JP2001506631A - 前駆細胞を保存するための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、造血前駆細胞等の前駆細胞を効果的に保存するタンパク質材料に関する。本発明タンパク質は、ＡＱＳＬＳＦＳＦＴＫＦＤ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有する分子量約１２−２０ｋＤのタンパク質であるか又はＶＶＡＶＥＦＤ（配列番号３）を含むアミノ酸配列を有する分子量約１５−２０ｋＤのタンパク質である。当該タンパク質の異種二量体および多量体も開示される。インビトロ、エクスビボ、及びインビボで前駆細胞を保存するために本発明のタンパク質を用いる方法も開示される。よって本発明は、ガン治療のための骨髄切除療法等を含むが、これは特定のタンパク質によってミエロイドの再構築を容易にするものである。本発明は他の治療用途にも用いることができ、例えば前駆細胞をエクスビボで増殖させて移植における変化を増大させたり、前駆細胞の輸送及び貯蔵条件を改善したり、生命を脅かす各種血液疾患の治療及び治癒に向けた遺伝子治療を容易ならしめることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 前駆細胞を保存するための組成物及び方法 発明の背景 本発明は前駆細胞に関連して用いる薬剤及び方法に関する。より詳細には、前 駆細胞を維持し得るタンパク質及び前駆細胞を維持（ｍａｌｎｔａｉｎｉｎｇ） 及び保存（ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ）するための該タンパク質の使用方法に関する 。 骨髄は毎日数十億個の完全に分化した機能性血液細胞を産生し、血流中に放出 している。これらの細胞は少数の蓄えられた静止前駆細胞（最も原始的な幹細胞 とその他のより分化しているが未成熟な前駆細胞とを含む）の造血と呼ばれるプ ロセスによって産生される（Ｚｉｐｏｒｉ １９９２）。最も原始的な幹細胞は すべての血液系統の細胞を含む１０¹³個以上の細胞を産生する能力を有する（Ｔ ｕｒｈａｎら １９８９）。このような多数の細胞の産生は成熟細胞をバランス 良く産生するに至る逐次分化段階と広汎な増殖の結果である。前駆細胞は次第に 多数の細胞系統を産生する能力を失い、やがて一又は二系統の細胞系統を作るよ うになる。 液性調節因子と細胞間相互作用は、厳密に制御されたプロセスと相まって未成 熟な前駆細胞の分化方向を規定しているが、このプロセスは十分に解明されてい ない。いくつかの体内の液性因子が培養系及び動物実験系において単離され、そ の特徴が明らかにされている（Ｏｇａｗａ（１９９３）及び該文献中の引用文献 等を参照）。コロニー刺激因子等の調節因子（ＩＬ３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳ Ｆ、Ｍ−ＣＳＦ等）は複数細胞系統（ＩＬ３及びＧＭ−ＣＳＦ）又は単一細胞系 統（Ｇ−ＣＳＦ及びＭ−ＣＳＦ）のいずれかの細胞を産生する能力を有する前駆 細胞の増殖及び分化を誘起するのみでなく、それら各々の前駆細胞の生存能力を 保持する。インターロイキン−１（ＩＬ１）、ｋｉｔ ｌｉｇａｎｄ（ＫＬ）及 びトロンボポエチン（Ｂｏｒｇｅら １９９６）は、多能性前駆細胞の生存能力 を増加させ、それに加えて他の機能も有する。既知のサイトカインは単独でも複 数種の組み合わせでも、ストローマ細胞の支持なしには数日間を超え て液体培養中の原始前駆細胞の生存能力を維持できない。 原始幹細胞の調節機構は、未成熟で複数系統に分化する前駆細胞の調節機構と は異なると見られる。幹細胞は大部分が静止期にあり、増殖や分化を誘起する調 節因子に即座には反応を示さない。これらの細胞の体内での維持は細胞間相互作 用と液性調節因子によって仲介されている。インビトロにおける静止幹細胞の維 持は、接着支持細胞層上においてＩＬ３、ＩＬ６、ＫＬ及びＬＩＦ等の液性調節 因子を併用した細胞培養によって達成されてきた（Ｙｏｕｎｇら １９９６）。 近年、この複合培養系にＦＬを加えると静止幹細胞の維持期間が数週間から三ヶ 月に延長されることが発見された（Ｓｈａｈら １９９６）。ストローマ細胞培 養の樹立を臨床に応用することは容易ではない。 レクチン類は抗体又は酵素以外の炭水化物結合タンパク質と定義でき（Ｂａｒ ｏｎｅｄｅｓ １９８８）、植物、原核生物及び真核生物中に広く存在している 。各々のレクチンは特定の炭水化物部分を認識し、相補的分子の立体化学的適合 性に基づいてその炭水化物と非共有結合を形成する（疎水ポケット等）。炭水化 物は細胞表面に広く存在しており（糖タンパク類、糖脂質類及び多糖類の形をと る）、細胞認識を含む細胞間連絡を提供していると考えられる。異常なグリコシ ル化パターンは、タンパク質のコンホメーション、安定性又はプロテアーゼ抵抗 性の変化を引き起こすことにより病気と関係している（Ｄｗｅｋ １９９５）。 Ｇｏｗｄａら（１９９４）は、フジマメ（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｌａｂ ｌａｂ ）からのマンノース−グルコース特異的レクチンの単離について記述している。 このレクチンの精製及び配列決定から、このタンパク質が二つの異なったサブユ ニットを含むことが示唆されるといわれる。Ｇｏｗｄａらの文献は、このレクチ ンと他のレクチン類との進化論的な関係について述べているが、当該植物源にお ける糖結合以外の機能についてはレクチンによるものとはしていない。 ある種の植物レクチン類が持つ細胞凝集特性については、１００年以上前から 知られている。Ｔリンパ球（フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）及びコンカナバリ ンＡ（ＣｏｎＡ））及びＢリンパ球（アメリカヤマゴボウ マイトジェン（ＰＷ Ｍ））の強力な特異的な活性化物質として、ある種のレクチンは免疫学実 験において重要なツールとして３０年以上用いられてきた（Ｓｈａｒｏｎら１９ ８９）。いくつかのレクチンは１５年以上前から造血前駆細胞の単離に用いられ ている（Ｇａｂｉｕｓ １９９４ａ）。ヨーロッパでは多くのガン患者に対し、 ガン治療の一候補療法としてヤドリギレクチン（Ｖｉｓｃｕｍ ａｌｂｕｍ）の 静脈投与が行われてきたが、大きな合併症はなかった（Ｇａｂｌｕｓ １９９４ ｂ）。これら植物レクチンが哺乳動物細胞に新しい手段によって作用するのか、 単に哺乳動物の機能上のホモローグを真似ているのみであるかはいまだに分かっ ていない。いずれのレクチンもまだヒト用治療剤としては開発が成功していない 。 以上のような考察から、造血プロセスの調節機構は完全に理解されていないこ とは明らかである。コロニー刺激因子やインターロイキン等の同定された液性調 節因子のほとんどは、培養された前駆細胞の増殖及び分化を誘起し、また血流中 におけるそれらの濃度は造血ストレス時（出血、感染等）に増加する。例えば、 米国特許第４，８０８，６１１号は造血幹細胞の増殖及び分化を誘起するＩＬ１ 及びコロニー刺激因子の利用方法について記述している。ＩＬ１、ＩＬ６、ＫＬ 、ＦＬ及びＴｐｏ等いくつかの液性調節因子は増殖及び分化に直接影響を及ぼさ ず幹細胞の生存能力を高めると見られる。しかし、いずれの既知の液性調節因子 も、単独であれ複数種の組み合わせであれ、インビトロにおいてストローマ細胞 なしに幹細胞数を維持又は増加させると報告されていない。その結果、ガンや遺 伝的血液病に対する多くの潜在的な治療方法はいまだに実現していない。 したがって、本発明の一目的は造血前駆細胞の数を保護、維持及び増加する因 子並びに方法を提供し、造血プロセスを調節する方法における前述の制約を克服 することである。本発明の別の目的はガン及び放置すると造血システムに害を及 ぼすことがあるその他の病気の治療を補助するものとして、生体内の造血プロセ スの完全性を保護する手段を提供することである。 発明の概要 本発明によってこれらの目的及びその他の目的が達成され得ることが明らかと なったが、本発明は前駆細胞を保存するタンパク質及び該タンパク質を用い る方法を提供するものである。該タンパク質はＡＱＳＬＳＦＳＦＴＫＦＤ（配列 番号１）を含むアミノ酸配列及び約１２−２０ｋＤの分子量を有するか、又はＶ ＶＡＶＥＦＤ（配列番号３）を含むアミノ酸配列及び約１５−２０ｋＤの分子量 を有する。前駆細胞を保存する方法は、前駆細胞を前駆細胞の保存に十分な量の タンパク質と接触させることを含むが、該タンパク質はＡＱＳＬＳＦＳＦＴＫＦ Ｄ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有する分子量約１２−２０ｋＤのタンパ ク質又はＶＶＡＶＥＦＤ（配列番号３）を含むアミノ酸配列を有する分子量約１ ５−２０ｋＤのタンパク質である。 一態様において本発明は造血治療を必要とする哺乳動物への処置方法を包含す る。この方法は、 ａ）造血前駆細胞を含む組織サンプルを該哺乳動物から摘出し、 ｂ）該前駆細胞を、該前駆細胞を保存し培養細胞を前駆細胞に富ませるためのタ ンパク質の存在下で培養し、ここで該タンパク質はＡＱＳＬＳＦＳＦＴＫＦＤ（ 配列番号１）を含むアミノ酸配列を有する分子量約１２−２０ｋＤのタンパク質 又はＶＶＡＶＥＦＤ（配列番号３）を含むアミノ酸配列を有する分子量約１５− ２０ｋＤのタンパク質であって、 ｃ）該哺乳動物を骨髄切除（ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｏｎ）に十分効果的な条件 下に置き、そして ｄ）骨髄切除に続いて培養細胞を該哺乳動物に投与し、該哺乳動物の造血システ ムを再構築する、ことを特徴とする。 別の態様においては、本発明は前駆細胞を富化する方法を包含する。該方法は 前駆細胞を保持する量のタンパク質中における前駆細胞の培養を含み、ここにお いて該タンパク質は該前駆細胞を特異的に保存し、また培養は前駆細胞を保存し つつ分化細胞の数を減らす条件下で行われるが、ここで当該タンパク質はＡＱＳ ＬＳＦＳＦＴＫＦＤ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有する分子量約１２− ２０ｋＤのタンパク質又はＶＶＡＶＥＦＤ（配列番号３）を含むアミノ酸配列を 有する分子量約１５−２０ｋＤのタンパク質である。 別の態様においては、本発明は哺乳動物において造血能力を高める方法を包含 する。この場合、該方法は、 ａ）造血前駆細胞を含む組織サンプルを、前駆細胞を保存しかつ培養細胞を前駆 細胞で富ませるのに十分な量のタンパク質を含んだ成長培地中で培養し、ここで 当該タンパク質はＡＱＳＬＳＦＳＦＴＫＦＤ（配列番号１）を含むアミノ酸配列 を有する分子量約１２−２０ｋＤのタンパク質、又はＶＶＡＶＥＦＤ（配列番号 ３）を含むアミノ酸配列を有する分子量約１５−２０ｋＤのタンパク質であり、 そして ｂ）血液細胞成分を産生するための前駆細胞を与えるために前駆細胞に富んだ培 養細胞を該哺乳動物に注入する、ことを特徴とする。 別の態様においては、本発明は体細胞に外来ＤＮＡ配列をトランスフェクトす る方法をさらに包含するが、この方法はＡＱＳＬＳＦＳＦＴＫＦＤ（配列番号１ ）を含むアミノ酸配列を有する分子量約１２−２０ｋＤのタンパク質又はＶＶＡ ＶＥＦＤ（配列番号３）を含むアミノ酸配列を有する分子量約１５−２０ｋＤの タンパク質により選択的に保存された前駆細胞へのトランスフェクションを含む 改良を特徴とする。 別の態様においては、本発明は細胞成長培地及び前駆細胞を保存するタンパク 質を含む、生体外で前駆細胞の生存能力を維持するための組成物を包含するが、 ここにおいて該タンパク質はＡＱＳＬＳＦＳＦＴＫＦＤ（配列番号１）を含むア ミノ酸配列を有する分子量約１２−２０ｋＤのタンパク質又はＶＶＡＶＥＦＤ（ 配列番号３）を含むアミノ酸配列を有する分子量約１５−２０ｋＤのタンパク質 である。 更に別の態様においては、本発明は哺乳動物中において前駆細胞を保存する方 法を包含する。該方法は、 ａ）該哺乳動物に前駆細胞を特異的に保存するタンパク質を、該哺乳動物の前駆 細胞が実質的に未増殖の状態で保存されるのに十分な量投与し、ここで当該タン パク質はＡＱＳＬＳＦＳＦＴＫＦＤ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有する 分子量約１２−２０ｋＤのタンパク質又はＶＶＡＶＥＦＤ（配列番号３）を含む アミノ酸配列を有する分子量約１５−２０ｋＤのタンパク質であって、 ｂ）哺乳動物を、増殖骨髄細胞が除去され非増殖前駆細胞が残存するのに十分効 果的な程度に骨髄切除状態に曝露し、そして ｃ）曝露に続き保存された前駆細胞の増殖又は分化を再樹立すること、特徴とす る。 本発明のこれらの利点及びその他の利点の理解を助けるため、ここに詳細な説 明及び実施例を記述する。詳細な説明及び実施例は本発明をよりよく理解するた めのもので、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。 図面の簡単な説明 本発明の好ましい各種態様を例示及び解説のため選択して記述するが、これは 本発明の範囲をいかなる点でも制限することを意図するものではない。本発明の いくつかの側面の好ましい態様は添付した図面によって示される。ここにおいて 、 図１はフジマメから得られたピラーチンタンパク質のアルファ及びベータサブ ユニットの構造を示すタンパク質の電気泳動分離を示す。 図２ＡはＩＬ１存在下でのＦＬＫ２−トランスフェクト３Ｔ３細胞における本 発明のタンパク質の効果を示すグラフであり、図２ＢはＩＬ１非存在下でのＦＬ Ｋ２−導入３Ｔ３細胞における本発明のタンパク質の効果を示すグラフであり、 図２ＣはＩＬ１存在下での非導入３Ｔ３細胞における本発明のタンパク質の効果 を示すグラフであり、図２ＤはＩＬ１非存在下での非導入３Ｔ３細胞における本 発明のタンパク質の効果を示すグラフである。 図３は赤インゲンマメ及びフジマメから得られた本発明のタンパク質を対照培 地と比較した一連のヒストグラムであり、本発明のタンパク質はｍＩＬ１、ｍＩ Ｌ３、及びｍＫＬを含むサイトカイン混合物の有無に係わらず、液体培養におい てマウスＣＤ３４⁺細胞を特異的に保存することを示す。 図４は赤インゲンマメ及びフジマメから得られた本発明のタンパク質を対照培 地と比較した一連のヒストグラムであり、本発明のタンパク質はｍＩＬ１、ｍＩ Ｌ３、及びｍＫＬを含むサイトカイン混合物の有無に係わらず、メチルセルロー スコロニーにおいてマウス前駆細胞を特異的に保存することを示す。 図５は６つの異なる細胞表面マーカーのフローサイトメトリー試験の結果を示 す一連のヒストグラムであり、本発明のタンパク質が特異的にマウス原始前駆細 胞を保存することを示す。 図６Ａは本発明のタンパク質を対照培地と比較した一組のヒストグラムであり 、本発明のタンパク質がＣＤ３４⁺ヒト臍帯血細胞を液体培養において６日間特 異的に維持することを示し、図６Ｂは補足的な一組のヒストグラムであり、本発 明のタンパク質がＣＤ３４⁺ヒト臍帯血細胞を液体培養において１７日間特異的 に保存することを示す。 図７は本発明のタンパク質を対照と比較した２つのヒストグラムの組であり、 ピラーチンタンパク質が単体でもＩＬ１−ａ又はＦＬと組み合わされた場合でも 、メチルセルロースコロニーアッセイにおいてヒト前駆細胞の数を保存又は増加 させることを示す。 図８Ａ〜８Ｃは一組のヒストグラムであり、ＦＬではなく、本発明のタンパク 質が液体培養中の原始造血前駆細胞を１５及び２１日後において保存しているこ とを示す。 図９Ａ及び９Ｂは一組のヒストグラムであり、本発明のタンパク質が用量反応 的に造血前駆細胞を維持することを示す。 図１０は本発明のタンパク質を対照培地と比較した一対のヒストグラムであり 、ピラーチンタンパク質がＩＬ−３によって誘起される分化を妨げることにより 前駆細胞を維持することを示す。 好ましい態様の詳細な説明 本発明は前駆細胞を維持するタンパク質、並びに前駆細胞の維持及び保持する ための該タンパク質の使用方法に関するものである。「タンパク質」とは、ペプ チド結合で連結したアミノ酸残基の配列を含む単離されたあらゆる天然又は合成 のオリゴ又はポリペプチドを意味する。 ここにおいて「前駆細胞」とは、分化及び増殖によって、完全に分化し機能を 有した子孫を産生する能力を有するあらゆる体細胞を示す。前駆細胞はあらゆる 組織又は器官系から得た前駆細胞を包含し、該器官系は血液、神経、筋肉、皮膚 、消化管、骨、腎臓、肝臓、膵臓、胸腺等を含むがこれらに限定されるものでは ない。前駆細胞は「分化した細胞」とは区別されるが、「分化した細胞」とは増 殖すなわち自己複製の能力を持つことも持たないこともあるが、通常の生理条件 下 ではそれ以上異なる細胞種へと分化することはできない細胞と定義される。加え て、前駆細胞はさらにガン細胞、特に白血病細胞のような異常細胞とも区別され るが、ガン細胞は増殖（自己複製）はするが、未熟で未分化に見えるものの通常 それ以上分化しない。 前駆細胞は最も分化が進み完全に成熟した細胞に先立つ分化及び増殖の系統の すべての細胞を包含する。したがって、例えば前駆細胞は一種類の細胞にしか分 化できずそれ自身は完全に成熟しておらずまた完全に分化していない成熟個体の 皮膚前駆細胞を含む。成熟し機能を有する血液細胞の製造は、「単能性前駆細胞 」、すなわち一種類の血液細胞しか産生できない前駆細胞の増殖及び分化による 。赤血球の製造においては、「ＣＦＵ−Ｅ」（赤芽球コロニー形成細胞）と呼ば れる前駆細胞が２〜３２個の子孫細胞を産生し得る。 他の様々な造血前駆細胞も明らかにされてきた。例えば、造血前駆細胞は８つ までの異なる造血細胞細胞系統を産生する分化及び増殖の連続するサイクルが可 能な細胞を包含している。造血領域の最も原始的又は未分化な段階では、造血前 駆細胞は造血「幹細胞」を包含する。これらのまれな細胞は、骨髄中の細胞１０ ，０００〜１００，０００個当たり１個であり、各々１０¹³を超えるあらゆる系 統の成熟血液細胞を産生する能力を有し、動物の生涯に渡って血液細胞を製造し 続ける役割を果たす。幹細胞は骨髄中に存在しほとんどが静止状態にあり、自己 再生と呼ばれるプロセスにより相同な娘細胞を形成することができる。したがっ て、このような非活動的な前駆細胞は「分化全能性」がある、すなわちすべての 種類の成熟血液細胞の産生に必要かつ十分であると表現できる。すべての血液細 胞系統を産生する能力は保持するが自己再生できない前駆細胞は、「多能性（ｐ ｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）」があると表現される。いくつかの血液系統を製造でき るがすべての血液系統を製造できない細胞であると共に自己再生できない前駆細 胞は、「多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）」と表現される。 本発明のタンパク質は、単能性分化細胞、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ） 分化細胞及び／又は分化全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞を含むこれらのい ずれの前駆細胞を保存する上でも有用である。該タンパク質は造血前駆細胞の保 存において特に効果があることが示されたが、しかしながら、該タンパク質は前 述した他の組織細胞の前駆細胞の保存に用いることもできる。造血プロセスの制 御における特性から、本明細書では該タンパク質を「ピラーチン」又は「ピラー チンタンパク質」とも称する。しかしながら、該タンパク質は非造血組織中の前 駆細胞の保存及び維持にも有効であると認識されるべきである。 ピラーチンタンパク質はヒト、マウス、ラット等哺乳類の造血前駆細胞の保存 に特に有効である。ヒトにおいては、原始的な成熟造血前駆細胞はＣＤ３４で示 される細胞表面抗原の発現により細胞のあるクラスに属することが同定される。 これらの細胞はＣＤ３４⁺細胞とも呼ばれる。マウスにおいては、細胞表面抗原 の発現を反映して、造血前駆細胞はＳｃａ⁺Ｌｉｎ^-細胞とも呼ばれる。他の哺乳 類の種も、造血前駆細胞の同定において同様の発現特性を示す。造血前駆細胞は またＦＬＫ２／ＦＬＴ３レセプターの発現によっても同定される。 ＣＤ３４抗原及び／又はＦＬＫ２レセプターを発現するヒト造血前駆細胞は本 明細書では「原始前駆細胞」と称する。これに対し、ＣＤ３４抗原又はＦＬＫ２ レセプターのどちらかを発現しない造血細胞を「成熟前駆細胞」と称する。 通常、ピラーチンタンパク質は、ＣＤ３４抗原又はＦＬＫ２レセプターを発現 する前駆細胞を保存するのに効果的である。前駆細胞は、細胞表面にＣＤ３４抗 原又はＦＬＫ２レセプターを発現する細胞を含むことができる。好ましい場合に おいては、このタンパク質は、前駆細胞上のＦＬＫ２レセプターに対して著しい 結合親和性を有し、このタンパク質のＦＬＫ２レセプターとの結合は、前駆細胞 の分化の阻止を仲介する。 ピラーチンタンパク質は、「前駆細胞」の保存を仲介する。これは、ペプチド が前駆細胞の分化を阻止するか、あるいは、これらを分化させることなく増殖を 誘起することを意味する。特に、分化のプロセスを阻止することにより、ペプチ ドは細胞の分化速度を著しく低下させ、また前駆細胞を細胞サイクルの静止状態 又はＧ０状態に維持することにより、実際にこれらのプロセスを完全に停止させ る場合もあることが理解される。しかし、このタンパク質は、細胞を大量に殺す ことなくこれを行う。この意味では、ピラーチンは、細胞のプロセス（例えば、 ＤＮＡ複製、タンパク質合成）を阻止又はこれに干渉するものであり、そのため 著しい細胞死亡率を誘起する因子からは明確に区別される。 本発明のピラーチンタンパク質は、自然資源から得られる。即ちマメに由来す る。マメは、マメ科植物の実又は種（例えば、エンドウ豆又はインゲン豆）であ る。マメ科植物は、双子葉類の草本、低木、及び根に（窒素固定細菌の）節を実 らせる木が属する科（マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ））の植物である。より 具体的には、ピラーチンタンパク質は、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｅａｅ） 属に属するマメから得られる。特に、このタンパク質は、フジマメ（Ｄｏｌｉｃ ｈｏｓ ｌａｂ ｌａｂ）、赤インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａ ｒｉｓ）等のインゲンマメ、又はササゲマメ（Ｖｉｇｎａ ｓｅｎｅｎｓｉｓ） から得られる。こうした自然資源から得られる自然な形態においては、このタン パク質はマンノース／グルコース特異的マメレクチンであるように見える。 一実施態様においては、ピラーチンタンパク質は、β（ベータ）鎖と称される ペプチド鎖を含む。このペプチド鎖は、配列ＡＱＳＬＳＦＳＦＴＫＦＤ（配列番 号：１）を含む。好ましくは、このβペプチドは、配列ＡＱＳＬＳＦＳＦＴＫＦ ＤＬＤ（配列番号：２）を含む。このβペプチドは、１２〜２０ｋＤの範囲内の 分子量、通常は１３ｋＤの分子量を有する。 別の実施態様においては、ピラーチンタンパク質は、α（アルファ）鎖と称さ れるペプチド鎖を含む。このペプチド鎖は、配列ＶＶＡＶＥＦＤ（配列番号：３ ）を含む。好ましくは、このαペプチドは配列ＴＤＳＹＶＶＡＶＥＦＤ（配列番 号：４）を含む。このαペプチドは、１５〜２０ｋＤの範囲内の分子量、通常は １６ｋＤの分子量を有する。 更に別の実施態様においては、このタンパク質は、配列ＶＶＡＶＥＤＦＤ（配 列番号：５）又はＴＤＳＹＶＶＡＶＥＤＦＤ（配列番号：６）を有するペプチド 鎖を含む。この態様のペプチド鎖は、本明細書の別の部分で説明するものに匹敵 する性質及び機能を有する。 別の実施態様においては、このタンパク質は、単量体、２量体、及び多量体の タンパク質を含むことができる。これらのタンパク質においては、それぞれ１本 、２本、又は２本を越えるペプチド鎖が、天然物として又は合成によって、単一 のタンパク性物質のサブユニットとして同時に出現する。こうした２量体及び多 量 体のサブユニットは同一でもよいし、また異なってもよい。本発明による非常に 好ましい２量体は、１つのアルファペプチド及び１つのベータペプチドを含むヘ テロダイマー（αβ）である。 ピラーチンヘテロダイマー（αβ）は、好ましくは非共有結合の相互作用によ り凝集して、約６０ｋＤの質量を有する４量体（αβ）₂を形成する。この４量 体は、このタンパク質の最も共通な自然発生的形態に見えるが、ヘテロダイマー のコンカテマー、即ち（αβ)_n（ｎは２を越える正の整数）等の他の多量体が、 質量が約２５〜３０ｋＤ増えて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により観察される場合が ある。従って、本発明はこれら全ての形状を包含する。α₂β₂として成熟した形 態においては、ピラーチンタンパク質は以下の条件で生物活性を回復する：ｐＨ ２〜１０；複数の冷凍−解凍サイクル；６０℃で１０分間；その後４℃で数ヶ月 間。 ピラーチンタンパク質の分子的特徴から、このタンパク質が、既知の植物レク チン、特にマメ類に由来するレクチンに関係することが示唆されている。例えば 、αペプチドのＮ−末端部位は、植物レクチンのコンセンサス配列、即ち、配列 番号３の残基５〜１２を含む。また、ピラーチンタンパク質は、多くのレクチン に共通する構造である４量体として発生することもある。 ピラーチンタンパク質の他の特性は、注目すべきものであり、かつ予期し得な いものである。例えば、本発明のタンパク質は、赤インゲンマメから以下に述ベ るようにして得られた。赤インゲンマメは、もう１つのレクチン（即ち、植物凝 集素）を非常に多く生成することで知られている。ある植物がこうした２つの明 らかに異なるレクチンを発現することは、予期し得ないことである。上記の植物 凝集素等の一定の植物タンパク質が、生理学的な効果を哺乳動物にもたらすこと は知られている。それにも拘らず、１つの分類学的領域から得られた不確定な機 能を有するンパク質が、他の分類学的領域における前駆細胞の特異的調節因子と しても作用することは予期し得ない。このような現象は全く予期し得ないばかり か説明不可能でもある。加えて、一定の真核タンパク質が発達の制御（例えば、 造血系統のためのＴａｎ−１）においてある役割を果たすことが確認されている 一方、植物レクチンについてはこれに相当する役割が未だに明確にされていない 。 本発明による結果として、多数の効用が技術的に実現可能となる。本発明の方 法は、前駆細胞を、インビトロ、エクスビボ、又はインビボにおいて、ピラーチ ンタンパク質と接触させることを含んでもよい。例えば、ピラーチンタンパク質 は、とりわけ、正常な又は悪性（例えば、白血病）の骨髄から単離された造血前 駆細胞の維持を可能にするという効用がある。従って、このタンパク質は、例え ば、骨髄、臍帯血、胎盤血、又は末梢血から得られる細胞源に由来する単核細胞 の培養において使用される。あるいは、ピラーチンタンパク質は、コロニー刺激 因子（ＣＳＦｓ）（例えば、ＩＬ３、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ） 、インターロイキン（例えば、ＩＬ１〜ＩＬ１５）、及びＫＬ等の成長因子と関 連して、インビトロで使用される。これにより、原始的な高度に富化された前駆 細胞を残しながら、成熟した前駆細胞の増殖及び末端分化が選択的に誘起される 。米国特許第５４７２８６７号及び同第５１８６９３１号には、前駆細胞数を拡 大するため、癌化学療法及び骨髄移植の観点から、それぞれ各種ＣＳＦ及びイン ターロイキン（ＩＬ）を用いる方法が記載されている。本発明の好ましい場合に おいては、その方法が、前駆細胞の分化を誘起することなくその数を選択的に増 大させるのに十分な量のＦＬＫ２リガンドに、前駆細胞を接触させることを更に 含む。 また、ピラーチンタンパク質は、インビトロ培養において前駆細胞の生存率を 高める。例えば、細胞の増殖に対し選択的に毒性を示す細胞毒性製剤、例えば細 胞サイクルを経る細胞（「サイクル細胞」）を殺すような細胞毒性製剤を使用し ながら、培養において前駆細胞を実質的な静止状態に維持するためのタンパク質 を使用することを含むインビトロ選択のプロセスを使用できる。適切な細胞毒性 製剤の例としては、アドリアマイシン、シクロホスファミド、タキソール又はそ の他のタキサン、シスプラチン、又は５−フルオロウラシル等が挙げられる。こ の方法は、静止状態の前駆細胞を保存するのに有用である。この方法は、前駆細 胞の維持及び適切な造血再構築のために通常必要と考えられる細胞であるストロ ーマ細胞が、実質的に前駆細胞にない場合であっても有効である。ピラーチンは 、幹細胞を単独に又は他の因子と共に機能的に選択する能力を向上させる。この ような機能選択方法としては、ＫＬ及びＩＬ３を５−ＦＵと組み合わせて使用し て 選択を行うベラルディ（Ｂｅｒａｒｄｉ）らが報告した方法（１９９５年）が挙 げられる。 エクスビボ・パージ（ｐｕｒｇｅ）・プロトコルは、活発なサイクル細胞の除 去を目標にして、新生細胞を選択的に除去するために用いることができる。サイ クル細胞が殺される一方で、本発明のタンパク質は、前駆細胞を静止状態に保つ ことにより、正常な前駆細胞を保存する。前駆細胞から悪性のサイクル細胞が排 除（ｐｕｒｇｅ）されてしまえば前駆細胞を患者にもどすことができ、正常な増 殖及び分化を回復することが可能となる。特に有用なシナリオの１つにおいては 、前駆細胞が、白血病の骨髄から正常な前駆細胞を機能的に選択できるようにな る。こうした機能的選択及び原始幹細胞の精製もまた、同種異系の移植操作を可 能にするために使用できる。 また、ピラーチンタンパク質は、液体培養において細胞を維持することによる 遺伝子治療にて使用される造血前駆細胞のインビトロ操作をも可能にする。例え ば、培養において造血前駆細胞を２週間を越えて保存すると、このタンパク質は 、未複製細胞に侵入するウイルス性ベクター（例えばアデノ関連ウイルスのよう なベクター）による標的侵入効率を向上させることを可能とし、トランスフェク ションの効率を決定するために得られた細胞数の評価のための期間を延長する。 従って、他の態様において、この方法は、外因性のＤＮＡ配列を体細胞にトラン スフェクトする方法と関連させて使用できる。つまり、この方法は、ピラーチン タンパク質により選択的に保存される前駆細胞をトランスフェクトすることを含 むことができる。 また、本発明は、癌治療等の照射を利用した治療に関連する効用をも有する。 具体的には、ピラーチンタンパク質は前駆細胞を静止状態に保つので、ピラーチ ンタンパク質を哺乳類の対象物にインビトロで投与することにより、静止状態の 細胞に相対的に影響を与えないようにしながら、新生細胞を除去するために高め られたレベルで全身照射を行うことが可能となる。このタンパク質は、より大き な又は補助的な効果を得るために、ＩＬ−１等の他の細胞保護物質と関連させて 使用できる。 従って、この方法は、造血治療が必要な哺乳類の対象物を治療することを含む 。 例えば、造血前駆細胞を含む組織サンプルを、その対象物から得ることができる 。この組織サンプルは、サイクル細胞が増殖、分化、及び死滅することが許容さ れる一方で、前駆細胞を保存するためピラーチンタンパク質の存在下で、エクス ビボにて培養できる。培養された細胞は、原始前駆細胞が高度に富化される。そ の間、哺乳動物を、例えば骨髄照射、全身照射、又は化学的誘起による骨髄切除 等の骨髄切除（ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｏｎ）を実行するのに十分な状態に置く ことができる。最後に、前駆細胞が富化された培養細胞は、哺乳動物の造血系を 再構築するために、骨髄切除（ｍｙｅｌｏｂｌａｔｉｏｎ）に続き哺乳動物に投 与することができる。本明細書では自家操作（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｃ ｅｄｕｒｅ）として説明してはいるが、当業者であれば、ある個体から他の個体 への前駆細胞富化培養細胞の移植に、この方法を容易に適用できることを認識す るであろう。 また、ピラーチンタンパク質は、哺乳動物における造血能力、即ち、哺乳動物 の機能的な成熟した血液成分を生成する能力を向上させる。例えば、造血前駆細 胞を含む組織サンプルは、その前駆細胞を保存し、かつ前駆細胞において富化さ れた培養細胞を得るのに十分な量のピラーチンタンパク質を含む成長培地にて培 養できる。そして、富化された培養細胞は、哺乳動物の血液細胞構成成分を生成 するための前駆細胞を提供するために、哺乳動物に輸血される。この方法は更に 、輸血に先だって哺乳動物の造血組織を切除することをも含む。加えて、この方 法では、末梢血、臍帯血、胎盤血、又は骨髄を含む組織サンプルも使用できる。 この組織サンプルは、その哺乳動物に対し自己由来であることが好ましい。この 組織サンプルは、少なくとも実質的にストローマ細胞がないものとすることがで きる。 本発明は更に、エクスビボ又はインビトロでの前駆細胞の生存能力を維持する ための組成を含む。この組成は、本明細書において説明される前駆細胞を保存す るのに十分な量のピラーチンタンパク質を有する、培養における哺乳動物の細胞 を成長させ且つ維持するのに適した培地を含む。この方法で前駆細胞を保存する ためには、実際にはあらゆる細胞又は組織の培地を改変して使用できる。また、 前駆細胞の培養を促進するため、血液バッグ、マイクロタイタープレート、組織 培養フラスコ等の容易に使用できるレセプタクル（培地その他の活性成分の有無 に拘らず）をピラーチンタンパク質と共に提供することもできる。 また、本発明は、哺乳動物において前駆細胞をインビボで保存するための方法 をも含む。このアプローチにおいて、この方法は、実質的に非増殖状態にある哺 乳動物の前駆細胞を保存するのに十分な量のピラーチンタンパク質を、哺乳動物 に投与することを含む。そして、哺乳動物は、非増殖状態の前駆細胞を温存する が骨髄細胞を増殖させる切除を実行するのに十分な骨髄切除条件（ｍｙｅｌｏａ ｂｌａｓｉｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）に晒される。切除処置に続き、保存さ れた前駆細胞の増殖又は分化が、通常は、前駆細胞の生存能力を向上させるのに 十分な量のサイトカインを哺乳動物に投与することにより再開される。生存能力 向上のための好ましいサイトカインの例としては、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６、Ｉ Ｌ１１、ＫＬ、又はこれらを組み合わせたものが挙げられる。より好ましくは、 この再開操作は、増殖刺激可能量のＦＬＫ２リガンドを哺乳動物に投与すること を含む。この方法によれば、ピラーチンタンパク質は、照射及び／又は化学療法 の致死量適用の後に貯蔵しておいた骨髄の再注入が行われる、自家骨髄移植法を 強化するために用いることができる。 ピラーチンタンパク質の有効量は、静脈注射等の非経口的経路などによる簡易 なアプローチにより、好ましくは、経腸的経路により、哺乳動物に投与できる。 経口投与の経路が有用であることが予想される。なぜなら、レクチンは通常、口 腔内／腸内における分解に対し抵抗力があり、このアプローチにより有効なバイ オアベイラビリティを示すからである。当業者であれば、様々な投与方法の効用 及び限界を認識し、これに従って投与量（薬量学）を調整できる。 また、他の治療的有用性も、本発明によって可能になるものとして、当業者に 提示される。このような他の治療的有用性は、移植（ｅｎｇｒａｆｔａｔｉｏｎ ）の可能性を高めるためにエクスビボで前駆細胞数を増大させること、前駆細胞 の移送及び貯蔵の条件を改善すること、及び鎌状赤血球貧血症やサラセミア等の 生命を脅かす血液病学的疾患を広い範囲にわたって処置及び治療する遺伝子療法 を可能にするため根本的な障壁を除去することを含む。 本発明のタンパク質は、前駆細胞の同定又は局所化のための具体的なプローブ として使用することもできる。このタンパク質は原始的な前駆細胞と特異的に結 合するので、蛍光マーカー等の検知可能な部分（ｍｏｉｅｔｙ）に結合するタン パク質を含む組成を使用して、前駆細胞を明確に標識化し且つ同定することがで きる。従って、前駆細胞を組織内で組織学的局所化することができると同様、細 胞選別（ソーティング）によって前駆細胞を単離することもできる。当業者であ れば、実行すべき課題に沿って利用されるマーカー部のタイプを選択できる。な ぜなら、タンパク質を標識化する多くの方法が、当技術分野において知られてい るからである。 以下の実施例は、本発明の更なる理解の一助として提供するものである。使用 される特定の材料及び条件は、本発明をより具体的に示す意図によるものであり 、本発明の妥当な請求の範囲を制限するものではない。 実施例１ インゲンマメ及びフジマメからのピラーチンタンパク質の単離 市販品（ストークス・シード社製、ニューヨーク州バッファロー、あるいはＷ ・アトリー・バーピー社製、ペンシルバニア州ワーミニスター）のインゲンマメ ２５０ｇをコーヒーミルで粉砕した。（この方法は、本発明の活性物質を含むフ ジマメ又は他の豆類から材料を分離する際にも用いられる。）得られた豆の粉を １リットルのアルカリレクチン結合緩衝液（ＬＢＢ；例 ５０ｍＭトリス／ＨＣ ｌ、ｐＨ７．０、金属カチオン含有：ＭｇＣｌ₂、ＣａＣｌ₂各１ｍＭ）に添加し 、４℃で一晩攪拌し続けながらインキュベートした。粉体は、１０，０００×ｇ 、２０分間の遠心分離によってペレット化し、上清を取得した。 上記タンパク質はマンノースと特異的に結合するため、このタンパク質を一工 程で精製することが可能になる。マンノース−アガロースのアフィニティークロ マトグラフィーを妨害する汚染物質を除去するため、上記豆の上清を６０％（０ ．６ｍｇ／ｍＬ）の硫酸アンモニウム溶液による硫安沈殿に付した。沈殿物を再 び懸濁させ、４℃で一晩ＬＢＢを用いて透析を行い、アフィニティークロマトグ ラフィーの出発原料を得た。透析した硫酸アンモニウム画分を、Ｓｅｐｈａｒｏ ｓｅ４Ｂ（シグマケミカル社製、ミズーリ州セントルイス）と共 有結合したマンノースと共に４℃でロッカー上にて一晩インキュベートした。そ の後、得られたゲルをＬＢＢにで十分洗浄し、重力沈降法によりペレット化した 。レクチン類は、２５０ｍＭのメチルアルファ−Ｄ−メチルピラノシド（シグマ ケミカル社製、ミズーリ州セントルイス）を溶解したＬＢＢを用いて、ロッカー 上にて４℃で２日間溶離させ、密度沈降法によりペレット化し、レクチン含有上 清を吸引した。ピラーチンタンパク質を含む上清は、一晩ＬＢＢを用いて透析を 行って糖分を除去し、得られた透析物を滅菌濾過し、−２０℃にて保存した。 フジマメから単離し、マンノース−アガロースにより精製した精製ピラーチン タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を図１に示す。ピラーチンサンプル及び 分子量マーカー（インテグレーティド・セパレーション・システムズ製、マサチ ューセッツ州ナットウィック）は１０〜２７％濃度勾配のポリアクリルアミドゲ ル（インテグレーティド・セパレーション・システムズ製、マサチューセッツ州 ナットウィック）上で還元状態下で分析し、クマシー・ブリリアントブルー染色 （シグマ・ケミカル社製、ミズーリ州セントルイス）により可視化した。分子量 をゲルの左側に示す。アルファ及びベータサブユニットをそれぞれ各ゲルの右側 に示したが、各数字はサブユニットのアイソフォームを示す。フジマメでは、ピ ラーチンのアルファサブユニットの４種類のアイソフォーム及びベータサブユニ ットの１種類のアイソフォームが検出された。 実施例２ ＦＬＫ２レセプタ−３Ｔ３アッセイはピラーチンタンパク質の生物活性を特異的 に定量する ピラーチンタンパク質は哺乳類のＦＬＫ２チロシンキナーゼレセプターと相互 作用する。ヒトＦｍｓレセプター（Ｌｅｍｉｓｃｈｋａら、未公表）の細胞内部 分と組み合わせたマウスＦＬＫ２レセプターの細胞外部分からなるキメラレセプ ター、又は完全長ヒトレセプター（Ｓｍａｌｌら、１９９４年）のいずれか一方 をトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞を用いた特異的かつ定量的バイ オアッセイによって、精製時におけるレクチンの生物活性を評価することができ る。レクチンのサンプルを、９６穴プレートの列を横断して倍々希釈しつつ滴下 すると、１０００倍を超える倍率においてＦＬＫ２３Ｔ３の生物活性がみとめら れた。ＦＬＫ２トランスフェクト細胞を殺さないよう、このバイオアッセイには 、マウスもしくはヒトのＦＬＫ２／ＦＬＴ３リガンド（ＦＬ）（Ｌｙｍａｎら、 １９９３年；Ｈａｎｎｕｍら、１９９４年）又はピラーチンタンパク質が必要で ある。 特に、３Ｔ３細胞をストック培養プレートから取り出す際には、組織培養プレ ート（ベクトン・ディッキンソン・ラボウェア製、ニュージャージー州リンカー ンパーク）で培養された細胞をハンクス緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ；ギブコ・ラ ボラトリーズ製、ニューヨーク州グランドアイランド）にて２回洗浄し、更に非 酵素系の細胞解離緩衝液（ギブコ製）を室温で１５分間に亘って添加した後、メ ジウム中で細胞を洗浄する。９６穴プレート中でウェル１個につき最終的に３０ ００個の細胞で満たされるよう、ＦＬＫ２３Ｔ３細胞を培養するが、その培養は １０％のＡＩＭＶ（ギブコ製）と９０％のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥ Ｍ；ギブコ製）を含む血清規定(serum-defined)培地１００マイクロリットル中 で行う。このアッセイ条件下では、細胞を死から守るリガンドを外から加えない と、細胞は３７℃及び５％ＣＯ₂の加湿インキュベータ中で２〜４日後に死ぬ。 ９６穴プレート各々にはポジティブコントロールとして子ウシ血清が含まれてお り、これは全ての３Ｔ３細胞を刺激する。培地だけのものがネガティブコントロ ールである。完全長Ｆｍｓトランスフェクト３Ｔ３細胞（生物反応についてはＴ ｅｓｓｌｅｒらによって示されている。１９９４年）はレセプタートランスフェ クト制御標的細胞として作用し、３Ｔ３親細胞はトランスフェクトしていない制 御細胞として作用する。細胞の増殖および生存はＸＴＴ（ダイアグノスティック ・ケミカル社製、カナダ、シャーロットタウン、プリンスエドワードアイランド ）、即ち活性呼吸細胞（モスマン、１９８３年）によって切断されたテトラホル マザン塩の添加によって定量化し、Ｖｍａｘ動的プレートリーダー（モレキュラ ー・デバイス社製、カリフォルニア州マウンテンビュー）を用いて分光光学的に 定量化し、比活性（ユニット／ｍＬ）又は特異活性（ユニット／ｍｇ）として記 録した。生物活性の１ユニットは、最大値の半値の細胞の刺激が検出された時点 での希釈度の逆数として定義される。図２Ａ〜２Ｄは、赤インゲンマメから単離 したピラーチンが、ＩＬ１に依存して特異的にＦＬＫ２３Ｔ３細胞を刺 激することを示す。ピラーチンの生物活性は、ＦＬＫ２／Ｆｍｓ３Ｔ３細胞上（ 図２Ａ及び２Ｂ参照）及びトランスフェクトしていない３Ｔ３親細胞上（図２Ｃ 及び図２Ｄ参照）にて、１０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えインターロイキン１−アル ファ（ＩＬ１−アルファ）（バイオソース・インターナショナル製、カリフォル ニア州カマリロ）の非存在下（図２Ａ及び２Ｃ参照）及び存在下（図２Ｂ及び２ Ｄ参照）で、１０００倍のレンジに亘って試験し、ＸＴＴによって定量した。ピ ラーチンタンパク質は、ＩＬ１の存在下でのみＦＬＫ２／Ｆｍｓ３Ｔ３細胞の増 殖を刺激し、ＩＬ１の存在、非存在に関係無く、トランスフェクトしていない３ Ｔ３細胞の増殖を刺激することは無かった。 次の実施例３〜１０は、本発明のタンパク質がインビトロで前駆細胞を保存す ることを示す。赤インゲンマメ及びフジマメから単離したピラーチンは、マウス 胎児の肝臓細胞及びヒト臍帯血細胞由来の前駆細胞を、液体培養において特異的 に保存する。 実施例３ ピラーチンタンパク質はインビトロでヒト及びマウスの造血前駆細胞を保存する 。 造血前駆細胞は単核細胞に対して、約１：１０,０００〜約１：１００,０００ の率で存在し、ヒトの骨髄、臍帯血、及びある条件下では末梢血に存在する。イ ンビトロ培養で前駆細胞を富化するためには、血液又は骨髄のサンプル全体から 密度分離法によって単核細胞を分離しなければならない。特に、５０ｍＬのコニ カルチューブ（ベクトン・ディッキンソン製、ニュージャージー州フランクリン レイクス）中で、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ファーマシア・バイオ テック製、ニュージャージー州ピスカタウェイ）上に丁寧にサンプル層を作り、 取扱説明書に従って、サンプルの処理を行う。 単核細胞調製物から幹細胞を１００倍を超えて富化するために、抗体標識磁気 ビーズ法を用いる。２種類の市販の方法（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ；ダイナル社製， ニューヨーク州レイクサクセス及びＭＩＮＩＭＡＣＳマルチパラメーター選別； ミルテナイ・バイオテック製、カリフォルニア州オーバーン）はＣＤ３４⁺細胞 のポジティブ選択によるものである。また、別の方法（ＳＴＥＭＳＥＰ ＣＤ３ ４⁺／ＣＤ３８^-；ステム・セル・テクノロジーズ社製、ブリティッシュ コロンビア州バンクーバー）では、ネガティブ選択（グリコホリンＡ、ＣＤ１４ 、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ３６、ＣＤ２４、Ｃ Ｄ４５ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ３８）によって幹細胞を分離し、その結果表面表現 型のＣＤ３４⁺、ＣＤ３６^-、ＣＤ３８^-、ＣＤ４５ＲＡ^-を伴う細胞が得られる。 ３７℃に保たれ、５％のＣＯ₂で満たされたインキュベータ中で、血清規定培 地（ＡＩＭＶ−Ｖ；ギブコ製、ニューヨーク州グランドアイランド、ＢＩＴ９５ ００；ステム・セル・テクノロジーズ製、ブリティッシュコロンビア州バンクー バー、又はＸ−ＶＩＶＯ１０；バイオ・ウィッタッカー製、メリーランド州ウォ ーカーズビル）を含む液体培養で、単核細胞集団においてもまたＣＤ３４⁺富化 細胞内においても、ピラーチンタンパク質は単離した前駆細胞を２〜４週間保存 するのに使用される。得られた細胞集団はフローサイトメトリーによって特徴づ けされ、前駆細胞の機能状態を数値化し評価するために造血コロニーアッセイを 行う。 ヒト造血幹細胞は、ＣＤ３４⁺⁺ＣＤ３８^-Ｔｈｙ⁺という細胞表面抗原表現型を 示すが、成熟血液細胞系列（ＣＤ３、ＣＤ１９等）に対して抗原を示さない（Ｐ ｅｌｔｚｅｒら、１９９６年）。具体的には細胞を取扱説明書に従って蛍光標識 抗体（例 コールター社製、フロリダ州ヒアリー）と共にインキュベートし、フ ローサイトメトリー（例 Ｅｐｉｃｓ Ｅｌｉｔｅ；クールター社製）によって マーカー発現を評価する。 造血コロニーアッセイによって、細胞集団における前駆細胞の頻度や原始状態 が間接的に評価される。また、細胞を、成長因子を含んだ半固体のメチルセルロ ース（ステム・セル・テクノロジーズ製、ブリティッシュコロンビア州バンクー バー）上で培養し、細胞増殖及び分化に関し最適な刺激を与える。 実施例４ ピラーチンは培養においてマウス胎児肝臓ＣＤ３４⁺細胞を保存する。 図３は、赤インゲンマメから精製したピラーチン（ピラーチンＲＫ）及びフジ マメから精製したピラーチン（ピラーチンＨ）が、単独でも、また濃度を段階的 に上げたサイトカインカクテル（ｍＩＬ１、ｍＩＬ３、ｍＫＬ）と一緒でも、１ ０％子ウシ血清含有ＤＭＥＭを含む液体培地で６日間、マウス胎児肝臓ＣＤ ３４⁺細胞を保存することを示す。１５日後、培養物を採取し、細胞を再びメチ ルセルロースコロニーアッセイに付し、機能性前駆細胞の頻度を評価した。図中 、ＮＴは未試験を示す。単核細胞の培養はピラーチンの存在下又は非存在下で、 外因性サイトカインを用いずに、または、５ｎｇ／ｍＬ又は５０ｎｇ／ｍＬの初 期作用性（ｅａｒｌｙ−ａｃｔｉｎｇ）組換マウスサイトカインカクテル（ｍＩ Ｌ１、ｍＩＬ３、ｍＫＬ）（バイオソース・インターナショナル製、カリフォル ニア州カマリロ）を用いて行った。残った生存可能細胞のフローサイトメトリー 分析によって、ピラーチンを含む培養ウェル中のＣＤ３４⁺細胞の比率は、初期 作用性サイトカインカクテル用量に依存的に高くなることがわかるが、対照の培 地ではこのような傾向は見られなかった。 実施例５ ピラーチンは培養においてマウス造血前駆細胞を保存する 上記ピラーチンタンパク質は、単独で又はＩＬ１もしくはＦＬのいずれか一方 と組み合わせて、培養中に機能性造血前駆細胞を少なくとも２週間保存する。具 体的には、図４は、１０％子ウシ血清含有ＤＭＥＭを含んだ液体培養培地中で１ ５日間培養した、マウス造血前駆細胞に対する精製ピラーチンの保存効果を示す 。機能性前駆細胞の評価は液体培養から採取した細胞によって行い、取扱説明書 に従って再びメチルセルロースコロニーアッセイ（ステム・セル・テクノロジー ズ製、ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）に付した。個々の前駆細胞か ら派生したコロニーの数を２週間後に数え、その結果を最初に植え付けた細胞１ ００，０００個当たりのコロニー数の頻度として標準化した。各ピラーチンサン プルは、外因性サイトカインカクテルの非存在下で前駆細胞を保存し（各グルー プの左バーに示す）、サイトカインカクテル含有ピラーチンサンプルについては 、それぞれ違いが見られた。 実施例６ ピラーチンタンパク質と共に培養した細胞上の細胞表面マーカーのフローサイト メトリー分析 ５０ｎｇ／ｍＬのサイトカインカクテル（図４参照）を含む培養物のメチルセ ルロースコロニーアッセイで発生した細胞の種類を、フローサイトメトリーによ って決定した。この結果を図５に示す。Ｓｃａ⁺細胞はピラーチン含有培養でか なり増加したが、他の細胞表面マーカーは特に影響を受けなかった。このＳｃａ 抗原は、マウス幹細胞及びＴ細胞を含む他の成熟細胞上に発現される。この実験 において、Ｔ細胞（ＣＤ３）は増加しなかった。図５には、５０ｎｇ／ｍＬの初 期作用性組換マウスサイトカイン（ｍＩＬ１、ｍＩＬ３、ｍＫＬ）（バイオソー ス・インターナショナル製、カリフォルニア州カマリロ）中、ピラーチンサンプ ルの存在下及び非存在下で、コロニーアッセイに先立って培養した細胞（図４中 それぞれ右端のバー）から採取した細胞の細胞表面表現型のフローサイトメトリ ー分析結果を示す。ピラーチンＲＫは対照培地と比較して１４．５のＳｃａ−１ 細胞を産生した。Ｓｃａ−１、又はＬｙ６は原始マウス前駆細胞に関係した抗原 であり、Ｔ細胞等を含む成熟血液細胞にも関係している（Ｓｐａｎｇｒｕｄｅら 、１９９１年）。Ｔ細胞（ＣＤ３）、樹枝状細胞（ＣＤ１１ｂ）、Ｆｃ−ガンマ レセプター（例 顆粒球及び単球）を発現する細胞、ＣＤ３８、又はトランスフ ェリンレセプター（ＣＤ７１）（カリフォルニア州、ファーミゲン社より入手し た抗体）の個数については違いが見られなかった。 実施例７ ピラーチンタンパク質は培養中ヒトＣＤ３４⁺細胞を保存する ピラーチンはヒト原始前駆細胞も保存する。図６Ａ及び６Ｂは、ピラーチンが 単独で、又は初期作用性ヒトサイトカイン（ｒｈＩＬ１−アルファ、ｒｈＩＬ３ 、ｒｈＦＬ、ｒｈＫＬ）と組み合わせてＣＤ３４⁺ヒト臍帯血細胞を特異的に２ 週間まで保存することを示す。フジマメから単離した精製ピラーチン（ピラーチ ンＨ）は、血清規定培地（ＢＩＴ９５００、ステム・セル・テクノロジーズ製、 ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）を含む液体培養中１７日間（図６Ａ 参照）及び６日間（図６Ｂ参照）に亘って、ＣＤ３４抗原を発現するヒト臍帯血 細胞を特異的に保存する。ピラーチンは、外因性サイトカイン類の添加の有無に かかわらず、効果的にＣＤ３４⁺細胞を保存する。 実施例８ ピラーチンタンパク質は液体培養中ヒト前駆細胞を保存する ピラーチンは単独で、又はＩＬ１もしくはＦＬのいずれか一方と組み合わせて 、 機能性前駆細胞を液体培養中少なくとも２週間保存する。図７には、この実験で ピラーチンとＦＬを組み合わせて用いることによって、選択されたアッセイ条件 下で液体培養中前駆細胞個数が実際に増加することが示されている。機能性前駆 細胞から派生したコロニーの数は、ＩＬ１又はＦＬの有無にかかわらず対照培地 （図の右側）の場合に比べてピラーチンの存在下（図の左側）で数倍に増加する 。 液体培養中ピラーチンによって保存される造血前駆細胞の性質は経時的に変化 する。臍帯血単核細胞（ｍｎｃ）を、４ｍＬ当たり細胞８００，０００個の濃度 で、ピラーチン、ＦＬ、ピラーチン＋ＦＬおよび対照培地の場合について、Ｘ− ＶＩＶＯ１０を用いて６日間、１５日間、２１日間培養した。機能性前駆細胞の 評価は、細胞をメチルセルロースコロニーアッセイの再プレーティングに付し、 更に１６日後にコロニー数を数えることによって行った。４種類のコロニーが記 録された。「ブラスト」は、非常に原始的な幹細胞を示しうる未分化細胞からな る、小さく分散したコロニーをいう。「ミックス」は、多系列に分化し得る前駆 細胞によって形成された分化したミエロイド及びエリスロイド細胞からなるコロ ニーをいう。「ミエロイド」は、分化したミエロイド細胞だけからなるコロニー をいう。「エリスロイド」は、「ＢＦＵ−Ｅ」（バースト−フォーミングユニッ トエリスロイド）と呼ばれる原始的前駆細胞によって形成された、分化した赤芽 球又は正常赤芽球だけからなるコロニーをいう。 コロニーは、全ての液体培養ウェル中で培養６日後に形成した（図８Ａ参照） 。図８Ａ中の実線は、コロニー数が多すぎて正確に数えられなかったことを示し ており、この実験では、８００，０００ｍｎｃ当たりコロニー数が１，５００を 超えていた。 培養１５日後、ピラーチンは、ミエロイド又はエリスロイド系列の比較的成熟 した前駆細胞を保存したが、ＦＬは保存しなかった（図８Ｂ参照）。「ブラスト 」状細胞及びミエロイド委任(committed)前駆細胞が、液体培養で２１日間保存 された臍帯血単核細胞からコロニーアッセイプレートに現れた（図８Ｃ参照）。 １５日間及び２１日間の培養後、前駆細胞の度数がかなり高いことは、前駆細胞 の保存だけでなく原始前駆細胞の増加（自己再生）を示している。 実施例９ ピラーチンは培養中、用量依存的に前駆細胞を保存する ピラーチンは用量依存的に作用し、ヒト臍帯血前駆細胞を保存する。図９Ａ及 び９Ｂには、実施例８に記載した方法を用いて、２人のドナーから採取した臍帯 血単核サンプルを培養した結果が示されている（図９Ａ及び９Ｂは各ドナーに対 応する）。このケースでは、培養は１００倍を超えるピラーチンの濃度範囲で１ ２日間に亘って続けられた。２人のドナー間で反応は異なっていた（コロニー種 の組成及び前駆細胞の度数の両方において）が、２０，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｇ におけるＤＬＬの特異的活性は、各ドナーについてほぼ同じであった。尚、図中 のＴＭＴＣはコロニー数が多すぎてカウントできなったことを意味する。 実施例１０ ピラーチンは培養中、成熟血液細胞への分化を防ぐことによって前駆細胞を保存 する。 図１０は、ピラーチン（この場合、フジマメから得たピラーチン）が、液体培 養６日後、ＩＬ３により誘起されるＦｃ−ガンマレセプター発現細胞の産生を防 ぐことを示す。ＩＬ３含有培養には約８０％のＣＤ３２⁺細胞が含まれていたが 、ピラーチン含有培養に含まれているＣＤ３２⁺は１０％未満であった。マウス のＦｃガンマ１１及びＦＣガンマＩＩＩレセプターを発現する細胞には、胎児胸 腺細胞類のほか、ナチュラルキラー細胞類、単球類、マクロファージ類、顆粒球 類、マスト細胞類等が挙げられる（Ｕｎｋｅｌｅｓｓ、１９７９年）。 上記各実施例で提供したデータより、ピラーチンは、単独で又は他のサイトカ イン類と組み合わせて原始造血前駆細胞を保存し、また、液体培養中でＩＬ３に よって誘起される分化を防ぐ。実際、このピラーチンタンパク質は、前駆細胞保 存においてＦＬよりも効果的であり、更にはＦＬにストローマ細胞を補った場合 と比較しても効果的である。このペプチドとストローマ細胞とが一緒に培養され るかどうかテストするためのデータはまだ得られていないが、本出願人らはこの ペプチド保存効果の向上も維持されるであろうと考えている。兎に角、本発明の タンパク質は、細胞培養での原始造血前駆細胞の保存において効果的であること は明白であり、このことは、前駆細胞の外移植、生体外での前駆細胞の培養及び 保存、及び保存された前駆細胞の再移植（又は移植）を含む臨床において、この タンパク質が有用であることを示唆している。 このように、現在考えられる本発明の最適な実施態様を上に述べたが、当業者 は本発明の主旨を逸脱せずに他の更なる実施態様が可能であることを理解するで あろう。このような更なる修正及び変更は添付のクレームの真の範囲内に含まれ ることが意図されている。 引用文献 以下の文献は、本明細書に記載されたものであるが、これらに開示された全内 容を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。 Ｂａｒｏｎｅｄｅｓ，ＳＨ、「レクチンの二機能性特性：再評価されたレクチン 」、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１３：４８０−４８２（１９８８ ）。 Ｂｅｒａｒｄｉ，ＡＣら、「ヒト造血幹細胞の機能による単離及びキャラクタリ ゼーション」、ｓｃｉｅｎｃｅ、２６７：１０４−１０８（１９９５）。 Ｄｗｅｋ，ＲＡ、「糖鎖生物学：オリゴ糖の多機能性」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６ ９：１２３４−１２３５（１９９５）。 Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ−Ｊ、「動物レクチンのパートナー／ドメインと結合する非炭 水化物」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６：４６９（１９９４ａ）。 Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ−Ｊ、「レクチノロジーの神秘：ヤドリギレクチンにとっての 腫瘍学的将来とは？」、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｏｓｃｉ ａｎｄ Ｇｌ ｙｃｏｔｅｃｈ ６：２２９（１９９４ｂ）。 Ｇｏｗｄａ，ＬＲ、ＨＳ Ｓａｖｉｔｈｒｉ、およびＤＲ Ｒａｏ、「フィール ドビーンから得られたユニークなマンノース／グルコース特異性レクチンの完全 主要構造」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１８７８９−１８７９３（１９ ９４）。 Ｈａｎｎｕｍ，ＣＯら、「ＦＬＴ３／ＦＬＫ２レセプターチロシンキナーゼ用リ ガンドは造血幹細胞の成長を調節し、変異体ＲＮＡによってコードされる」、Ｎ ａｔｕｒｅ ３６８：６４３（１９９４）。 Ｌｙｍａｎ，ＳＤら、「ＦＬＴ３／ＦＬＫ２チロシンキナーゼレセプター用リガ ンドの分子クローニング：原始造血細胞用増殖性アッセイ」、Ｃｅｌｌ ７５： １１５７（１９９３）。 Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ、「細胞成長及び生存に対する急速比色アッセイ：増殖及び 細胞毒性アッセイへの応用」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５ ５−６３（１９８３）。 Ｏｇａｗａ，Ｍ、「造血幹細胞の分化及び増殖」、Ｂｌｏｏｄ ８７：２８５５ （１９９３）。 Ｐｅｌｔｚｅｒ，ＡＬら、「インビトロでの原始ヒト造血細胞（長期培養始原細 胞）の自己再生及び規定培地でのこれら細胞の膨張」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、９３：１４７０−１４７４（１９９６）。 Ｓｈａｈ，ＡＪら、「ＦＬＴ３リガンドはインビトロで静止ヒト骨髄ＣＤ３４⁺ ＣＤ３８^-細胞の増殖を誘起し、前駆細胞を維持する」、Ｂｌｏｏｄ、８７３５ ６３−３５７０（１９９６）。 Ｓｈａｒｏｎ，Ｎ、およびＨ ＬｉＳ、「細胞認識分子としてのレクチン」、Ｓ ｃｉｅｎｃｅ、２４６：２２７−２３４（１９８９）。 Ｓｍａｌｌ，Ｄ、Ｍ Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎ、Ｅ Ｋｉｍ、Ｃ Ｃａｒｏｗ、Ｓ Ａｍｉｍ、Ｐ Ｒｏｃｋｗｅｌｌ、Ｌ Ｗｉｔｔｅ、Ｃ Ｂｕｒｒｏｗ、Ｍ Ｒａｔａｊｃｚａｋ、ＡＭ Ｇｅｗｉｒｔｚ、およびＣ Ｃｉｖｉｎ、「ＦＬＫ −２／ＦＬＴ３のヒトホモログであるＳＴＫ−１はＣＤ３４⁺ヒト骨髄細胞で選 択的に発現され、初期前駆／幹細胞の増殖に必要とされる」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：４５９−４６３（１９９４）。 Ｓｐａｎｇｒｕｄｅ，ＧＪら、「マウス造血幹細胞の精製及びキャラクタリゼー ション」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５８−６２（１９９１）。 Ｔｅｓｓｌｅｒ，Ｓ、Ｐ Ｒｏｃｋｗｅｌｌ、Ｄ Ｈｉｃｋｌｉｎ、Ｔ Ｃｏｈ ｅｎ、Ｂ−Ｚ Ｌｅｖｉ、Ｌ Ｗｉｔｔｅ ＩＲ Ｌｅｍｉｓｃｈｋａ、および Ｇ Ｎｅｕｆｅｌｄ、「ヘパリンはＶＥＧＦ１６５と溶解性細胞結合ＦＬＫ−１ レセプター間の相互作用を調節する」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２ ４５６−１２４６１（１９９４）。 Ｔｕｒｈａｎ ＡＧら、「同種骨髄移植後のｘ−リンクＤＮＡ多型性によって示 されたクローン造血」、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３２０：１６５ ５−１６６１（１９８９）。 Ｕｎｋｅｌｅｓｓ，ＪＣ、「マウスマクロファージ及びリンパ球Ｆｃレセプター に対してなされたモノクローナル抗体のキャラクタリゼーション」、Ｊ．Ｅｘｐ ．Ｍｅｄ．１５０：５８０−５９６（１９７９）。 Ｙｏｕｎｇ，ＪＣ、Ａ Ｖａｒｍａ、Ｄ ＤｉＧｉｕｓｔｏ、およびＭ Ｂａｃｋｅｒ、「エクスビボ幹細胞培養中の高増殖可能性を有する静止造血細胞 の保持」、Ｂｌｏｏｄ ８７：５４５−５５６（１９９６）。 Ｚｉｐｏｒｉ，Ｄ、「造血幹細胞の再生及び分化」、ＦＡＳＥＢ Ｊ．６：２６ ９１−２６９７（１９９２）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/06 Ａ６１Ｐ 7/06 // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＡＱＳＬＳＦＳＦＴＫＦＤ（配列番号１）を含むアミノ酸配列及び約１２− ２０ｋＤの分子量を有するか、又はＶＶＡＶＥＦＤ（配列番号３）を含むアミノ 酸配列及び約１５−２０ｋＤの分子量を有する、前駆細胞を保存するタンパク質 。 ２．該タンパク質が、ＶＶＡＶＥＦＤ（配列番号３）を含むアミノ酸配列を有す る分子量約１５−２０ｋＤのアルファポリペプチド、及びＡＱＳＬＳＦＳＦＴＫ ＦＤ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有する分子量約１２−２ＯｋＤのベー タポリペプチドを含むヘテロダイマーを含むタンパク質である請求項１記載のタ ンパク質。 ３．ＴＤＳＹＶＶＡＶＥＦＤ（配列番号４）を含むアミノ酸配列を有する請求項 １記載のタンパク質。 ４．ＡＱＳＬＳＦＳＦＴＫＦＤＬＤ（配列番号２）を含むアミノ酸配列を有する 請求項１記載のタンパク質。 ５．２つ以上のヘテロダイマーである請求項２記載のタンパク質。 ６．２つの同一なヘテロダイマーを含む四量体である請求項５記載のタンパク質 。 ７．マンノース／グルコース特異的豆レクチンである請求項１記載のタンパク質 。 ８．Ｐｈａｓｅｏｌｅａｅ族の豆から得られたものである請求項７記載のタンパ ク質。 ９．インゲンマメ、フジマメ又はササゲから得られたものである請求項８記載の タンパク質。 １０．前駆細胞が少なくとも単能性前駆細胞である請求項１記載のタンパク質。 １１．前駆細胞が多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）前駆細胞である請求項１記 載のタンパク質。 １２．前駆細胞が分化全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）前駆細胞である請求項１ 記載のタンパク質。 １３．前駆細胞が造血前駆細胞である請求項１記載のタンパク質。 １４．前駆細胞が神経、筋肉、皮膚、消化管、骨、腎臓、肝臓、膵臓又は胸腺前 駆細胞である請求項１記載のタンパク質。 質。 １６．前駆細胞がｆｌｋ２レセプターを発現するものである請求項１１記載のタ ンパク質。 １７．前駆細胞が表面にｆｌｋ２レセプターを発現するように変化させた細胞で ある請求項１６記載のタンパク質。 １８．タンパク質が細胞表面のｆｌｋ２レセプターと顕著な結合親和性を持ち、 タンパク質とｆｌｋ２レセプターとの結合が前駆細胞の分化の阻害を仲介するタ ンパク質である請求項１６記載のタンパク質。 １９．前駆細胞を前駆細胞の保存に十分な量のタンパク質と接触させることを特 徴とする前駆細胞を保存する方法であって、該タンパク質がＡＱＳＬＳＦＳＦＴ ＫＦＤ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有する分子量約１２−２０ｋＤのタ ンパク質又はＶＶＡＶＥＦＤ（配列番号３）を含むアミノ酸配列を有する分子量 約１５−２０ｋＤのタンパク質である方法。 ２０．タンパク質がＡＱＳＬＳＦＳＦＴＫＦＤＬＤ（配列番号２）を含むアミノ 酸配列を有するタンパク質である請求項１９記載の方法。 ２１．タンパク質がＴＤＳＹＶＶＡＶＥＦＤ（配列番号４）を含むアミノ酸配列 を有するタンパク質である請求項１９記載の方法。 ２２．タンパク質がＰｈａｓｅｏｌｅａｅ族の豆から得られたタンパク質である 請求項１９記載の方法。 ２３．タンパク質がインゲンマメ、フジマメ又はササゲから得られたタンパク質 である請求項２２記載の方法。 ２４．前駆細胞が造血前駆細胞である請求項１９記載の方法。 ２５．前駆細胞がＣＤ３４抗原及び／又はｆｌｋ２レセプターを発現するヒト細 胞である請求項２４記載の方法。 ２６．前駆細胞かＳｃａ抗原を発現するが成熟血液細胞系統を発現しないマウス 細胞である請求項２４記載の方法。 ２７．前駆細胞とタンパク質とをインビトロ、生体外又は生体内で接触させる請 求項１９記載の方法。 ２８．前駆細胞と分化を誘起せずに前駆細胞の数を選択的に増加するのに十分な 量のｆｌｋ２リガンドとを接触させることを更に含む請求項１９記載の方法。 ２９．造血治療を必要とする哺乳動物の処置方法であって、 ａ）造血前駆細胞を含む組織サンプルを哺乳動物から摘出し、 ｂ）前駆細胞を、培養細胞を前駆細胞に富化させるために、前駆細胞を保存する タンパク質の存在下で培養し、ここでタンパク質がＡＱＳＬＳＦＳＦＴＫＦＤ（ 配列番号１）を含むアミノ酸配列を有する分子量約１２−２０ｋＤのタンパク質 又はＶＶＡＶＥＦＤ（配列番号３）を含むアミノ酸配列を有する分子量約１５− ２０ｋＤのタンパク質であって、 ｃ）哺乳動物を骨髄切除（ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｏｎ）に十分効果的な条件下 に置き、そして ｄ）骨髄切除に続いて培養細胞を哺乳動物に投与し、哺乳動物の造血システムを 再構築する、ことを特徴とする方法。 ３０．骨髄切除（ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｏｎ）条件が骨髄照射、全身照射又は 化学的に誘発された骨髄を切除するものである請求項２９記載の方法。 ３１．前駆細胞を保持する量のタンパク質中における前駆細胞の培養を含む前駆 細胞を富化する方法であって、該タンパク質がＶＶＡＶＥＦＤ（配列番号３）を 含むアミノ酸配列を有する分子量約１５−２０ｋＤのタンパク質またはＡＱＳＬ ＳＦＳＦＴＫＦＤ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有する分子量約１２−２ ０ｋＤのタンパク質であり、ここでタンパク質が前駆細胞を特異的に保存し、ま た培養は前駆細胞を保存しつつ分化細胞の数を減らす条件下で行うことを特徴と する方法。 ３２．前駆細胞が原始前駆細胞である請求項３１記載の方法。 ３３．前駆細胞が成熟前駆細胞である請求項３１記載の方法。 ３４．前駆細胞が少なくとも実質的にストローマ細胞を含まない請求項３１記載 の方法。 ３５．培養条件が増殖細胞への選択的毒性を示す細胞毒剤を含む培地での培養で ある請求項３１記載の方法。 ３６．細胞毒剤がアドリアマイシン、シクロホスファミド、タキソールその他の タキサン、シスプラチン又は５−フルオロウラシルである請求項３５記載の方法 。 ３７．哺乳動物において造血能力を高める方法であって、 ａ）造血前駆細胞を含む組織サンプルを、前駆細胞を保存しかつ培養細胞を前駆 細胞で富ませるのに十分な量のタンパク質を含んだ成長培地中で培養し、ここで 当該タンパク質はＡＱＳＬＳＦＳＦＴＫＦＤ（配列番号１）を含むアミノ酸配列 を有する分子量約１２−２０ｋＤのタンパク質、又はＶＶＡＶＥＦＤ（配列番号 ３）を含むアミノ酸配列を有する分子量約１５−２０ｋＤのタンパク質であり、 そして ｂ）血液細胞成分を産生するための前駆細胞を与えるために前駆細胞に富んだ培 養細胞を哺乳動物に注入する、ことを特徴とする方法。 ３８．組織サンプルが末梢血、臍帯血、胎盤血又は骨髄である請求項３７記載の 方法。 ３９．組織サンプルが哺乳動物への自己移植である請求項３８記載の方法。 ４０．組織サンプルが少なくとも実質的にストローマ細胞を含まないものである 請求項３７記載の方法。 ４１．注入に先立つ哺乳動物の造血組織の切除を更に含む請求項３７記載の方法 。 ４２．タンパク質により選択的に保存された前駆細胞へのトランスフェクション を含む体細胞に外来ＤＮＡ配列をトランスフェクトする方法であって、該タンパ ク質がＡＱＳＬＳＦＳＦＴＫＦＤ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有する分 子量約１２−２０ｋＤのタンパク質又はＶＶＡＶＥＦＤ（配列番号３）を含むア ミノ酸配列を有する分子量約１５−２０ｋＤであることを特徴とする方法。 ４３．生体外で前駆細胞の生存能力を維持するための組成物であって、細胞成長 培地及び前駆細胞を保存するタンパク質を含み、タンパク質がＡＱＳＬＳＦＳＦ ＴＫＦＤ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有する分子量約１２−２０ｋＤの タンパク質又はＶＶＡＶＥＦＤ（配列番号３）を含むアミノ酸配列を有する分子 量約１５−２０ｋＤのタンパク質であることを特徴とする組成物。 ４４．哺乳動物中において前駆細胞を保存する方法であって、 ａ）哺乳動物に前駆細胞を特異的に保存するタンパク質を、哺乳動物の前駆細胞 が実質的に未増殖の状態で保存されるのに十分な量投与し、ここで当該タンパク が実質的に未増殖の状態で保存されるのに十分な量投与し、ここで当該タンパク 質はＡＱＳＬＳＦＳＦＴＫＦＤ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有する分子 量約１２−２０ｋＤのタンパク質又はＶＶＡＶＥＦＤ（配列番号３）を含むアミ ノ酸配列を有する分子量約１５−２０ｋＤのタンパク質であって、 ｂ）哺乳動物を、増殖骨髄細胞が除去され非増殖前駆細胞が残存するのに十分効 果的な程度に骨髄切除状態に曝露し、そして ｃ）曝露に続き保存された前駆細胞の増殖又は分化を再樹立することを特徴とす る方法。 ４５．再樹立が前駆細胞の生存能力を高めるのに十分な量のサイトカインを前記 哺乳動物へ投与することを含む請求項４４記載の方法。 ４６．前記生存能力を高めるサイトカインがＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｉ Ｌ−１１、ＫＬ又はそれらの組み合わせである請求項４５記載の方法。 ４７．前記再樹立が増殖を刺激する量のｆｌｋ２リガンドを前記哺乳動物に投与 することである請求項４４記載の方法。