JP2001510474A - カテプシンｄのナノモルの非ペプチド阻害剤 - Google Patents

カテプシンｄのナノモルの非ペプチド阻害剤

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、非ペプチドカテプシンＤ結合化合物、及びカテプシンＤの検出、ラベル化及び阻害におけるその使用に関する。式（Ｉ）において、Ｒ1，Ｒ2及びＲ3はアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アリールオキシアルキル、置換アリールオキシアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、置換ヘテロアリールアルキル、ヘテロサイクル、置換ヘテロサイクル、ヘテロサイクルアルキル及び置換ヘテロサイクルアルキルであり、Ｒ5及びＲ6は独立に、水素、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アリールオキシアルキル及び置換アリールオキシアルキルから成る群から選択され、あるいはＲ5及びＲ6並びにそれらが結合している炭素原子は一緒になって場合によっては置換されている９−又は10−環原子の炭素環又は複素環融合環系を形成している。

Description

【発明の詳細な説明】 カテプシンＤのナノモルの非ペプチド阻害剤 政府の権利 この発明は米国国立衛生研究所によって与えられた助成（契約）等R01GM53696 号および第R01GM50353号に基づいた政府援助によってなされた。したがって米国 政府はこの発明に特定の権利を有している。 発明の技術分野 この発明は、一般に、カテプシンＤに結合して阻害する物質、およびこの結合 する性能に基づいて、各種の分析法、診断法および治療法に、これら物質を使用 することに関する。 発明の背景 化学者が大切にする目標は、特定の諸特性を兼ね備えた化合物を設計して合成 することである。この目標は、薬剤発見法の一部として、生物化学および医薬品 化学において、特に差し迫った目標である。この活動で、二つの強力な新しい手 段は、構造ベースの設計（I.D．Kuntz，Science，257巻1078〜1082頁1992年；I. D．Kuntz外、Accts．Chem．Res.，27巻117〜123頁1994年）およびコンビナトリ アルケミストリー（combinatorial chemistry（L.A．Thompson外、Chem Rev.，9 6巻555〜600頁1996年；E.M．Gordon外、J．Med．Chem.,37巻1385〜1401頁1994年 ）である。構造ベースの設計では、標的の巨大分子（酵素の場合が多い）の結晶 学的試験と磁気共鳴の試験から集めた情報が利用され、阻害剤の選択または設計 が案内 される。この試みでは、コンピュータの使用が重要な役割を演じている（I.D．K untz外、Accts．Chem．Res.，27巻117〜123頁1994年；N.C．Cohen外、J．Med．C hem.，33巻883〜894頁1990年）。コンビナトリアルケミストリーは、異なる構築 ブロックを、高収率で結合させる総合的な化学的変換法である。これらの変換法 は、類縁化合物のライブラリーを迅速にかつ効率的に合成するため平行に実施さ れる(L.A．Thompson外、Chem．Rev.96巻555〜600頁1996年；E.M．Gordon外、J． Med．Chem．37巻1385〜1401頁1994年)。それにもかかわらず、新しい先導化合物 の発見または既存の先導化合物の特性の改良は、依然として厳しく要求されてい る課題である。 リガンドを同定するためのコンビナトリアル法は、最初、化学的方法または生 物学的方法で製造された生体高分子のライブラリーに集中した(M.A．Gallop外、 J．Med．Chem.,37巻1233〜1251頁1994年)。これらのライブラリーの場合、構築 ブロックの可能なすべての組合せが一般に使用される。なぜならば、アプタマー ライブラリーには４種の天然ヌクレオチドの構築ブロックしか存在せずそしてペ プチドライブラリーには20種の蛋白新生のアミノ酸構造ブロックが存在するから である。これらの化合物の構造と、ライブラリー中の化合物の理論的数とは、生 体分子の連鎖の長さを設定することによって決定される。最近、ペプチドまたは オリゴヌクレオチドに見出されているより一層広い範囲の特性をもたらす、化学 的変換の広いスペクトルを有する化合物のライブラリーを作製するのにかなりの 努力がなされている(L.A．Thompson外、Chem．Rev.,96巻555〜600頁1996年；E.M ．Gordon外、J．Med．Chem.,37巻1385〜1401頁1994年)。これらの新しい方法は 、ライブラリーの設計に、重要な課題を紹介している。 ライブリー設計の決定的な要素は、どの化合物を合成するかを選 択する方法である。これには、構築ブロックのスカホルド（Scaffold）、基本反 応および性質の選択が含まれる。構築ブロックが、アミン、アルデヒドまたはカ ルボン酸などの容易に入手できる成分であれば、考えられる可能性のある化合物 の数は極めて大きい。例えば、三つの構築ブロックに、数千の成分を、各位置に 結合させると、10億種を超える化合物がもたらされる。戦略が異なると、実施す る場合の制限が異なるが、一般に、数千種の立体的に異なる化合物と数千万種の 化合物のみを混合物で合成する研究者が準備される。さらに、非常に大きなライ ブラリーの評価と解析が律速作業になら（N.K．Terrett外、Bioorg．Med．Chem ．Lett.，５巻917〜922頁1995年）。したがって、合成の作業を減らして、所望 の特性に偏向させた小サブセットの化合物を得る方法には大きな利点がある。 可能性のある選択をいかにして効率的に減らすことができるであろうか。標準 の戦略は、多様性の選択(diversity selection)と制御された選択（directed se lection）である。多様性の方法は、化合物の数が固定されている場合、化学的 特性と生物学的特性のサンプリングを最大にしようとする（R.J．Simon外、Proc ．Natl．Acad．Sci．U.S.A.,89巻9367〜9371頁1992年）。制御されたライブラリ ーでは、ライブラリーの、大きさとしばしば多様性を、標的と有利な相互作用を 行うと予想される構築ブロックを選択することにより、または前もって不利な相 互作用を行うと考えられる候補を除くことによって、低下させる。制御されたラ イブラリーは、基質の選択、既知の阻害剤についての情報または特定の官能基と 標的との可能性のある相互作用の評価に基づいている。多様性と制御された戦略 の両者によって、第一ラウンドで発見された活性化合物由来の第二ライブラリー との多段アタックが可能になる。 アスパラギン酸プロテアーゼ類の小さな非ペプチドの阻害剤を同 定する一般的で効率的な方法の開発は、引続いて関心が高い。というのは、これ らプロテアーゼは、治療に関連があるプロセスで重要な役割を演じているからで ある（K．Takahashi編、「Aspartic Proteinases Structure，Function，Biolog y，and Biomedical Implications」米国ニューヨークPlenum Press，1995年；J ．Adams外、Ann．Rep．Med．Chem.，31巻279〜288頁1996年；J.J．Edmunds外、A nn．Rep．Med．Chem.，31巻51〜60頁1996年；D.K．Miller，Ann．Rep．Med．Che m.,31巻249〜268頁1996年）。アスパラギン酸プロテアーゼ類は、広く分布して いる酵素ファミリーであり、真菌、植物、脊椎動物およびレトロウイルスにおい て重要な役割を演じている。アスパラギン酸プロテアーゼ類（その活性部位に二 つのアスパラギン酸残基を有することを特徴とする）は、大きな疎水性残基の間 に位置するペプチド結合に対して特異性を有するアミド結合の加水分解反応を触 媒する。アスパラギン酸プロテアーゼ類の多くは、医薬の重要な標的であり、レ ニン、カテプシンＤ、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)プロテアーゼ類、ヒトＴ細胞 白血病ウイルスＩ型（HTLV−１）プロテアーゼおよびカンジダ・アルビカンス（ candida albicans）アスパラギン酸プロテアーゼが含まれる。 これらの酵素の強力な阻害剤は、そのペプチド基質の切断しやすい結合の代わ りに、四面体の中間体の形態に似せた等配電子体を組み込むことによって容易に 入手することができる。あいにく、これらの阻害剤は、そのペプチドの性質が原 因である、経口利用度が劣っていることおよび／または循環半減期が短いことか ら、治療に使用するには限度がある。この理由のため、構造ベースの設計とコン ビナトリアル化学の方法を、アスパラギン酸プロテアーゼの非ペプチド阻害剤を 開発するのに利用できれば有利である。 発明の要約 カテプシンＤは、リソソームに存在する酵素であり、タンパク質代謝(Helseth 外、Proc．Natl．Acad．Sci．USA．81巻3302〜3306頁1984年）、異化作用〔Kay 外、「Intracellular Protein Catabolism」（Katumura外編）、155〜162頁1989 年〕および抗原プロセシング（Guagliardi外、Nature,343巻133〜139頁1990年； Van Noort外、J．Biol．Chem.,264巻14159〜14164頁1989年）において重要な役 割を演じている。この発明は、非ペプチドのカテプシンＤ結合化合物、およびこ れら化合物のカテプシンＤ結合特性に基づいたこれら化合物の各種の治療および 診断の用途に関する。これらの方法には、分析または診断を行うため、生体試料 中のカテプシンＤの存在を検出し定量するための上記化合物の使用、ならびに生 きている細胞中のタンパク質を処理するカテプシンＤの性能を阻害する上記化合 物の使用が含まれる。 一実施態様で、この発明は、カテプシンＤ結合タンパク質として有用な化合物 を提供する。これら化合物はアミノ酸を全く含有せず、分子量が一般に約700〜8 00ダルトンより小さい。さらにこれらの化合物はカテプシンＤの強力な非ペプチ ドの阻害剤であることが発見されたのである。この発明の範囲内に入る化合物は 下記構造式で表される。 式Ｉにおいて、Ｒ1，Ｒ2およびＲ3は、アルキル、置換アルキ ル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アリ ールオキシアルキル、置換アリールオキシアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテ ロアリール、ヘテロアリールアルキル、置換ヘテロアリールアルキル、ヘテロ環 類、置換ヘテロ環類、ヘテロ環アルキルおよび置換ヘテロ環アルキルからなる群 から独立して選択して選択されるメンバーである。 式Ｉにおいて、Ｒ5とＲ6は、水素、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アリ ール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アリールオキ シアルキルおよび置換アリールオキシアルキルからなる群から独立して選択され る。別の一実施態様で、Ｒ5とＲ6は、結合して合して任意に置換された９個もし くは10個の環原子を含有する炭素環式もしくはヘテロ環式の結合環システムを形 成する炭素である。代表的な９個もしくは10個の原子を含有する縮合環システム としては、限定されないが、ナフチル、１，３−ベンゾジオキソリル、２，３− ベンゾフラニル、１，４−ベンゾジオキサニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチ アゾリルなどがある。 上記式Ｉの範囲内にある特定の実施態様が好ましい。式Ｉにおいて一つの好ま しい実施態様は、Ｒ1が、限定されないが、ヘテロアリールアルキルおよび置換 アリールアルキルを含む官能基である実施態様である。かような官能基の例とし ては、限定されないが下記のものがある。 他の好ましい実施態様は、Ｒ2が、限定されないがヘテロアリールアルキル、置 換アリールアルキルおよび置換アリールオキシアルキルを含む官能基である実施 態様である。かような官能基の例として は、限定されないが下記のものがある。 また、Ｒ3が、限定されないが置換アリール、ヘテロアリールアルキルおよび 置換アリールオキシアルキルを含む官能基である実施態様も好ましい。かような 官能基の例としては、限定されないが下記のものがある。 別の好ましい実施態様は、Ｒ5とＲ6が、結合して合し任意に置換されたナフタ レン環を形成する炭素原子である実施態様である。 他の好ましい実施態様では、Ｒ5とＲ6がともに水素であるか、またはＲ5が水素 でＲ6がメタもしくはパラの置換基である実施態様である。 この発明の化合物は、カテプシンＤに結合する性質によって、各種の目的に対 して有用である。その結合によって非共有結合が形成される化合物の場合、得ら れるものは、標識された形態のプロテアーゼとして働く複合体である。その標識 は、カテプシンＤ結合化合物の非共有結合によってもたらされた分子量の増大で もよい。あるいは、その標識は、カテプシンＤ結合化合物の構造に連結されたか または該構造中に組み込まれたシグナル発生部分でもよい。かような部分の例と しては、酵素、発蛍光団、ケモフォア（chemophore）、高アフィニティ基および 放射性（同位元素で標識された）原子である。単一の複合体は、同じかまたは異 なるタイプの単一の標識または多重標識を有している。この発明による標識化は 、その環境すなわち生体内または生体外にかかわらず、カテプシンＤプロテアー ゼに行うことができる。したがって標識化は組織と細胞内に存在するプロテアー ゼに広がる。一般に、その標識化の次に、例えば、当業技術者に知られているオ ートラジオグラフィー、または広範囲の方法などの適当な検出法が実施される。 この発明による標識化の一つの用途として、この発明のカテプシンＤ結合化合 物は、カテプシンＤ結合部位の存在と性質を決定すべき化合物の、トポロジック 検定法において、カテプシンＤの機構的プローブとして使用できる。トポロジッ ク検定法は、例えば、反応容器中で以下の物質を結合させることによって実施さ れる。 （ａ）カテプシンＤ結合部位が分かっている上記式で表される１種以上の化合 物の標識されたバージョン、 （ｂ）カテプシンＤプロテアーゼ、および （ｃ）カテプシンＤ結合部位を測定すべき試験化合物。 次に、前記第一のカテプシンＤ結合化合物の、カテプシンＤに結合する量を測 定し、次に、試験化合物が存在しない場合に起こるかような結合の量と比較する 。 標識化の用途に加えて、カテプシンＤ結合化合物は、カテプシンＤによるタン パク質プロセシングを阻害するため投与して、かようなプロテアーゼがペプチド の基質を加水分解するのを妨害することができる。特に、カテプシンＤの阻害は 、多くの治療用途をもっている。かような用途には癌の治療が含まれている。と いうのは、特に乳癌の場合の腫瘍中のカテプシンＤのレベルが高いことは、カテ プシンＤが、腫瘍の転移をもたらす細胞外マトリックスのタンパク質分解反応を 仲介するため、治療後の経過の予測がむつかしいことと関連があったからである 。その上に、カテプシンＤの阻害は、アルツハイマー症の治療に有効である。な ぜならば、高レベルのカテプシンＤが、アルツハイマー症の患者の脳脊髄液中に 確認されており、そしてカテプシンＤが、アルツハイマー症に関与している変異 β−プロテイン前駆体に対して高いタンパク質分解活性を有していることが分か っているからである。それ故、この発明の化合物は、例えば癌やアルツハイマー 症の治療に使用できる。 この発明の他の特徴、目的および利点、ならびにこの発明の好ましい実施態様 は、以下の詳細の説明から明らかになるであろう。 図面の簡単な説明 図１は等配電子体（isostere）ベースの阻害剤の設計を示す。 図２はカテプシンＤを標的とするライブラリーを調製するのに利用される成分 を示す。同じ結合切断によってスカフォルド２が与えられる。Ｒ2とＲ3を組み込 むために使用できるイソシアネート類 とスルホニルクロリド類は、それぞれ尿素類とスルホンアミド類を提供する。 図３は、コンビナトリアルライブラリーを設計する際のBUILDERoptの使用を示 す。（ａ）スカホルドのモデリング。ペプスタチン阻害剤の配位（coordinate） とＰ1−Ｐ3立体配座をヒドロキシエチルアミンのスカホルドの出発形態として用 いた。メチル基を、スカホルドのＲ1−Ｒ4位置の各々に配置した。（ｂ）スカホ ルドの立体配座。スカホルドの三つのねじれ角についての立体配座のサーチによ って、四つの立体配座のファミリーを得た。ベンジル側鎖（Bn）を、これらファ ミリーの各々のＲ4位置に付加した。（ｃ）ライブラリー成分の評価。プログラ ムBUILDERoptによって、各ファミリーの各可変位置（Ｒ1−Ｒ3）におけるすべて の可能性のある成分について、限定された立体配座のサーチを行い、それら成分 のカテプシンＤとの可能性のある相互作用によって、それら成分を採点した。各 ファミリーの最高得点の候補を結合させた。 図４Ａ〜４Ｃは制御されたライブラリーを調製するために使用した成分を示す 。制御されたライブラリーの成分は、文字のコードで標識する。EHAは、Ｒ1＝Ｅ ；Ｒ2＝Ｈ；およびＲ3＝Ａと定義する。 図５Ａ〜５Ｃは多様性ライブラリーを調製するのに使用した成分を示す。多様 性ライブラリーの成分は、制御されたライブラリーの場合と同様に小文字の文字 コードで標識する。図５Ａでは、Ｒ1＝ｉのｔ−ブチルエステルをカップリング 反応に使用した。図５Ｃでは、Ｒ3＝ｄのBoc保護アミンをカップリング反応に使 用した。これらの保護基は、TFA：H2O開裂反応中に除去される。 図６Ａ〜６Ｃは、最も活性の高い側鎖、Ｒ1＝Ｅ，Ｆ；Ｒ2＝Ｆ，Ｈ；Ｒ3＝Ａ ，Ｄ，Ｊを含有する各クラスター(cluster)の成分 を示す（実験計画参照）。これらの側鎖を有する39種類の化合物すなわちEFD，E HD，FFD，FHD，KFD，KHD，LFD，LHD，MFD，MHD，NFD，NHD，OFD，OHD，PFD，PHD ，QFD，QHD，RFD，RHD，SFD，SHD，TFD，THD，UFD，UHD，VFD，VHD，EHA，EHJ， EHK，EHL，EHM，EHN，EHO，EHP，EHQ，EHR，EHSを、先に述べた樹脂の上に合成 した。これらの化合物を、333nM、100nMおよび33nMにて、ハイ−スループットス クリーニング（high-through put screening）で検定した。最も活性の高い化合 物を大規模に合成してそのＫ1値を測定した（表３）。 図７は、固体支持体に結合されたα−アルコキシピロリジンアミドに、グリニ ャール付加反応で導入されている構造の多様性を示す。 図８は、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤の固相合成を示す。 図９は、204個の化合物のライブラリーのライブラリー多様性を生成する成分 を示す。 発明の詳細な説明 本発明は（ｉ）非−ペプチドカテプシンＤ結合化合物；（ii）新規ならびに既 知の非−ペプチド化合物のカテプシンＤ結合法、（iii）非−カテプシン化合物 を用いたカテプシンＤ阻害法に関する。 Ａ．定義 本発明に於ける“独立に選別された”とは、３種類の基、即ちＲ1，Ｒ2とＲ3 が同一であるか、または異なることを示す（例えば、Ｒ1，Ｒ2とＲ3が全て置換 アルキルであってもよく、またはＲ1とＲ2が置換アルキルでありＲ3がアリルで あってもよい）。 本発明に於ける“アルキル”とは、１−12個の炭素、好ましくは１から６個の 炭素を持つ、分枝型または非分枝型の、飽和型または 不飽和型の一価の炭化水素ラジカルを指す。アルキル基が１−６個の炭素原子を 持つとき、それを“低級アルキル”と称する。好適なアルキルラジカルには、例 えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、２−プロフェニル（または アリル）、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｉ−ブチル（または２−メチルプロピル） 等が含まれる。本発明で使用する如く、本用語には“置換アリル”を包含する。 “置換アルキル”とは、低級アルキル、アリル、アシル、ハロゲン（例えば、 アルキルハロス、例えばCF3）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルア ミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、アリルオキシ、アリルオキシアルキル、メ ルカプト、飽和型と不飽和型環状炭化水素、ヘテロ環体等の様な官能基を１つ以 上含む様に記載されるアルキルである。これらの基はアルキル部分のいずれかの 炭素にも結合できる。 本発明の“アリル”とは、１個の芳香環または互いに融合した複数の芳香環が 、メチレンまたはエチレン部分の様な共通基と共有結合、または結合したものを 指す。共通結合基はベンゾフェノン内の場合にはカルボニルでも良い。芳香環は フェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルメチルとベンゾフェノン等を含む 。“アリル”は“アリルアルキ”を包含する。 本発明における“アリルアルキル”とは、アリル基が式１に示す核に本書定義 によるアルキ基により結合している“アリル”のサブセットを意味する。 本発明に於ける“置換アリル”とは、芳香環と融合し、メチレンまたはエチレ ン部分の様な共通基に共有結合または結合した、低級アリル、アシル、ハロゲン 、アルキルハロス（例えばCF3）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキル アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、アリルオキシ、アリルオキシアルキル、 メルカプト、 飽和型と不飽和型環状炭化水素の様な官能基を１つ以上含み、芳香環と融合し、 メチレンまたはエチレン部分の様な共通基に共有結合または結合した様に記載さ れる“アリル”を指す。結合基はまたシクロヘキシルフェニルケトン内と同様に カルボニルでも良い。“置換アリル”には置換アリルアルキルを包含する。 “置換アリルアリル”とは、置換アリル基が、本発明により定義されたアルキ ル基により式１に示す核と結合する“置換アリル”のサブセットを指す・ 本発明の於ける“アシル”とは、Ｒが本発明の定義によるアルキルまたは置換 アルキル、アリル、または置換アリルである−C(O)Rである、ケトン置換体を示 すために用いられる。 本発明に於ける“ハロゲン”とは、フッ素、臭素、塩素と沃素原子を表す。 本発明に於ける“ヒドロキシ”とは、−OHである基を表す。 本発明に於ける“アミノ”とは、Ｒ−NH2である第一級アミンを表す。 本発明に於ける“アルコキシ”とは、Ｒが本発明定義の低級アルキル、置換低 級アルキル、アリル、置換アリル、アリルアキルまたは置換アリルアルキルであ る−OR基を表す。好適なアルコキシラジカルには、例えばメトキシ、エトキシ、 フェノキシ、置換フェノキシ、ベンジルオキシ、フェネチルオキシ、ｔ−ブトキ シ等がある。 本発明に於ける“アルキルアミノ”とは、アルキル基が同一または別であり、 直鎖または分枝した、飽和または不飽和炭化水素である、第三級および四級アミ ンを指す。 本発明では、“アクリルアミノ”とは、式中のＲ’が低級アルキル基であり、 Ｒが式１に示す核を表すか、または該核に結合する本発明定義のアルキル基であ る一般式RC(O)NR’である置換体を表す 。 本発明に於ける“アシルオキシ”とは酸性水素除去により有機酸より由来する 有機ラジカルを示す。単純アシルオキシ基には、例えばアセトオキシ、エタン酸 、プロパン酸、ブタン酸等の様なカルボン酸に由来する高級同族体を含む。アシ ルオキシ部分は、正向き、または逆向きエステル（即ち、それぞれRC(O)OR’、 またはR'OC(O)Rで式中のＲは請求項１の核に直接または中間炭化水素を介して結 合しているエステル部分を成す）のいずれかに向いている。 本発明に於ける“アリルオキシ”とは、酸素原子を介して図１に示す核に直接 結合した芳香族基を示す。この語は、芳香族基が上記“置換アリル”と同様に置 換された“置換アリルオキシ”も包含する。 本発明に於いては、“メルカプト”とは、式中のＲとＲ’が同一または別であ り、本発明定義のアルキル、アリルまたはヘテロ環である一般紙Ｒ−Ｓ−Ｒ’部 分を表す。 本発明の於ける“飽和環状炭化水素”とは、シクロプロピル、シクロブチル、 シクロペンチル等の基、ならびにそれら構造の置換同族体を表す。 本発明の於ける“不飽和環状炭化水素”とは、シクロペンテン、シクロヘキセ ン、等の基とその置換同族体の様な、少なくとも１つの二重結合を持つ単価非芳 香族基を表す。 本発明に於ける“ヘテロアリル”とは、１つ以上の芳香族環の炭素分子が窒素 、酸素または硫黄の様な別原子により置換された芳香族環を指す。ヘテロアリル とは、単一芳香族環、複芳香族環、または１つ以上の非芳香族環に結合した１つ 以上の芳香族環である構造を指す。複数の環を有する構造では、環は互いに融合 し、共有結合し、またはメチレンまたはエチレン部分の様な共通基に結合する。 共通結合基としてはフェニルピリジルケトンの様なカルボニルもあるだろう。本 発明に於いては、ジオフェン、ピリジン、イソキサゾール、フタールイミド、ピ ラゾール、インドール、フラン等の環、またはこれらベンゾ環の融合同族体は“ ヘテロアリル”と表される。 “ヘテロアリルアルキル”は、本発明定義のアルキル基がヘテロアリル基を図 １に示す核に結合する“ヘテロアリル”のサブセットを表す。 “置換ヘテロアリル”とは、ヘテロアリル核が、低級アルキル、アシル、ハロ ゲン、アリルハロス（例えば、CF3）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アリ ルアミノ、アクリルアミノ、アクリルオキシ、メルカプト等の１つ以上の官能基 で置換されたヘテロアリル核を表す。即ち、チオフェン、ピリミジン、イソキサ ゾール、フタールイミド、ピラゾール、インドール、フラン等の様なヘテロ芳香 族環の置換同族体、またはこれら環のベンゾ融合同族体は“置換ヘテロアクリル ”と定義される。 “置換ヘテロアルキルアリル”は、本発明のアルキル基が図１に示す核にヘテ ロアリル基を結合する上記定義の“置換ヘテロアリル”を表す。 本発明の“ヘテロ環”とは、単環または１−12個の炭素と、環内の窒素、硫黄 または酸素より選択される１−４個のヘテロ分子からなる複縮合環を有する単価 の飽和または不飽和非芳香族基を表す。 本発明による“置換ヘテロ環”は、ヘテロ核が低級アルキル、アシル、ハロゲ ン、アルキルハロス（例えばCF3）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキ ルアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、メルカプト等の官能基で１つ以上が置 換された“ヘテロ環”のサブセットを表す。 “ヘテロ環状アルキル”とは、本発明定義のアルキル基が図１に示す核にヘテ ロ環基を結合する“ヘテロ環”のサブセットとして定義される。 “場合によって置換されたナフチレン環”とは、置換されなくてもよく、また は低級アルキル、ハロゲン、アシル、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキ ルアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、またはアリルを含む官能基で１つ以上 で置換されてもよいナフタレンを表す。 “置換ヘテロ環アルキル”とは低級アルキル、アシル、ハロゲン、アルキルハ ロス（例えばCF3）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシ ルアミノ、アシルオキシ、メルカプト等の官能基で１つ以上が置換されたヘテロ 核である“ヘテロ環アルキル”のサブセットを表す。 本発明に於ける、“接触する”とは、結合する、加える、譲る、反応する、流 れ出る等と言い換えることができる。さらに、本発明のカテプシンＤ化合物は、 例えば本発明記載の如く非経口的、経口、局所、ならびに吸引経路の様な通常の 方法により“投与”することができる。 “十分量”または“有効量”とは、試験体の結合／阻害活性を阻害し、または 自覚的な症状の解放または医師またはその他の評価観察者により客観的に認めら れる改善をもたらすカテプシンＤ化合物量である。 Ｂ．非−ペプチドプロテアーゼ結合化合物 本発明は、結合コンビナトリアルライブラリー（例えばThompsonら、Chemical Reviews，96，555-600(1996)参照）と、設計アプローチ(例えばKuntz，I.D.，S cience，257，1078-1082(1992))に基づく構造を利用した、カテプシンに結合、 阻害できる小分子化合物 の大量同定に関する。潜在カテプシンＤ結合化合物のライブラリーは、図１に示 すヒドロキシエチルアミンスキャフォルドに関する機能的表示に基づいた。最初 のライブラリーでは、Ｐ1側鎖（Ｒ4）をEricksonにより報告された(Baldwin，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90，6796-6800(1993))ペプチドベースの天 然生成ペプスタチンと複合体形成したカテプシンＤのＸ−線結晶像に基づいたベ ンジル置換体に固定した。図２に示す様に、３カ所に変化を誘導した：第一級ア ミンによりＲ1置換体を導入し、アシル化剤によりＲ2とＲ3置換体を導入した。 一度調整した後、ライブラリーをスクリーニングし、カテプシンＤと結合し阻害 する化合物を同定した。その後、第２世代ライブラリーを調整し、さらに最も活 性型の化合物変種を探索した。即ち、構造ベース設計とコンビナトリアルライブ ラリー法を組み合わせ、カテプシンＤと結合し阻害できる非−ペプチド化合物を さらに同定した。 上記の如く、本発明は一般式を有する化合物を提供する： 一般式Ｉに於いて、Ｒ1，Ｒ2とＲ3は、アルキル、置換アルキル、アリル、置 換アリル、アリルアルキル、置換アリルアルキル、アリルオキシアルキル、置換 アリルオキシアルキル、ヘテロアリル、置換ヘテロアリル、ヘテロアリルアルキ ル、置換アリルアルキル、ヘテロ環、置換ヘテロ環、ヘテロ環アリルと置換ヘテ ロ環アルキルから成るグループより独立に選択される。 式Ｉでは、Ｒ5とＲ6は水素、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アリル、置 換アリル、アリルアルキル、置換アリルアルキル、アリルオキシアルキルと置換 アリルオキシアルキルから成るグループから独立に選択される。別の実施態様で は、Ｒ5とＲ6とそれらが結合する炭素は結合して置換９−または10−環分子炭素 環またはヘテロ環融合環系を形成することもある。典型的な９−または10−分子 環系は、これに限定されるものではないが、ナフリル、１，３−ベンゾヂオキシ リル、２，３−ベンゾフラニル、１，４−ベンゾヂオキシアニル、ベンズイミダ ゾイル、ベンゾチアゾイル等を含む。 上記式Ｉの範囲の中では、特定の実施態様が好適である。式Ｉの好適な実施態 様は、Ｒ１がこれに限定されるものではないが、ヘテロ環アリルアルキルと置換 アリルアルキルを含む官能基であるものである。官能基の例には、次のものが含 まれるが、もとよりこれに限定されるものではない： 別の好適な実施態様では、Ｒ2はこれに限定されるものではないが、ヘテロア リルアキル、置換アリルアルキルとアリルオキシアルキルを含む官能基である。 この様な官能基の例は以下を含むが、もとよりこれに限定されるものではない； また好適例は、Ｒ3がこれに限定されるものではないが、置換アリル、ヘテロ アリルアルキルと置換アリルオキシアルキル含む官能基である実施態様である。 この様な官能基の例は以下を含むが、もとよりこれに限定されるものではない： Ｒ5とＲ6そしてこれらが結合する炭素が結合し、置換ナフタレン環を形成する こともある場合も、別の好適な実施態様である。別の実施態様では、Ｒ5とＲ6は 共に水素であるか、またはＲ5が水素でありＲ6がベンジル環上のメタまたパラ置 換である。 式Ｉでは、ベンジル環は置換Ｒ4（以下参照）で置換できる。該実施態様では 、Ｒ4はアルキル、置換アルキル、アリル、置換アリル、アリルアルキル、置換 アルキルアリル、アリルオキシアルキル、置換アリルアルキル、ヘテロアリル、 置換ヘテロアリル、ヘテロ アリルアルキル、置換ヘテロアリルアルキル、ヘテロ環、置換ヘテロ環、ヘテロ 環アルキルと置換ヘテロ環アルキルから成るグループより選択できる。 表１に特に好適な本発明による化合物を記載している。この表中と本明細書記 載の化合物は、コード番号にて参照されるが、これは便宜上からのみ利用される ものであり、また本発明の目的のためのみに厳密に限定される。 表１．例示的プロテアーゼ結合化合物 本発明の化合物は、慣用的な合成化学技術を用いて種々の方法で合成すること ができる。典型的には、本発明の化合物は、図２に示す反応スキーム（ここで、 Ｒ1，Ｒ2、及びＲ3は先の定義通りである）に従って調製される。これらの反応 を行うための適切な有機溶媒、温度及び時間の条件の使用は当業者の標準の範囲 内である。この型の反応は、一般に、その技術が引用により本明細書に組み込ま れるE.K．Kick及びJ.A．Ellman(J ．Med．Chem．38，1427〜1430(1995))により記 述される。Ｃ．結合法 一実施形態において、本発明は、カテプシンＤを標識するために先に指定され た化合物を用いることが考慮される。１つの場合、カテプシンＤは、その化合物 の非共有結合による分子量の増加により“標識化（ラベル）”することができる 。その分子量の増加は、い ずれかの大きさを測る技術、例えばHPLC，SDS-PAGE、及び質量分光法によって検 出することができる。 本発明には、シグナル放射又は特異的結合のいずれかにより検出することがで きる少くとも１の成分を、その化合物に結合させ又はそれらの構造に組み込むこ とに関する標識化法も考慮される。これらのような成分は、一般に、カテプシン Ｄ又はカテプシンＤに結合した分子の検出を容易にすることを意図する。この目 的のために役立つ型の成分の例は、酵素、発蛍光団、高アフィニティーコンジュ ゲート、発色団（発光団）及び放射性元素（ラジオアイソトープ）である。酵素 の例はアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びグルコースオキシダ ーゼである。アフィニティーコンジュゲートシステムの例はビオチン−アビジン システムである。発蛍光団の例はフルオレセインである。発色団の例はルミノー ルである。放射性標識の例は3Ｈ，14Ｃ，231Ｉ及び125Ｉである。当業者に知ら れており、彼らに用いられる他の検出成分を本発明の方法に用いることができる 。 上述の通り、１つの複合体中には１つの又は多重の標識が存在し得る。ここで 、その多重の標識は同一でも異なってもよい。カテプシンＤの検出を容易にする ための本発明の使用において、好ましい標識はチタニウム(3Ｈ)及び14Ｃである 。化合物に結合した分子の検出を容易にするための好ましい標識はビオチンであ る。 本発明には、組織及び細胞内でカテプシンＤを標識するために本明細書に開示 される化合物の標識化アナログが考慮される。この型の標識化は、診断及び予後 の両方に用いることができる。この標識化技術によるカテプシンの定量は、当業 者に周知の多くの方法で行うことができ、これには、化合物のトリチウム化アナ ログ及び顕微鏡スライド上での処理した細胞のオートラジオグラフィーを用いる 方法がある。更に、用いることができる蛍光染色について記述されたいくつかの 自動化検出システムがある。例えば、引用により本明細書に組み込まれるResnic kら（米国特許第4,125,828号及び第4,207,554号）を参照のこと。 本発明には、カテプシンＤのトポロジー作用的及び機械作用的プローブとして 本明細書に開示される化合物の試験管内での使用も考慮される。一実施形態にお いて、トポロジー作用的アッセイは、そのプロテアーゼ結合部位が知られている 標識化化合物を利用する。更に、本発明の化合物の周知のカテプシンＤ結合部位 により、その結合物を、他の（ペプチド及び非ペプチド）化合物についての結合 部位の決定に用いることを可能にする。一実施形態において、本発明の化合物は 、プロテアーゼ結合部位がテストされるべき第２の化合物との競合アッセイに用 いられる。本発明の化合物は、一緒に、又はいずれかの連続的順番でカテプシン Ｄに加えることができる。本発明の化合物を標識化する場合、最初に、（できる なら）結合部位を遮断させるために第２の化合物を加えることが好ましい。同様 に、第２の化合物を標識化する場合、本発明の化合物を最初に加えるのが好まし い。 本発明には、カテプシンＤを固定化するための結合法も考慮される。一実施形 態において、本発明は、固体支持体上にプロテアーゼを固定するためにカテプシ ンＤに非共有結合で結合するであろう本発明のカテプシンＤ結合化合物を用いる ことが考慮される。このような方法は、プロテアーゼの精製に役立つ。 上述の化合物の結合は、部分的には、溶解性の機能である。必要に応じて、こ れらの化合物の溶解度は、共溶媒の使用により水溶液中で増加させることができ る。好ましい共溶媒は、ジメチルスルホキシド（DMSO）である。DMSOの濃度範囲 は0.1％〜10％であり、好 ましくは、0.5％〜５％の範囲である。Ｄ．カテプシンＤ阻害 本発明の化合物は、カテプシンＤの潜在的なインヒビターであることが見い出 されている。それ自体、本発明には、生体内又は試験管内のいずれかでカテプシ ンＤを阻害するために本発明の化合物を用いることが考慮される。一実施形態に おいて、本発明は、カテプシンＤを阻害する方法であって、式Ｉ：の化合物にカテプシンＤを接触させることを含む方法を供する。 この式において、Ｒ1，Ｒ2及びＲ3は、アルキル、置換化アルキル、アリール 、置換化アリール、アリールアルキル、置換化アリールアルキル、アリールオキ シアルキル、置換化アリールオキシアルキル、ヘテロアリール、置換化ヘテロア リール、ヘテロアリールアルキル、置換化ヘテロアリールアルキル、ヘテロ環、 置換化ヘテロ環、ヘテロ環式アルキル及び置換化ヘテロ環式アルキルからなる群 から独立して選択されるハンバーである。Ｒ1，Ｒ2及びＲ3に関する先の議論及 びそれらの好ましい実施形態は、この本発明の方法に用いられるカテプシンＤイ ンヒビターに十分に適用可能であり、これにより、この特定の方法に関してくり 返す必要はないであろう。Ｒ5及びＲ6は先に定義される。 他の実施形態において、本発明は、生きている細胞内でのカテプシンＤによる タンパク質プロセッシングを阻害する方法であって、 有効量の式Ｉ： の化合物に前記細胞を接触させることを含む方法を供する。 Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ5及びＲ6に関する先の議論並びにそれらの好ましい実施形 態は、本発明のこの方法に用いられるカテプシンＤインヒビターに十分に適用可 能であり、これによりこの特定の方法に関してくり返す必要はないであろう。 カテプシンＤを阻害できる化合物はペプチド基質の加水分解における変化を測 定する本明細書に記載のアッセイを利用して容易に同定できる。より詳しくは、 ヒト肝臓カテプシンＤ（Calbiochem）に対する活性についての蛍光定量高処理量 アッセイが、本発明の化合物のカテプシンＤを阻害する能力をスクリーニングす るのに利用できうる。このアッセイはG.A．Kraftら、Methods Enzymol．241，70 -86(1994)に過去に発表され、その教示内容は引用することで本明細書に組入れ る。更に、このアッセイにおいて利用するペプチド基質(Ac-Glu-Glu(エダンス)- Lys-Pro-Ile-Cys-Phe-Phe-Arg-Leu-Gly-Lys(メチルレッド)-Glu-NH2)が過去に報 告されている(Km＝６μＭ)(E.T．Baldwinら、Proc．Natl．Acad．Sci.，U．S.A ．90，6796-6800(1993))。一般に、反応体を混合し、反応を特定時間進行させ、 そして反応生成物の蛍光をモニターし、どの程度ペプチド基質が切断されたかを 決定する。上記のアッセイを利用してカテプシンＤに対する阻害活性を示すこと が認められた化合物は大量スケールで 合成することができ、そしてより詳細な反応速度論分析を、後述の表３に記載の ものと類似し、且つG.A．Kraftら、、Methods Enzymol．241，70-86(1994)によ り一層詳しく述べられているアッセイを利用して実施できる。このようにして、 本発明の方法に従い、化合物は容易に合成でき、そしてカテプシンＤを阻害する 化合物を同定するためにスクリーニングできる。 前述の通り、カテプシンＤはタンパク質の代謝、異化作用及び抗原プロセッシ ングにおいて重要な役割を果たすリソソーム酵素である。カテプシンＤを阻害す るその能力の結果、本発明の化合物は幾多の治療的用途に利用できうる。かかる 用途には癌の治療が挙げられ、その理由は腫瘍、特に乳癌におけるカテプシンＤ の高揚したレベルは、腫瘍転移をもたらす細胞外マトリックスのカテプシンＤ媒 介タンパク質分解に基づく劣った予後と相関するからである（例えば、B.R．Wes tleyら、Eur．J．Cancer 32，15-24（1996）参照）。 従って、本発明は腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法を提供し、ここでこの 方法は腫瘍細胞を次式を有する化合物と接触させることを含んで成る： Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ5及びＲ6並びにその好適な態様についての先の論述は本発 明のこの方法において利用されるカテプシンＤインヒビターに完全に適用でき、 従ってこの特定の方法に関して繰り返さない。 現状好適な態様において、本発明の化合物は哺乳動物被検体における腫瘍細胞 の増殖の阻害に利用され、この方法はこの哺乳動物被検体に治療的に有効な量の 本発明の化合物を投与することを含んで成る。この方法に従うと、哺乳動物被検 体には、限定することなく、ヒト、実験用動物、家畜ペット及び牧畜動物が挙げ られる。更に、腫瘍細胞には、限定することなく、肺、結腸、乳、卵巣、前立腺 及び肝腫瘍細胞が挙げられる。現状好適な態様において、腫瘍細胞は乳腫瘍細胞 である。 以上に加えて、カテプシンＤの阻害はアルツハイマー病の処置のために有効で あり、その理由はカテプシンＤの高揚したレベルがアルツハイマー病患者の大脳 脊髄液において同定され、そしてカテプシンＤはアルツハイマー病に関与する突 然変異β−タンパク質前駆体に対して高いタンパク質分解活性を有することが示 されているからである（例えば、Ladror，U.S.ら、J．Biol．Chem．269，18422- 18428(1994)；Cataldo，A.M．ら、J．Neurosci．16，186-199（1996）参照）。 従って、本発明はアルツハイマー病に冒された患者の突然変異β−タンパク質 前駆体のタンパク質分解を阻害する方法を提供し、この方法はこの患者に突然変 異β−タンパク質前駆体のタンパク質分解を阻害するのに有効な量のカテプシン Ｄインヒビターと薬理学的に許容される担体とを投与することを含んで成り、こ のカテプシンＤインヒビターは次式を有する： Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ5及びＲ6並びにその好適な態様についての先の論述は本発 明のこの方法において利用されるカテプシンＤインヒビターに完全に適用でき、 従ってこの特定の方法に関して繰り返さない。 本発明の化合物、即ち、アスパラギン酸プロテアーゼは治療的投与のための様 々な製剤に組込んでよい。より詳しくは、本発明の化合物は適当な薬理学的に許 容される担体又は希釈剤との組合せにより薬理組成物の中に配合してよく、そし て固体、半固体、液体又は気体の形状、例えば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、オ イントメント、溶液、座薬、注射、吸入剤及びエアロゾールにおいて調製品へと 製剤化されうる。従って、当該化合物の投与は様々な方法、例えば経口、頬、直 腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内投与等で達成できる。本発明における 利用に適当な製剤は、引用することで本明細書に組入れるRemington's Pharmace utical Sciences(Mack Publishing Company，Philadelphia，PA，17版(1985))に おいて見い出せる。更に、薬剤導入のための方法の簡単な文献については引用す ることで本明細書に組入れるLanger，Science 249：1527-1533(1990)を参照のこ と。 本発明の化合物は単独でもしくは互いと組合せて投与してよく、又はその他の 公知の化合物（例えば、その他のプロテアーゼインヒビター）と組合せて利用し てよい。薬理投与形態において、当該化 合物はその薬理学的に許容される塩の形態で投与してよく、又は単独でもしくは 適当に会合させて用いてもよく、またその他の薬理活性化合物と組合せてよい。 以下の方法及び賦形剤は単なる例示であり、限定を意味しない。本発明の化合物 は本質的に非ペプチドであるため、それらは本質的にペプチドである化合物より も優れた薬動力学的活性（例えば、より良い経口有用率及び長い循環半減期）を 有することに注目すべきである。 経口調製品に関して、当該化合物は単独で又は適当な添加剤、例えば慣用の添 加剤、例えばラクトース、マンニトール、コーンスターチもしくはポテトスター チ；結合剤、例えば結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンス ターチもしくはゼラチン；崩壊剤、例えばコーンスターチ、ポテトスターチもし くはナトリウムカルボキシメチルセルロース；潤滑剤、例えばタルクもしくはス テアリン酸マグネシウム；そして所望するなら希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤 及び風味料と組合せて用い、錠剤、粉末、顆粒もしくはカプセルにしてよい。 それらを水性又は非水性溶剤、例えば植物油又は他の類似する油、合成脂肪酸 グリセリド、高級脂肪酸又はプロピレングリコールのエステルに溶解、懸濁又は 乳化させることにより前記化合物を注入用の製剤に配合することができる。所望 であれば常用の添加剤、例えば可溶化剤、等張剤、沈澱防止剤、乳化剤、安定剤 及び保存剤を用いることができる。 前記化合物は、吸入を通じて投与すべきエアゾール製剤で使用できる。本発明 の化合物を、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等のような加圧される 許容可能な噴射剤中に配合することができる。 さらに、前記化合物を、乳化性基剤又は水溶性基剤のような種々 の基剤との混合により座剤に調製することができる。本発明の化合物を、座剤を 通じて直腸に投与することができる。座剤は、体温で融解するココアバター、カ ーボワックス及びポリエチレングリコールのような賦形剤を含む場合があるが、 室温では固形である。 シロップ、エリキシル及び懸濁液のような経口投与又は直腸投与用の単位投与 形態は、各投与単位、例えば茶さじ一杯の量、テーブルスプーン一杯の量、錠剤 又は座剤が１種以上の本発明の化合物を含む組成物を所定量含むように提供され てよい。同様に、注入又は静脈投与用の単位投与形態は、滅菌水、通常の食塩水 又は他の医薬的に許容可能なキャリヤー中の溶液として本発明の化合物を含んで よい。 ここで用いる「単位投与形態」なる用語は、人及び動物の被験者に対して１回 の投与量として適する物理的に分離している単位を意味し、各単位は医薬的に許 容可能な希釈剤、キャリヤー又は賦形剤と協働して望ましい効果を生じさせるの に十分な量の計算された所定量の本発明の化合物を含む。本発明の新規な単位投 与形態に関する明細事項は、使用される個々の化合物及び得ようとする効果並び にホスト中の各化合物と関係のある薬効に依存する。 医薬的に許容可能な添加剤、例えば賦形剤、補助剤、キャリヤー又は希釈剤は 容易に入手できる。さらに、医薬的に許容可能な補助物質、例えば、pH調節剤及 び緩衝剤、等張化剤、安定剤、湿潤剤等も容易に入手できる。 本発明の化合物の好ましい製剤は経口投与製剤、それぞれ活性成分を約10ミリ グラム〜約1000ミリグラム含む、特にカプセル又は錠剤である。本発明の化合物 は、摂取又は注入に適する生理学的適合性のあるマトリックス又は溶剤に配合さ れる。 本発明を具体例により詳細に説明する。以下の実施例は例示を目 的とするものであって、けっして本発明を限定するものではない。当業者は、変 更又は改良を加えることのできる種々の臨界的でないパラメータを容易に認識し 、本質的に同じ結果を得ることができる。 実施例 Ａ．具体的アプローチ 酵素群の対象をしぼる１つの有効な手法は、酵素触媒反応の遷移状態又は中間 体の安定な模倣体又はアイソスターを組み入れることである(R.A．Wiley等のMed ．Res．Rev．13，327-384(1993))。可能なカテプシンＤ阻害剤のライブラリーは 、周知のヒドロキシエチルアミンアイソスターに基づく（図１参照）。初期ライ ブラリーについて、Ｐ1側鎖（Ｒ4）は、天然ペプチド阻害剤ペプスタチンと錯化 したカテプシンＤのＸ線結晶構造(E.T．Baldwin等のProc．Natl．Acad．Sci.，U .S.A．90，6796-6800(1993))と、ペプチドをベースとする阻害剤の阻害指数(R.A ．Jupp等のBiochem．J．265，871-878(1990)；N.S．Agarwal等のJ．Med．Chem． 29，2519-2524(1986))を基準にして、ベンジル置換基として一定に保たれる。 試験的研究において、両方のジアステレオマーが他のアスパラギン酸プロテア ーゼの潜在的阻害剤のうちに見いだされているために(R.A．Wiley等のMed．Res ．Rev．13，327-384(1993))、ヒドロキシル炭素に関するＳ及びＲエピマーの両 方（図１、構造１及び２参照）を調製した。１μＭでの阻害が試験的研究での枠 組み１の化合物に対して確認されたため、カテプシンＤへのライブラリーのさら なる合成には枠組み１のみを用いた。計算機モデリング（以下参照）によって、 その構造１（図１）が最も有効な阻害剤を与えることが予測された。３つの位置 に多様性を導入した：Ｒ1置換基に対して第１級アミン、Ｒ2及びＲ3置換基に対 してアシル化剤（図２参 照）。合成順序の最適化はすでに報告されている(E.K．Kick，J.A．Ellman，J． Med．Chem．38，1427-1430(1995))。 Ｒ1，Ｒ2及びＲ3位置に官能基を導入するための商業的に入手可能な化合物を 使用できるようにライブラリー合成を設計した。利用可能な物質の網羅的組み合 わせによって、100億種以上の化合物のライブラリーが得られる場合がある。判 断可能な手法でこれらの可能性を抑えるために、MDL Information Systems(カリ フォルニア州サンリアンドロ(San Leandro)所在)製のAvailable Chemical Direc tory(ACD)のバージョン93.2を使用して分子量275ダルトン未満の全てのアミン、 カルボン酸、塩化スルホニル及びイソシアネートを検索した。前記合成法に明ら かに適合しない官能基を有する化合物は排除した。得られた一覧表には、約700 種のアミンと1900種のアシル化剤が含まれていた。しかしながら、この一覧表か らでも10億種以上の化合物にたどり着く。明らかに、さらなる選択の規準が必要 であり、計算機によるスクリーニングプロセスにいっそうの選択の努力が求めら れる。 Ｂ．指向ライブラリーデザイン 構造をベースとするデザインプロセスはカテプシンＤを含む錯体におけるペプ スタチンのための配位子とともに始まった（E.T．Baldwinら、Proc．Natl．Acad ．Sci．，U.S.A.90，6796〜6800(1993)）。スカッフォルドはＰ1−Ｐ3サイドで ペプスタチンと同一であるが、Ｂ1−Ｐ3サイドで異なり、そして同一の水素結合 を酵素と形成することができない（図３Ａ）。このように、Ｐ1−Ｐ3サイドのペ プスタチンの位置を用い、そしてＰ1−Ｐ3サイドにある３つのスカッフォルドの 捩じれ角を全体的に回転させた。各回転はSybyl中のAMBER（S.J．Weinerら、J． Am．Chem．Soc．106，765〜784(1984)）力場、Tripos Associates(St．Luis，MO )の分子モデリン グソフトウェアパッケージを用いて、カテプシンＤの活性サイト内のエネルギー を最小にすることにより行った。最小化の間に、酵素は剛性が維持されたが、ス カッフォルドの完全な可撓性が可能であった。構造１および２のＳエピマーおよ びＲエピマーの両方はＲ1〜Ｒ4基の各々にメチル基を用いてモデル化された。Ｒ エピマーのコンフォメーションエネルギーは、一般に、Ｓエピマーよりも約２kc al高く、その為、ＳエピマーはＲエピマーよりも強固に結合するものと予測され る。２kcal／モルの範囲のＳエピマーの最小化コンフォメーションの全てを集め 、そして幾何学的類似性を基礎に４つの群にまとめた（図３Ｂ）。ベンジル基を Ｒ4位での各群に加えた。ACDの化合物の加エリストをSybylに通し、各成分につ いてのGasteigerおよびMarsili部分原子電荷を得た(J．Gasteigerら、Tetrahedr on Lett 36，3219(1980)；J．Gasteiger，M．Marsili，Organ．Magn．Reson．15 ，353(1981))。成分を探究するための計算時間を短縮するために、４個以上の捩 じれ結合を有する化合物を同定し、そして除外した。BUILDERopt（D.C．Roe，Di ssertation，University of California，San Francisco(1995)）と呼ばれる、 新規の特徴のBUILDER分子モデリングプログラム（R.A．Lewisら、J．Mol．Graph ics 10，66〜78(1992)；D.C．RoeおよびKuntz，I.D.，JCAMD 9，269〜282(1995) を用いて、Ｒ1，Ｒ2およびＲ3成分の各々をスカッフォルド上に配置し、15°の 増分で置換基の捩じれ角の完全なコンフォメーション研究を行った。組み合わせ の問題を低減するために、Ｒ1，Ｒ2およびＲ3成分を独立に調べたが、蓋然性を ベースとするクラッシュグリッドを構築して、オーバーラップしうるＲ1および Ｒ2コンフォメーションを同定した。例えば、Ｒ1コンフォメーションが50％より 多くのＲ2成分と衝突するならば、そのコンフォメーションを除外した。その後 、各回転を、ス カッフォルドとの分子内衝突およびカテプシンＤとのオーバーラップについて調 べた。各々の許容されるコンフォメーションは剛体最小化されており(D.A．Gsch wendら、J．Compt-Aided Drug Design 10，123〜132(1996)）、そして力場グリ ッドとともに記録した(E.C．Mengら、J．Comput．Chem．13，505〜524(1992))。 ４つの異なるスカッフォルドコンフォメーションに結合した全ての側鎖について の全ての捩じれ角を評価するために必要な合計時間はSilicon Graphic Iris R44 00で16時間であった。全ての群についての50の最良の記録成分を３つの可変位置 の各々について合わせ、そして全体で最低のスコアにより分けた。$35／gmを越 えるコストの成分を除外し、Ｒ1，Ｒ2およびＲ3のそれぞれに34，35および41成 分が残った。各々の残っている成分を構造的にフィンガープリントし（Daylight Clustering Toolkit，Daylight Chemical Information Systems，Inc.，SantaF e，NM）、そしてTanimoto symilarity metric(P．Willett，Similarity and Clu stering in Chemical Information Systems（John Wiley & Sons，New York，NY ，1987）；P．Willettら、J．Chem．If．Comput．Sci．26，109〜118(1986)))を 用いて、階層的に集団化した(類似性カットオフ＝0.63)(H.C．Romesburg，Clust er Analysis For Researchers(Lifetime Learning Publications，Belmont，CA ，1984)。Ｒ1，Ｒ2およびＲ3について、ユニークな集団の10個の最良記録成分を 指向ライブラリーとして選択した。 Ｃ．ダイバースライブラリーデザイン 指向ライブラリーと同一のサイズに設定したダイバースライブラリーを構造ベ ースの方法を用いないときの「ヒット」レートを提供するために用意した。ダイ バースライブラリーは官能基の種類およびライブラリー成分の構造モチーフを最 大化するようにデザインし た。このライブラリーの側鎖を、成分の初期リストを互いの類似性をベースに集 団化することにより選択した。成分はDaylight connectivity measure of simil arity(Daylight Clustering Toolkit，Daylight Chemical Information Systems ，Inc.，Santa Fe，NM)およびbinary Tanimoto metric（P．Willett，Similarit y and Clustering in Chemical Information Systems(John Wiley & Sons，New York，NY，1987)；P．Willettら、J．Chem．If．Comput．Sci．26，109〜118(19 86)）を用いて、Jarvis-Patrickアルゴリズム(R.A．Jarvisら、IEEE Comput C22 ，1025〜1034(1973))で集団化した。Jarvis-Patrick法において、もし、１）２ 種の化合物が互いにネイバー(neighbors)であり、かつ、２）ｑの最も近いネイ バーのリストから少なくともｐネイバーを共有しており、ｐおよびｑが調節可能 なパラメータであるならば、その２種の化合物は同一の集団に入る。集団の図心 に最も近い化合物を集団の代表例として選択した。 Ｒ1（アミン）成分を第一級アミンとして直接的に集団化した。Ｒ2およびＲ3 アシル化剤は結合サイトの適切な化学コンテクストを生じるように集団化する前 に、スカッフォルドの一部に各々結合した。集団化の第一ラウンドは、Ｒ1，Ｒ2 およびＲ3のそれぞれについて、ｐ／ｑ＝４／11，ｐ／ｑ＝４／12およびｐ／ｑ ＝４／１２を用い、47，154および162の集団を生じた。代表例のＲ2およびＲ3成 分を第二回目の集団化を行い（Ｒ2ついてはｐ／ｑ＝４／７、Ｒ3についてはｐ／ ｑ＝４／７）、23のＲ2および35のＲ3成分となった。集団の要素は非常に多種に なることができるので、多数の化合物を独断的に少数の集団に集約することは実 用的でないことに注意されたい。各リストからの10種の化合物の最終的な選択は 、サイズ、コスト、入手容易性および合成可能性を基礎とするもので あった。さらに、側鎖の各セットについての官能基のバランスを追求した。指向 ライブラリーおよびダイバースライブラリーの比較（図４および５）は、より非 常に広い範囲の官能基がダイバースライブラリーにおいて広がっていることを示 す。 Ｄ．ライブラリー合成およびスクリーニング 指向ライブラリーおよびダイバースライブラリー（各々1000種の化合物）を、 それぞれ図４および５に示したライブラリー合成において用いられる成分を含む ヒドロキシエチルアミンスカッフォルドのジアステレオマー１を用いて調製した 。ＲおよびＳエピマーを用いたパイロット実験は、Ｓエピマーに対して１μＭの インヒビター濃度での活性のみを示したので、指向ライブラリーおよびダイバー スライブラリーのＳエピマーのみが合成された。全てのライブラリーは空間的に 別個のフォーマットにおいて合成され、そしてカテプシンＤに対する抑制活性に ついての高通過量蛍光分析アッセイにおいてスクリーニングされた(G.A．Krafft ら、Methods Enzymol．241，70〜86（1994）。 １．ライブラリー合成 ヒドロキシエチルアミン阻害剤の固相合成シーケンスの最適化及び反応の説明 はすでにE.K．Kick及びJ.A．Ellmanらによって報告されている（J．Med．Chem． 38，1427-1430(1995)）。また、Ｒ1，Ｒ2及びＲ3において異なる官能基がこの阻 害剤として用い得ることを示すためにさらにテストが行われた。第一に、この合 成シーケンスにおいて基材開裂条件、特に最も過酷な反応条件に対する安定性を 確認するため、デバース及び指向ライブラリーの両方に混入されるアミン及びア シル化剤のすべてを室温において２時間、トリフルオロ酢酸によりテストした。 第二に、化学的もしくは立体的見地から困難であると考えられる成分を試験的合 成により評価した。 予想される最終生成物を高収率もしくは高純度で与えない５種のアミン及び４種 のカルボン酸を放棄した。以下のアミン及びアシル化剤がこの合成シーケンスに おいて成功した。Ｒ1＝Ｂ，Ｃ，Ｅ，Ｆ，ａ，ｅ，ｈ，ｉ，ｊ，Ｒ2＝Ｂ，Ｃ，Ｄ ，Ｅ，Ｈ，ａ，ｅ，ｆ，Ｒ3＝Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｈ，ａ，ｂ，ｅ，ｇ，ｈ，ｉ（図４ 及び５）。残りの成分はこの合成シーケンスに適合すると仮定した。 ライブラリー合成はポリスチレンビーズ（20〜40メッシュ）上で行った。ライ ブラリーは96ウェルフィルター装置を用いる空間分離アレイにおいて合成した。 個々のウェルへの樹脂の移送はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド(DMF)と１，２− ジクロロエタンの等密度混合物を用いて行った。Ｒ1の導入は80℃において36時 間、Ｎ−メチルピロリジノン(NMP)中の1.0Ｍの遊離アミンを用いて行った。Ｒ2 の導入はNMP中の0.3Ｍのカルボン酸、0.3Mのベンゾトリアゾール−１−イルオキ シトリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBOP)、0.3Ｍの ７−アザ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOAt）、及び0.9ＭのiPr2EtNの ストック溶液を用いて一晩行った。カップリング反応は、完全なカップリングを 確実に行うため２回行った。SnCl2，PhSH及びEt3Nによるアジド還元後、上記Ｒ2 と同様にしてＲ3の導入を行った。標準カップリング法において沈澱が形成する ため、PyBOPの代わりにｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１， １，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HATU）を用 いてカルボン酸Ｒ2＝Ｅをカップリングした。イソシアネートＲ2＝ｂはNMP中0.3 Ｍにおいて一晩カップリングし、スルホニルクロリドＲ2＝ｅ及びＲ3＝ｃはiPr2 EtN中0.9ＭであるNMP中0.3Ｍでカップリングした。基材からの材料の開裂は、樹 脂を95：５のトリフルオロ酢酸：H2Oに30分晒すことによって行った。開裂混合 物は濾過により 樹脂から除去され、次いで樹脂を洗浄し、Jouan 10.10遠心濃縮器を用いて濾液 を濃縮した。濃縮工程の間にトルエンを加えてトリフルオロ酢酸との共沸混合物 を形成した。濃縮後、ライブラリーを−20℃で保存した。 ランダムに取り出した各ライブラリーからの化合物を、Perseptive Biosystem s MALDI装置においてαシアノシンナミン酸のマトリックス中でマススペクトロ メトリーにより分析した。デバースライブラリーについては、49の化合物のうち 46について予想される分子イオンピークを観察した（他の３つについては十分な イオン化が得られなかった）。指向ライブラリーからの49の化合物のうち44につ いて分子イオンピークが得られた。さらに、多くの化合物について大スケールで 合成した精製材料のライブラリーからの粗材料のIC50値の相関関係によりこの合 成を確認した（特に表３を参照されたい）。 ２．カテプシンＤに対する阻害活性を有する化合物のライブラリーのスクリーニ ング 96ウェルミクロ滴定プレートにおいて、ヒト肝臓カテプシンＤ（Calbiochem） についての蛍光ハイスループットアッセイを行った(G.A．Krafftら、Methods En zymol．241，70-86(1994))。このアッセイにもちたペプチド基質（Ac-Glu-Gl(E) -Lys-Pro-Ile-Cys-Phe-Phe-Arg-Leu-Gly-Lys(Methyl Red)-Glu-NH2）はすでに報 告されている(Km＝６μＭ)(E.T．Baldwinら、Proc．Natl．Acad．Sci.，U.S.A． 90，6796-6800（1993）。このアッセイはDYNATECH Microfluor蛍光ミクロ滴定プ レートにおいて行い、96ウェルプレートリーダーを取りつけたPerkin-Elmer LS- 50Bで読み取った。励起波長は340nmであった。励起用に340nmの干渉フィルター （Hoya U-340）を、エミッション用に430nmカットオフフィルターを用いた。ミ クロ滴 定をベースとするアッセイについては、基質濃度は５μＭであり、カテプシンＤ 濃度は0.1Ｍ蟻酸バッファー(pH＝3.7)中９nMであった。基質開裂の直線領域にお いて３点で蛍光ユニット値を読み取り、阻害剤を含まない６つの対照ウェルにつ いてのFU中の平均変化に対して各ウェルについての蛍光ユニット（FU）の変化を 比較することによって酵素の活性率を決定した。各ライブラリーは、各阻害剤に ついて理論収率の50％が得られる仮定をベースとした濃度で約１μＭの阻害剤に おいてスクリーニングした。50％未満のカテプシンＤ活性を示すすべてのウェル を３倍希釈でスクリーニングした。１μＭもしくはそれ以下の阻害剤濃度におい て60％未満の酵素活性を示すすべての活性化合物を複数回アッセイした。 Ｅ．アッセイの結果 約１μＭの粗化合物において、指向ライブラリーはカテプシンＤ活性を50％以 下阻害する67の化合物を与えた(G.A．Krafftら、Methods Enzymol．241，70-86( 1994))。333nM及び100nMの阻害剤濃度の希釈は23及び７の化合物を与え、これは カテプシンＤ活性を50％以上阻害した（表２参照）。デバースライブラリーにつ いてのデータも表２に示す。各化合物の純度、化合物の濃度、及びミクロ滴定蛍 光に伴う実験誤差を含む多くの不確実性がハイスループット蛍光アッセイの結果 に影響を与える。各実験より、これらの誤差は酵素活性として表すと、約30％と 推定される。 表２ ライブラリースクリーンにおいてカテプシンＤを50％以上阻害する化合物 の数 a各濃度におけるカテプシンＤの阻害剤。cEAA，EFA，EHA，EHD，EHI，EHJ，FHA 。他の６つの化合物は40〜50％のカテプシンＤの阻害を与えた。eEAA，EFA，EHA ，FAA，FFA，FHA，FHB，EFD，EHD，EEF，EHF，FHF，EFH，EHH，FAH，FFH，EFI， EHI，EAJ，EFJ，EGJ，EHJ，FHJ。他の30の化合物は40〜50％のカテプシンＤの阻 害を与えた。g10μＭにおけるテスト用にランダム数発生により100の化合物を選 んだ。５つの化合物はこの濃度において高蛍光であり、これらのケースにおいて 正確なアッセイデータは得られなかった。dfbb，ffba，fbb，fcb。４つの化合物 （fca，fdb，fib，hhb）は40〜50％のカテプシンＤの阻害を与えた。このアッセ イの実験誤差により、この活性は示した３つについての活性と同じである。b10 μＭではデバースライブラリーはテストしなかった。 正確な阻害定数（Ｋ1）を得るため、ライブラリースクリーニングに基づき最 も有力な阻害剤となりそうな化合物のいくつかを大規模合成し、クロマトグラフ ィーで精製し、NMR及びマススペクトルで特性決定した。Ｋ1値はIC50測定より算 出した（表３参照）。十分に特性決定された化合物より、指向されたライブラリ ーからはＫ1 が100nM未満の化合物が一つ得られ、一方、多様なライブラリーには効力が３〜 ４倍低い阻害剤が含まれた。 表３ 有力な阻害剤となるいくつかの化合物の阻害定数a a指向されたライブラリー及び多様なライブラリーからの「ヒット」についての カテプシンＤアッセイを石英キュベット中でパーキン−エルマー社LS-50B分光光 度計により行った。基質濃度は2.5μＭ、カテプシンＤ濃度は10nMとした。Ｖi／ Ｖ0対阻害剤濃度のプロットから得られるIC50値から阻害定数（Ｋi）を求めた。 ここで、Ｖ0は阻害剤が無い場合の速度で、Ｖiは阻害剤を含む場合の速度である 。基質濃度はＫmよりも著しく低いため、IC50値を方程式Ｋi＝（IC50−Ｅ／２） 〔式中、Ｅは酵素濃度である。S．Cha，et al.，Biochem．Pharmacol.，24，218 7-2197，(1975)〕によりＫiに変換した。 Ｆ．（ｉ）第二世代ライブラリー 指向されたライブラリーの設計において、最もスコアリングの高い成分にクラ スタリング・アルゴリズムを適用することによって、構造上の類似性レベルの高 い誘導体を選択した（「指向されたライブラリーの設計」参照）。これらのクラ スターを再検査して、指向されたライブラリーからの最も活性な化合物の重要な 構造要素を探索した。具体的には、最も活性な化合物を提供するＲ1位、Ｒ2位及 びＲ3位について、当該クラスターから小さな第二世代ライブラリーを合成し、 スクリーニングした（第６図参照）。１μＭでは、スクリーニングした化合物の 92％がカテプシンＤ≧50％を阻害し、100nMでは化合物の18％がカテプシンＤ≧5 0％を阻害した。特定の化合物について阻害定数を求め（表４参照）、カテプシ ンＤの有力な阻害剤（Ｋi≦15nM）をいくつか得た。 表４ 第二世代アッセイ（第６図参照）a aアッセイ条件は表３に報告されている。 Ｆ．（ii）追加の化合物 公知のアスパルチルプロテアーゼ阻害剤は、式Ｉ中のヒドロキシル基に関して (Ｒ)，(Ｓ)両方の立体中心を有している。α−アルコキシキレート化及び非キレ ート化制御還元法を採用し、後述の合成戦略により所望のジアステレオマーのい ずれかにアクセスする固体支持体上での非環式ジアステレオ制御を例証した。Ｒ5 及びＲ6について異なる官能基を探索し且つＲ1，Ｒ2及びＲ3置換基を選択して 最も有力なカテプシンＤ阻害剤を提供することにより、追加の低ナノモルのカテ プシンＤ阻害剤を発見した。 構造上の多様性は、固体支持体に結合されたα−アルコキシピロリジンアミド ３へのグリニャール付加を介して誘導することができる（第７図参照）。多様性 の源は芳香族及びアルキルグリニャール試薬に由来する。市販されていないグリ ニャール試薬については、活性化したマグネシウムターニング又はマグネシウム ・アントラセン・THF複合体並びに対応する芳香族及びアルキルハロゲン化物を 使用して合成することができる。有力なアスパルチルプロテアーゼ阻害剤のＰ1 部位に多様性を導入する上でグリニャール試薬は好適な源である。というのは、 Ｓ1プロテアーゼの表面は疎水性の傾向を有するからである。得られたケトンを キレート化及び非キレート化条件で還元して所望のジアステレオマーを得る。数 段階の官能基操作後に、公知のアジドノシレート中間体２が誘導され、前述の合 成を介して有力なアスパルチルプロテアーゼ阻害剤１を得る(E.K.Kick，J.A．El lman．J．Med．Chem．38，1427-1430(1995)参照)(第７図参照)。 市販のメチル（ｓ）−（−）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４− カルボキシレートから全体収率76％で３段階で調製されたピロリジンアミド４を 、水素化ナトリウム、ヨウ化テトラブチルアンモニウム及び触媒的18−クラウン −６をTHF中で45℃、２時 間使用してベンジルオキシベンジルブロミドに結合させた（第８図参照）。臭化 物樹脂５は四塩化炭素、トリフェニルホスフィン及び市販のWang樹脂から誘導さ れた。 支持体に結合されたピロリジンアミド６へ０℃でTHF中でグリニャール付加し た後に得られたケトンを−20℃でジエチルエーテル中でホウ水素化亜鉛を用いて α−アルコキシキレート化制御還元したところ、第二アルコール７が85：15のジ アステレオマー混合物として得られた。主ジアステレオマーを示す（第８図参照 ）。少量の第二アルコール７を支持体から切り離して対応するトリオール生成物 を得、これを無水酢酸とDMAP（ジメチルアミノピリジン）を用いて対応するトリ アセテートに転化した。この対応するトリアセテートのGC分析からジアステレオ 選択性を求めた。ライブラリーで用いたどの成分についても、グリニャール付加 による過アルキル化は検出されなかった。 クロロホルム中で４−ニトロベンゼンスルホニルクロリド及び４−ピロリジノ ピリジンを使用して第二ノシレートを形成し、次いでＮ，Ｎ−ジメチルホルムア ミド中50℃でアジ化ナトリウムでアジド置換することにより、第二アルコール７ をアジド８へ転化した。塩化メチレン中で１％ｐ−トルエンスルホン酸を使用し てｐ−メトキシトリチル保護基を選択的に除去した。クロロホルム中で４−ニト ロベンゼンスルホニルクロリドとピリジンにより第一アルコールをノシル化する ことによりアジドーノシレート９を得た。 Ｎ−メチルピロリジノン(NMP)中80℃でアミン置換した後に、NMP中で所望のカ ルボン酸、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホス ホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBOP)、アザ−１−ヒドロキシベンゾト リアゾール（HOAt）又はイソシアネートでアシル化することにより、多様性のＰ1 ，Ｒ1及 びＲ2部位を適所に有する中間体10を得た。当該アジドを塩化錫（II）、チオフ ェノール及びトリエチルアミンで還元した後、Ｒ3カルボン酸、PyBOP及びHOAtで アシル化し、最後にトリフルオロ酢酸：塩化メチレン（90：10）混合物で支持体 から切り離すことにより、所望の有力なアスパルチルプロテアーゼ阻害剤Ｉａを 得た。 204化合物のライブラリーは、図９の成分から得られた。カテプシンＤの最も 有効な阻害剤が、大量合成され、精製され、そして表５の記載通りにそのＫ1値 を決定する生物学的検査が行われた。全12過程から成る固相合成において、規模 を拡大したこれらの阻害剤の総合収量は、46〜48％の範囲となった。これは、カ ラムクロマトグラフィーで精製した後の希望産物の質量バランスから決定された 。 表５．選択した化合物の阻害定数（Ｋi） 阻害剤の合成 前記方法に従って、固体支持体上で、平均規模115mgで最も強力な化合物のい くつかを合成した。これらの化合物を、カラムクロマトグラフィーで精製した後 、1H NMR及び元素分析で解析した。化合物の総収量は、全12過程の固相合成に基 づくもので、カラムクロマトグラフィー精製後の希望産物の質量バランスから決 定された。解析データを、対応する化合物コードと共に表示する。1H NMRのデー タは、各化合物の主要なジアステレオマーの主要アミドロトマー(rotomer)に関 するものである。Ｇ．結果 カテプシンＤの新規な低ナノモーラー阻害剤を、２つの異なるコンピュータ方 式を組み合わせた化学を用いて、早急に同定した。別種ライブラリー及び直接ラ イブラリーから、合わせて、１μＭで活性を示す90個超の化合物、及び１μＭ未 満で活性を示す26個の化合物が得られた。１μＭで活性を示す化合物の適中率は 、直接ライブラリーの場合で６〜７％、別種ライブラリーで２〜３％である。直 接及び別種ライブラリーは共に基本構造の「活性」エピマーに基づくものである が、直接ライブラリーからの結果の方が明かに良い。１μＭ以下の全濃度では、 別種ライブラリーより、直接ライブラリーの「適中」の方が多い。直接ライブラ リーからの最も有効な阻害剤は、別種ライブラリーのものより３〜４倍良い。こ の結果から、本活性化合物の数と質を、標的に関する適当な情報を用いることに よって増すことができることが明かである。 構造に基づく処置の強さから、試され得る幾何学的な仮定が直接に導かれる。 この研究では、３つの仮定が考えられる：１）Ｓエピマーは、Ｒエピマーより良 く結合すると予想される；２）２つのエネルギ一的に合理的な基本立体配置があ り（ファミリー１＋２、ファミリー３＋４）、そこではＲ基が異なるポケットに 配置される；３）全阻害剤は、ペプチタチンとほぼ同じ配向で結合すると仮定す る。 最初の仮定は、パイロット実験で直接試された。そこでは、Ｒエピマーに基づ く阻害剤は１μＭで活性を示さかった。更に、最も有効な化合物の１つのＲエピ マーのＫiは、５μＭ以下であったが、ＳエピマーのＫ1は15nMであった（表４参 照）。この結果及びカテプシンＤ中の阻害剤の配向が、結晶学的に調べられるだ ろう。 本明細書中に記載された方法論を用いて、活性化合物を同定する ことができる。そして次にその活性を最適化する。最適化の基準は、効力、選択 性、薬物動態特性の向上、または毒性の低下である。各項目は、ライブラリーの 設計の影響を受けやすい様だ。例えば、５〜６倍向上した効力を有する化合物は 、小さな２次ライブラリーを合成及びスクリーニングすることによってすぐに同 定された。そのライブラリーは、種々の最も有効な化合物が探索されたものであ る。 直接ライブラリーから有効な阻害剤を発見することに成功したことから、組み 合わせライブラリーと、構造に基づく設計とを結びつける効果が証明された。組 み合せライブラリーでは、構造に基づく設計によって選択された機能によって、 広大な分子空間を探索することができ、前もって単一の「最良の」標的を同定す る必要がなくなる。同様に、コンピュータ的方法によって、1010を超える化合物 からなる非常に巨大な事実上の型を早急に調べることが可能となり、生産方法に 努力を集中することができる。 前記載は、説明するためであり、限定するためではない。前記載から、多数の 実施態様が、当業者によって考えられるであろう。発明の範囲は、前記載からで はなく、補正した請求項から、請求項に相当する全範囲に亘って決定される。全 ての引用文献の記載事項を引用して、本明細書に組み込む。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/28 Ａ６１Ｐ 43/00 43/00 Ｃ０７Ｄ 263/22 Ｃ０７Ｄ 263/22 317/58 317/58 405/12 405/12 405/14 405/14 413/12 413/12 413/14 413/14 209/48 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 エルマン，ジョナサン エー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94618, オークランド，マソニック アベニュ 5450 (72)発明者 カンツ，アーウィン ディー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94904, グリーンブレー，アルメマー ドライブ 55 (72)発明者 リー，クリスティーナ イー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94708, バークレー，アーチ ストリート 1530, アパートメント ３ (72)発明者 リウ，グアンチェン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94710, アルバニー，ナインス ストリート 1133 ＃ジー (72)発明者 ロー，ダイアナ シー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94560, ニューアーク，ラムスゲート ドライブ 5206 (72)発明者 スキルマン，エー．ジョフリー アメリカ合衆国，カリフォルニア 94110 ―5261，サンフランシスコ，ライプリー ストリート 149

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1. 下記式Ｉ： 〔式中、Ｒ1，Ｒ2及びＲ3は、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換 されたアリール、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、アリールオ キシアルキル、置換されたアリールオキシアルキル、ヘテロアリール、置換され たヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、置換されたヘテロアリールアルキ ル、複素環式化合物、置換された複素環式化合物、複素環式アルキル及び置換さ れた複素環式アルキルから成る群から独立して選択されたメンバーであり； Ｒ5及びＲ6は、水素、ハロゲン、アルキル、置換されたアルキル、アリール、 置換されたアリール、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、アリー ルオキシアルキル、及び置換されたアリールオキシアルキルから成る群から独立 して選択され；又は Ｒ5及びＲ6、及びそれらが結合される炭素は、任意に置換された９−又は10− 環原子の炭素環式又は複素環式融合環システムを形成するために結合する〕で表 わされる化合物。 2. 前記Ｒ1が、ヘテロアリールアルキル及び置換されたアリールアルキルか ら成る群から選択されたメンバーである請求の範囲第１項記載の化合物。 3. 前記Ｒ1が、 から成る群から選択されたメンバーである請求の範囲第１項記載の化合物。 4. 前記Ｒ2がヘテロアリールアルキル、置換されたアリールアルキル、及び アリールオキシアルキルから成る群から選択されたメンバーである請求の範囲第 １項記載の化合物。 5. 前記Ｒ2が、 から成る群から選択されたメンバーである請求の範囲第１項記載の化合物。 6. 前記Ｒ3が、置換されたアリール、ヘテロアリールアルキル及びアリール オキシアルキルから成る群から選択されたメンバーである請求の範囲第１項記載 の化合物。 7. 前記Ｒ5，Ｒ6及びそれらが結合される炭素が、任意に置換されたナフタレ ン環を形成するために結合する請求の範囲第１項記載の化合物。 8. 前記Ｒ5及びＲ6が、両者とも水素である請求の範囲第１項記載の化合物。 9. 前記Ｒ5が水素であり、そして前記Ｒ6がハロゲン、アルキル、置換された アルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、置換されたアリ ールアルキル、アリールオキシアルキル及び置換されたアリールオキシアルキル から成る群から選択されたメタ又はパラ置換基である請求の範囲第１項記載の化 合物。 10．前記Ｒ3が、から成る群から選択されたメンバーである請求の範囲第１項記載の化合物。 11．前記化合物が から成る群から選択される請求の範囲第１項記載の化合物。 12．前記化合物が、 から成る群から選択される請求の範囲第１項記載の化合物。 13．生物学的サンプルにおけるカテプシンＤの存在を検出するための方法であ って、 （ａ）前記生物学的サンプルと、下記一般式Ｉ： 〔式中、Ｒ1，Ｒ2及びＲ3は、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換 されたアリール、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、アリールオ キシアルキル、置換されたアリールオキシアルキル、ヘテロアリール、置換され たヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、置換されたヘテロアリールアルキ ル、複素環式化合物、置換された複素環式化合物、複素環式アルキル及び置換さ れた複素環式アルキルから成る群から独立して選択されたメンバーであり； Ｒ5及びＲ6は、水素、ハロゲン、アルキル、置換されたアルキル、アリール、 置換されたアリール、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、アリー ルオキシアルキル、及び置換されたアリールオキシアルキルから成る群から独立 して選択され；又は Ｒ5及びＲ6、及びそれらが結合される炭素は、任意に置換された９−又は10− 環原子の炭素環式又は複素環式融合環システムを形成するために結合する〕で表 わされる化合物、 又は放射性ラベルされたその類似体とを接触せしめ；そして （ｂ）前記生物学的サンプルにおけるカテプシンの存在の測定として、カテプ シンＤへの前記化合物の結合により形成される複合体の存在を検出することを含 んで成る方法。 14．前記化合物中のＲ1が、ヘテロアリールアルキル及び置換されたアリール アルキルから成る群から選択されたメンバーである請求の範囲第13項記載の方法 。 15．前記化合物中のＲ1が、 から成る群から選択されたメンバーである請求の範囲第13項記載の方法。 16．前記化合物中のＲ2がヘテロアリールアルキル、置換されたアリールアル キル、及びアリールオキシアルキルから成る群から選択されたメンバーである請 求の範囲第13項記載の方法。 17．前記Ｒ5，Ｒ6及びそれらが結合される炭素が、任意に置換されたナフタレ ン環を形成するために結合する請求の範囲第13項記載の方法。 18．前記化合物中のＲ2が、 から成る群から選択されたメンバーである請求の範囲第13項記載の方法。 19．前記化合物中のＲ3が、 から成る群から選択されたメンバーである請求の範囲第13項記載の方法。 20．前記化合物中のＲ3が、置換されたアリール、ヘテロアリールアルキル及 びアリールオキシアルキルから成る群から選択されたメンバーである請求の範囲 第13項記載の方法。 21．前記Ｒ5，Ｒ6及びそれらが結合される炭素が、任意に置換されたナフタレ ン環を形成するために結合する請求の範囲第13項記載の方法。 22．前記Ｒ5及びＲ6が、両者とも水素である請求の範囲第13項記載の方法。 23．前記Ｒ5が水素であり、そして前記Ｒ6がハロゲン、アルキル、置換された アルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、置換されたアリ ールアルキル、アリールオキシアルキル及び置換されたアリールオキシアルキル から成る群から選択されたメタ又はパラ置換基である請求の範囲第13項記載の方 法。 24．カテプシンＤを阻害するための方法であって、 カテプシンと、下記式Ｉ： 〔式中、Ｒ1，Ｒ2及びＲ3は、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換 されたアリール、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、アリールオ キシアルキル、置換されたアリールオキシアルキル、ヘテロアリール、置換され たヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、置換されたヘテロアリールアルキ ル、複素環式化合物、置換された複素環式化合物、複素環式アルキル及び置換さ れた複素環式アルキルから成る群から独立して選択されたメンバーであり； Ｒ5及びＲ6は、水素、ハロゲン、アルキル、置換されたアルキル、アリール、 置換されたアリール、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、アリー ルオキシアルキル、及び置換されたアリールオキシアルキルから成る群から独立 して選択され；又は Ｒ5及びＲ6、及びそれらが結合される炭素は、任意に置換された９−又は10− 環原子の炭素環式又は複素環式融合環システムを形成するために結合する〕で表 わされる化合物とを接触せしめることを含んで成る方法。 25．前記化合物中のＲ1が、ヘテロアリールアルキル及び置換されたアリール アルキルから成る群から選択されたメンバーである請求の範囲第24項記載の方法 。 26．前記化合物中のＲ1が、 から成る群から選択されたメンバーである請求の範囲第24項記載の方法。 27．前記化合物中のＲ2がヘテロアリールアルキル、置換されたアリールアル キル、及びアリールオキシアルキルから成る群から選択されたメンバーである請 求の範囲第24項記載の方法。 28．前記化合物中のＲ2が、 から成る群から選択されたメンバーである請求の範囲第24項記載の方法。 29．前記化合物中のＲ3が、置換されたアリール、ヘテロアリールアルキル及 びアリールオキシアルキルから成る群から選択されたメンバーである請求の範囲 第24項記載の方法。 30．前記化合物中のＲ3が、から成る群から選択されたメンバーである請求の範囲第24項記載の方法。 31．前記Ｒ5，Ｒ6及びそれらが結合される炭素が、任意に置換されたナフタレ ン環を形成するために結合する請求の範囲第24項記載の方法。 32．前記Ｒ5及びＲ6が、両者とも水素である請求の範囲第24項記載の方法。 33．前記Ｒ5が水素であり、そして前記Ｒ6がハロゲン、アルキル、置換された アルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、置換されたアリ ールアルキル、アリールオキシアルキル及び置換されたアリールオキシアルキル から成る群から選択されたメタ又はパラ置換基である請求の範囲第24項記載の方 法。 34．生存細胞におけるカテプシンＤによりタンパク質プロセッシングを阻害す るための方法であって、 前記細胞と、有効量の下記式Ｉ：〔式中、Ｒ1，Ｒ2及びＲ3は、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換 されたアリール、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、アリールオ キシアルキル、置換されたアリールオキシアルキル、ヘテロアリール、置換され たヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、置換されたヘテロアリールアルキ ル、複素環式化合物、置換された複素環式化合物、複素環式アルキル及び置換さ れた複素環式アルキルから成る群から独立して選択されたメンバーであり； Ｒ5及びＲ6は、水素、ハロゲン、アルキル、置換されたアルキル、アリール、 置換されたアリール、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、アリー ルオキシアルキル、及び置換されたアリールオキシアルキルから成る群から独立 して選択され；又は Ｒ5及びＲ6、及びそれらが結合される炭素は、任意に置換された９−又は10− 環原子の炭素環式又は複素環式融合環システムを形成するために結合する〕で表 わされる化合物とを接触せしめることを含んで成る方法。 35．前記化合物中のＲ1が、ヘテロアリールアルキル及び置換されたアリール アルキルから成る群から選択されたメンバーである請求の範囲第34項記載の方法 。 36．前記化合物中のＲ1が、 から成る群から選択されたメンバーである請求の範囲第34項記載の方法。 37．前記化合物中のＲ2がヘテロアリールアルキル、置換されたアリールアル キル、及びアリールオキシアルキルから成る群から選択されたメンバーである請 求の範囲第34項記載の方法。 38．前記化合物中のＲ2が、 から成る群から選択されたメンバーである請求の範囲第34項記載の方法。 39．前記化合物中のＲ3が、置換されたアリール、ヘテロアリールアルキル及 びアリールオキシアルキルから成る群から選択されたメンバーである請求の範囲 第34項記載の方法。 40．前記Ｒ5，Ｒ6及びそれらが結合される炭素が、任意に置換されたナフタレ ン環を形成するために結合する請求の範囲第34項記載の方法。 41．前記Ｒ5及びＲ6が、両者とも水素である請求の範囲第34項記載の方法。 42．前記Ｒ5が水素であり、そして前記Ｒ6がハロゲン、アルキル、置換された アルキル、アリール、置換されたアリール、アリールアルキル、置換されたアリ ールアルキル、アリールオキシアルキル及び置換されたアリールオキシアルキル から成る群から選択されたメタ又はパラ置換基である請求の範囲第34項記載の方 法。 43．前記化合物中のＲ3が、から成る群から選択されたメンバーである請求の範囲第34項記載の方法。 44．前記化合物が、 から成る群から選択される請求の範囲第34項記載の方法。 45．前記化合物が、 から成る群から選択される請求の範囲第34項記載の方法。 46．医薬的に許容できる賦形剤、及び下記式Ｉ： 〔式中、Ｒ1，Ｒ2及びＲ3は、アルキル、置換されたアルキル、アリール、置換 されたアリール、アリールアルキル、置換されたア リールアルキル、アリールオキシアルキル、置換されたアリールオキシアルキル 、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、置換 されたヘテロアリールアルキル、複素環式化合物、置換された複素環式化合物、 複素環式アルキル及び置換された複素環式アルキルから成る群から独立して選択 されたメンバーであり； Ｒ5及びＲ6は、水素、ハロゲン、アルキル、置換されたアルキル、アリール、 置換されたアリール、アリールアルキル、置換されたアリールアルキル、アリー ルオキシアルキル、及び置換されたアリールオキシアルキルから成る群から独立 して選択され；又は Ｒ5及びＲ6、及びそれらが結合される炭素は、任意に置換された９−又は10− 環原子の炭素環式又は複素環式融合環システムを形成するために結合する〕で表 わされるカテプシンＤインヒビターを含んで成る医薬組成物。
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