケージングウィ
ルス株の例は、Ｃｒｉｐ、Ｃｒｅ、２、およびＡｍを含む。レトロウィルスは多
様な遺伝子を、神経細胞を含む多くの異なる細胞種にｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／
またはｉｎ ｖｉｖｏで導入するために用いられてきた（例えば、Ｅｇｌｉｔｉ
ｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３９５−１３９８；
Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ （１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．（１９８８）Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３０１４
−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：
８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５；
ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ
．（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７；
Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：４１０４−４１１５；米国特許番号４，８６８，
１１６；米国特許番号４，９８０．２８６；ＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ８９／０７１３６；ＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ８９／０２
４６８；ＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ８９／０５３４５；およびＰ
ＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ９２／０７５７３を見よ）。 さらに、ウィルス小胞表面上のウィルスパッケージングタンパク質を修飾するこ
とにより、レトロウィルス、および結果的にレトロウィルスを基盤とするベクタ
ーの感染特性を制限することが可能であることが示されている（例えばＰＣＴ 出版 ＷＯ ９３／２５２３４およびＷＯ９４／０６９２０を見よ）。例えば、
レトロウィルスベクターの感染特性を修飾する方策は、：細胞表面抗源に特異的
な抗体をウィルスｅｎｖタンパク質に共役させること（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．
（１９８９）ＰＮＡＳ８６：９０７９−９０８３；Ｊｕｌａｎ ｅｔ ａｌ．（
１９９２）Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７３：３２５１−３２５５；およびＧｏｕ
ｄ ｅｔ ａｌ．（１９８３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６３：２５１−２５４）
；または細胞表面受容体リガンドをウィルスｅｎｖタンパク質に共役させること
（Ｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２６６：１４
１４３−１４１４６）。共役は、タンパク質または他の多様な物質（例えばラク
トースはｅｎｖタンパク質をアシアロ糖タンパク質に変換する）との化学的な架
橋、および融合タンパク質の作成（例えば一本鎖抗体／ｅｎｖ融合タンパク質）
の形でありえる。この技術は、ある種の組織への感染を制限または指示する一方
、エコトロピックなベクターをアンフォトロピックなベクターに変換するために
も用いられえる。
【０１３４】 さらに、レトロウィルス遺伝子投与の使用は、レトロウィルスベクターのｈｅ
ｄｇｅｈｏｇ遺伝子の発現を調節する、組織または細胞特異的転写調節配列の利
用によりさらに増強されえる。
【０１３５】 本発明の方法において有用な、他のウイルス遺伝子運搬系はアデノウイルス由
来ベクターを使用するものである。アデノウイルスのゲノムを、それが所期の遺
伝子をコードし発現するが、正常な溶菌ウイルス生活環において複製する能力と
いう点において不活性化されているように、操作することが可能である。例えば
、Ｂｅｒｋｎｅｒら（１９８８） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６；
Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：４３１−４３４；お
よびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）Ｃｅｌｌ６８：１４３−１５５を参照さ
れたい。アデノウイルスＡｄ５型ｄｌ３２４株またはその他のアデノウイルス株
（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）に由来する適切なアデノウイルスベクタ
ーが当業者に良く知られている。組換えアデノウイルスは、ニューロン細胞（上
に引用したＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２））を含む広範な細胞種に感染さ
せるために使用され得る情況において有利である。
【０１３６】 さらに、ウイルス粒子は比較的安定であり、精製および濃縮が容易であり、上
記のとおり、感染力の範囲に影響を与えるために修飾を施すことが可能である。
さらに、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびそこに含まれる外来ＤＮＡ）
は宿主細胞のゲノムに取り込まれず、エピソーム状に留まるが、それによって、
導入したＤＮＡが宿主ゲノム内に取り込まれる状況下（例えば、レトロウイルス
ＤＮＡ）での挿入突然変異導入の結果として起こり得る潜在的な問題が回避され
る。さらに、アデノウイルスゲノムの外来ＤＮＡに対する運搬能力はその他の遺
伝子運搬ベクターと比較して大きい（８キロベースまで）（上に引用したＢｅｒ
ｋｎｅｒら；Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．５７：２６７）。現在使用中の大部分であり、およびそれゆえに本発明で
好んで使用する複製欠陥アデノウイルスベクターはウイルスのＥ１およびＥ３遺
伝子の全体または部分を欠失しているが、アデノウイルスの遺伝物質の８０％程
度を保持する（例えば、Ｊｏｎｅｓら、（１９７９）Ｃｅｌｌ １６：６８３；
Ｂｅｒｋｎｅｒら、上に記載；およびＧｒａｈａｍら、Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編（Ｈｕｍａｎａ、
Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ、１９９１）第７巻、１０９−１２７ページを参照せよ）
。挿入されたｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子の発現は、例えばＥ１Ａプロモーター、主
要な後期プロモーター（ＭＬＰ）および関連するリーダー配列、Ｅ３プロモータ
ー、または外来から付加したプロモーター配列の制御下におくことが可能である
。
【０１３７】 動物の組織内でｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの発現を引き起こすために、ウ
イルス転移方法に加えて、上記の説明のような非ウイルス性の方法もまた使用す
ることが可能である。遺伝子転移の最も非ウイルス性の方法は、巨大分子の取り
込みおよび細胞内輸送のために哺乳類細胞が使用している正常な機構に頼るもの
である。好ましい態様においては、本発明の非ウイルス性の遺伝子運搬系は、標
的細胞によるｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチド遺伝子の取り込みのためのエンドサ
イトーシスの経路に依存している。この種の遺伝子運搬系の例は、リポソーム派
生系、ポリ−リシン共役物、および人工ウイルス外被を含む。
【０１３８】 臨床的な装置においては、当業者に既知である数々の方法のいずれかによって
、治療用ｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子のための遺伝子運搬系を患者に導入することが
可能である。例えば、遺伝子運搬系の医薬的な調製物は、例えば静脈内注射によ
って全身に導入することが可能であり、および標的細胞におけるタンパク質の特
異的な伝達は遺伝子運搬者によって供給される感染の特異性、受容体遺伝子の発
現を調節する転写制御配列による細胞種または組織種の発現、またはその組み合
わせから優先して起こる。その他の態様においては、組換えタンパク質の最初の
運搬は、極めて局所的な動物への導入にさらに限定されている。例えば、遺伝子
運搬者はカテーテルによって（米国特許第５，３２８，４７０号を参照せよ）ま
たは定位的な注射によって（例えば、Ｃｈｅｎら、（１９９４）ＰＮＡＳ ９１
：３０５４−３０５７）導入することが可能である。ｈｅｄｇｅｈｏｇ発現構築
物は、例えばＤｅｖら、（（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ ２
０：１０５−１１５）によって記述される技術を用いた電気穿孔法によって、遺
伝子治療構築物内で皮膚細胞へと運搬することが可能である。
【０１３９】 遺伝子治療構築物の医薬的調製物は、本質的に、受容できる希釈液中の遺伝子
運搬系からなり得る。または、遺伝子運搬者が埋め込まれた遅延性放出物質を含
み得る。あるいは、例えばレトロウイルスベクターなどの、完全な遺伝子運搬系
が組換え体細胞から無傷で産生され得るところにおいては、医薬的調製物は遺伝
子運搬系を産生する１個またはそれ以上の細胞を含み得る。
【０１４０】 さらにもう一つの態様においては、ｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤は、
ゲノムＤＮＡとの相同的組換えによって内在性遺伝子の転写制御配列を変化させ
る「遺伝子活性化」構築物であり得る。例えば、遺伝子活性化構築物はｈｅｄｇ
ｅｈｏｇ遺伝子の内在性のプロモーターを、異種性のプロモーター、例えばｈｅ
ｄｇｅｈｏｇ遺伝子の構成的発現を引き起こすもの、またはある条件下でその遺
伝子の正常な発現様式とは異なる遺伝子発現の誘導を引き起こすもの、に置き換
えることが可能である。ｐａｔｃｈｅｄシグナル伝達経路におけるその他の遺伝
子群が同様に標的となり得る。遺伝子活性化構築物のための様々な異なる型式が
使用可能である。例えば、Ｔｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ（
核移植治療）Ｉｎｃ ＰＣＴ刊行物ＷＯ９３／０９２２２，ＷＯ９５／３１５６
０，ＷＯ９６／２９４１１，ＷＯ９５／３１５６０およびＷＯ９４／１２６５０
を参照せよ。
【０１４１】 好ましい態様においては、遺伝子活性化構築物として使用したヌクレオチド配
列は、（１）組換えに向いている内在性ｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子のいくらかの部
分に由来するＤＮＡ（エキソン配列、イントロン配列、プロモーター配列等。）
、（２）遺伝子活性化構築物の組換えにおける、ゲノムのｈｅｄｇｅｈｏｇに対
するコード配列に操作上連結することが可能である、異種性の転写制御配列（群
）、を含み得る。ｈｅｄｇｅｈｏｇ産生細胞の培養の作製において使用するため
に、構築物はさらに、細胞内のノックアウト構築物の存在を検出するためのレポ
ーター遺伝子を含み得る。
【０１４２】 遺伝子活性化構築物を細胞に導入し、細胞のゲノムＤＮＡの、生来のｈｅｄｇ
ｅｈｏｇ遺伝子と操作的に結合させて異種性の制御配列を提供するような位置に
取り込ませる。そのような挿入は相同組換えによって起こる。すなわち、内在性
のｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子配列と相同的な活性化構築物の組換え領域がゲノムＤ
ＮＡとハイブリダイズし、構築物がゲノムＤＮＡの相当する場所に取り込まれる
ようにゲノム配列と組換えを起こす。
【０１４３】 「組換え領域」または「標的配列」という語句は、例えばゲノム遺伝子の５’
側方配列を含む、ゲノム上の遺伝子配列と実質的に同一であるまたは実質的に相
補的である配列を有する遺伝子活性化構築物の一画分（一部）を意味し、ゲノム
配列および標的導入遺伝子構築物との間の相同的組換えを促進することが可能で
ある。
【０１４４】 本明細書において使用したとおり、「置換領域」は、組換え領域とゲノム配列
との間の相同組換えに続いて内在性の染色体位置に取り込まれる活性化構築物の
一部を意味する。
【０１４５】 例えば置換領域に供給される非相同制御配列は、プロモーター（構成的または
誘導性プロモーターなど）、エンハンサー、負の制御要素、遺伝子座調節領域、
転写因子結合部位、またはそれらの組合わせを含む、様々な要素の一個またはそ
れ以上を含み得る。標的遺伝子の発現をインビボで調節するために使用すること
が可能であるプロモーター／エンハンサーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
プロモーター／エンハンサー（Ｋａｒａｓｕｙａｍａら、１９８９、Ｊ．Ｅｘｐ
．Ｍｅｄ．、１６９：１３）、ヒトβ−アクチンプロモーター（Ｇｕｎｎｉｎｇ
ら、（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：４８３１−４８３５）、マウス乳腺腫瘍ウイ
ルスの末端反復配列（ＭＭＴＶ ＬＴＲ）内に存在するグルココルチコイド誘導
性プロモーター（Ｋｌｅｓｓｕｇら、（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
． ４：１３５４−１３６２）、モロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列
（ＭｕＬＶ ＬＴＲ）（Ｗｅｉｓｓら、（１９８５）ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉ
ｒｕｓ、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー、ニ
ューヨーク）、ＳＶ４０初期または後期領域プロモーター（Ｂｅｒｎｏｉｓｔら
、（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ、２９０：３０４−３１０；Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら
、（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、４：８１７；およびＳｐｒａｇ
ｕｅら、（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、４５：７７３）、ラウス肉腫ウイルス
（ＲＳＶ）の３’末端反復配列に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、
１９８０、Ｃｅｌｌ、２２：７８７−７９７）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ
）チミジンキナーゼプロモーター／エンハンサー（Ｗａｇｎｅｒら、（１９８１
）ＰＮＡＳ ８２：３５６７−７１）、および単純ヘルペスウイルスＬＡＴプロ
モーター（Ｗｏｌｆｅら、（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１：
３７９−３８４）を含むが、これに限定されない。
【０１４６】 ある例示的な態様においては、ヒトＳｈｈ遺伝子の５’側方配列の部分を、制
限部位を付加するプライマーを用いて増幅し、以下の断片を産生する。
【０１４７】
【化４】
【０１４８】
【化５】
【０１４９】 上記に示したとおり、プライマー１はヒトＳｈｈ遺伝子の５’非コード領域を
含み、制限酵素ＡｓｕＩＩおよびＣｌａＩが側方に付加されている。プライマー
２はプライマー１に存在する３’に隣接しする５’非コード領域の一部分を含む
。ｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子配列はＸｈｏＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位が側方に
付加されている。精製した増幅物は各々の適切な酵素を用いて切断する。
【０１５０】 ベクターｐＣＤＮＡ１．１（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社）はＣＭＶプロモーターを
含む。本プラスミドを、ＣＭＶプロモーター配列の丁度３’位置を切断するＡｓ
ｕＩＩにより切断する。プライマー１のＡｓｕＩＩ／ＣｌａＩ断片をｐｃＤＮＡ
ベクターのＡｓｕＩＩ切断部位に核酸連結する。ＣｌａＩ／ＡｓｕＩＩ核酸連結
は、正確に挿入されたプライマー１の３’末端におけるＡｓｕＩＩ部位を破壊す
る。
【０１５１】 次に本ベクターをＢａｍＨＩにより切断し、プライマー２のＸｈｏＩＩ／Ｂａ
ｍＨＩ断片をＢａｍＨＩ切断部位に核酸連結する。上と同様に、ＢａｍＨＩ／Ｘ
ｈｏＩＩ核酸連結は、正確に挿入されたプライマー２の５’末端におけるＢａｍ
ＨＩ部位を破壊する。
【０１５２】 独立なコロニーを選択し、ＡｓｕＩＩおよびＢａｍＨＩにより切断し、Ａｓｕ
ＩＩ／ＢａｍＨＩ断片の大きさを決定する。プライマー１およびプライマー２の
両方の配列が正確に挿入されいるコロニーをさらに増幅し、ＡｓｕＩＩおよびＢ
ａｍＨＩにより切断し、以下の遺伝子活性化構築物を産生させる
【０１５３】
【化６】
【０１５４】 本構築物において、側方に位置するプライマー１およびプライマー２配列は、
ヒトＳｈｈ遺伝子のコード配列の上流にあるＣＭＶプロモーターの挿入を可能に
する組換え領域を提供する。同様の方法により、その他の異種プロモーター（ま
たはその他の転写制御配列）をゲノムｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子内に挿入すること
が可能である。
【０１５５】 さらにその他の態様において、例えば、発現を活性化するため、または正の調
節要素を除去するため、例えば、標的遺伝子の発現を阻害するために、置換領域
は単に本来の遺伝子の負の転写調節要素を欠失させる。
【０１５６】 Ｖ．ＰＴＣ治療用化合物の例。 別の態様においては、ｐｔｃ治療用化合物を用いた方法を実行する。このよう
な化合物は例えば、ｐａｔｃｈｅｄと結合し、そのシグナル伝達活性を変化させ
る化合物、ｐａｔｃｈｅｄシグナル伝達経路に関与するタンパク質（例えば、細
胞内の）の結合および酵素活性を変化させる化合物、およびｈｅｄｇｅｈｏｇタ
ンパク質、ｐａｔｃｈｅｄタンパク質またはｐａｔｃｈｅｄの細胞内シグナル伝
達経路に関与するタンパク質の発現レベルを変化させる化合物を用いて産生され
得る。
【０１５７】 精製および組換えｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの利用により、特にニューロ
ン細胞死の病原における役割において、ｈｅｄｇｅｈｏｇおよび／またはｐａｔ
ｃｈｅｄタンパク質の正常な細胞内機能に対するアゴニストまたはアンタゴニス
トのいずれかである小有機分子などの薬剤のスクリーニングに使用することが可
能である分析系の作製が促進される。ある態様においては、本分析はｈｅｄｇｅ
ｈｏｇポリペプチドとｐａｔｃｈｅｄなどのｈｅｄｇｅｈｏｇ受容体との結合を
調節する化合物の能力を評価する。その他の態様においては、本分析は単にｐａ
ｔｃｈｅｄタンパク質のシグナル伝達活性を変化させる試験化合物の能力を計測
する。この方法においては、神経保護活性を有するものを含む様々なｈｅｄｇｅ
ｈｏｇおよび／またはｐｔｃ治療剤が同定され得る。様々な分析型式は十分に存
在し、本開示の観点から、それらは技術者に理解されるであろう。
【０１５８】 化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬剤スクリーニング
プログラムにおいては、所与の時間内に調査する化合物の数を最大にするために
、処理量の高い分析が好ましい。精製または半精製されたタンパク質によって得
ることが可能である無細胞系において行われた分析は、試験化合物によって仲介
される分子標的における変化の急速な発達および比較的容易な検出を可能にする
ために作製され得る点において、しばしば「第一次」スクリーニングとして好ま
れる。さらに、試験化合物の細胞障害性および／または生物学的利用能は一般的
にインビトロの系、すなわち受容体タンパク質との結合親和性の変化に重要であ
ると考えられるとして薬剤の分子標的に対する効果に当初焦点が当てられた分析
、では無視され得る。
【０１５９】 従って、ｐｔｃ治療剤のためのスクリーニング分析の例において、通常ｈｅｄ
ｇｅｈｏｇタンパク質と結合する能力を有する条件下で、興味の対象である化合
物をｈｅｄｇｅｈｏｇ受容体タンパク質（例えば、ｐａｔｃｈｅｄ受容体を発現
している細胞）およびｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質を含む混合物に接触させる。
次にその混合液に試験化合物を含む組成物を添加する。受容体／ｈｅｄｇｅｈｏ
ｇ複合体の検出および定量は試験化合物の受容体タンパク質とｈｅｄｇｅｈｏｇ
ポリペプチドとの複合体形成を阻害する（または強化する）効力の決定のための
手段を提供する。さらに、比較の基準を提供するために、対照の分析を行うこと
もまた可能である。その対照分析において、単離および精製したｈｅｄｇｅｈｏ
ｇポリペプチドを受容体タンパク質に添加し、受容体／ｈｅｄｇｅｈｏｇ複合体
の形成を試験化合物の非存在下で定量する。
【０１６０】 別の態様においては、本発明のｐｔｃ治療剤はｐａｔｃｈｅｄとｓｍｏｏｔｈ
ｅｎｅｄとの結合を破壊するものである。
【０１６１】 神経保護のアゴニストおよびアンタゴニストは区別することが可能であり、そ
の化合物の効力はそれに続くニューロン細胞の試験によって分析することが可能
である。
【０１６２】 ある実例となる態様においては、ｈｅｄｇｅｈｏｇ受容体として利用されるポ
リペプチドはｐａｔｃｈｅｄタンパク質から産生される。従って、例となるスク
リーニング分析は、例えば、ヒトｐａｔｃｈｅｄ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ４
３１４８）またはその他の脊椎動物種（ニワトリｐａｔｃｈｅｄについてはＧｅ
ｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ４００７４、およびマウスｐａｔｃｈｅｄについてはＵ４
６１５５を参照せよ）またはその他の無脊椎動物種から得たｐａｔｃｈｅｄタン
パク質の全体または適切な一部分を含む。ｐａｔｃｈｅｄタンパク質はスクリー
ニング分析において完全長のタンパク質（好ましくは細胞表面に発現している）
として、または択一的に、ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドに結合する全長のタン
パク質の一断片として、例えば、１個または両方の実質的な細胞外ドメイン（例
えば、ヒトｐａｔｃｈｅｄタンパク質の残基Ａｓｎ１２０−Ｓｅｒ４３８および
／またはＡｒｇ７７０−Ｔｒｐ１０２７に対応する）として、提供され得る。例
えばｐａｔｃｈｅｄタンパク質は、例えば細胞外ドメインの一つの調製物、また
は不統一なリンカーによって共有結合により結合した両方の細胞外ドメインの調
製物として、可溶状態で提供され得る（Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８）ＰＮＡＳ ８５：４７８９；および米国特許第５，０９１，５１３号を参照せよ）。別の
態様においては、本タンパク質はリポソーム調製物の一部として提供することま
たは細胞表面に発現することが可能である。本ｐａｔｃｈｅｄタンパク質は例え
ば異種細胞内で異所的に発現させた組換え遺伝子に由来し得る。例えば、本タン
パク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって、卵母細胞、哺乳類細胞（例えば
、ＣＯＳ、ＣＨＯ、３Ｔ３またはその類）または酵母細胞において発現させるこ
とが可能である。これらの組換え体細胞は受容体の結合、シグナル伝達または遺
伝子発現分析のために使用され得る。Ｍａｒｇｉｏら、（１９９６）Ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔ １２２：１２２５−１２３３は、アフリカツメガエルの卵母細胞
内で異所的に発現させたヒトｈｅｄｇｅｈｏｇのニワトリｐａｔｃｈｅｄタンパ
ク質への結合分析を示す。Ｍａｒｇｉｏらは本薬剤スクリーニング分析に適用す
ることが可能である。その参考文献に示されているように、Ｓｈｈはｐａｔｃｈ
ｅｄタンパク質に選択的、飽和的に用量依存的な方法で結合し、このようにｐａ
ｔｃｈｅｄがＳｈｈの受容体であることを示している。
【０１６３】 ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドとｈｅｄｇｅｈｏｇ受容体との複合体形成様々
な技術によって検出することが可能である。例えば、複合体の形成の調節は、例
えば、放射性標的、蛍光標識、または酵素的標識されたｈｅｄｇｅｈｏｇポリペ
プチドなどの検出可能な標識化タンパク質を用いて、免疫分析によって、または
クロマトグラフ検出によって定量することが可能である。
【０１６４】 一般に、無細胞分析においては、分析の自動化をはかることと同様に、一方の
タンパク質の未結合型からの受容体／ｈｅｄｇｅｈｏｇ複合体の分別を促進する
ために、ｈｅｄｇｅｈｏｇ受容体またはｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドのいずれ
かを固定化することが好ましい。ある態様においては、タンパク質が物質に結合
するのを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供することが可能で
ある。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／受容体（ＧＳＴ／受容
体）融合タンパク質はグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ社、セントルイス、ＭＯ）またはグルタチオン由来のマイクロタイター
プレートに吸着することが可能である。それは次に例えば35Ｓ−標識したｈｅｄ
ｇｅｈｏｇポリペプチドなどのｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドおよび試験化合物
と結合させ、例えば塩およびｐＨにおける生理的条件において、しかし僅かによ
りストリンジェントな条件が望ましい可能性があるが、複合体形成を誘導する条
件下で保温した。保温の後、未結合のｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドを除去する
ためにビーズを洗浄し、ビーズ物質に結合した放射性標識量を直接（例えば、シ
ンチレーション室内に置いたビーズ）、または受容体／ｈｅｄｇｅｈｏｇ複合体
が分離した後の上清内において、決定する。あるいは、複合体はビーズからの解
離、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによる分離、および標準的な電気泳動技術を用いて、
ビーズ画分内に見られるｈｅｄｇｅｈｏｇペプチドの量をゲルから定量すること
が可能である。
【０１６５】 物質上にタンパク質を固定するためのその他の技術もまた対象分析における使
用のために利用可能である。例えば、ｈｅｄｇｅｈｏｇ受容体タンパク質の可溶
部分はビオチンおよびストレプトアビジンの共役を利用して固定することが可能
である。例えば、ビオチン化された受容体分子はビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロ
キシ−スクシニミド）から当業者に良く知られた技術を用いて調製すること（例
えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、ロックフォード
、ＩＬ）、およびストレプトアビジンで覆った９６穴プレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）内に固定することが可能である。あるいは、ｈｅｄｇｅｈ
ｏｇ受容体に反応するがｈｅｄｇｅｈｏｇ結合には干渉しない抗体をプレートの
穴に添加すること、および受容体を抗体の共役によって穴内に捕らえることが可
能である。上記のように、ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの調製物および試験化
合物を受容体の存在するプレートの穴内で保温し、穴内に捕らえられた受容体／
ｈｅｄｇｅｈｏｇ複合体の量を定量することが可能である。そのような複合体を
検出するための方法の例は、ＧＳＴ固定した複合体に関する上記の記載に加えて
、ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドと反応する抗体または受容体タンパク質に反応
する抗体を用いてｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドとの結合に関して比較する複合
体の免疫検出；ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質に結合した酵素活性の検出を基にし
た酵素−結合分析を含む。後者の例においては、酵素は化学的に共役させること
、またはｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドとの融合タンパク質として提供すること
が可能である。説明のために、ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドはアルカリホスフ
ァターゼと化学的に架橋または遺伝学的に融合することが可能であり、複合体内
に捕らえられたｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの量は酵素の色素生産性基質、例
えばパラニトロフェニルリン酸など、を用いて調査することが可能である。同様
に、ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドおよびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼを含む融合タンパク質を提供することが可能であり、複合体形成は１−クロロ
−２，４−ジニトロベンゼンを用いてＧＳＴ活性を検出することによって定量す
ることが可能である（Ｈａｂｉｇら、（１９７４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
４９：７１３０）。
【０１６６】 複合体内に捕らえられたタンパク質の一種類を定量するための免疫検出に頼っ
た方法のために、本明細書に記載した抗ｈｅｄｇｅｈｏｇ抗体などの本タンパク
質に対する抗体を使用することが可能である。あるいは、複合体内に検出される
べきタンパク質は、ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドまたはｈｅｄｇｅｈｏｇ受容
体配列に加えてそれに対する抗体が（例えば商業源から）既に入手可能である第
二のポリペプチドを含む融合タンパク質の形態で「抗原決定基付加」することが
可能である。例えば、上記のＧＳＴ融合タンパク質もまたＧＳＴ部分に対する抗
体を用いた結合の定量のために利用することが可能である。その他の有用な抗原
決定基タグは、ｐＦＬＡＧ系（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ社）またはｐＥＺＺ−プロテインＡ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ＮＪ）と同
様に、ｃ−ｍｙｃに由来する１０残基配列を含むｍｙｃ−抗原決定基（例えば、
Ｅｌｌｉｓｏｎら、（１９９１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６：２１１５０
−２１１５７を参照せよ）を含む。
【０１６７】 ｈｅｄｇｅｈｏｇ受容体（またはその他のｈｅｄｇｅｈｏｇ結合分子）の望ま
しい部分は可溶状態では提供され得ないが、受容体の操作可能で単離可能な由来
種を提供するためにリポソーム小胞を使用することが可能である。例えば、真正
および組換え型の両方のｐａｔｃｈｅｄタンパク質を人工脂質小胞（例えば、ホ
スファチジルコリンリポソーム）内で、または細胞膜由来小胞（例えば、Ｂｅａ
ｒら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：８０９−８１８；Ｎｅｗｔｏｎら、（１９８
３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２：６１１０−６１１７；およびＲｏｂｅｒ
ｔら、（１９８７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：１１３６９−１１３７４
を参照せよ）内で再構築することが可能である。
【０１６８】 上記のような無細胞分析に加えて、ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の容易に利用
可能な由来源は、野生型ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の神経保護活性の小分子ア
ゴニストの同定のために、無細胞分析の作製を促進する技術によって提供される
。組合わせライブラリーのスクリーニングのための、細胞を基にした上記の分析
と同様に、細胞への単純な結合から試験試薬の存在下または非存在下での標的細
胞による栄養性反応までのすべてを計測する分析とともに、ドーパミン作動性お
よびＧＡＢＡ−作動性の神経などの、ｈｅｄｇｅｈｏｇ依存型保護に感受性であ
るニューロン細胞をｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質および興味の対象である試験試
薬に接触させることが可能である。無細胞分析と同様に、ｈｅｄｇｅｈｏｇ活性
に統計的に有意な変化（阻害または活性化）をもたらす試薬を同定することが可
能である。
【０１６９】 その他の態様においては、無細胞分析は例えば細胞表層膜またはリポソーム調
製物において、ｐａｔｃｈｅｄとｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄタンパク質の結合を破壊
する試薬に対して計測する。
【０１７０】 天然にｐａｔｃｈｅｄタンパク質を発現する細胞の特徴付けに加えて、ｐａｔ
ｃｈｅｄを異所的に発現するように遺伝学的に組換えられている細胞をスクリー
ニング分析に利用することが可能である。例として、ｐａｔｃｈｅｄタンパク質
を低レベルで発現するまたは発現を欠く細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細
胞、ＣＯＳ細胞または酵母細胞は、ｐａｔｃｈｅｄタンパク質を異所的に発現さ
せるための標準的な技術を用いて遺伝学的に組換えることが可能である。（上記
のＭａｒｇｉｏらを参照せよ）。
【０１７１】 その結果生じた組換え体細胞、例えば機能的なｐａｔｃｈｅｄ受容体を発現す
る細胞は、ｈｅｄｇｅｈｏｇ結合に対するアゴニストおよびアンタゴニストを同
定するための受容体結合分析に利用することが可能である。結合分析は細胞全体
を使用して実行され得る。さらに、本発明の組換え体細胞は、ｈｅｄｇｅｈｏｇ
依存性シグナル伝達経路に関与するタンパク質をコードするその他の異種遺伝子
を含むように組換えることが可能である。ｈｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達カスケ
ードの機能的再構築に感受性である分析とともに、例えば、ｓｍｏｏｔｈｅｎｅ
ｄ，ｃｏｓｔａｌ−２および／またはｆｕｓｅｄの１個またはそれ以上の遺伝子
産物を試薬細胞内でｐａｔｃｈｅｄとともに共発現することが可能である。
【０１７２】 あるいは、再構築したｐａｔｃｈｅｄタンパク質を使用するリポソーム調製物
を利用することが可能である。真正または組換え由来源からの界面活性剤による
抽出物から精製したｐａｔｃｈｅｄタンパク質は人工脂質小胞（例えば、ホスフ
ァチジルコリンリポソーム）内で、または細胞膜由来小胞（例えば、Ｂｅａｒら
（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：８０９−８１８；Ｎｅｗｔｏｎら、（１９８３）
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２：６１１０−６１１７；およびＲｏｂｅｒｔら
、（１９８７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：１１３６９−１１３７４を参
照せよ）内で再構築することが可能である。その結果生じたリポソームの層状構
造および大きさは電子顕微鏡を用いて決定することが可能である。再構築した膜
内でのｐａｔｃｈｅｄタンパク質の外向きの方向性は、例えば免疫電子顕微鏡に
よって示すことが可能である。ｈｅｄｇｅｈｏｇ−ｐａｔｃｈｅｄ相互作用の潜
在的な調節因子を同定するために、候補である試薬の存在下における、ｐａｔｃ
ｈｅｄを含むリポソームおよびタンパク質を含まないリポソームのｈｅｄｇｅｈ
ｏｇタンパク質結合活性を比較することが可能である。
【０１７３】 これらの細胞を基にした分析において使用したｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質は
精製された物質源（天然または起源の組換え体）として、またはタンパク質を発
現し、標的細胞とともに共培養する細胞／組織の形態で提供され得る。（誘導よ
りも）単純な結合が分析のために計測されたｈｅｄｇｅｈｏｇ活性である無細胞
系分析と同様に、タンパク質は上記の技術のいずれか、例えば蛍光、酵素、また
は放射線によって標識すること、または免疫分析によって検出することが可能で
ある。
【０１７４】 結合研究に加えて、例えばｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐａｔｃｈｅｄ活性のアゴ
ニストなどの同定された調節因子に対する機能分析の使用が可能である。試験試
薬と接触したｐａｔｃｈｅｄ発現細胞における二次メッセンジャーまたは遺伝子
発現の変化などの細胞内シグナルの変化を検出することによって、ｐａｔｃｈｅ
ｄシグナル伝達に対するアンタゴニスト候補物を同定することが可能である（例
えば、ｈｅｄｇｅｈｏｇ様の活性を有するもの）。
【０１７５】 ｐａｔｃｈｅｄ、転写因子ｃｕｂｉｔｕｓ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｕｓ（ｃｉ）
、セリン／スレオニンキナーゼｆｕｓｅｄ（ｆｕ）およびｃｏｓｔａｌ−２、ｓ
ｍｏｏｔｈｅｎｅｄおよびｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｆｕｓｅｄの遺伝子産
物を含む、数多くの遺伝子産物がｐａｔｃｈｅｄ媒介シグナル伝達に関与してい
る。
【０１７６】 ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質のｐａｔｃｈｅｄとの相互作用は下流のエフェク
ターの活性化および阻害に関与するカスケードを開始させる。その最終的な結末
は、幾つかの例では、遺伝子の転写または翻訳における検出可能な変化である。
ｐａｔｃｈｅｄシグナル伝達の潜在的な転写標的は、ｐａｔｃｈｅｄ遺伝子自身
（ＨｉｄａｌｇｏおよびＩｎｇｈａｍ、１９９０ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １
１０：２９１−３０１；Ｍａｒｇｉｏら、１９９６）、およびショウジョウバエ
のｃｕｂｉｔｕｓ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｕｓ遺伝子の脊椎動物相同物であるＧＬ
Ｉ遺伝子（Ｈｕｉら、（１９９４）Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １６２：４０２−４１３
）である。ｐａｔｃｈｅｄ遺伝子発現はＳｈｈに反応する肢芽および神経板の細
胞において誘導されることが示されている（Ｍａｒｇｉｏら（１９９６）ＰＮＡ
Ｓ、出版中；Ｍａｒｇｉｏら、（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：
１２２５−１２３３）。ＧＬＩ遺伝子は亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを有
する推定上の転写因子をコードする（Ｏｒｅｎｉｃら、（１９９０）Ｇｅｎｅｓ
＆Ｄｅｖ ４：１０５３−１０６７；Ｋｉｎｚｌｅｒら、（１９９０）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０：６３４−６４２）。ＧＬＩ遺伝子の転写は肢芽にお
いてｈｅｄｇｅｈｏｇに応答して上方向制御（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）を受け、
その一方でＧＬＩ３遺伝子はｈｅｄｇｅｈｏｇ誘導に応答して下方向制御（ｄｏ
ｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ）を受けることが報告されている。これらの遺伝子の上方
向または下方向制御の原因である、そのような標的遺伝子、例えばｐａｔｃｈｅ
ｄまたはＧＬＩ遺伝子から転写制御配列を選択することによって、およびそのよ
うなプロモーターをレポーター遺伝子に連結することによって、ｐａｔｃｈｅｄ
シグナル伝達経路を修飾する特異的な試験化合物の能力に感受性である、転写を
基にした分析を実行することが可能である。このように、レポーター遺伝子の発
現は、例えば、神経保護試薬として有用であり得るｐｔｃのアンタゴニストとし
て作用する化合物の発達のための、価値のあるスクリーニング用具を提供する。
【０１７７】 本発明のレポーター遺伝子を基にした分析は、前述のカスケードの事象の終末
段階、例えば転写修飾を測定する。従って、当該分析のある態様の実行において
、ｐｔｃシグナル伝達に依存したシグナルの検出を作製するために、レポーター
遺伝子構築物を試薬細胞内に挿入する。標的遺伝子の転写制御配列内に存在する
ｐｔｃシグナルに反応する潜在的な制御領域を同定するために、標準的な技術を
用いて標的遺伝子のゲノムクローンの段階削除物を構築することが可能である。
例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９）；米国特許第５，２６６，４
８８号；Ｓａｔｏら、（１９９５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：１０３１
４−１０３２２；およびＫｕｂｅら、（１９９５）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ７：１−
７を参照せよ。遺伝子の５’−隣接領域から得た段階切除した一連のＤＮＡ断片
をルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター遺伝子の上流に配置し、ｐａｔｃｈｅ
ｄ発現細胞においてレポーター遺伝子の発現を指示する能力を分析する。ｐａｔ
ｃｈｅｄ依存性シグナルの原因である制御配列を決定するために、レポーター遺
伝子構築物に一時的にトランスフェクトさせた宿主細胞に対して、ｈｅｄｇｅｈ
ｏｇの存在下または非存在下でレポーター遺伝子の発現誘導を計測することが可
能である。
【０１７８】 当該分析のある態様の実行においては、ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質による誘
導によって産生される二次メッセンジャーに依存したシグナルの検出を実行する
ために、レポーター遺伝子構築物を試薬細胞に挿入する。一般的に、レポーター
遺伝子構築物は、ｈｅｄｇｅｈｏｇ依存性検出シグナルを提供するレポーター遺
伝子の発現レベルとともにｈｅｄｇｅｈｏｇ活性の原因である転写制御領域の１
個またはそれ以上と操作的に連結したレポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝
子からの発現量は、当業者に既知であるいずれかの適切な方法を用いて測定する
ことが可能である。例えば、レポーター遺伝子からのｍＲＮＡの発現はＲＮＡｓ
ｅ保護法またはＲＮＡを基にしたＰＣＲを用いた検出が可能であり、またはレポ
ーター遺伝子からのタンパク質産物は、特徴的な染色または固有活性によって同
定が可能である。レポーター遺伝子からの発現量は次に試験化合物（またはｈｅ
ｄｇｅｈｏｇ）の非存在下での同細胞における発現量と比較する。または、標的
受容体タンパク質を欠く実質的に同一の細胞における転写量と比較することが可
能である。転写量における実質的にまたはその他のあらゆる有意な差は、試験化
合物が何らかの方法でｐａｔｃｈｅｄタンパク質のシグナル伝達を変化させたこ
とを示唆している。例えば、当該試験化合物は潜在的なｐｔｃ治療剤である。
【０１７９】 以下にさらなる詳細を記述するように、好ましい態様においては、レポーター
遺伝子産物はその産物に関連した固有活性によって検出される。例えば、レポー
ター遺伝子は、酵素活性によって色、蛍光、または発色を指標とした検出シグナ
ルを引き起こす遺伝子産物をコードすることが可能である。その他の好ましい態
様においては、レポーターまたはマーカー遺伝子は選択的な増殖利点を提供する
。例えば、レポーター遺伝子は細胞生存率を増強すること、細胞の栄養要求性か
ら解放すること、および／または薬剤耐性を供給することが可能である。
【０１８０】 好ましい受容体遺伝子は容易に検出可能なものである。当該受容体遺伝子は、
望ましい転写調節配列を含むかまたはその他の望ましい特性を示す遺伝子との融
合遺伝子の形態で構築物に含まれ得る。レポーター遺伝子の例は、ＣＡＴ（クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）（ＡｌｔｏｎおよびＶａｐｎｅ
ｋ（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２８２：８６４−８６９）ルシフェラーゼ、およ
びβ−ガラクトシダーゼ等のその他の酵素検出系；ホタルのルシフェラーゼ（ｄ
ｅＷｅｔら、（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５−７３７）
；バクテリアのルシフェラーゼ（ＥｎｇｅｂｒｅｃｈｔおよびＳｉｌｖｅｒｍａ
ｎ（１９８４）ＰＮＡＳ １：４１５４−４１５８；Ｂａｌｄｗｉｎら、（１９
８４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：３６６３−３６６７）；アルカリホス
ファターゼ（Ｔｏｈら、（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８２：２
３１−２３８、Ｈａｌｌら、（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．２：
１０１）、ヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼ（ＣｕｌｌｅｎおよびＭａｌｉ
ｍ（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１６：３６２−３６８
）を含むが、これに限定されない。
【０１８１】 レポーター遺伝子構築物に含まれ得る転写調節要素は、プロモーター、エンハ
ンサー、および受容体および活性化因子結合部位を含むがこれに限定されない。
適切な転写調節要素は、ｐａｔｃｈｅｄシグナル伝達経路の調節後に発現が誘導
される遺伝子の転写調節領域に由来し得る。転写調節要素が由来する遺伝子の好
ましい性質は以下のことを含むが、これに限定されない。すなわち、休止細胞に
おける低量または検出不可能な発現、細胞外刺激から数分内での転写レベルでの
迅速な誘導、一時的およびタンパク質新規合成とは独立である誘導、そして次に
続く転写のシャットオフはタンパク質新規合成を必要とし、およびこれらの遺伝
子から転写されたｍＲＮＡは短い半減期を有する。これらの特性の全てが備わっ
ている必要はない。
【０１８２】 さらに別の態様においては、例えば、細胞内カルシウムの移動、リン脂質代謝
またはアデニル酸シクラーゼ活性を定量するなど、検出工程において二次メッセ
ンジャーの産生を直接測定することが可能である。リン脂質加水分解の産物ＩＰ 3 、ＤＡＧまたはｃＡＭＰの測定が可能である。例えば、近年の研究により、プ ロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）はｈｅｄｇｅｈｏｇ／ｐａｔｃｈｅｄシグナル伝
達の可能な構成成分として示唆されている（Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔら、（
１９９６）Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ １０：６４７）。これらの系において、高いＰ
ＫＡ活性はｈｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達に拮抗することが示されている。逆に
、ＰＫＡの阻害因子はｈｅｄｇｅｈｏｇの挙動を模倣および／または強調する。
ＰＫＡの作用がｈｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達の直接下流であるかまたは並行で
あるかは不明であるが、ｈｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝達がＰＫＡ活性の阻害を経
由して起こる可能性がある。このように、ＰＫＡ活性の検出は当該分析のための
潜在的な情報を提供する。
【０１８３】 好ましい態様においては、ｐｔｃ治療剤はＰＫＡ阻害因子である。ペプチジル
および有機化合物の両方を含む様々なＰＫＡ阻害因子が当業者に既知である。例
えば、ｐｔｃ治療剤は以下の一般式：
【０１８４】
【化７】
【０１８５】 ［式中、 Ｒ1およびＲ2は、各々独立に水素、並びに、結合価および安定性に応じて低
級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、カルボニル（カルボキシル、エ
ステル、蟻酸エステルまたはケトン等）、チオカルボニル（チオエステル、チオ
酢酸またはチオ蟻酸エステル等）、アミノ、アシルアミノ、アミド、シアノ、ニ
トロ、アジド、硫酸エステル、スルホン酸エステル、スルホンアミド、−（ＣＨ 2 ）m−Ｒ8、−（ＣＨ2）m−ＯＨ、−（ＣＨ2）m−Ｏ−低級アルキル、−（ＣＨ2 ）m−Ｏ低級アルケニル、−（ＣＨ2）n−Ｏ−（ＣＨ2）m−Ｒ8、−（ＣＨ2）m−
ＳＨ、−（ＣＨ2）m−Ｓ−低級アルキル、−（ＣＨ2）m−Ｓ−低級アルケニル、
−（ＣＨ2）n−Ｓ−（ＣＨ2）m−Ｒ8であるか、または、 Ｒ1およびＲ2はＮと共に（置換または未置換の）複素環であり； Ｒ3は存在しないか、または、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキ ニル、カルボニル（カルボキシル、エステル、蟻酸エステルまたはケトン等）、
チオカルボニル（チオエステル、チオ酢酸またはチオ蟻酸エステル等）、アミノ
、アシルアミノ、アミド、シアノ、ニトロ、アジド、硫酸エステル、スルホン酸
エステル、スルホンアミド、−（ＣＨ2）m−Ｒ8、−（ＣＨ2）m−ＯＨ、−（Ｃ Ｈ2）m−Ｏ−低級アルキル、−（ＣＨ2）m−Ｏ−低級アルケニル、−（ＣＨ2）n −Ｏ−（ＣＨ2）m−Ｒ8、−（ＣＨ2）m−ＳＨ、−（ＣＨ2）m−Ｓ−低級アルキ ル、−（ＣＨ2）m−Ｓ−低級アルケニル、−（ＣＨ2）n−Ｓ−（ＣＨ2）m−Ｒ8 等の、イソキノリン環の１またはそれ以上の置換基であり； Ｒ8は置換または未置換のアリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロ アルケニルまたは複合環であり；そして、 ｎおよびｍは各々独立に存在０であるか、または１ないし６の範囲の整数であ
る。］ で表されるような５−イソキノリンスルホンアミドで有り得る。
【０１８６】 好ましい態様において、ＰＫＡ阻害因子はＮ−［２−（（ｐ−ブロモシンナミ
ル）アミノ）エチル］−５−イソキノリンスルホンアミド（Ｈ−８９；Ｃａｌｂ
ｉｏｃｈｅｍ社、型録番号３７１９６３）、例えば、以下の構造式を有する：
【０１８７】
【化８】
【０１８８】 もう一つの態様において、ＰＫＡ阻害因子は１−（５−イソキノリンスルホニ
ル）−２−メチルピペラジン（Ｈ−７；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、型録番号３７
１９５５）、例えば以下の構造式を有する：
【０１８９】
【化９】
【０１９０】 さらに別の態様においては、ＰＫＡ阻害因子は次の構造を有するＫＴ５７２０
（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、型録番号４２０３１５）である
【０１９１】
【化１０】
【０１９２】 様々なヌクレオチド類似物はＰＫＡ阻害因子としてもまた有用である。例えば
、当該方法はＰＫＡのキナーゼ活性を阻害するサイクリックＡＭＰ類似物、例え
ば、以下の８−ブロモｃＡＭＰまたはジブチリル−ｃＡＭＰなど、を実行するこ
とが可能である：
【０１９３】
【化１１】
【０１９４】 ＰＫＡ活性のペプチジル阻害因子の例は、ＰＫＡ熱安定阻害因子（例えばアイ
ソフォームα；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、型録番号５３９４８８、およびＷｅｎ
ら、（１９９５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：２０４１を参照せよ。） あるｈｅｄｇｅｈｏｇ受容体はホスホリパーゼの活性を刺激し得る。イノシト
ール脂質は標準的な脂質抽出技術を用いて抽出および解析することが可能である
。全３種類のイノシトール脂質（ＩＰ1、ＩＰ2、ＩＰ3）水可溶性派生物は放射 性標識技術またはＨＰＬＣを用いて定量することもまた可能である。
【０１９５】 細胞内カルシウムの移動または細胞外からのカルシウムの流入はｈｅｄｇｅｈ
ｏｇ刺激またはその欠乏に対する反応であり得る。試薬細胞内のカルシウム流動
は標準的な技術を用いて測定することが可能である。適切なカルシウム指示物、
蛍光、生物発光、金属クロム、またはＣａ++感受性微小電極の選択は細胞種、お
よび研究中の事象の量および時間定数にに依存する（Ｂｏｒｌｅ（１９９０）Ｅ
ｎｖｉｒｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ ８４：４５−５６）。Ｃａ++ 検出の方法の例として、標準的な方法を用いて細胞にＣａ++感受性蛍光色素ｆｕ
ｒａ−２またはｉｎｄｏ−１を添加することが可能である。そしてＣａ++の何ら
かの変化は蛍光光度計を用いて測定可能である。
【０１９６】 本分析のある態様においては、細胞のリン酸化における変化をスクリーニング
することが望ましくあり得る。例として、セリン／スレオニンキナーゼをコード
するショウジョウバエ遺伝子ｆｕｓｅｄ（ｆｕ）はｈｅｄｇｅｈｏｇシグナル伝
達における潜在的な下流の標的として同定されている。（Ｐｒｅａｔら、１９９
０ Ｎａｔｕｒｅ ３４７：８７−８９；Ｔｈｅｒｏｎｄら、１９９３，Ｍｅｃ
ｈ．Ｄｅｖ．４４：６５−８０）。セリン／スレオニンキナーゼの活性化を調節
する化合物の能力は、リン酸化されたセリンまたはスレオニン残基に対する抗体
を使用したコロニーイムノブロット法（ＬｙｏｎｓおよびＮｅｌｓｏｎ（１９８
４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：７４２６−７４３
０）を用いてスクリーニングが可能である。そのような分析を実行するための試
薬は商業的に入手可能であり、例えば、それらの残基におけるリン酸化の上昇を
測定するホスホセリンおよびホスホスレオニン特異的抗体は商業源より購入可能
である。
【０１９７】 さらにもう一つの態様において、本ｐｔｃ治療剤はｐａｔｃｈｅｄ媒介シグナ
ル伝達経路に関与するタンパク質の発現を阻害するアンチセンス分子である。説
明すると、ｆｕｓｅｄ，ｃｏｓｔａｌ−２，ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄおよび／また
はＧｌｉ遺伝子、またはｐａｔｃｈｅｄ自身などのｐａｔｃｈｅｄシグナル伝達
に関与するタンパク質の発現を阻害することによって、例えばドーパミン作動性
またはＧＡＢＡ作動性細胞の分化状態を維持する能力を変化させる、ｐａｔｃｈ
ｅｄシグナル伝達経路の能力は活性化または抑圧などの変化を起こし得る。
【０１９８】 本明細書で使用さているとおり、「アンチセンス」治療は、オリゴヌクレオチ
ドプローブ、または、ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質、ｐａｔｃｈｅｄ、またはｐ
ａｔｃｈｅｄ媒介シグナル伝達経路に関与するタンパク質をコードする細胞内Ｒ
ＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと細胞内条件下で特異的にハイブリダイズ（例
えば、結合）するその派生物の、投与またはインサイチュ産生を意味する。その
ハイブリッド形成は、例えば転写および／または翻訳を阻害することによって、
そのタンパク質の合成を阻害する。その結合は慣用的な塩基対相補性によって、
または、例えばＤＮＡ二重鎖への結合の場合、二重らせんの大溝における特異的
な相互作用を通して、成され得る。一般的に、「アンチセンス」治療は当該技術
分野において一般的に使用されている範囲のものについて言及し、オリゴヌクレ
オチド配列への特異的結合に依存するあらゆる治療を含む。
【０１９９】 本発明のアンチセンス構築物は、例えば、細胞内で転写された場合に標的であ
る細胞内ＲＮＡの少なくとも独特な一部分に対して相補的であるＲＮＡを産生す
る発現プラスミドとして提供される。あるいは、本アンチセンス構築物は、細胞
に導入した場合標的遺伝子のｍＲＮＡおよび／またはゲノム配列とハイブリダイ
ズすることによって発現の阻害を引き起こす、エクスビボで産生されたオリゴヌ
クレオチドプローブである。そのようなオリゴヌクレオチドプローブは、好まし
くは、例えばエキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ等の内在性
のヌクレアーゼに対して耐性であり、それゆえにインビボで安定である修飾され
たオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用する
ための核酸分子の例は、ＤＮＡのホスホロアミデート、ホスホロチオネートおよ
びメチルホスホネート類似物である（米国特許第５，１７６，９９６号；第５，
２６４，５６４；および第５，２５６，７７５号も参照せよ）。さらに、アンチ
センス治療に有用であるオリゴマーを構築するための一般的な方法は、例えば、
Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら、（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：
９５８−９７６；およびＳｔｅｉｎら、（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４
８：２６５９−２６６８に論評されている。
【０２００】 本発明の方法において使用するアンチセンスオリゴヌクレオチドを構築する際
に、幾つか考慮に入れるべき事項がある：（１）オリゴは５０％またはそれ以上
のＧＣ含量を有するべきである；（２）３またはそれ以上の個数のＧの連続配列
を避ける；および（３）オリゴヌクレオチドは２５−２６量体より長くしない。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを試験する際に、不適性調節が構築され得る。
同一の塩基比を保持するために、調節は、一致するアンチセンスオリゴヌクレオ
チドの順序に配列を逆転させることによって成される。
【０２０１】 説明上の態様においては、本ｐｔｃ治療剤は、例えばｈｅｄｇｅｈｏｇによっ
てｐａｔｃｈｅｄの阻害を模倣するために、ｐａｔｃｈｅｄの発現を阻害するた
めのアンチセンス構築物である。アンチセンス構築物の例は以下を含む：
【０２０２】
【化１２】
【０２０３】 ＶＩ．ＨＥＤＧＥＨＯＧおよびＰＴＣ治療剤の医薬的調製物の例： 処方されるｈｅｄｇｅｈｏｇおよびｐｔｃ治療剤の由来源は試薬固有の形態に
依存する。小有機分子およびペプチジル断片は化学的に合成され、そして医薬的
／美容的使用に適した純粋な形態で提供される。天然抽出物の産物は当業者に既
知の技術に従って精製することが可能である。例えば、Ｃｏｘら、米国特許第５
，２８６，６５４号は天然に生じた分泌タンパク質の精製方法を記述しており、
それはｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの精製に適用可能である。ｈｅｄｇｅｈｏ
ｇポリペプチドの組換え体由来源もまた使用可能である。例えば、ｈｅｄｇｅｈ
ｏｇポリペプチドをコードする遺伝子は、とりわけ、ＰＣＴ刊行物ＷＯ９５／１
８８５６およびＷＯ９６／１７９２４に由来することが既知である。
【０２０４】 神経組織を処理する技術により、医薬的または美容的調製物において処方され
るｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤の効果量を決定することが可能である。
【０２０５】 本発明の方法で使用したｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤の処方は最も好
ましくは、適切な組成物の形態において適用される。適切な組成物として、全身
または局所的に（くも膜下腔内など）薬剤を投与するために通常使用される全て
の組成物が引用され得る。活性成分と反応しないように、医薬的に許容可能な担
体は実質的に不活性であるべきである。適切な不活性担体は水、アルコール、ポ
リエチレングリコール、ミネラルオイルまたは石油ゲル、プロピレングリコール
およびその類を含む。
【０２０６】 本発明の医薬組成物を調製するために、活性成分として効果量の特定のｈｅｄ
ｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤は、担体が投与に望ましい調製物の形態に依存し
て広範な形態を取りうるような、完全に混合された混合物内で医薬的に許容可能
な担体に結合している。これらの薬剤組成物は、特に経口投与、経腸投与、経皮
投与、または非経口注射に適した単一の剤形であることが望ましい。例えば、経
口剤形での組成物の調製においては、例えば水、グリコール、オイル、アルコー
ル、および例えば懸濁液、シロップ、エリキシル、および溶液等の、経口液体調
製物の場合のそれに類するもの等；あるいは澱粉、砂糖、カオリン、潤滑油、結
合剤、分解試薬、および、散剤、丸剤、カプセル剤、および錠剤の場合のそれに
類するもの等の個体の担体の、通常の医薬的な媒体のいずれかを使用することが
可能である。投与の際の容易さゆえに、固体の医薬的な担体が明らかに使用され
る場合において、錠剤およびカプセル剤が最も有利な経口の剤形単位である。非
経口の組成物においては、その他の成分は例えば溶解性を補助するために含むこ
とが可能であるものの、担体は少なくとも大部分は通常滅菌水を含む。例えば注
入可能な溶液は、担体が含む生理食塩水溶液、グルコース溶液、または生理食塩
水およびグルコースの混合溶液中に調製することが可能である。注入可能な懸濁
液は、適切な液体担体、懸濁試薬およびその類が使用され得る場合においても調
製が可能である。また含まれるのは使用直前に液体形態調製物に変換する個体形
態の調製物である。経皮投与に適した組成物においては、所望により担体は浸透
増強試薬および／または適切な保湿試薬を含み、所望により少ない割合で存在す
るあらゆる天然の適切な付加物と結合させる。その付加物は皮膚に有意な欠失効
果を誘導しない。
【０２０７】 投与を容易にすることおよび投与量の統一のため、剤形単位で本対象組成物を
投与することは特に有利である。本明細書および特許請求の範囲において使用す
る剤形単位は、必要である医薬的な担体と結合して望ましい治療効果を産生する
と計算される、前決定された量の活性成分を各々の単位が有する単一の投与量と
して適した、物理的に別々の単位について言及する。そのような剤形単位の例は
錠剤（切れ目の入った、または被覆させた錠剤を含む）、カプセル剤、丸剤、散
剤袋、ウエハース、注入可能な溶液または懸濁液、小匙一杯、大匙一杯およびそ
の類、および分裂したその集合体である。
【０２０８】 本発明の医薬組成物は前述のとおり、美容上の利用の可能性も含めて多くの応
用に利用することが可能である。当業者に既知である美容組成物は、好ましくは
低アレルギーおよびｐＨ調整済のものが特に好ましく、化粧水、パック、皮膚乳
液または乳性ローションを含む。本組成物はｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療
剤の他に、そのような調整物に通常使用される成分を有する。そのような成分の
例は、オイル、脂肪、ワックス、表面活性剤、湿潤剤、濃化剤、抗酸化薬、粘度
安定剤、キレート試薬、緩衝液、保存料、香料、色素、低級アルカノール、およ
びその類である。所望により、抗炎症試薬、抗細菌剤、抗菌剤、消毒剤、ビタミ
ン、日焼け止め剤等の、さらなる成分を組成物に取り込むことも可能である。
【０２０９】 オイルの例は、オリーブオイルおよび酸化オイル等の脂肪およびオイル；蜜蝋
およびラノリン等のワックス；流動パラフィン、セレシンおよびスクアラン等の
炭化水素；ステアリン酸およびオレイン酸等の脂肪酸；セチルアルコール、ステ
アリルアルコール、ラノリンアルコールおよびヘキサデカノール等のアルコール
；および、イソプロピルミリスチン酸エステル、イソプロピルパルミチン酸エス
テルおよびブチルステアリン酸エステル等のエステル、を含む。表面活性剤の例
として、以下を引用すべきである：ステアリン酸ナトリウム、セチル硫酸ナトリ
ウム、ポリオキシエチレンラウリルエステルリン酸、Ｎ−アシルグルタミン酸ナ
トリウム等の陰イオン表面活性剤；塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウ
ムおよび塩化ステアリルトリメチルベンジルアンモニウムなどの陽イオン表面活
性剤；アルキルアミノエチルグリシン塩酸溶液およびレシチン等の両性電解質の
表面活性剤；および、グリセリンモノステアリン酸エステル、ソルビタンモノス
テアリン酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコールモノステア
リン酸エステル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリエチレングリコー
ルモノステアリン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸
エステル、ポリオキシエチレンヤシ脂肪酸モノエタノールアミド、ポリオキシプ
ロピレングリコール（例えば「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ」商標の下で販売されている物
質）、ポリオキシエチレンキャスターオイル（ひまし油）、および、ポリオキシ
エチレンラノリン等の非イオン性表面活性剤。湿潤剤の例はグリセリン、１，３
−ブチレングリコール、およびプロピレングリコールを含み；低級アルコールの
例はエタノールおよびイソプロパノールを含み；濃化剤の例はキサンタンガム、
ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエ
チレングリコールおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムを含み；抗酸化
薬の例はブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、プロピ
ル没食子酸塩、クエン酸およびエトキシキンを含み；キレート試薬の例はエデト
酸二ナトリウムおよびエタンヒドロキシ二リン酸を含み；緩衝液の例はクエン酸
、クエン酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂およびリン酸水素二ナトリウムを含み；
および、保存料の例はパラヒドロキシ安息香酸メチル、パラヒドロキシ安息香酸
エチル、デヒドロ酢酸、サリチル酸および安息香酸である。
【０２１０】 軟膏、クリーム、化粧水、皮膚乳剤、およびそれに類するものの調製のために
、一般的に、０．０１ないし１０％、特に０．１ないし５％、およびさらに特別
に０．２ないし２．５％の活性成分、例えばｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療
剤の活性成分、が組成物に取り込まれる。軟膏またはクリームにおいて、例えば
担体は、１ないし２０％、特に５ないし１５％の湿潤剤、０．１％ないし１０％
、特に０．５ないし５％の濃化剤または水分から成り；または前述の担体は、７
０ないし９９％、特に２０ないし９５％の表面活性剤、および０ないし２０％、
特に２．５ないし１５％の脂肪；または８０ないし９９．９％、特に９０ないし
９９％の濃化剤；または５ないし１５％の表面活性剤、２−１５％の湿潤剤、０
ないし８０％のオイル、ごく少量の（＜２％）保存料、色素試薬および／または
香料、および水、から成る。化粧水においては、例えば担体は２ないし１０％の
低級アルコール、０．１ないし１０％または特に０．５％ないし１％の表面活性
剤、１ないし２０％、特に３ないし７％の湿潤剤、０ないし５％の緩衝液、水お
よび少量（＜２％）の保存料、色素試薬および／または香料から成る。皮膚乳剤
においては、担体は一般的に１０−５０％のオイル、１ないし１０％の表面活性
剤、５０−８０％の水および０ないし３％の保存料および／または香料からなる
。前述の調製物において、全ての％表記は質量に対する質量の百分率を表す。
【０２１１】 本発明の方法において使用するための特定の組成物は、ｈｅｄｇｅｈｏｇまた
はｐｔｃ治療剤をリポソームを有する組成物で投与する場合の組成物である。リ
ポソームは、例えば、ホスファチジルコリン、エタノールアミンおよびセリン、
スフィンゴミエリン、カルジオリピン、プラスマロゲン、ホスファチド酸および
セレビオシドなどの、極性脂質などの両親媒性分子によって形成される人工的な
小胞である。リポソームは、適切な両親媒性分子が水性物質によって互いに分離
された多くの二重層を含む多層構造の液体結晶を形成するように水または水溶液
中で膨張することが可能である場合に、形成される（粗製リポソームとも表記さ
れる）。水性物質を包む一個の二重層から成ることが知られているその他の型式
のリポソームは単一層状小胞とも表記する。脂質の膨張中に水溶性物質が水層に
含まれるならば、物質は脂質二重層内の水層に捕獲される。
【０２１２】 例えばｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドなどの様々な塩の型の水溶性活性成分は
、水空間において分子層間で内包される。極性先端基は層から水空間に出てよい
が、有機性模倣物などの、ｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤の脂溶性活性成
分は、優位に脂質層に取り込まれる。最も一般的に用いられる方法は、有機溶剤
から吸引することにより、リン脂質の薄膜をフラスコ壁へ型にとることを含む。
この膜は適切な水性溶媒に分散されると、多層リポソームが形成される。適切な
ソニケーションにより粗大なリポソームは、より小さい閉じた小胞を形成する。
【０２１３】 水溶性活性成分は通常、型にとられた膜を化合物の水溶液で分散することによ
り取り込まれる。カプセルに内包されなかった成分は遠心分離、クロマトグラフ
ィー、透析または他の該当分野において通常の知識を有する者により知られる適
切な工程により除去される。脂溶性活性成分は通常、リン脂質とともに有機溶媒
に溶解し、膜を型にとることにより取り込まれる。脂質層中の材料の溶解性が大
きくない、または存在量が脂質に結合できる量を超過しない場合、上記の方法で
調製したリポソームは通常、大半の材料を脂質二重層に結合し含む。リポソーム
のカプセルに内包されなかった材料との分離は必要でない。
【０２１４】 特にｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃ治療剤と結合した型のリポソームの調製の
簡易的方法は、ＥＰ−Ａ−２５３，６１９に記載された方法であり、ここで参考
文献として取り入れられる。この方法において、内包された活性成分を含む単一
の２重層リポソームは、脂質成分を有機溶媒中に溶解し、圧力下において脂質成
分の有機溶液を水性成分に注入し、それと同時に有機および水性成分を高速ホモ
ジナイザーまたは撹拌機により、リポソームが自然に形成されるように撹拌する
ことにより調製される。
【０２１５】 内包されたｈｅｄｇｅｈｏｇまたはｐｔｃの治療的物質を含む単一の２重層リ
ポソームは直接に用いられることは可能である、またはそれらは、適切な化学療
法において局所的投与のための良質の担体として用いられることは可能である。
リポソームの粘性は、例えばキサンガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒド
ロキシプロピルメチルセルロース、およびそれらの混合といった、１つまたはよ
り多くの適切な濃厚化薬剤の添加により増大されることは可能である。水性成分
は水のみから構成されてよく、あるいは電解質、緩衝系、および例えば保存料な
どの他の成分を含んでよい。用いることの出来る適切な電解質は、アルカリ金属
、およびアルカリ希土類金属塩などの金属塩を含む。好ましい金属塩は、塩化カ
ルシウム、塩化ナトリウム、および塩化カリウムである。電解質の濃度は０から
２６０ｍＭ、好ましくは５ｍＭから１６０ｍＭであってよい。水性成分は、有機
成分の中の間の大きな撹拌によるホモジナイゼーションに適応することの可能な
適切な容器におかれる。２成分のホモジナイゼーションは容器中で行われる、ま
たは代替的に水性および有機成分は、容器外にある撹拌装置中に別個に注入され
て良い。後者の場合、リポソームは撹拌装置中で形成され、引き続き別の容器へ
回収のために移される。
【０２１６】 有機成分は、例えばエタノール、グリセロール、プロピレングリコール、およ
びポリエチレングリコールなどの適切な非毒性で薬事的に良質の溶剤、および溶
剤に可溶性である適切なリン脂質から構成される。用いられることの可能な適切
なリン脂質として、例えばレシチン、フォスファチジルコリン、フォスファチジ
ルセリン、フォスファチジルエタノール−アミン、フォスファチジルイノシトー
ル、リソフォスチジルコリン、およびフォスファチジルグリセロールを含む。他
の脂肪親和性の添加物は、リポソームの特異性の選択的修飾のために用いられて
良い。そのようなほかの添加物の例は、ステアリルアミン、フォスファチジック
酸、トコフェノール、コレステロール、およびラノリン抽出物を含む。
【０２１７】 さらに、リン脂質の酸化を妨げる他の成分は有機成分に添加されて良い。その
ようなほかの成分の例はトコフェノール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチ
ル化ヒドロキシトルエン、アスコルビルパルミチン酸塩、およびアスコルビルオ
レイン酸塩を含む。安息香酸、メチルパラベン、およびプロピルパラベンなどの
保存剤もまた添加されて良い。
【０２１８】 導入の方法は、再充填可能または生物分解可能な装置により供給されて良い。
タンパク質性生物薬理物質を含む薬の調節的伝達のため、最近数年のうちに、様
々な低速解離多重装置が開発され、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて試験されてきた。様
々な生物分解可能および非分解性ポリマーの両方を含む、生物融和性ポリマー（
水性ゲルを含む）は、特異的標的部位におけるｈｈの持続的解離のための移植を
形成するために用いられることは可能である。そのような本発明の様態は、多重
装置中に取り込まれた外因性精製ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質の輸送、または多
重装置中に内包された細胞により生産されたｈｅｄｇｅｈｏｇの輸送に用いられ
ることは可能である。
【０２１９】 ある移植の様態の重要な特徴は治療剤の線形的解離であることは可能であり、
これはポリマー化合物および形状の操作によりなされる。単量体化合物または多
量体化技術の選択により、水分量、有孔性、およびその結果の浸透性は、制御さ
れることは可能である。形状、大きさ、ポリマー、および移植法の選択は、処置
される疾患に関する個々の主薬、および個々の患者の応答により決定されること
は可能である。そのような移植の作製は一般に該当分野において通常の知識を有
するものにより知られる。例としてＣｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ ＆ Ｄｅｎｔａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ， ｅｄ． ｂ
ｙ Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ（ＭＩＴ Ｐｒｅｓｓ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ
，ＭＡ，１９９０）；ａｎｄ ｔｈｅ Ｓａｂｅｌ ｅｔ ａｌ． 米国特許第
４，８８３，６６６号を参照 移植の他の様態において、治療剤を生産する細胞の源、例えば可溶性型ｈｅｄ
ｇｅｈｏｇタンパク質を分泌する細胞は、移植可能な空洞の線維やその類似物に
内包される。そのような線維は前もって紡がれ、細胞源を封入されることができ
る、（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． 米国特許第４，８９２，５３８号；
Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．米国特許第５，１０６，６２７号；Ｈｏｆｆ
ｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｅｘｐｔ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． １１０
：３９−４４；Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９０）Ｐｒｏｇ． Ｂｒａ
ｉｎ Ｒｅｓ． ８２；４１−４６；およびＡｅｂｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．
（１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｍｅｃｈ． Ｅｎｇ． １１３：１７８−１８３）
または、細胞に対して多重コートを形成するように働くポリマーとともに供形成
されることは可能である。（Ｌｉｍ 米国特許第４，３９１，９０９号；Ｓｅｆ
ｔｏｎ 米国特許第４，３５３，８８８号；Ｓｕｇａｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（
１９８９）Ｔｒａｎｓ． Ａｍ． Ａｒｔｉｆ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｏｒｇａｎ
ｓ ３５：７９１−７９９；Ｓｅｆｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｔ
ｅｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ２９：１１３５−１１４３；およびＡｅｂｉｓ
ｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９１）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １２：５０
−５５） 実施例 本発明は、一般的に記載されているが、本発明の様態のある一面の解説を目的
とし、本発明を限定することを意図していない、以下の例を参照することにより
より迅速に理解されるだろう。
【０２２０】 ショウジョウバエにおいてｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子は最初に初期胚パターン形
成において働く役割で発見された（Ｎｕｓｓｌｅｉｎ−Ｖｏｌｈａｒｄ ａｎｄ
ｗｉｅｓｃｈａｕｓ，１９８０）。さらなる研究はこの遺伝子の産物は分泌さ
れ、細胞間シグナルタンパク質として体節形成および目や羽根の幼虫原基のパタ
ーン形成において重要な役割を果たすことを示した（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，１
９９２；Ｍｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｖａｎｉｅ，１９９２；Ｔａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．１９９２）。現在３つの哺乳類のショウジョウバエｈｅｄｇｅｈｏｇの類
似物がある（Ｆｉｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。脊椎動物の進化の間、こ
れらの分泌性ペプチド分子は軸性パターン形成に関与し、その結果、機能的分化
細胞への前駆細胞の表現特異化の制御をする。
【０２２１】 Ｓｈｈの胚発現パターンは密接に発生および腹側神経軸全体の分化に連動する
ことが示されてきた（Ｍａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。適当なレベルの
口−尾軸由来の神経管移植を用いて、脊椎運動ニューロン（Ｒｏｅｌｉｎｋ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９４；Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、中脳ドーパ
ミン作動性ニューロン（Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、および前脳基底コリンニューロン（Ｅｒｉｃｓｏｎ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９５）の誘導はＳｈｈへの接触に依存することが示された。ｉ
ｎ ｖｉｖｏにおいて、機能的Ｓｈｈ遺伝子産物の発現に欠損のあるマウスの胚
は、中央神経系における通常の腹側パターン形成の欠損と同様に顕著な頭蓋骨全
体の衰退を示すことより（Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６）この分子は
、そのようなパターン形成および表現型の特異化に対し重要であると思われる。
【０２２２】 この研究において、我々はこれまでに研究されたものより後のニューロン発達
の段階でＳｈｈが活性を有してよいのかという問題について解析した。即ち我々
はＳｈｈはあるニューロン集団に対し栄養的作用をするのか、および毒性条件下
においてニューロン防御をするのかどうか調べた。１４−１６日目の胚（Ｅ１４
−１６）のラット由来の培養を用いて、我々はＳｈｈは中脳、線条ニューロン、
および脊髄ニューロンに対し栄養的作用することを発見する。最初の場合におい
て、その因子はドーパミン作動性ニューロンおよびＧＡＢＡ免疫反応性ニューロ
ン（ＧＡＢＡ−ｉｒ）の両方に対し、栄養的作用をする。脊髄ニューロン培養に
おいてＳｈｈは介在ニューロンであろうヘテロ集団の生存を推進する一方、線条
ニューロンから生存したニューロンはＧＡＢＡ−ｉｒのみである。Ｓｈｈは試験
した、いかなる末梢ニューロン系の生存も支持しない。最後に、我々はＳｈｈが
、パーキンソン氏症候群をｉｎ ｖｉｖｏで誘導する特異的ニューロン毒である
ＭＭＰ＋の毒性効果から、中脳ドーパミン作動性ニューロンの防御をすることを
示す。これらの観察はＳｈｈのニューロン系発達における新たな役割を示すとと
もに、治療剤としての役割の潜在力を示す。
【０２２３】 材料と方法 ホールマウント組織内ハイブリッド形成 ２等分したＥ１４．５ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット胚上のホールマ
ウント組織内ハイブリッド形成は、前に記載したｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎラベル
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）したマウスＲＮＡプローブを用い
て行われた（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，１９９２）。結合したプローブはアルカリフ
ォスファテースと結合した抗ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ抗体Ｆａｂ断片（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により検出された。０．７ＫｂｐのＳｈｈプ
ローブはＴ３（アンチセンス鎖）またはＴ７（センス鎖）ＲＮＡポリメラーゼを
用い、Ｅｃｈｅｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９３）により記載されたように、
直線化されたＨｉｎｄＩＩＩ（アンチセンス鎖）またはＢａｍＨＩ（センス鎖）
鋳型鎖から転写された。０．９ｋｂのＰｔｃプローブはＴ３（アンチセンス鎖）
またはＴ７（センス鎖）ＲＮＡポリメラーゼを用い、Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）により記載されたように、直線化されたＢａｍＨＩ（アンチ
センス鎖）またはＨｉｎｄＩＩＩ（センス鎖）鋳型鎖から転写された。
【０２２４】 Ｓｈｈタンパク質および抗Ｓｈｈ抗体 ラットＳｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇアミノ末端シグナルドメイン（アミノ酸
２−１９８）Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５）はバキュロウィルス発現
ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中へクローン化
された。（Ｓｈｈ挿入物をコードしているウィルスはＨｅｎｋ Ｒｏｅｌｉｎｋ
博士，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗ
Ａから贈与された）Ｈｉｇｈ ＦｉｖｅTM昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は
操作指導書に従いバキュロウィルスに感染された。培養上清はヘパリンアガロー
スＩ型（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に一括吸着され、Ｓｈｈは全量
に０．７５ＭＮａＣｌおよび０．１ｍＭメルカプトエタノールを含むＰＢＳとと
もに溶出した。Ｓｈｈ濃度はＥｒｉｃｓｏ ｅｔ ａｌ（１９９６）の方法で決
定された。大腸菌由来のＳｈｈは前に記載したように得られ、上記のように精製
された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。全ての試料は、濾過滅菌され、
分注され、液体窒素中で凍結された。抗Ｓｈｈポリクローナル抗体はＡｎｄｙ ＭｃＭａｈｏｎ博士（Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から贈与された
。Ｓｈｈのアミノペプチドに対するこの試薬の調製は、Ｂｕｍｃｒｏｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）により記載される。抗Ｓｈｈモノクローナル抗体（５１ｌ）
はＴｈｏｍａｓ Ｊｅｓｓｅｌｌ博士（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ）から贈与され、この試薬の調製はＥｒｉｃｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６
）に記載される。
【０２２５】 分離およびニューロン組織の培養 Ｅ１４．５ラット腹側中脳はＳｈｉｍｏｄａ ｅｔ ａｌ．（Ｓｈｉｍｏｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９２）に記載されるように分離された。線条培養は、Ｅ１
５−１６胚のＡｌｔｍａｎおよびＢａｙｅｒ（１９９５）により線条および灰白
質外套として同定された領域から確立された。脊髄培養は、Ｅ１５−１６脊椎ニ
ューロンの腹側３分の１を利用した（Ｃａｍｕ ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，
１９９２）。組織は、およそ４０分の間０．１−０．２５％トリプシン−ＥＤＴ
Ａ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ；ＧａｉＴｈｅｒｓｂｕｇ，ＭＤ）中で分離し、等量の
３．５ｍｇ／ｌのダイズトリプシン阻害剤（Ｓｉｇｍａ）および０．０４％ＤＮ
ａｓｅ（ＧｒａｄｅＩＩ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ；Ｉｎｄｉ
ａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含み、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋を含まないＨａｎｋ'ｓ 緩衝液（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて消化は停止された。細胞は２×２０5− ３×２０5細胞／穴でＫｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ（１９９５）の培地 （修飾されたＮ２培地）に、ポリ−Ｌ−リジンまたはポリ−Ｌ−オルニチン（Ｓ
ｉｇｍａ）でコートした３４穴組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）中に、同じ培
地で２回洗浄した後、蒔かれた。この工程では、培養中の細胞は１度も血清に接
触されたことがないことに結果としてなり、分離プロテアーゼの中和のため、お
よび／または血清除去に先立つ細胞への「提示」のための血清が用いられた培養
と対照として位置する。結果に示したように、以下のペプチド成長因子は添加さ
れた。；基本線維芽細胞（ＦＧＦｂ）、形質転換成長因子１（ＴＧＦ１）、ＴＧ
Ｆ２、グリア由来ニューロン栄養因子（ＧＤＮＦ）、および脳由来ニューロン栄
養因子（ＢＤＮＦ）（すべては、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，
ＮＪより、；ＢＤＮＦおよびＧＤＮＦの追加ロットはＰｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉ
ｓｏｎ ＷＩより購入した。）抗ＴＧＦ抗体はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓより購入
した。抗体はＳｈｈの培養への添加時に添加した。培養は３週間まで維持され、
４日毎に培地は交換された。
【０２２６】 免疫細胞化学および細胞評価 すべての細胞染色のため、培養は５％パラホルムアルデヒドでＰＢＳ（ＧＡＢ
Ａの染色に際し０．１％グルタルアルデヒドを添加）中において固定され、３％
ゴート血清，（Ｓｉｇｍａ）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いてＰＢ Ｓ中でブロッキングされた。抗体保温はブロッキング溶液中で行われた。この研
究で用いた抗体は抗チューブリンＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ）、抗チロシンヒドロキシ
レース（ＴＨ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、抗ＧＡＢＡ（Ｓ
ｉｇｍａ），および抗グリア線維酸性タンパク質（ＧＥＡＰ）（Ｓｉｇｍａ）で
あった。１次抗体はホースラディッシュペルオキシダーゼ−、アルカリフォスフ
ァターゼ−、または蛍光色素−結合２次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ；Ｂｕｒｌｉｎｇａ
ｍｅ，ＣＡ）を用いて検出された。ペルオキシダーゼ結合２次抗体はＮＩ／ＤＡ
Ｂキット（Ｚｙｍｅｄ；ＳｏｕＴｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用
い、フォスファターゼ結合２次抗体はＶｅｃｔｏｒ ＢｌｕｅTMを用いて可視化
された。
【０２２７】 細胞の計測はＯｌｙｍｐｕｓ転移顕微鏡を合計倍率３００倍で用いて行われた
。示したデータは典型値で、各々のニューロン集団数の議論に対し、最低４−１
０回の独立の繰り返し培養により確かめられた。細胞数は細胞／場として報告さ
れた。（５穴／状態の総計から３０−４０場の平均；４−１０の独立の実験は、
各々の試験した状態の培養毎に標定された。）計測の一貫性は最低３人の観測者
により保証された。誤差は平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として報告され、ス
チューデントｔ−検定により有意性は計算される。
【０２２８】 ドーパミン輸送の測定 ドーパミン輸送体の存在を検出するため、培養は５×１０−8Ｍ 3Ｈ−ドーパ
ミン（Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ；４８Ｃ
ｉ／ｍモル）、１００μＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、１μＭフルオキシエ
チン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、１μＭデスメ
チルイミパラミン（Ｓｉｇｍａ）、およびＤＭＥ−Ｆ１２中の１０μＭパルギリ
ン（Ｓｉｇｍａ）からなる混合と保温された。非特異的標識は５×１０−5Ｍ非 標識ドーパミンの添加により測定された。細胞は３７℃で３０分間保温され、Ｐ
ＢＳで３回リンスされ、シンチレーション計測または放射線写真のための処理が
された。シンチレーション計測のため細胞は最初１５０μｌの０．１％ＳＤＳに
溶解され、次に５００μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ２０（Ｐａｃｋａｒｄ；Ｍｅ
ｒｉｄｅｎ，ＣＴ）が添加され、Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｔｏ
ｐｃｏｕｎｔ シンチレーション機中で計測された。放射線写真のために妹プレ
ートは、１：３で１０％グリセロールで希釈されたＮＴＢ−２放射線写真液（Ｋ
ｏｄａｋ；Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）でコートされた。プレートは風乾され、
１−２週間露出され、現像された。
【０２２９】 量拮抗的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＣ−ＰＣＲ） 製造業者により以前記載されたようにＴｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を
用いて、ＲＮＡは細胞および組織から単離された。ゲノムＤＮＡは０．５ユニッ
トのＤＮａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｃａｔ#２８０６８−０１５）とともに 室温で２５分間保温することによりＲＮＡから除去された。ＤＮａｓｅを不活化
するため溶液は７５℃で２０分間温められた。製造業者の指示に従いランダム６
マーおよびＭｕＬＶ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて、逆転写反応は
行われた。すべての量的ＲＴ−ＰＣＲの内部対照、または模倣物は、中央領域に
内部欠損を持つ標的配列に対応する合成１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドであっ
た（Ｏｌｉｇｏｓ，Ｅｔｃ．；Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＯＲ）。アクチンに対
し、標的=２８０ｂｐ、模倣物=２３０ｂｐ、ｐｔｃに対し、標的=３５４ｂｐ、 模倣物=２００ｂｐ ＰＣＲはＣｌｏｎｔｅｃｈ ＰＣＲ Ｋｉｔを用いて行わ れた。アクチンに対し、アニーリング温度は６４℃、オリゴはＧＧＣＴＣＣＧＧ
ＴＡＴＧＴＧＣ，ＧＧＧＧＴＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴ ｐｔｃに対しアニーリング
温度は７２℃ オリゴはＣＡＴＴＧＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴＧＧ
ＡＧＣＡＣＣＴＴＴＴＧＡＧＴＧＧＡＧＴＴＴＧＧＧＧ である。各ＱＣ−Ｐ
ＣＲ反応において、４つの反応は各チューブ中に等量の試料ｃＤＮＡ、および５
倍の連続的希釈の模倣物を用い行われた。各試料に対し、ｃＤＮＡの分注は保存
され、混入に対する対照として量的ＰＣＲにより増幅された。ＰＣＲ反応はＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−２００ 温度サイキュラー中で行われ、以下のサ
イクルプログラムが使用された。４０サイクルについて、：９５℃４５秒、６４
℃または７２℃３５秒、８２℃３０秒。反応混合物はアガロース電気泳動により
分離され、ネガフィルムは得られ、フィルムはデジタル的にスキャンされ確立さ
れた手順に従った面積分により定量された（Ｗａｎｇ ｅｔ．，１９９５，およ
びその中の参考文献）。標的分子の量は、拮抗する模倣物で標準化され、各反応
において合成され、用いられたｃＤＮＡの機能として表された Ｎ−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ＋）の投与 ドーパミン作動性ニューロンの培養およびＭＰＰ＋処理は以前に記載された（
Ｈｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．
，１９９５）ように行われた。ＭＰＰ＋（Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
ＭＯ）は最終濃度３μＭになるように３日目の培養に５８時間の間、添加された
。培養はＭＰＰ＋除去のため、ていねいに洗浄され、死んでいるＴＨ＋ニューロ
ンの除去を許すため更に３４−４８時間培養され、免疫細胞化学処理された。
【０２３０】 結果 背腹パターン形成の主な期間の後、ラットＣＮＳにおいてＳｈｈおよびｐｔｃ
は発現され続ける 腹腹パターン形成の決まる期間の脊椎動物胚においてＳｈｈは発現することは
以前の研究が示している（ラットにおいて、およそＥ９−１０）。中央神経系中
で、Ｓｈｈ発現はこの期間を越えてみられ、Ｅ１４−１６ラット胚において高い
レベルで検出できる。例えばＥ１４．５胚の組織内ハイブリッド形成実験（図１
ＡおよびＥ）はＳｈｈは脊髄神経の腹側領域、後脳、中脳、および間脳において
発現されていることを明らかにする。この方法の検出限界内で皮質において発現
が似られない一方、腹側線条、および間膜において低レベルの発現が見られた。
興味深いことにＳｈｈ発現の「縞」（図１Ａ，矢印）が間脳を全部と後部に分け
るように見られた。これは前体部２および３に分ける視床間の限界帯であり、以
前発生途中のヒヨコ胚におけるＳｈｈ発現の研究において観察されたものである
。（Ｍａｒｔｉ，ｅｔ ａｌ．，１９９５） 最近の生化学的証拠はｐｔｃ遺伝子産物は高親和性のＳｈｈ受容体として働く
ことができるという見解を支持する。（Ｍａｒｉｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６
ａ；Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６）Ｐｔｃは相補的パターンの発現を示
し（図１Ｃおよび１Ｅ）、Ｓｈｈ発現部位の側部および背側に見られる。限界帯
にｐｔｃのｍＲＮＡがない間脳の領域において発現のこのような相補性はもっと
も顕著であるが、この構造の両側ではとても高いレベルで発現している。更に興
味深いのは限界帯の前部で、ｐｔｃ発現はもはやＳｈｈ発現のすぐ背側領域に制
限されているように見えないという観察である。この技術の検出限界内において
ｐｔｃは皮質において発現していない。ゆえに推定される受容体の発現により証
拠付けられるように、Ｓｈｈの発現している領域において、隣接した組織は遺伝
子産物に応答することができるようである。
【０２３１】 Ｓｈｈはドーパミン作動性ニューロンの生存を推進する 発生途中の中脳（Ｅ９）においてＳｈｈは最初そのドーパミン作動性ニューロ
ンの誘導の能力で特徴づけられた。ゆえにＳｈｈの栄養的潜在的能力は、すでに
これらのニューロンが誘導された後の段階でのニューロン数により試験された。
Ｅ１４．５の間脳由来の培養を用い、ＳｈｈがＴＨ＋ニューロンの生存を量依存
的に増加させることは発見された（図２Ａ）。これらの細胞はニューロン状の形
状を示し（図２Ｂ）、９５％以上のＴＨ＋細胞はニューロン特異的なマーカー、
チューブリンＩＩＩ（Ｂａｎｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０）に陽性であ
った。；ＧＦＡＰ染色はグリア細胞が存在しないことを明らかにした（データは
示さない）。対照と試験したＳｈｈの間のＴＨ＋ニューロンの生存の違いは、５
日程度で良く観察できた。これらの厳しい血清のない条件下（即ち細胞は１度も
血清に接触されていない）における生存の基本レベルは、低い濃度の血清中で維
持した培養、または一度血清「提示」した培養について以前報告された生存レベ
ルより低いことに注意すること。培養３週間で、蒔いた全ＴＨ＋細胞の６％未満
は対照条件下で存在した、一方３５−３０％の細胞が６０ｎｇ／ｍｌのＳｈｈで
生存した。（５から２４日、３５、６０ｎｇ／ｍｌでｐ＜．００１） すべてのカテコールアミンニューロンはＴＨを発現するが、特異的高親和性Ｄ
Ａ取り込み機構の存在は、中脳ドーパミン作動性ニューロンの存在を示す。（Ｄ
ｉ Ｐｏｒｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，１９８０；Ｄｅｎｉｓ−Ｄｏｎｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｃｅｒｒｕｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｃｉｌｉａｘ ｅｔ ａｌ．，１９９５）さらなる証拠として、Ｓｈｈに支持される細胞はｂ
ｏｎｅ ｆｉｄｅドーパミン作動性ニューロンであり、特異的高親和性ドーパミ
ン（ＤＡ）取り込みもまた示された（図３）。Ｓｈｈ処理した中脳培養は生存曲
線と並行的な量依存的特性をもって、3Ｈ−ＤＡを輸送し、維持した（図３Ａ） 。（２５および５０ｎｇ／ｍｌにおいて ｐ＜０．００５）エマルジョン放射線
写真もまた、3Ｈ−ＤＡの取り込みをしている細胞は形態的にニューロンである ことを示した（図３Ｂ）。さらにドーパミンに対する免疫組織化学は高い細胞内
容物の存在を示した（データは示さない）。
【０２３２】 以前の研究で移植組織におけるＳｈｈのドーパミン作動性ニューロンの誘導能
力は分化の後の段階において失われることが示されていることより（Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９５；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、観察され
たような増加したＴＨ＋ニューロン数へのＳｈｈの効果は潜在的先駆細胞の分化
によるものではないようである。さらに、培養に５−ブロモ−２'−デオキシウ リジン（ＢｒｄＵ）を１，２，または４日にｉｎ ｖｉｔｒｏで加えることによ
りＳｈｈの存在、非存在に関わらず細胞分裂活性はとても低いことが明らかにさ
れているので、この効果は運命決定した神経芽細胞の細胞分裂によるものではな
いように思われる（データは示さない）。ゆえに中脳におけるドーパミン作動性
ニューロンの誘導に加え、Ｓｈｈはこれらのニューロンに対し栄養的因子である
。
【０２３３】 中脳ニューロンにおけるＳｈｈ活性の特異性：Ｐｔｃの発現の制御 ｐｔｃの発現は以前Ｓｈｈにより制御されていることが示され（Ｇｏｏｄｒｉ
ｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｍａｒｉｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６ｂ）、
現在までにＳｈｈはｐｔｃ発現の上方向制御を転写レベルで行う唯一の因子であ
ること知られている。ゆえに中脳移植によるｐｔｃの発現は、これらの細胞がＳ
ｈｈに応答可能であるという見方を強め、Ｓｈｈに応答したｐｔｃｍＲＮＡの上
方向制御はそのような応答の特異性を示唆する。ゆえに量的拮抗ＰＣＲ（ＱＣ−
ＰＣＲ）はｐｔｃ発現のレベルを測定するために用いられた。
【０２３４】 ｐｔｃのｍＲＮＡレベルは０，３，５および７日の培養においてＷａｎｇ， ｅｔ ａｌ（１９９５）により記載された方法で測定された。各時間における培
養条件に対し、５つの個別のｃＤＮＡ試料は異なる既知量の模倣基質（同じプラ
イマーにより増幅されることが可能であるが、試料において予想される分子量よ
り低い分子量を産生するＤＮＡ）とともに供増幅された。各条件および時間に対
し、図４Ａに示されるようなゲルは製作された（上のバンドはｐｔｃ転写物に対
応する；下のバンドは増幅された模倣物に対応する）。観察されたバンドの定量
のために走査濃度計を用いて、各試料に対しグラフが作製された（図４Ｂは図４
Ａに対応している）標的バンドと模倣物のバンドの濃度が等しくなったとき、未
知の標的の濃度は模倣物の既知の濃度と等しいと捉えられる。線形曲線回帰に基
づき、模倣物と標的基質の濃度が等しくなる（ＬｏｇＤｓ／Ｄｍ=０）各点にお ける模倣物の濃度は試料中の基質濃度であると捉えられた。；この値は反応に加
えたｃＤＮＡの全量で標準化された。これらの値は図４Ｃにプロットされる。；
回帰曲線の相関係数（ｒ2）は常に０．９５を越え、示した値に対する誤差の端 は５％未満である。この実験は２回独立に独立の培養を用い行われ、結果はほと
んど同一であった。
【０２３５】 図４Ｃに示されるように、有意なｐｔｃの発現はＥ１４．５腹側中脳（時間０
）において見られた。培養２日後、分離時よりも高いレベルのｐｔｃの発現が見
られた。；対照培養において一定量のＲＮＡが解析されたので、これはｐｔｃ非
発現型細胞の欠失の影響であろう。この時間において対照培養と５または２５ｎ
ｇ／ｍｌのＳｈｈで処理した培養の間にｐｔｃ発現に差異はなかった。しかし５
０ｎｇ／ｍｌのＳｈｈで処理した培養は、分離時と比べ２０倍のｐｔｃｍＲＮＡ
発現の誘導を示し、他の培養条件でも最低５倍以上であった。５日目の培養で、
ｐｔｃのｍＲＮＡレベルは３日目の発現に比べ有意に低下したが、５０ｎｇ／ｍ
ｌのＳｈｈ中では高いレベルの発現がまだ見られた。７日目には、アクチンはま
だ検出されるにも関わらず、対照培養または５ｎｇ／ｍｌのＳｈｈのどちらでも
全くｐｔｃ発現は見られなかった（データは示さない）。全細胞数の低下にも関
わらず、２５および５０ｎｇ／ｍｌのＳｈｈで処理した培養におけるｐｔｃ発現
は、中脳における時間０におけるｐｔｃ発現と同じ、またはそれを越えるもので
あることに注意することは重要である。これらの結果はＡ）ｐｔｃはＥ１４．５
腹側中脳で発現する（この領域の細胞はＳｈｈに応答することができることを示
唆する）、ｂ）Ｓｈｈはｐｔｃ遺伝子発現の維持に必要である、およびＣ）ｐｔ
ｃの発現は、上記した神経栄養活性と平行関係にあるＳｈｈ量に依存性を示す。
【０２３６】 中脳ニューロンでのＳｈｈ機能の特異性：免疫中和 バキュロウィルス発現系から精製し、これらの研究に用いたＳｈｈ調製の栄養
活性はＳｈｈのためであり、混入した因子のためでないことのさらなる証拠とし
て、抗体中和実験が行われた。図４Ｄに示されるように、飽和量のＳｈｈ（５０
ｎｇ／ｍｌ）は中脳の生存を推進する（Ｐ＜．００１），一方５倍を越えるモル
数の活性中和剤である抗Ｓｈｈモノクローン抗体（５Ｅ１；Ｅｒｉｃｓｏｎ ｅ
ｔ ａｌ．（１９９６））の存在下における同量のＳｈｈはこの栄養的応答を阻
害する（ｐ＜．００１）。以前の研究において（データは示さない）、親和性精
製ポリクローン抗Ｓｈｈ抗体は、ドーパミン作動性ニューロンの生存検定におい
てＳｈｈ活性を劇的に低下させた（ｐ＜．００５）が、前免疫血清から精製した
ラビットＩｇＧ抗体は有意な効果を示さなかった。Ｓｈｈに対し３倍を越えるモ
ル数で使用した抗ＴＧＦ抗体は栄養的活性を阻害しなかったが、それらは以前報
告された（Ｋｒｉｅｇｌｅｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）外因的に適用
したＴＧＦの栄養的効果を阻害した（データは示さない）。Ｓｈｈと同様の方法
で発現および精製されたガラクトシダーゼの添加は、いかなる栄養的効果も示さ
なかった（データは示さない）、ゆえに非特定のバキュロウィルスタンパク質が
観察された栄養的効果の原因であるという可能性は考えられない。最後に大腸菌
発現系（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５）から精製したＳｈｈもまたＴＨ＋
細胞に対し栄養的活性を有したが、Ｓｈｈと同様に大腸菌発現系から精製したガ
ラクトシダーゼは濃度２０μｇ／ｍｌに高めてもそのような活性を与えなかった
（データは示さない）。
【０２３７】 Ｓｈｈは他の中脳ニューロンの生存を支持する 中脳の発生におけるＳｈｈの役割に関する最初の観察はドーパミン作動性ニュ
ーロンの誘導に関するものであったので（Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５
；Ｗａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、現行の研究では初めにこれらのニュー
ロンへの、可能な栄養的効果に焦点が当てられる。興味深いことに、上記した栄
養効果が観察された培養は、Ｓｈｈの栄養効果が非ドーパミン作動性ニューロン
（すなわちＴＨニューロン）にまで及ぶことを示した。中脳のドーパミン作動性
ニューロン中で、黒質、ＧＡＢＡもまた主な神経伝達物質である（Ｍａｓｕｋｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。これらの培養におけるＧＡＢＡの染色（図５）は
、ＧＡＢＡ＋細胞はＴＨ＋細胞と同様に量依存的にＳｈｈの存在により支持され
ることを示した。さらにＧＡＢＡ細胞はおよそ３：１の比でＴＨ＋細胞に数で勝
っていた。チューブリンＩＩＩ染色で測定されたように（データは示さない）、
２つの細胞型は全体のおよそ９５％を占め、ゆえに中脳ニューロンでのＳｈｈの
栄養効果は多くのニューロンのサブタイプにまで及ぶことは明白である。（３５
および６０ｎｇ／ｍｌでＴｈに対し、ｐ＜０．００１；（３５および６０ｎｇ／
ｍｌでＧＡＢＡに対し、ｐ＜．００１） 線条ニューロンにおけるＳｈｈの効果 Ｓｈｈは前脳の腹がわおよび側側で強く発現され、（Ｅｃｈｅｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｅｒｉｃｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）Ｓｈｈノック
アウトマウスは、線条に欠損を示すことから（Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１
９９６）、同様に線条由来培養においてもＳｈｈ神経栄養活性は試験された。ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏで４日後に評価するように（図６）、ＳｈｈはＥ１５−１６の線
条由来のニューロン培養に対し栄養因子の能力があり、中脳に対してと同様に量
依存性を示した。全ニューロン数（チューブリンＩＩＩ＋細胞）とＧＡＢＡ＋ニ
ューロン数の比較において、Ｓｈｈに支持された本質的にすべてのニューロンは
ＧＡＢＡ＋ニューロンであることは明白である。（図６）（ｔｕｂｕｌｉｎＩＩ
Ｉ，２５および５０ｎｇ／ｍｌでｐ＜０．００１；ＧＡＢＡ，２５および５０ｎ
ｇ／ｍｌでｐ＜．００１）この効果が厳密に栄養的であることは、培養期間を通
してＢｒｄＵ標識値は低く、量的に変化しないという（データは示さない）観察
により確かめられた。より厳密な観察は、ＧＡＢＡ染色の強さは可変的であり、
ゆえにＧＡＢＡ＋介在ニューロンの様々なサブタイプはすべてＳｈｈに支持され
ることは可能である。
【０２３８】 脊髄ニューロンにおけるＳｈｈ効果 Ｓｈｈの腹側神経管派生体への誘導後の効果のさらなる試験として、Ｅ１４−
１５腹側神経管の培養は様々な量のＳｈｈとともに培養された。再び中脳および
線条培養における観察と同一の量依存性を伴い、ｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養
後に評価されたように、ＳｈｈはチューブリンＩＩＩ＋ニューロンの生存を推進
した。（図６Ａ）多くの、しかしこれらのすべてではない細胞がＧＡＢＡで染色
され、より少ない一部の細胞は脊髄介在神経の核のマーカー、Ｌｉｍ−１／２（
Ｔｓｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９４）で染色された（図６Ａ−Ｃ）。（
ｔｕｂｕｌｉｎＩＩＩ，２５および５０ｎｇ／ｍｌでｐ＜０．００１；Ｌｉｍ−
１／２，５、１０、２５および５０ｎｇ／ｍｌでｐ＜．００１；ＧＡＢＡ，２５
および５０ｎｇ／ｍｌでｐ＜．００１）ＧＡＢＡ＋細胞数およびＬｉｍ−１／２
＋細胞数に重複があるが、ＧＡＢＡで染色されないＬｉｍ−１／２＋細胞が存在
することから、後者は前者の単なる一部ではないということに注意することは重
要である。興味深いことに、低親和性神経成長因子受容体（Ｃａｍｕ ａｎｄ Ｈｅｂｄｅｉｓｏｎ，１９９２）、Ｉｓｌｅｔ−１（Ｅｒｉｃｓｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９２）、またはｇａｌｅｃｔｉｎ−１（Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，
１９９０）、ラット運動ニューロンのすべてのマーカーに対する免疫反応性はこ
れらの培養において検出不可能であった、ゆえにＳｈｈは脊髄運動神経に対して
は栄養的でないようである。
【０２３９】 ＳｈｈはＴＨ＋細胞をＭＰＰ＋毒性から防御する 毒素、５−ｐｈｅｎｙｌ−１，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｔｅｒｉ
ｎｅ（ＭＰＴＰ）およびその活性代謝物ＭＰＰ＋は中脳ドーパミン作動性ニュー
ロンに対して選択的毒素である（Ｋｏｐｉｎ ａｎｄ Ｍａｒｋｅｙ，１９８８
；Ｆｏｍｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。ＴＨ＋細胞の生存を促進するほかの薬
剤もまたＭＰＰ＋の化学的毒性に対し防御する（Ｈｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１
９９１；Ｋｒｉｅｇｌｅｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。我々はＥ１４
ラット中脳移植におけるＭＰＰ＋の効果からＴＨ＋細胞を防御するＳｈｈの能力
を試験した。図８に示すように、ＭＰＰ＋で５８時間処理した培養においてＳｈ
ｈの存在は、ＭＰＰ＋除去後に有意に培養中のＴＨ＋細胞の数を増加させた。Ｍ
ＰＰ＋処理は、非ＭＰＰ＋処理対照培養と比較して９０％を越えるＴＨ＋細胞数
の減少を引き起こした、しかるにＳｈｈを伴う保温はＴＨ＋細胞を保護し、ＭＰ
Ｐ＋処理後に対照に対し、わずか７５％の減少にとどめた。４Ｈ−ＤＡ輸送につ
いて試験した妹培養は、Ｓｈｈ処理した培養は対照に対して８倍輸送が増加して
いることを示した（データは示さない）。
【０２４０】 ＭＰＰ＋効果からのＴＨ＋細胞防御について、Ｓｈｈは有意に他の試験した成
長因子；グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９
３）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｈｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９
９１）よりの活性が高かった（Ｓｈｈ，６０および３５０ｎｇ／ｍｌでｐ＜０．
００１；ＢＤＮＦ 有意性なし；ＧＤＮＦｐ＜．０５）。これらの実験で用いた
無血清条件において、神経防御に最適であることが前に示されたレベルで試験を
行っても、試験したほかの成長因子はＭＰＰ＋からのＴＨ＋細胞防御のレベルで
どれもＳｈｈのような有意性を示さなかった（図８）。
【０２４１】 議論 Ｓｈｈは様々な腹側ニューロンに対し神経栄養的である Ｓｈｈはその最初の神経管の腹側化における機能に加え、神経系において役割
を果たすという仮説は、Ｓｈｈの腹側神経組織における神経軸全体に沿った発現
が現象的特異化の起こる期間の後に続くという観察により最初示唆された（Ｅｃ
ｈｅｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。さらに我々の研究所で予備的に得ら
れた証拠は、成人ヒトＣＮＳ（例えば脊髄管および黒質、Ｐ．Ｊｉｎ，未発表観
察）の特異的部位におけるＳｈｈ ｍＲＮＡの有意レベルの存在を示唆する。わ
れわれはここで、確かにＳｈｈはその誘導およびパターン形成活性とは独立な効
果を発揮することが可能である証拠を報告する。
【０２４２】 神経発達の初期の段階における役割と異なり、この新しい神経栄養活性は、分
裂中の前駆細胞よりむしろ分裂後のニューロンに作用する。多くのＣＮＳ領域（
図２および６−7）における一般的な栄養効果は明白であるが、試験した領域の 中で観察された効果において異なる点と類似点の両方が存在する。Ｓｈｈは脊髄
運動ニューロンおよび中脳ドーパミン作動性ニューロンの両方の誘導に必要であ
るという事実があり、Ｓｈｈは細胞に対し栄養的であろうと予想された。たしか
にＳｈｈは中脳ドーパミン作動性ニューロンに対し優れた栄養因子としての能力
がある（図２）。しかし腹側脊髄ニューロンの培養において、運動神経上にその
ような効果は見られなかった。ゆえにＳｈｈに誘導されるニューロンの表現型と
このような栄養的方法におけるＳｈｈによる効果の間に直接的関係はない。興味
深いことに、試験した３つのＣＮＳ領域間の共通の特徴はＧＡＢＡ作動性ニュー
ロンに対する栄養効果であった（図６−７）。このような特異的ＧＡＢＡ＋の数
の初期発生時のＳｈｈによる誘導は、直接的か間接的かはっきりしない（ｃｆ．
Ｐｆａｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９６）がこれらのニューロンに対する栄養的作
用は直接的であるようである。
【０２４３】 ここで報告した神経栄養効果は特異性を失ったものではないことに注意するこ
とは重要である。例えば、末梢神経系のニューロンはＳｈｈ投与に応答した生存
を全く示さない。そしてＥ１５ー１６背側ＣＮＳ領域由来の培養（例えば新皮質
および背側脊髄間）の予備的研究は、外因的Ｓｈｈの適用に対する有意な応答な
しに、高い基本レベルのニューロンが生存することを示す（Ｊ．Ａ．Ｏ． ａｎ
ｄ Ｎ．Ｋ．Ｍ．，未発表観察）。ゆえにＳｈｈにより特異化されたＣＮＳ領域
に対する、Ｓｈｈの栄養的効果の一般的制限は存在するようであるが、本当の栄
養的活性の標的は、その誘導がＳｈｈ依存的であるという表現型を内包する必要
がない。にもかかわらず、Ｓｈｈはニューロンを毒性攻撃から防御する（図８）
という事実は、以前予測できなかった治療剤としての役割をＳｈｈに示唆する。
【０２４４】 Ｓｈｈの働きの可能な機構 上述したように、これらの培養中で見られるＳｈｈの神経栄養効果は増殖の刺
激によるものではない。しかし観察された効果は間接的なものであるという議論
は可能である。あるシナリオにおいてＳｈｈは、神経栄養因子を分泌することに
より順次応答する非神経性細胞に作用してよい。我々はいかなる神経培養中にも
、形態的またはＧＦＡＰ染色によっても星状細胞の徴候を観察しなかった。さら
に中脳から確立した純粋神経培養中において、ｐｔｃはＳｈｈに応答して多いに
上方制御されていて、ゆえに報告された生存効果はニューロンによる応答による
ものであるに違いない（図４Ｃ）。
【０２４５】 別のシナリオでは、Ｓｈｈは直接的にいくつかのまたはすべてのニューロンに
作用するが、応答は本当に生存活性を有する別の因子の分泌による、というのも
可能である。例えばＳｈｈはＢＭＰなどのＴＧＦファミリーの一員のｉｎ ｖｉ
ｖｏでの発現の誘導をすることが示されていて（Ｌａｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，
１９９４；Ｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、これらのタンパク質は中脳
ドーパミン作動性ニューロンに対し栄養的である（Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９５）。外因的ＴＧＦは我々の培養系では中程度の栄養活性を
示すのみで、中和剤、抗ｐａｎーＴＧＦ抗体の存在はＳｈｈの神経栄養効果を阻
害することが出来ないので、この誘導されたＴＧＦの発現が栄養機構であるとは
考えにくい。ゆえに最低限、Ｓｈｈは腹側ＣＮＳニューロンの一部の生存を支持
する。Ｓｈｈがニューロン生存を指示する機構はまだ決定されていない。これら
の効果は直接的であるという仮説を我々は好むが、生存応答がＳｈｈに発現誘導
された２次的栄養因子によるものである可能性は残る。
【０２４６】 多くの分泌性ペプチド因子の場合のように、Ｓｈｈは因子の発現される時間お
よび空間に依存して、大きく変化することの可能な活性を有するようである。Ｓ
ｈｈのＣＮＳにおける１次的役割は初期パターン形成時にあり、形態的特異化に
重要であると最初考えられたが、今ＳｈｈはＣＮＳ領域の生存および成熟にもま
た貢献することは明らかである。興味深いことに、これらの２つの異なるＳｈｈ
の役割において、作用される細胞のタイプは、オーバーラップする必要はない。
ゆえに、この多面的特性を有する分子のより深い理解には、初期胚発生を通して
の発現パターンのより詳細な理解を必要とする。さらにＳｈｈのｉｎ ｖｉｖｏ
での栄養効果の有意性を確かめることは重要になるだろう。
【０２４７】 参考文献 Ａｌｔｍａｎ Ｊ，Ｂａｙｅｒ ＳＡ（１９９５）出生時のラット脳発生の解
説書Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ． Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ａ，Ｒｏａｃｈ ＭＣ，Ｔｒｃｋａ Ｐ，Ｌｕｄｕｅｎａ ＲＦ（１９９０）チューブリンＩＩＩ型アイソタイプを欠損する牛脳チューブ
リンにおける増加した微小管集合。Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９０：１７９
４−１９７７ Ｂｕｍｃｒｏｔ ＤＡ，ＴＡＮＡＤＡ Ｒ、ＭｃＭａｈｏｎ ＡＰ（１９９５
）タンパク質プロセッシングは２つの分泌型Ｓｏｎｉｃｈｅｄｇｅｈｏｇを生産
する Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５：２１９４−２３０３ Ｃａｍｕ Ｗ，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ＣＥ（１９９２）低親和性ＮＧＦ受容体
に対するモノクローナル抗体上でのパニングによるラット胚運動神経の精製 Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈ５４：５９−７０ Ｃｅｒｒｕｔｉ Ｃ，Ｗａｌｔｈｅｒ ＤＭ，Ｋｕｈａｒ ＭＪ，Ｕｈｌ Ｇ
Ｒ（１９９３）ドーパミン輸送体ＭＲＮＡの発現はラット中脳において強く中脳
外側で中程度である Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ２８：１８１−１８６ Ｃｈｉａｎｇ Ｃ，Ｌｉｔｉｎｇｕｎｇ Ｙ，Ｌｅｅ Ｅ，Ｙｏｕｎｇ ＫＥ
，Ｃｏｒｄｅｎ ＪＬ，Ｗｅｓｔｐｈａｌ Ｈ，Ｂｅａｃｈｙ ＰＡ（１９９６
）Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子機能を欠損しているマウスにおけるキク
ロプス症および軸パターン形成の欠損 Ｎａｔｕｒｅ４８３：４０７−４１３ Ｃｉｌｉａｘ ＢＪ，Ｈｅｉｌｍａｎ Ｃ，Ｄｅｍｃｈｙｓｈｕｎ ＬＬ，Ｐ
ｒｉｓｔｕｐａ ＺＢ，Ｉｎｃｅ Ｅ，Ｈｅｒｓｃｈ ＳＭ（１９９５）ドーパ
ミン輸送体；免疫化学的特徴づけ、および脳における局在Ｊ Ｎｕｅｒｏｓｃｉ
２５．１７１４−１７２３． Ｄｅｎｉｓ−Ｄｏｎｉｎｉ−Ｓ、Ｇｌｏｗｉｎｓｋｉ Ｊ，Ｐｒｏｃｈｉａｎ
ｔｚ Ａ（１９８４）グリアの不均一性はマウス中脳ＤＡニューロンの３次元的
形を規定する。 Ｎａｔｕｒｅ３０７：６４１−６４３ Ｄｉ Ｐｏｒｚｉｏ Ｕ，Ｄａｇｕｅｔ Ｍ−Ｃ，Ｇｌｏｗｉｎｓｋｉ Ｊ，
Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ Ａ（１９８０）ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける無血清条件で
の中脳ドーパミン作動性ニューロンの成熟における線条細胞の効果 Ｎａｔｕｒ
ｅ３８８：３７０−３７３ Ｅｃｈｅｌａｒｄ Ｙ，Ｅｐｓｔｅｉｎ ＤＪ，Ｓｔ−Ｊａｃｑｕｅｓ Ｂ，
Ｓｈｅｎ Ｌ，Ｍｏｈｌｅｒ Ｊ，ＭｃＭａｈｏｎ ＪＡ，ＭｃＭａｈｏｎ Ａ
Ｐ（１９９３） 推定されるシグナル分子ファミリーの一員であるＳｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇはＣＮＳ極性の制御に関わる。Ｃｅｌｌ８５：１４１７−１４
３０ Ｅｒｉｃｓｏｎ Ｊ，Ｍｏｒｔｉｎ Ｓ，Ｋａｗａｋａｍｉ Ａ，Ｒｏｅｌｉ
ｎｋ Ｈ，Ｊｅｓｓｅｌｌ ＴＭ（１９９６）Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇシ
グナルの２つの重要な期間は運動神経の同一性の特異化に必要である Ｃｅｌｌ ８７：６６１−６７３． Ｅｒｉｃｓｏｎ Ｊ、Ｍｕｈｒ Ｊ，Ｐｌａｃｚｅｋ Ｍ，Ｌｉｎｔｓ Ｔ，
Ｊｅｓｓｅｌｌ ＴＭ，Ｅｄｌｕｎｄ Ｔ（１９９５）Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅ
ｈｏｇは腹側前脳ニューロンの分化を誘導する：神経管内の腹側パターン形成の
共通のシグナル Ｃｅｌｌ ８１：７４７−７５６ Ｅｒｉｃｓｏｎ Ｊ，Ｔｈｏｒ Ｔ，Ｊｅｓｓｅｌｌ ＴＭ，Ｙａｍａｄａ Ｔ（１９９２） Ｉｓｌ−１ホメオボックス遺伝子の発現により明らかにされた
運動神経分化の初期段階 Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５６：１５５５−１５６０ Ｆｉｅｔｚ ＭＪ，Ｃｏｎｃｏｒｄｅｔ Ｊ−ｐ，Ｂａｒｂｏｓａ Ｒ，Ｊｏ
ｈｎｓｏｎ Ｒ，Ｋｒａｕｓｓ Ｓ，ＭｃＭａｈｏｎ ＡＰ，Ｔａｂｉｎ Ｃ，
Ｉｎｇｈａｍ ＰＷ（１９９４） ショウジョウバエのｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子
ファミリーおよび脊椎動物の発生 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｕｐｐｌ．：４
３−５１． Ｆｏｒｎｏ ＬＳ，ＤｅＬａｎｎｅｙ ＬＥ，Ｉｒｗｉｎ Ｉ，Ｌａｎｇｓｔ
ｏｎ ＪＷ（１９９３） ＭＰＴＰに誘導されるパーキンソン症とパーキンソン
病の間の類似点および違い：神経病理学的考察 Ａｄｖ Ｎｅｕｒｏｌ ７０：
６００−６０８ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ ＬＶ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＲＬ，Ｍｉｌｅｎｋｏｖｉｃ Ｌ
，ＭｃＭａｈｏｎ ＪＡ，Ｓｃｏｔｔ ＭＰ（１９９６） ｈｅｄｇｅｈｏｇ／
ｐａｔｃｈｅｄシグナル経路のハエからマウスにわたる保存性：ｈｅｄｇｅｈｏ
ｇによるマウスｐａｔｃｈｅｄ遺伝子の誘導 Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ２０：３０１−３１２ Ｈｙｍａｎ Ｃ，Ｈｏｆｅｒ Ｍ，Ｂａｒｄｅ Ｙ−Ａ，Ｊｕｈａｓｚ Ｍ，
Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ ＧＤ，Ｓｑｕｉｎｔｏ ＳＰ，Ｌｉｎｄｓａｙ ＲＭ
（１９９１） ＢＤＮＦは黒質のドーパミン作動性ニューロンに対する神経栄養
因子である Ｎａｔｕｒｅ４５０：２３０−２３２ Ｈｙｍａｎ Ｃ，Ｊｕｈａｓｚ Ｍ，Ｊａｃｓｏｎ Ｃ，Ｗｒｉｇｈｔ Ｐ，
ＩｐＮＹ，Ｌｉｎｄｓａｙ ＲＭ（１９９４） 神経栄養素ＢＤＮＦ、ＮＴー３
、およびＮＴ４／５のドーパミン作動性細胞培養、および腹側中脳のＧＡＢＡ作
動性ニューロン上での重複的および異なった働き Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２４
：３３５−３４７ Ｈｙｎｅｓ Ｍ，ＰｏｒｔｅｒＪＡ，Ｃｈｉａｎｇ Ｃ，Ｃｈａｎｇ Ｄ，Ｔ
ｅｓｓｉｅｒ Ｌａｖｉｇｎｅ Ｍ，Ｂｅａｃｈｙ ＰＡ，Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ
Ａ（１９９５） Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇによる中脳ドーパミン作動性
ニューロンの誘導 Ｎｅｕｒｏｎ ２５：３５−４４ Ｈｙｎｅｓ ＭＡ，Ｇｉｔｔ Ｍ，Ｂａｒｏｎｄｅｓ ＳＨ，Ｊｅｓｓｅｌｌ ＴＭ，Ｂｕｃｋ ＬＢ（１９９０）中央および末梢ニューロンの一部分におけ
る内在的ラクトース結合レクチン遺伝子の選択的発現 Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０：１００４−１０１３ Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｙ，Ｗｉｌｓｏｎ ＣＪ，Ａｕｇｏｏｄ ＳＪ，Ｅｍｓ
ｏｎ ＰＣ（１９９５）線条介在ニューロン：化学的、生理的、および形態学的
特徴付け ＴＩＮＳ ２８：５２７ー５３５ Ｋｏｐｉｎ ＩＪ，Ｍａｒｋｅｙ ＳＰ（１９８８）ＭＰＴＰ毒性：パーキン
ソン病の研究に対する示唆 Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２１：８１−
９６． Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎ Ｋ，Ｓｕｔｅｒ−Ｃｒａｚｚｏｌａｒａ Ｃ，Ｆｉ
ｓｃｈｅｒ ＷＨ，Ｕｎｓｉｃｋｅｒ Ｋ（１９９５）ＴＧＦＰスーパーファミ
リーの一因は中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存を促進し、ＭＰＰ＋毒性に
対してそれらを防御する ＥＭＢＯ Ｊ ２４：７３６−７４２． Ｌａｕｆｅｒ Ｅ，Ｎｅｌｓｏｎ ＣＥ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＲＬ，Ｍｏｇａｎ ＢＡ，Ｔａｂｉｎ Ｃ（１９９４） Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇおよびＦ
ＧＦ−４は、肢芽発生のパターン形成および成長を統合するためフィードバック
ループを伴うシグナル経路で働く Ｃｅｌｌ ８９：９９３−１００３ Ｌｅｅ ｊｊ，Ｖｏｎ Ｋｅｓｓｌｅｒ ＤＰ，Ｐａｒｋｓ Ｓ，ｂｅａｃｈ
ｙ ＰＡ（１９９２）セグメント遺伝子ｈｅｄｇｅｈｏｇの産物に対し、分泌と
局在化した転写物は位置シグナルにおける役割を示唆する Ｃｅｌｌ ８１：３
３−５０ Ｌｅｖｉｎ Ｍ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＲＬ，Ｓｔｅｒｎ ＣＤ，Ｋｕｅｈｎ Ｍ
，Ｔａｂｉｎ Ｃ（１９９５）ヒヨコ胚における左右非対称性を決定する分子経
路 Ｃｅｌｌ ８２：８０３−８１４ Ｌｉｎ Ｌ−ＦＨ，Ｄｏｈｅｒｔｙ ＤＨ，Ｌｉｌｅ ＪＤ，Ｂｅｋｔｅｓｈ Ｓ，Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｆ（１９９３）ＧＤＮＦ：グリア細胞系由来中脳ドーパ
ミン作動性ニューロンに対する神経栄養因子 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１３０
−１３２ Ｍａｒｉｇｏ Ｖ，Ｄａｖｅｙ ＲＡ，Ｚｕｏ Ｙ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＪＭ，Ｔａｂｉｎ ＣＪ（１９９６ａ） ｐａｔｃｈｅｄはｈｅｄｇｅｈｏｇ受
容体である生化学的証拠 Ｎａｔｕｒｅ ４８４：１７６−１７９ Ｍａｒｉｇｏ Ｖ，Ｓｃｏｔｔ ＭＰ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＲＬ，Ｇｏｏｄｒｉ
ｃｈ ＬＶ，Ｔａｂｉｎ ＣＪ（１９９６ｂ）ｈｅｄｇｅｈｏｇシグナルの保存
：発生中の肢におけるｈｅｄｇｅｈｏｇによるチキンｐａｔｃｈｅｄホモログの
誘導 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２２２：１２２５−１２３３ Ｍａｒｔｉ Ｅ，Ｂｕｍｃｒｏｔ ＤＡ，Ｔａｋａｄａ Ｒ，ＭｃＭａｈｏｎ ＡＰ（１９９５）ＣＮＳ移植片中の明確な腹側細胞型の誘導に対する１９Ｋ Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇの必要性 Ｎａｔｕｒｅ ３７５：３２２−３２
５ Ｍａｓｕｋｏ Ｓ，Ｎａｋａｊｉｍａ Ｓ，Ｎａｋａｊｉｍａ Ｙ−＠（１９
．９−２） 生後ラットの黒質および腹側中脳被蓋領域からの高純粋ドーパミン
作動性ニューロンの分離 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ５９：３４７−３６４ Ｍｏｈｌｅｒ Ｊ−Ｖａｎｉ Ｋ（１９９２）ショウジョウバエの体節パター
ン形成における細胞間連絡に関わるｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子の分子組成および胚
での発現 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２１５：９５７−９７１ Ｎｕｓｓｌｅｉｎ−Ｖｏｌｈａｒｄ Ｃ，Ｗｉｅｓｃｈａｕｓ Ｅ（１９８０
）ショウジョウバエの体節数および極性に影響する変異 Ｎａｔｕｒｅ ３８７
：７９５−８０１ Ｐｆａｆｆ ＳＬ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ Ｍ，Ｓｔｅｗａｒｔ ＣＬ，Ｅｄ
ｌｕｎｄ Ｔ，Ｊｅｓｓｅｌｌ ＴＭ（１９９６）ＬＩＭホメオボックス遺伝子
ＩＳＬ１の運動神経形成における必要性は、介在ニューロン分化における運動神
経依存的段階の存在を明らかにする。Ｃｅｌｌ ８４：３０９−３２０ Ｐｏｒｔｅｒ ＪＡ，Ｅｋｋｅｒ ＳＣ，Ｙｏｕｎｇ ＫＥ，Ｖｏｎ Ｋｅｓ
ｓｌｅｒ ＤＰ，Ｌｅｅ ｊｊ，Ｍｏｓｅｓ Ｄ，Ｂｅａｃｈ ＰＡ（１９９５
） 局所的および広範囲シグナルにおけるｈｅｄｇｅｈｏｇ産物の自己切断活性
Ｎａｔｕｒｅ ４７４：３６３−３６６ Ｒｏｅｌｉｎｋ Ｈ，Ｐｏｒｔｅｒ ＪＡ，Ｃｈｉａｎｇ Ｃ，Ｔａｎａｂｅ Ｙ，Ｃｈａｎｇ ＤＴ，Ｂｅａｃｈｙ ＰＡ，Ｊｅｓｓｅｌｌ ＴＭ（１９９
４） 脊索で発現される脊椎動物のｈｅｄｇｅｈｏｇホモログであるＶｈｈ−１
によるフロアープレートおよび運動神経の誘導 Ｃｅｌｌ ８６：７６１−７７
５ Ｓｈｉｍｏｄａ Ｋ，Ｓａｕｖｅ Ｙ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＪＰ，Ｃｏｍｍｉ
ｓｓｉｏｎｇ ＪＷ（１９９２）ラットＥ１４中脳細胞培養からのチロシンヒド
ロキシレース陽性細胞の効率的産生 Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ６８６：３１９−３３１ Ｓｔｏｎｅ ＤＭ，Ｈｙｎｅｓ Ｍ，Ａｒｍａｎｉｎｉ Ｍ，Ｓｗａｎｓｏｎ ＴＡ，Ｇｕ Ｑ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＲＬ，Ｓｃｏｔｔ ＭＰ，Ｈｏｏｐｅｒ ＪＥ，Ｓａｕｖａｇｅ Ｆｄ，Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ Ａ（１９９６）癌抑制遺伝
子 ｐａｔｃｈｅｄはＳｏｎｉｃｈｅｄｇｅｈｏｇの受容体の候補をコードする
Ｎａｔｕｒｅ ４８４：１１９−１３４ Ｔａｂａｔａ Ｔ，Ｅａｔｏｎ Ｓ，Ｋｏｅｎｂｅｒｇ ＴＢ（１９９２） ショウジョウバエｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子は後方領域細胞で特異的に発現し、ｅ
ｎｇｒａｉｌｅｄの制御の標的である Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ７：２６３５−２
６４５ Ｔａｎａｂｅ Ｙ．Ｒｏｅｌｉｎｋ Ｈ，Ｊｅｓｓｅｌｌ ＴＭ（１９９５）
Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇによる運動神経の誘導はフロアープレートに依存
しない Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ６：６５１−６５８ Ｔｓｕｃｈｉｄａ Ｔ，Ｅｎｓｉｎｉ Ｍ，Ｍｏｒｔｏｎ ＳＢ，Ｂａｌｄａ
ｓｓａｒｅ Ｍ，Ｅｄｌｕｎｄ Ｔ，Ｊｅｓｅｌｌ ＴＭ，Ｐｆａｆｆ ＳＬ（
１９９４）胚運動神経の解剖学的組成はＬＩＭホメオボックス遺伝子の発現によ
り決定された Ｃｅｌｌ ８９：９５７−９７０ Ｗａｎｇ ＭＺ， ｊｉｎ Ｐ，Ｂｕｍｃｒｏｔ ＤＡ，Ｍａｒｉｇｏ Ｖ，
ＭｃＭａｈｏｎ ＡＰ，Ｗａｎｇ ＥＡ，Ｗｏｏｌｆ Ｔ，Ｐａｎｇ Ｋ（１９
９５）Ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質による中脳におけるドーパミン
作動性ニューロン表現型の誘導 Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ ２：１１８４−１１８
８ Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ．Ｄ．Ｇ．（１９９２）脊椎動物胚のホールマウント組織
内ハイブリダイゼーション 組織内ハイブリダイゼーション：実践的アプローチ
，Ｄ．Ｇ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）
，ｐｐ．７５−８３ すべての上に引用した参考文献および出版物は、本明細書中に参考文献として
援用される。均等物 該当技術分野において通常の知識を有するものは、多くはここで記載した本発
明の特定の様態に均等であることを認識するだろう、または通常の実験の範囲で
確かめることは可能であろう。そのような均等物は、以下の請求項により取り込
まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１。Ｅ１４．５ラット胚におけるＳｈｈ及びＰｔｃ。ダイゴキシジェニン標
識リボプローブ及びアルカリホスファターゼ結合抗ダイゴキシジェニンによるイ
ンサイチュハイブリッド形成により検出された、Ｓｈｈ（Ａ、アンチセンス；Ｂ
、センス対照）及びｐｔｃ（Ｃ、アンチセンス；Ｄ、センス対照）の発現。Ａに
おける矢印及びＣにおける二重矢印は視床内帯状境界を示す。主要な解剖学上の
構造物及び、ｓｈｈ及びｐｔｃ発現の手短な図解はＥにおいて示される。スケー
ルバー＝１ｍｍ。
【図２】 図２。Ｓｈｈは腹側中脳のＴＨ＋ニューロンの生存を誘導する。（Ａ）Ｓｈｈ
効果の時系列及び量反応。対照培地における（０ｎｇ／ｍｌ Ｓｈｈ）ＴＨ＋ニ
ューロンの数はインビトロにおいて５日目より劇的に減少しはじめた。２５及び
５０ｎｇ／ｍｌのＳｈｈで処理した培地において、対照を超えてインビトロにお
いて２４日間にわたり相当に多数のＴＨ＋ニューロンが存在した（５から２４日
、ｐ＜．００１、２５及び５０ｎｇ／ｍｌ）。５０ｎｇ／ｍｌ量は特に、全ての
時点において対照より５０％―１００％の増加を与えた（エラーバーはｓ．ｅ．
ｍ．）。５０ｎｇ／ｍｌ Ｓｈｈ処理（Ｂ、Ｄ）及び対照（Ｃ、Ｅ）培地におけ
るＴＨ＋ニューロンの光学顕微鏡像、植菌後２日目（Ｂ、Ｃ）及び７日目（Ｄ、
Ｅ）。ＴＨ＋細胞体の数の増加に加え、Ｓｈｈ処理細胞は過剰な神経炎過程を示
したことを付記する。スケールバー＝２００ｕｍ。
【図３】 図３。３Ｈ―ドーパミンの輸送。生存する脳中部ニューロンの特徴及び機能は
、それらの特異的ドーパミン輸送の能力により評価された。（Ａ）２５ｎｇ／ｍ
ｌ Ｓｈｈの追加により、対照及び低濃度Ｓｈｈを上回り３Ｈ―ＤＡ細胞吸収は
２２倍に増加する結果となった。５０ｎｇ／ｍｌＳｈｈは３Ｈ―ＤＡ吸収におい
て３０倍の増加を与えた（エラーバー＝ｓ．ｄ．）（２５及び５０ｎｇ／ｍｌに
おいてｐ＜０．００５）。（Ｂ）ドーパミン輸送を可視化するためにシスタープ
レートにおいて放射線写真を撮影した。ニューロン形態の細胞のみが３Ｈ―ＤＡ
を輸送した（挿入図）。スケールバー＝５０ｃｐｍ、挿入図１５ｍ。
【図４】 図４。Ｓｈｈ活性の特異性。（Ａ）ＱＣ―ＰＣＲゲル。レーン１―４は、模倣
オリゴの４倍希釈系列と共に共増幅した脳中部培養物由来のＣＤＮＡである。レ
ーン５はＤＮＡマーカーレーンである。Ｐｔｃ標的は２５４ｂｐであり、模倣物
は１００ｂｐである。（Ｂ）競合模倣物の対数濃度と、標的及び模倣物のＰＣＲ
基質の得られたバンド濃度の対数の代表的平面図（Ａに対応）は増幅反応の線形
性を示す。試験したＣＤＮＡにおけるｐｔｃメッセージの推定値は、Ｌｏｇ Ｄ
ｓ／Ｄｍ＝０となる模倣物濃度の値と等しいと決定される。本文の手順の詳細を
見よ。量はｎｇ／ｍｌ；Ｄｓ＝試験基質の濃度；Ｄｍ＝競合模倣物の濃度。ｒ２
値はこの範囲が３％変動したときに成される決定を示す。（Ｃ）Ｓｈｈの投与は
、生存曲線と平行な量反応においてｐｔｃ発現を誘導する。値は、２６０ｎｍに
おける光密度（ＯＤ）により計測された、各反応において用いられたＣＤＮＡの
全量に対する標的分子の数（ｌｏｇ Ｄｓ）として表され、Ａ及びＢにおいてな
されたように決定された。４日間のインビトロにおける５ｎｇ／ｍｌ Ｓｈｈは
対照を上回りｐｔｃ発現を増加させ、５０ｎｇ／ｍｌでは切開時の腹側中脳にお
いて見られる程度を上回りｐｔｃの発現が増加した。（Ｄ）親和性精製した抗Ｓ
ｈｈ抗体はＳｈｈ神経栄養反応を阻害した（ｐ＜．００１）。培養は５日間維持
した。Ｓｈｈは５０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した、５Ｓｈｈ及び抗Ｓｈｈ（”Ｓ
ｈｈ抗体”）の共投与においては、Ｓｈｈは０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、抗Ｓ
ｈｈはモル量比５倍で添加した（エラーバーｓ．ｅ．ｍ．）。
【図５】 図５。Ｓｈｈは脳中部ＧＡＢＡ＋ニューロンの生存も支援する。（Ａ）脳中部
培養においてＴＨ＋細胞の生存を支援するのに加えて、Ｓｈｈは同程度の量反応
においてＧＡＢＡ免疫反応性ニューロンの生存も誘導する（エラーバー＝ｓ．ｅ
．ｍ）（ＴＨではｐ＜０．００１、２５及び５０ｎｇ／ｍｌ；ＧＡＢＡではｐ＜
．００１、２５及び５０ｎｇ／ｍｌ）。（Ｂ）Ｓｈｈ処理培養の二重免疫蛍光は
ＧＡＢＡ＋細胞（オレンジ）の大部分はＴＨ＋細胞と重ならないことを示す。；
スケールバー＝１５ｍ。
【図６】 図６。Ｓｈｈの線条体培養に対する効果。（Ａ）１０ｎｇ／ｍｌ及びそれ以上
の濃度において、チューブリンＰＩＩＩの染色より評価して、Ｓｈｈはニューロ
ンの生存を誘導する、これらの細胞はもっぱらＧＡＢＡ＋である（エラーバー＝
Ｓ．Ｄ．）（チューブリンＰＩＩＩ、２５及び５０ｎｇ／ｍｌにおいてｐ＜０．
００１；ＧＡＢＡ、２５及び５０ｎｇ／ｍｌにおいてｐ＜０．００１）。５０ｎ
ｇ／ｍｌ Ｓｈｈで処理し、チューブリンＰＩＩＩ（Ｂ）及びＧＡＢＡ＋（Ｃ）
で染色した神経の典型的領域を示す。；スケールバー＝１００ｇｍ。
【図７】 図７。Ｓｈｈの腹側脊髄培養に対する効果。（Ａ）２５ｎｇ／ｍｌ及びそれ以
上の濃度において、チューブリンＰＩＩＩの染色より評価して、Ｓｈｈはニュー
ロンの生存を誘導する。細胞の大部分はＧＡＢＡ染色に陽性であり、その一部は
脊髄介在ニューロンの核マーカーであるＬｉｍ―１／２染色される。（エラーバ
ー＝ｓ．ｅ．ｍ）（チューブリンｐｉｌｌ、２５及び５０ｎｇ／ｍｌにおいてｐ
＜０．００１；ｌｉｍ １／２、５、１０、２５及び５０ｎｇ／ｍｌにおいてｐ
＜．００１；ＧＡＢＡ、２５及び５０ｎｇ／ｍｌにおいてｐ＜．００１）。Ｅ１
４ラット脊髄における典型的Ｌｉｍ―１／２染色（Ｂ、スケールバー＝１００ｍ
）及び５０ｎｇ／ｍｌ Ｓｈｈの存在下で培養した脊髄神経（Ｃ、スケールバー
＝２０ｍ）。
【図８】 図８。Ｓｈｈは脳中部ＴＨ＋ニューロンを神経毒障害から守護する。腹側中脳
ニューロンの培地は、示される濃度のＳｈｈ（ｎｇ／ｍｌ）において培養された
。ＭＰＰ＋はインビトロにおいて４日目に４８時間加えた。培地はその後大規模
に洗浄し、死んでいるニューロンを除去するためにさらに４８時間培養した。Ｍ
ＰＰ＋神経毒からの守護は、５ｎｇ／ｍｌにおいて観察され、その効果は５０ｎ
ｇ／ｍｌにおいて飽和した。ＢＤＮＦは１０ｎｇ／ｍｌで、ＧＤＮＦは２０ｎｇ
／ｍｌで使用した（エラーバー＝ｓ．ｅ．ｍ）（Ｓｈｈ、５０及び２５０ｎｇ／
ｍｌでｐ＜０．００１；ＢＤＮＦ、検定なし；ＧＤＮＦ、ｐ＜０．５）。この実
験に用いた植密度は図２において使用したものの２倍であったことを付記する。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１０月２７日（２０００．１０．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/711 Ａ６１Ｋ 31/711 38/00 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 25/14 Ａ６１Ｐ 25/14 25/16 25/16 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｄ 217/02 Ｃ０７Ｄ 217/02 401/12 401/12 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｋ 14/46 Ｃ０７Ｋ 14/46 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/12 15/09 ＺＮＡ (Ｃ０７Ｄ 401/12 Ｃ１２Ｑ 1/68 217:02 // Ｃ１２Ｎ 9/12 241:04） (Ｃ０７Ｄ 401/12 Ａ６１Ｋ 37/02 217:02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ 241:04） 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 マハンタッパ，ナゲシュ・ケイ アメリカ合衆国マサチューセッツ州02139, ケンブリッジ，ノーフォーク・ストリート 240 (72)発明者 パング，ケヴィン アメリカ合衆国マサチューセッツ州02178, ベルモント，ヒル・ロード 53，ナンバー 710

Claims (48)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 黒質ニューロン細胞の生存を促進する方法であって、当該細胞を栄養量のｐｔ
    ｃ治療剤と接触させることを含む、前記方法。
  2. 【請求項２】 ドーパミン作動性細胞の生存を促進する方法であって、当該細胞を栄養量のｐ
    ｔｃ治療剤と接触させることを含む、前記方法。
  3. 【請求項３】 ＧＡＢＡ作動性細胞の生存を促進する方法であって、当該細胞を栄養量のｐｔ
    ｃ治療剤と接触させることを含む、前記方法。
  4. 【請求項４】 ドーパミン作動性ニューロンおよび／またはＧＡＢＡ作動性ニューロンの欠損
    によって特徴付けられる障害を治療するための方法であって、治療的に有効な量
    のｐｔｃ治療剤を必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
  5. 【請求項５】 パーキンソン病を治療または予防するための方法であって、治療的に有効な量
    のｐｔｃ治療剤を必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
  6. 【請求項６】 ハンチントン病を治療または予防するための方法であって、治療的に有効な量
    のｐｔｃ治療剤を必要とする患者に投与することを含む、前記方法。
  7. 【請求項７】 ｐｔｃ治療剤がｐａｔｃｈｅｄに結合し、ｈｅｄｇｅｈｏｇ媒介ｐａｔｃｈｅ
    ｄシグナル伝達を模倣する、請求項１−６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 ｐｔｃ治療剤が小有機分子である、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 ｐｔｃ治療剤のｐａｔｃｈｅｄへの結合が、ｐａｔｃｈｅｄおよび／またはｇ
    ｌｉ発現の上方向制御（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）の結果となる、請求項７に
    記載の方法。
  10. 【請求項１０】 ｐｔｃ治療剤が、ニューロン細胞と相互作用し、ｈｅｄｇｅｈｏｇ媒介ｐａｔ
    ｃｈｅｄシグナル伝達を模倣する小有機分子である、請求項１−６のいずれか１
    項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 ｐｔｃ治療剤が、ｐａｔｃｈｅｄシグナル伝達に関与する配置、タンパク質−
    タンパク質結合、および／または細胞内タンパク質の酵素活性を変化させること
    によって、ｈｅｄｇｅｈｏｇ媒介ｐａｔｃｈｅｄシグナル伝達を模倣する、請求
    項１−６のいずれか１項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 ｐｔｃ治療剤が、ｈａｄｇｅｈｏｇタンパク質、ｐａｔｃｈｅｄタンパク質又
    はｐａｔｃｈｅｄの細胞内シグナル伝達経路に関与するタンパク質の発現レベル
    を変化させる、請求項１−６のいずれか１項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 ｐｔｃ治療剤が、ｐａｔｃｈｅｄのシグナル伝達経路に関与するタンパク質の
    発現を阻害し、そして、その発現がｈｅｄｇｅｈｏｇ媒介シグナルと拮抗するア
    ンチセンス構築物である、請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 アンチセンス構築物が、長さ約２０−３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド
    であり、そして、少なくとも５０パーセントのＧＣ含量を有する、請求項１３に
    記載の方法。
  15. 【請求項１５】 アンチセンスオリゴヌクレオチドが、以下の： ５’−ＧＴＣＣＴＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＧＣＣ； ５’−ＴＴＣＣＧＡＴＧＡＣＣＧＧＣＣＴＴＴＣＧＣＧＧＴＧＡ；および ５’−ＧＴＧＣＡＣＧＧＡＡＡＧＧＴＧＣＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴ からなるグループから選択される、請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 ｐｔｃ治療剤が、ｐａｔｃｈｅｄに結合し、ｐａｔｃｈｅｄ依存性遺伝子発現
    を制御する、請求項１２に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 ｐｔｃ治療剤がプロテインキナーゼＡの阻害因子である、請求項１１に記載の
    方法。
  18. 【請求項１８】 ＰＫＡ阻害因子が５−イソキノリンスルフォンアミドである、請求項１７に記
    載の方法。
  19. 【請求項１９】 ＰＫＡ阻害因子が、以下の一般式： 【化１】 ［式中、 Ｒ1およびＲ2は、各々独立に水素、並びに、結合価および安定性に応じて、
    低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、カルボニル（カルボキシル、
    エステル、蟻酸エステル若しくはケトン等）、チオカルボニル（チオエステル、
    チオ酢酸エステル若しくはチオ蟻酸エステル等）、アミノ、アシルアミノ、アミ
    ド、シアノ、ニトロ、アジド、硫酸エステル、スルホン酸エステル、スルホンア
    ミド、−（ＣＨ2）m−Ｒ8、−（ＣＨ2）m−ＯＨ、−（ＣＨ2）m−Ｏ−低級アル キル、−（ＣＨ2）m−Ｏ−低級アルケニル、−（ＣＨ2）n−Ｏ−（ＣＨ2）m−Ｒ 8 、−（ＣＨ2）m−ＳＨ、−（ＣＨ2）m−Ｓ−低級アルキル、−（ＣＨ2）m−Ｓ −低級アルケニル、−（ＣＨ2）n−Ｓ−（ＣＨ2）m−Ｒ8でもよく、あるいは、 Ｒ1およびＲ2はＮと共に（置換若しくは未置換の）複素環を形成し； Ｒ3は存在しないか、あるいは、低級アルキル、低級アルケニル、低級アル キニル、カルボニル（カルボキシル、エステル、蟻酸エステル若しくはケトン等
    ）、チオカルボニル（チオエステル、チオ酢酸エステル若しくはチオ蟻酸エステ
    ル等）、アミノ、アシルアミノ、アミド、シアノ、ニトロ、アジド、硫酸エステ
    ル、スルホン酸エステル、スルホンアミド、−（ＣＨ2）m−Ｒ8、−（ＣＨ2）m −ＯＨ、−（ＣＨ2）m−Ｏ−低級アルキル、−（ＣＨ2）m−Ｏ−低級アルケニル
    、−（ＣＨ2）n−Ｏ−（ＣＨ2）m−Ｒ8、−（ＣＨ2）m−ＳＨ、−（ＣＨ2）m− Ｓ−低級アルキル、−（ＣＨ2）m−Ｓ−低級アルケニル、−（ＣＨ2）n−Ｓ−（
    ＣＨ2）m−Ｒ8等の、イソキノリン環の１またはそれ以上の置換基であり； Ｒ8は、置換若しくは未置換のアリール、アラルキル、シクロアルキル、シ クロアルケニル又は複素環であり；そして ｎおよびｍは、各々独立に存在０であるか、または１ないし６の範囲の整数
    である］ によって表される、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 ＰＫＡ阻害因子がサイクリックＡＭＰ類似体である、請求項１７に記載の方法
    。
  21. 【請求項２１】 ＰＫＡ阻害因子が、Ｎ−［２−（（ｐ−ブロモシンナミル）アミノ）エチル］
    −５−イソキノリンスルホンアミド、１−（５−イソキノリン−スルホニル）−
    ２−メチルピペラジン、ＫＴ５７２０、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ジブチリル−ｃ
    ＡＭＰおよびＰＫＡ熱安定性阻害因子アイソフォームαからなるグループから選
    択される、請求項１７に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 患者が予防的に治療される、請求項４−６のいずれか１項に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 ｐａｔｃｈｅｄの小分子アゴニストの治療用調製物であって、ｐａｔｃｈｅｄ
    アゴニストが医薬的に許容可能な担体中において、哺乳動物中のドーパミン作動
    性細胞の生存を促進するのに十分な量で提供される、前記治療用調製物。
  24. 【請求項２４】 ｐａｔｃｈｅｄの小分子アゴニストの治療用調製物であって、ｐａｔｃｈｅ ｄアゴニストが医薬的に許容可能な担体中において、成人ヒト中のドーパミン作
    動性細胞の生存を促進するのに十分な量で提供される、前記治療用調製物。
  25. 【請求項２５】 ｐａｔｃｈｅｄアゴニストがｐａｔｃｈｅｄに結合する、請求項２４に記載の
    調製物。
  26. 【請求項２６】 ｐａｔｃｈｅｄアゴニストがＭＰＴＰ １ｍｇ／ｋｇで治療されている哺乳動
    物中のドーパミン作動性細胞の生存を促進するのに十分な量で提供される、請求
    項２４に記載の調製物。
  27. 【請求項２７】 ｐａｔｃｈｅｄアゴニストがＭＰＴＰ １０ｍｇ／ｋｇで治療されている哺
    乳動物中のドーパミン作動性細胞の生存を促進するのに十分な量で提供される、
    請求項２４に記載の調製物。
  28. 【請求項２８】 パーキンソン病によるニューロン細胞の損傷を制限するための方法であって、
    患者のゲノムｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子と組み込まれ、ｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子の
    コード配列に機能可能なように結合された異種転写制御配列を提供する、遺伝子
    活性化構築物を患者に投与することを含む、前記方法。
  29. 【請求項２９】 配列番号１６または配列番号１７によって示される配列と少なくとも９５％同
    一であるアミノ酸配列を含む、単離されたおよび／または組換え産生されたポリ
    ペプチド、あるいはその生物活性的な細胞外断片。
  30. 【請求項３０】 配列番号１６および配列番号１７からなるグループから選択される配列に、ス
    トリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる、単離
    されたおよび／または組換え産生されたポリペプチド。
  31. 【請求項３１】 ヒトＤｈｈ遺伝子によってコードされる、単離されたおよび／または組換え産
    生されたＤｈｈ ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチド、あるいはその生物活性的な細
    胞外断片。
  32. 【請求項３２】 ヒトＩｈｈ遺伝子によってコードされる、単離されたおよび／または組換え
    産生されたＩｈｈ ｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチド、あるいはその生物活性的な
    細胞外断片。
  33. 【請求項３３】 医薬的に許容可能な担体中に処方された、請求項２９−３２のいずれか１項に
    記載のポリペプチド。
  34. 【請求項３４】 ポリペプチドが乾燥重量で少なくとも８０％精製されている、請求項２９−３
    ２びいずれか１項に記載のポリペプチド。
  35. 【請求項３５】 配列番号１６および配列番号１７からなるグループから選択されるｈｅｄｇｅ
    ｈｏｇタンパク質と少なくとも９５％同一であるｈｅｄｇｅｈｏｇアミノ酸配列
    を含むポリペプチド、又はその断片をコードする単離された核酸であって、当該
    ｈｅｄｇｅｈｏｇアミノ酸配列は、（ｉ）ｐａｔｃｈｅｄタンパク質に結合する
    、（ｉｉ）ニューロン細胞の分化を制御する、（ｉｉｉ）分化したニューロン細
    胞生存を制御する、（ｉｖ）軟骨細胞の増殖を制御する、（ｖ）精巣生殖細胞の
    増殖を制御する、又は（ｖｉ）トランスジェニック ショウジョウバエにおいて
    ショウジョウバエ Ｈｅｄｇｅｈｏｇを機能的に置換する、あるいはこれらの組
    み合わせである、前記核酸。
  36. 【請求項３６】 配列番号７および配列番号８からなるグループから選択される核酸配列にスト
    リンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるｈｅｄｇ
    ｅｈｏｇアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列で
    あって、当該ポリペプチドのｈａｄｇｅｈｏｇアミノ酸配列はｈｅｄｇｅｈｏｇ
    タンパク質の天然のタンパク質分解産物に相当し、（ｉ）ｐａｔｃｈｅｄタンパ
    ク質に結合する、（ｉｉ）ニューロン細胞の分化を制御する、（ｉｉｉ）分化し
    たニューロン細胞生存を制御する、（ｉｖ）軟骨細胞の増殖を制御する、（ｖ）
    精巣生殖細胞の増殖を制御する、又は（ｖｉ）トランスジェニック ショウジョ
    ウバエにおいてショウジョウバエ Ｈｅｄｇｅｈｏｇを機能的に置換する、ある
    いはこれらの組み合わせである、前記核酸。
  37. 【請求項３７】 ｈｅｄｇｅｈｏｇアミノ酸配列が、配列番号１６および配列番号１７からなる
    グループから選択される、ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質と同一である、請求項３
    ５または３６の核酸。
  38. 【請求項３８】 ヒトｈｅｄｇｅｈｏｇ遺伝子のコード配列を含む単離された核酸であって、生
    物活性なｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質をコードする、前記核酸。
  39. 【請求項３９】 原核細胞または真核細胞の少なくとも１つで複製可能な、請求項３５、３６ま
    たは３８を含む、発現ベクター。
  40. 【請求項４０】 請求項３９の発現ベクターでトランスフェクトされ、当該組換えポリペプチド
    を発現する宿主細胞。
  41. 【請求項４１】 組換えｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドを産生するための方法であって、請求項
    ４０の細胞を培養培地中で培養してｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドを発現し、そ
    して前記培養培地よりｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドを単離することを含む、前
    記方法。
  42. 【請求項４２】 （ｉ）真核細胞中でｈｅｄｇｅｈｏｇポリペプチドの発現を生じさせるための
    転写制御配列に機能的に結合した、請求項３５、３６または３８の核酸を含む遺
    伝子構築物、および （ｉｉ）前記遺伝子構築物を細胞に運搬し、細胞を前記遺伝子構築物でトラン
    スフェクトさせるための、遺伝子運搬用組成物 を含む、組換えトランスフェクション系。
  43. 【請求項４３】 遺伝子運搬用組成物が、組換えウイルス粒子、リポソームおよびポリ−陽イオ
    ン性核酸結合剤からなるグループから選択される、請求項４２に記載の組換えト
    ランスフェクション系。
  44. 【請求項４４】 実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーであって
    、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号７若しくは８、又はそれらの天然に生じ
    た変異体のセンス又はアンチセンスの少なくとも１０の連続するヌクレオチドに
    、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を有
    する、前記プローブ／プライマー。
  45. 【請求項４５】 プローブ／プライマーが、さらにそれに結合した標識グループを含み、当該標
    識が検出可能なものである、請求項４４に記載のプローブ／プライマー。
  46. 【請求項４６】 請求項４５のプローブ／プライマーを含む、ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｍＲＮＡ転写
    産物を有する細胞を検出するための、試験用キット。
  47. 【請求項４７】 生理的な条件下で、ヒトＩｈｈまたはＤｈｈ ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質を
    コードする遺伝子と特異的にハイブリダイズし、そしてその発現を阻害する、ア
    ンチセンス核酸の精製調製物であって、当該核酸が（ｉ）合成オリゴヌクレオチ
    ドである、（ｉｉ）一本鎖である、（ｉｉｉ）直鎖状である、（ｉｖ）長さ２０
    ないし５０ヌクレオチドである、そして（ｖ）ヌクレアーゼ分解に対して耐性な
    ＤＮＡ類似体である、少なくとも１つを満たす、前記調製物。
  48. 【請求項４８】 前記アンチセンス核酸がヌクレアーゼ分解に対して耐性なＤＮＡ類似体である
    、請求項４７に記載の調製物。
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