JP2001509591A - 細胞ｄｎａを染色するための組成物および方法 - Google Patents

細胞ｄｎａを染色するための組成物および方法

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Abstract

(57)【要約】 細胞ＤＮＡを染色するための組成物および方法が開示されている。本発明の組成物は、カチオン染料、メタ重亜硫酸塩、並びにメタノール、エタノール、およびその混合物から好ましくは選択されるアルコールを含むアルコール水溶液である。好ましい態様において、カチオン染料はチオニンである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、一般に細胞ＤＮＡを染色するための組成物および方法に関し、より
詳細には、カチオン染料を含む組成物およびその使用方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
細胞病理学および組織病理学において、新生物発生前の病巣内もしくは新生物
性病巣内で異数体の細胞集団を検出するために、イメージサイトメトリーは頻繁
に利用されてきている。ＤＮＡイメージサイトメトリーは、ヒトの癌に関する診
断情報および予後情報を得るための手段として、病理学および細胞病理学におい
て広く認められている。このような診断は、細胞のＤＮＡ含量を正確に測定する
ことを必要とする。従って、核ＤＮＡを定量的に染色する種々の方法が開発され
ている。幾つかの定量的ＤＮＡ染料の再現性および信頼性が、近年報告されてい
る。"A Comparative Study of Quantitative Stains for DNA in Image Cytomet
ry," Mickel,U.V.and Becker,Jr.,R.L., Analytical and Quantitative Cytolog y and Histology 1991, 13: 253-260。
【０００３】 細胞ＤＮＡを染色するための種々の技術の中で推奨されるのは、フォイルゲン
(Feulgen)染色技術である。Feulgen,R.and Voit K., Z.Physiol.Chem. 1924, 13
6: 57-61。フォイルゲンは、固定された組織の加水分解（即ち、ＤＮＡの加水分
解）により、細胞核内に存在するデオキシペントースがアルデヒド形態で晒され
ることを発見した。その後フォイルゲンは、細胞ＤＮＡの温和な酸加水分解に続
いて、シッフ試薬を添加することによりＤＮＡ含有構造が赤紫色を呈することを
見出した。フォイルゲン技術は、細胞ＤＮＡを定量するための方法として実用化
されることに寄与し、フォイルゲン技術は一般に、核酸を酸化してアルデヒドを
提供する工程と、前記アルデヒドをシッフ試薬と反応させて、ＤＮＡの存在を示
唆する赤紫色を形成させる工程とを含む。この反応は化学量論的であるため、過
剰な試薬が洗い落とされれば、色の強度はサンプル中のＤＮＡ量に直接関連があ
る。
【０００４】 1954年、チオニン−亜硫酸塩試薬が、マウスの腎臓および肝臓の細胞核のうち
、加水分解された切片標本の核のみを染色することが発見された。Van Duijn,P.
, J.Histochem.Cytochem. 1956, 4: 55-63。アルデヒド試薬は、ｔ-ブタノール および水の媒質中にチオニンおよび二酸化硫黄を含んでいた。このチオニン試薬
は、チオニンのｔ-ブタノール水溶液（水:ｔ-ブタノール, 1:1）を塩酸水溶液で
酸性化し、その後メタ重亜硫酸ナトリウムを添加することにより調製した。Van
Duijnは、チオニンと二酸化硫黄と核酸との間の反応の正確な化学的性質は明ら かではないが、チオニン−亜硫酸塩/ｔ-ブタノール試薬が、アルデヒドと反応す
る一以上の構成成分を含有していることを、組織化学的データから結論づけた。
フォイルゲン染色法は、今日まで継続して利用され、種々の化合物がフォイルゲ
ン染料として使用されている。核の染料として一般に見なされるチオニンは、フ
ォイルゲン手法においてより一般に使用される染料の一つである。
【０００５】 チオニン−フォイルゲン染料試薬が初めて報告されてから何年も経過したにも
かかわらず、前記試薬の組成は変化しないままである（即ち、塩酸水溶液でｐＨ
を約1.5に調整した、チオニンおよびメタ重亜硫酸ナトリウムのｔ-ブタノール水
溶液である）。
【０００６】 1950年代に開発されたフォイルゲンのチオニン染色法は、定量的なＤＮＡ測定
を容易にしたが、従来のチオニン染色試薬の溶媒としてｔ-ブタノールを使用す ることにはかなり欠点がある。第一に、ｔ-ブタノールは刺激性物質であり、取 り扱いに危険がある。第二に、ｔ-ブタノールは融点が約25℃であるため、しば しば室温で固体であり、試薬を調製する際に液体として投与するためには加熱お
よび融解を必要とする。ｔ-ブタノールは、多くの他の低分子量のアルコールと 違って、適切に処分することが難しい。更にｔ-ブタノールはその危険な性質の ために、ｔ-ブタノールと関連したシッピング（shipping）に制限がある。他の 単純なアルコールに対して、ｔ-ブタノールは非常に高価である（例えば、メタ ノールもしくはエタノールのリットルあたり約２＄と比べて、リットルあたり45
＄である）。おそらく最も重大なことは、チオニン/ｔ-ブタノール染色溶液の有
効な保存寿命が約２日であることである。このような短い保存寿命は、その保存
を妨げ、その結果この試薬の商業的実用性を妨害し、フォイルゲン染色法でチオ
ニン試薬を使用したい人は使用直前にその試薬を調製する必要がある。
【０００７】 従って、前記試薬の主要成分であるｔ-ブタノールに付随する不利益がなく、 従来のチオニン/ｔ-ブタノール染色試薬により得られる細胞ＤＮＡ定量の利益を
提供してくれるチオニン主成分の試薬が必要とされている。より詳細には、長く
且つ安定な保存寿命を有するチオニン染色試薬が必要とされている。本発明は、
前記必要性を満たし、更に関連した利益を提供することに努める。
【０００８】
【発明の概要】
一つの見方において、本発明は、細胞ＤＮＡを染色するのに有効な組成物を提
供する。一般に前記組成物は、式：
【化５】 （ここでＲ1およびＲ2は、水素およびメチル基から独立に選択され、Ｘは対イオ
ンである）のカチオン染料；メタ重亜硫酸塩；並びにメタノール、エタノール、
およびメタノールとエタノールの混合物の一つから選択されるアルコールを含む
アルコール水溶液である。好ましい態様において、カチオン染料は、チオニンア
セテート（即ち、Ｒ1およびＲ2は水素、Ｘはアセテート）である。
【０００９】 別の見方において、本発明は、細胞ＤＮＡを染色する方法を提供する。前記方
法において、上記組成物を細胞に適用し、染色された核を有する細胞を提供する
。本発明は、細胞を上記組成物で染色して、染色された核を有する細胞を提供す
る工程と、その後染色された核の光学密度を測定して、核に存在するＤＮＡの存
在もしくは量を決定する工程とを含む細胞ＤＮＡの定量方法を更に提供する。
【００１０】 更に別の見方において、本発明は、上記組成物を含む細胞ＤＮＡの染色用キッ
トを提供する。
【００１１】
【好ましい態様の詳細な説明】
本発明は、一般に細胞ＤＮＡを染色するための組成物および方法に関する。よ
り詳細には、本発明は、フォイルゲン染色法で試薬として使用され、細胞ＤＮＡ
の存在もしくは量を染色し且つ測定する際に使用される組成物を提供する。本発
明の組成物は、カチオン染料、メタ重亜硫酸塩、並びに好ましくはメタノール、
エタノール、およびエタノールとメタノールの混合物から選択されるアルコール
を含むアルコール水溶液である。
【００１２】 本発明の組成物に使用されるカチオン染料は、フェノチアジン誘導体、より詳
細には、３,７-ジアミノ-５-フェノチアジン誘導体である。カチオン染料は、以
下の式により示され：
【化６】 ここで、Ｒ1およびＲ2は、水素、メチル基、または水素およびメチル基の組み合
わせの何れかであり、Ｘは対イオンである。本発明の組成物に使用されるカチオ
ン染料は、上記式により示されるが、カチオン染料は、
【化７】 および
【化８】 など他の同等の式によって示され得ることも認識されたい。適切なカチオン染料
には、Azure A（Ｒ1およびＲ2はメチル基）、およびAzure C（Ｒ1はメチル基、 Ｒ2は水素）などがある。好ましい態様において、カチオン染料はチオニン（Ｒ1 およびＲ2は水素）である。適切な対イオンＸには、染色手法においてカチオン 染料の性能に負の影響を及ぼさないアニオンが含まれ、アセテート、塩化物、お
よび臭化物などである。好ましい態様において、対イオンはアセテートである。
特に好ましい態様において、カチオン染料は、チオニンアセテート（Ｒ1および Ｒ2は水素、Ｘはアセテート）である。
【００１３】 カチオン染料は、約1.0×10-3 Ｍ〜約2.5×10-2 Ｍ、好ましくは約4.0×10-3
Ｍ〜約8.0×10-3 Ｍの濃度で組成物中に存在する。
【００１４】 カチオン染料に加えて、本発明の組成物は、好ましくは更にメタ重亜硫酸塩を
含む。重亜硫酸塩を含む本発明の態様が、染色溶液として有用であるが、メタ重
亜硫酸塩を含む溶液が最良の染色結果を提供することが見出された。適切なメタ
重亜硫酸塩は、本発明の組成物の染色性能に負の影響を及ぼさない。適切なメタ
重亜硫酸塩には、メタ重亜硫酸リチウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびメタ
重亜硫酸カリウムのようなメタ重亜硫酸金属が含まれる。好ましくは、本発明の
組成物は、メタ重亜硫酸ナトリウムまたはメタ重亜硫酸カリウムの何れかを含む
。好ましくは、メタ重亜硫酸塩は、約1.0×10-3 Ｍ〜約2.5×10-2 Ｍ、好ましく
は約4.0×10-3 Ｍ〜約8.0×10-3 Ｍの濃度で組成物中に存在する。当該分野で公
知のフォイルゲン染色溶液では、メタ重亜硫酸塩：チオニンのモル比が４〜10：
１であるのに対し、本発明の組成物では、メタ重亜硫酸塩：チオニンのモル比は
１：１であることが好ましい。
【００１５】 本発明の組成物は、アルコール水にカチオン染料およびメタ重亜硫酸塩を含む
。前記アルコール水溶液は、染料およびメタ重亜硫酸塩を溶解するだけでなく、
該溶液中に形成された任意の活性ＤＮＡ染色成分を溶解する役目を果たす。従っ
てアルコールは、水と混和性があり、試薬調製の容易性から室温で液体であるこ
とが好ましい。前記組成物に使用されるアルコールには、Ｃ１〜Ｃ３のアルコー
ル（即ち、メタノール、エタノール、ｎ-プロパノール、およびイソプロパノー ル）、並びに前記アルコールの混合物が含まれる。好ましいアルコールとしては
、メタノール、エタノール、およびメタノールとエタノールの混合物である。好
ましくは、アルコール水溶液は、約20％〜約60％のアルコール、より好ましくは
約40％のアルコールを含む。本発明の組成物は、好ましくはｐＨ約1.0〜約2.0、
より好ましくはｐＨ約1.3〜約1.5の酸性水溶液である。前記組成物のｐＨは、多
数の酸のうちの任意の一つを用いて調整することができるが、前記溶液のｐＨは
、好ましくは塩酸水溶液で調整される。
【００１６】 本発明の代表的な組成物、チオニン/メタノール染色溶液の調製は、例１に記 載されている。
【００１７】 一般に、上記カチオン染料とメタ重亜硫酸塩との反応により、加水分解された
ＤＮＡに結合する活性成分が形成される。このように本発明の組成物は、細胞Ｄ
ＮＡを染色するのに有効である。従って、別の見方において、本発明は細胞ＤＮ
Ａを染色する方法を提供する。この方法において、上記組成物を細胞に適用して
、染色された核を有する細胞を提供する。細胞固定、脱水、清浄、染色、および
封入（mounting）などの基本的手法、並びにフォイルゲン技術、核酸染色、およ
び細胞構成要素の染色などの特定の染色方法は、当業者に周知である。基本的な
細胞学的技術および組織化学的技術は、以下の文献に記載されており：Histolog ical and Histochemical Methods: Theory and Practice , 2nd Ed., J.A.Kieren
an, ed., Pergamon Press, New York, 1990, およびAnimal Tissue Techniques,
4th Ed., Gretchen L.Humason, W.H.Freeman & Company, San Francisco, 1979
、ともに参照により本明細書の開示内容の一部とする。
【００１８】 上述したとおり、本発明の方法は、細胞に上記組成物を適用することを含む。
本発明の組成物および方法は、核を有する任意の細胞（例えば、上皮細胞、筋細
胞、神経細胞、および結合組織細胞）を実際に染色するのに有効である。前記方
法において、多数の細胞標本のうち任意の一つを使用することができ、例えば対
象の細胞標本には、慣用的なスミア、組織学的標本、および単層標本などがある
。一般に、細胞は染色用の顕微鏡スライド上に置く。細胞をスライド上に置いた
後、スライドを固定溶液中に浸漬することにより細胞を固定し、その後リンスす
る。リンスした後、スライドを酸性溶液中に浸漬することにより細胞ＤＮＡを加
水分解する。更にリンスした後、スライドを染色溶液中に浸漬することにより細
胞を染色する。更にリンスした後、エタノール溶液中に浸漬することにより細胞
を脱水し、次いでキシレンで清浄する。この時点で、手動および自動技術など多
数の技術のうち任意の一つ、例えば顕微鏡およびイメージサイトメトリー技術に
より、染色結果を可視化することができる。本発明の方法を含む代表的な染色手
法の詳細な方法は、例１に記載されている。染色手法は手動でもできるが、本発
明の方法は自動染色手法も含み得る。
【００１９】 本発明の染色方法は、細胞ＤＮＡを染色するための定量的方法であるため、本
発明の染色溶液で細胞を染色する工程と、得られた染色核の光学密度を測定する
工程を組み合わることにより、細胞の核に存在するＤＮＡの存在もしくは量を決
定することができる。従って別の見方において、本発明は、上記組成物で細胞を
染色する工程と、その後染色された核の光学密度を測定し、核に存在するＤＮＡ
の存在もしくは量の何れかを決定する工程とを含む細胞ＤＮＡの定量方法を提供
する。染色された核の光学密度は、例えば光学スキャナー、顕微鏡、および他の
イメージサイトメーターなどの手動および自動技術により測定することができる
。染色された細胞の光学密度を測定する適切な装置は、当該分野で公知であり、
以下の文献に記載されている装置を含み："The Design and Development of an
Optical Scanner for Cell Biology," Jaggi,B.and Palcic,B., IEEE Proc.Eng. Med. Biol. 1985; 2: 980-985; "Cell Recognition Algorithms for the Cell
Analyzer," Jaggi,B.and Palcic B., IEEE Proc.Eng. Med. Biol. 1987; 4: 145
4-1456; および"Design of a Solid State Microscope," Jaggi,B., Deen,M.J.,
and Palcic B., Opt.Engineer 1989; 28(6): 7675-682、それぞれ参照により本 明細書の開示内容の一部とする。
【００２０】 本発明の方法は、染色された細胞をデジタル画像にし、得られたデジタル強度
画像をコンピューターで操作して種々の細胞特性を測定する技術において有効で
ある。核のサイズ、形状、およびＤＮＡ含量、並びに核内のクロマチンの空間分
布を描写する他の特性などの細胞特性を、計算することができる。クロマチン分
布を描写する特性を、総体的に組織特性（texture features）と称し、組織特性
は、クロマチンパターンの種々の描写クラスを識別する能力、およびある病気に
関連したクロマチンパターンの変化の程度（例えば悪性度）に関して定量的情報
を提供する能力について選択することができる。従って、本発明の組成物および
方法は、核の組織測定（texture measurement）の際に有効であり、その結果、 ある種の病気の診断および予後に有効である。イメージサイトメトリーでの核の
組織測定、並びにヒトの癌の診断および予後における有用性は、以下の文献に記
載されており：A.Doudkine, C.MacAulay, N.Poulin, and B.Palcic, "Nuclear T
exture Measurements in Image Cytometry," Pathologica 1995; 87: 286-299、
これは参照により本明細書の開示内容の一部とする。
【００２１】 本発明の代表的な染色溶液、および従来のチオニン/ｔ-ブタノール染料により
染色された細胞の集中光学密度（Integrated Optical Density, ＩＯＤ）、即ち
核の特性測定は、例３に記載されている。
【００２２】 上述したとおり、従来のチオニン/ｔ-ブタノールのフォイルゲン染色技術にと
って最も重大な欠点の一つは、ｔ-ブタノールを主成分とする染色溶液の保存寿 命が短いことである。対照的にメタノールおよびエタノールを主成分とする本発
明の組成物は、有意にかなり長い保存寿命を有する。本発明の代表的な組成物（
即ち、チオニン/メタノールおよびチオニン/エタノール染色溶液）の染色性能と
、従来のフォイルゲン染色試薬（即ち、チオニン/ｔ-ブタノール染色溶液）の染
色性能との比較は、例２に記載されている。表１および表２に要約された結果に
より、(１)本発明の組成物が、標準的なチオニン/ｔ-ブタノール染色溶液に匹敵
する細胞ＤＮＡの染色を提供すること、並びに(２)本発明の組成物が細胞ＤＮＡ
を有効に染色する能力は、約５週間にわたって本質的に一定であることが明らか
に実証された。対照的に、従来のチオニン/ｔ-ブタノール染色溶液は、わずか４
日間で染色能力の約40％を失ってしまう。従来の染色溶液と比較して本発明の組
成物の安定性が高まることで、意義深いことに実用的な利点および商業的利点が
付与される。例えば、従来の染色溶液は、開業医もしくは臨床医により染色の直
前に新たに調製しなければならないが、本発明の組成物は、その安定性および長
い保存寿命のおかげで、調製して保存し、比較的長い期間繰り返し使用すること
ができる。
【００２３】 細胞内ＤＮＡを定量的に染色する際に、本発明の組成物および方法が有用であ
り好結果をもたらすことは、種々の化学的処理に対する定量ＤＮＡ法の充分に確
立された感度から考えて注目に値するものである。定量的なＤＮＡ測定は、例え
ば細胞固定法に大きく影響を受けることは公知である。固定法、並びにより詳細
には特定の方法で使用される試薬および溶媒が、細胞内ＤＮＡの定量に劇的に影
響を及ぼすことが示されている。染色可能な細胞ＤＮＡ量の変動は、ある方法で
観察される細胞ＤＮＡ量の変動の一根拠として提案される。細胞内で、ＤＮＡは
タンパク質と結合している。細胞固定は、ある程度、結合したタンパク質を変性
させてＤＮＡを晒し、染色可能なＤＮＡを作成する役割を果たす。固定法は、典
型的には、アルコールを含む溶媒を使用してタンパク質を変性させる。一般に、
結合しているタンパク質が変性する程度、並びにＤＮＡが測定可能になる程度は
、使用する試薬および方法に大きく依存する。例えば、ホルマリン固定法におい
て、固定試薬中のアルコール濃度は、タンパク質の変性に重大な影響を与え、そ
の結果、細胞内ＤＮＡの定量測定に重大な影響を及ぼすことが見出された。一般
に、定量ＤＮＡ法に対する特定の溶媒もしくは試薬の効果は、ほとんど予測不可
能であり、典型的には実験により経験的に決定され得る。
【００２４】 種々の試薬および溶媒に対する定量ＤＮＡ法の周知の感度にもかかわらず、本
発明の組成物および方法は、細胞内ＤＮＡを定量する際に有効であることが見出
された。例２および例３で示された染色結果により実証されるとおり、本発明の
組成物は、標準的なｔ-ブタノール主成分の組成物と同等に細胞内ＤＮＡの染色 に有効である。更に本発明の組成物は、標準的な染色組成物より非常に長く且つ
安定な保存寿命を有する染色試薬を提供する。
【００２５】 従って別の見方において、本発明は細胞ＤＮＡの染色用キットを提供する。本
発明のキットは、上記組成物を含む。一般に組成物の構成成分は、前記キットに
おいて一以上の容器に含有されている。例えばある態様において、前記キットは
、単一の溶液中に本発明の組成物の構成成分を全て組み込んだ染色試薬（即ち、
ｐＨを約1.5に調整された、カチオン染料およびメタ重亜硫酸塩のアルコール水 溶液）を含む。或いは別の態様において、前記キットは、ドライ（即ち粉末状）
形態で染色試薬を含む。このような態様において、前記キットは、一つの容器に
固形のカチオン染料を含み、もう一つの容器に固形のメタ重亜硫酸塩を含むこと
ができる。この態様において、前記組成物の液体成分はドライ試薬に添加され、
次いでこれを本発明の染色溶液を提供するために混合する。更に別の態様におい
て、前記キットは単一の容器に固形のカチオン染料およびメタ重亜硫酸塩の組み
合わせを含むことができる。
【００２６】 前記染色試薬に加えて、前記キットは、リンス試薬（即ち、メタ重亜硫酸塩の
酸性水溶液）を更に含む。染色試薬について上述したとおり、リンス試薬は、固
形物として、または溶液内で提供され得る。前記キットは、例えば、染色手法の
質の標準をモニターするために、顕微鏡スライド上の未染色の培養細胞（コント
ロールスライド）を任意に含むことができる。前記キットは、染色手法を指示し
、適用される態様には、キットの試薬から染色溶液の調製を指示する使用説明書
を更に含むことができる。
【００２７】 以下の実施例は、本発明を説明するためのものであって、限定するものではな
い。
【００２８】
【実施例】
例１ 細胞ＤＮＡ染色の代表的手法 この例では、チオニンのアルコール溶液を用いて細胞ＤＮＡを染色する代表的
な手法を記載している。ＤＮＡ染色手法で使用される試薬、チオニンのメタノー
ルおよびｔ-ブタノール溶液、並びに固定溶液、およびリンス溶液などは、以下 に記すとおり調製された。
【００２９】 染色試薬の調製： Ａ. 本発明の代表的な染色溶液 ［チオニン/メタノール染色溶液］ １．0.5ｇ チオニン（Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI）および0.5ｇ メタ重亜硫酸ナトリウムを、スターラーバーの入った500 mLガラス瓶に添加する
。 ２．200 mL メタノールを添加する。充分に混合する。 ３．250 mL 蒸留水を添加する。 ４．50 mLの１Ｎ塩酸を添加し、瓶に蓋をする。 ５．１時間染色溶液を撹拌する。アルミホイルで瓶を覆うことにより溶液を光
から保護する。冷却しない。 ６．使用直前に、蒸気フードで濾紙（No.１グレード）により染色溶液を濾過 する。
【００３０】 Ｂ. 従来のフォイルゲン染色溶液 ［チオニン/ｔ-ブタノール染色溶液］ １．0.5ｇ チオニンを、2000 mL エルレンマイアーフラスコ中で435 mL 蒸留 水に添加する。 ２．約５分間溶液を沸騰させて加熱し、次いでほぼ室温まで冷却する。 ３．435 mL ｔ-ブタノールを添加する。（必要であれば、水浴でｔ-ブタノー ルを融解する。ｔ-ブタノールの融点は25〜26℃であるため、約25℃以下の温度 では固定である。） ４．130 mLの１Ｎ塩酸水溶液を添加する。 ５．8.7ｇ メタ重亜硫酸ナトリウムを添加する。 ６．スターラーバーを添加し、パラフィルムＭで容器を密封する。 ７．少なくとも１時間染色溶液を撹拌する。光から保護し、冷却しない。 ８．使用直前に、蒸気フードで濾紙（No.１グレード）により染色溶液を濾過 する。
【００３１】 他の試薬の調製： ［Bohm-Sprenger固定液］ １．320 mL メタノールと60 mL ホルムアルデヒド水溶液（37％）を、500 mL
ガラス瓶中で混合する。 ２．20 mL 氷酢酸を添加する。 ３．充分に混合し、パラフィルムＭで密封する。
【００３２】 ［リンス溶液］ １．7.5ｇ メタ重亜硫酸ナトリウムを、2000 mL エルレンマイアーフラスコ中
で1425 mL 蒸留水に溶解する。 ２．75 mLの１Ｎ塩酸水溶液を添加する。 ３．スターラーバーを添加し、溶解するまで撹拌する。フラスコをパラフィル
ムＭで密封する。
【００３３】 ［１％酸アルコール］ １．280 mL 無水エタノールと120 mL 蒸留水を混合する。 ２．4 mL 濃塩酸を添加する。 ３．充分に混合する。
【００３４】 上述のとおり調製した試薬を、その後以下の方法により細胞ＤＮＡを染色する
ために使用した。対象細胞（例えば、子宮頸サンプル由来の細胞）の標本、例え
ば慣用的なスミアおよび単層標本を、当該方法に使用することができる。当該方
法において、細胞は一般に染色用の顕微鏡スライド上に置く。
【００３５】 染色手法： １．顕微鏡スライド上に細胞を置く。 ２．Bohm-Sprenger固定液にスライドを浸漬することにより細胞を固定する：3
0〜60分。 ３．スライドを蒸留水でリンスし：１分、旋回させる。 ４．スライドを５Ｎ塩酸に浸漬することにより細胞をＤＮＡを加水分解する：
室温で60分。 ５．スライドを蒸留水でリンスし：15ディップ（dip）、旋回させる。 ６．新たに濾過されたチオニン染色溶液を適用することにより細胞を染色する
：75分。 ７．スライドを蒸留水で洗浄する：６チェンジ（change）、各20ディップ。 ８．新たに調製したリンス溶液でスライドをリンスする：３チェンジ：最初の
２回のリンスは30秒、最後のリンスは５分。 ９．スライドを蒸留水でリンスする：３チェンジ、各20ディップ。 １０．ムコイドのサンプルのみ：任意に１％酸アルコールでスライドをリンス
する：２分。 １１．スライドを蒸留水でリンスする：３チェンジ、各20ディップ。 １２．50％、75％エタノール水溶液、２チェンジの100％エタノールにスライ ドを連続して浸漬することにより細胞を脱水する：各１分。 １３．キシレンに浸漬することによりスライドを清浄する：５分。 １４．スライド上をカバーガラスで封入する。 １５．所望ならばバーコードラベルでスライドを識別する。
【００３６】 例２ 細胞ＤＮＡの染色結果：時間に関しての性能 この例は、チオニン/メタノール染色溶液と、チオニン/ｔ-ブタノール染色溶 液との間で、細胞ＤＮＡの染色性能を時間に関して比較する。この比較研究にお
いて、チオニン溶液は、上記例１で記載したとおり、メタノールもしくはｔ-ブ タノール中で調製し、細胞標本を染色し、染色された核の光学密度を測定した。
各チオニン染色溶液の性能に対する時間の効果を決定するため、一定の時間の間
隔で（以下の表１参照）、同じストック染色溶液を用いて、各チオニン溶液での
細胞染色を行った。実際この比較実験により、調査した特定のチオニン染色試薬
それぞれの有効な保存寿命が決定された。
【００３７】 細胞標本（American Type Culture SelectionからのHL-60細胞）を、上記例１
で記載した手法により染色した。各サンプルの集中光学密度（ＩＯＤ）を、光学
スキャナーを用いた定量的イメージサイトメトリー、および以下の文献に記載の
方法により測定した："CytoSavant and Its Use in Automated Screening of Ce
rvical Smears," Garner,D.M., Harrison,A., MacAulay,C.,and Palcic,B., in Compendium on the Computerized Cytology and Histology Laboratory , Wied,G
.L., Bartels,P.H., Rosenthal,D.L.,and Schenck,U., eds., Tutorials of Cyt
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for Cell Biology," Jaggi,B. and Palcic,B., IEEE Proc.Eng.Med.Biol. 1985;
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B. and Palcic B., IEEE Proc.Eng.Med.Biol. 1987; 4: 1454-1456; および"Des
ign of a Solid State Microscope," Jaggi,B., Deen,M.J.,and Palcic B., Opt
.Engineer 1989; 28(6): 7675-682、全て参照により本明細書の開示内容の一部 とする。各データの時間に対して、３スライドを染色し、次いでその光学密度を
測定した。二種類のチオニン染色溶液の性能（即ち、細胞ＤＮＡを染色し、光学
的に濃い核を提供する能力）を、以下の表１に要約する。
【００３８】
【表１】
【００３９】 表１に示すとおり、ｔ-ブタノールを主成分とするチオニン染色溶液の性能は 、時間とともに劇的かつ急激に低下する。染色された核の光学密度により測定さ
れるとおり、わずか４日後に、この溶液の有効性は、元の値の約60％まで減少し
た。対照的に、チオニン/メタノール染色溶液およびチオニン/エタノール染色溶
液の性能は、４週間の期間にわたって本質的に変化しないままである。これらの
結果は、チオニンのメタノール溶液およびエタノール溶液が、チオニンのｔ-ブ タノール溶液より有意に安定であることを実証している。この結果は、更に、チ
オニン染料の溶媒としてメタノールおよびエタノールが有効であり匹敵するもの
であること、並びにチオニン染料の溶媒として、ｔ-ブタノールよりメタノール およびエタノールが優れていることを実証している。
【００４０】 本発明の好ましい態様を例証し説明してきたが、本発明の精神および範囲を逸
脱することなく、種々変化させることができることを認識されたい。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ラム、ポール・ポン・シン カナダ国、ブイ５ワイ・２ブイ４、ブリテ ィッシュ・コロンビア、バンクーバー、ウ エスト・フォーティーフォース・アベニュ ー 196 (72)発明者 ペイン、ピーター・ウイリアム カナダ国、ブイ３エックス・３エイチ４、 ブリティッシュ・コロンビア、サリー、63 エー・アベニュー 12385 (72)発明者 ガーナー、デビット・マイケル カナダ国、ブイ６ピー・１ティー８、ブリ ティッシュ・コロンビア、バンクーバー、 ウエスト・シックスティナインス・アベニ ュー 838 (72)発明者 パルシック、ブルーノ カナダ国、ブイ６エル・２ダブリュ８、ブ リティッシュ・コロンビア、バンクーバ ー、ケスネル・ドライブ 3758

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式： 【化１】 （ここでＲ1およびＲ2は、水素およびメチル基からなる群より独立に選択され、
    Ｘは対イオンである）のカチオン染料； メタ重亜硫酸塩；並びにメタノール、エタノール、およびその混合物からなる
    群より選択されるアルコールを含有するアルコール水溶液を含む組成物。
  2. 【請求項２】 Ｒ1およびＲ2が水素である請求項１記載の組成物。
  3. 【請求項３】 Ｒ1がメチル基であり、Ｒ2が水素である請求項１記載の組成
    物。
  4. 【請求項４】 Ｘがアセテート、塩化物、および臭化物からなる群より選択
    される請求項１記載の組成物。
  5. 【請求項５】 Ｘがアセテートである請求項１記載の組成物。
  6. 【請求項６】 Ｒ1およびＲ2が水素であり、Ｘがアセテートである請求項１
    記載の組成物。
  7. 【請求項７】 前記カチオン染料が、約1.0×10-3 Ｍ〜約2.5×10-2 Ｍの濃
    度で組成物中に存在する請求項１記載の組成物。
  8. 【請求項８】 前記カチオン染料が、約4.0×10-3 Ｍ〜約8.0×10-3 Ｍの濃
    度で組成物中に存在する請求項１記載の組成物。
  9. 【請求項９】 前記メタ重亜硫酸塩が、メタ重亜硫酸リチウム、メタ重亜硫
    酸ナトリウム、およびメタ重亜硫酸カリウムからなる群より選択される請求項１
    記載の組成物。
  10. 【請求項１０】 前記メタ重亜硫酸塩が、約1.0×10-3 Ｍ〜約2.5×10-2 Ｍ
    の濃度で組成物中に存在する請求項１記載の組成物。
  11. 【請求項１１】 前記メタ重亜硫酸塩が、約4.0×10-3 Ｍ〜約8.0×10-3 Ｍ
    の濃度で組成物中に存在する請求項１記載の組成物。
  12. 【請求項１２】 前記組成物が、約1.0〜約2.0のｐＨを有する請求項１記載
    の組成物。
  13. 【請求項１３】 前記組成物が、約1.3〜約1.5のｐＨを有する請求項１記載
    の組成物。
  14. 【請求項１４】 細胞に染色溶液を適用して、染色された核を有する細胞を
    提供することを含む細胞ＤＮＡの染色方法であって、前記染色溶液が、式： 【化２】 （ここでＲ1およびＲ2は、水素およびメチル基からなる群より独立に選択され、
    Ｘは対イオンである）のカチオン染料； メタ重亜硫酸塩；並びにメタノール、エタノール、およびその混合物からなる
    群より選択されるアルコールを含有するアルコール水溶液を含む細胞ＤＮＡの染
    色方法。
  15. 【請求項１５】 Ｒ1およびＲ2が水素である請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 Ｒ1がメチル基であり、Ｒ2が水素である請求項１４記載の
    方法。
  17. 【請求項１７】 Ｘがアセテート、塩化物、および臭化物からなる群より選
    択される請求項１４記載の方法。
  18. 【請求項１８】 Ｒ1およびＲ2が水素であり、Ｘがアセテートである請求項
    １４記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記カチオン染料が、約1.0×10-3 Ｍ〜約2.5×10-2 Ｍの
    濃度で組成物中に存在する請求項１４記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記メタ重亜硫酸塩が、メタ重亜硫酸リチウム、メタ重亜
    硫酸ナトリウム、およびメタ重亜硫酸カリウムからなる群より選択される請求項
    １４記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記メタ重亜硫酸塩が、約1.0×10-3 Ｍ〜約2.5×10-2 Ｍ
    の濃度で組成物中に存在する請求項１４記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記組成物が、約1.0〜約2.0のｐＨを有する請求項１４記
    載の方法。
  23. 【請求項２３】 細胞を組成物で染色して、染色された核を有する細胞を提
    供することと； 核に存在するＤＮＡの存在もしくは量の指標として、染色された核の光学密度
    を測定することとを含む細胞ＤＮＡの定量方法であって、 前記組成物が、式： 【化３】 （ここでＲ1およびＲ2は、水素およびメチル基からなる群より選択され、Ｘは対
    イオンである）のカチオン染料； メタ重亜硫酸塩；並びにメタノール、エタノール、およびその混合物からなる
    群より選択されるアルコールを含有するアルコール水溶液を含む細胞ＤＮＡの定
    量方法。
  24. 【請求項２４】 式： 【化４】 （ここでＲ1およびＲ2は、水素およびメチル基からなる群より選択され、Ｘは対
    イオンである）のカチオン染料； メタ重亜硫酸塩；並びにメタノール、エタノール、およびその混合物からなる
    群より選択されるアルコールを含有するアルコール水溶液を含む細胞ＤＮＡの染
    色用キットであって、 前記カチオン染料、メタ重亜硫酸塩、およびアルコールが、一以上の容器に含
    有される細胞ＤＮＡの染色用キット。
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