JP2001502530A - 新規ＳｐｓＢ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ｓｐｓＢポリペプチドおよびかかるｓｐｓＢをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）ならびに組み換え法によるかかるポリペプチドの製造方法を開示する。感染、詳細には細菌感染の治療のためのかかるｓｐｓＢの使用方法も開示する。かかるｓｐｓＢに対するアンタゴニストおよび感染、詳細には細菌感染を治療するための治療薬としてのそれらの使用も開示する。宿主におけるｓｐｓＢ核酸配列およびポリペプチドの存在に関連した疾病の検出のための診断アッセイも開示する。宿主におけるｓｐｓＢをコードするボリヌクレオチドの検出およびそのポリペプチドの検出のための診断アッセイも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 新規ＳｐｓＢ 関連出願 本発明は、１９９６年９月３０日出願の米国特許出願第６０／０２７２１８号 、１９９６年１０月１日出願の米国特許出願第６０／０２７２２０号、および１ ９９６年９月３０日出願の米国特許出願第６０／０２７０７５号の利益を主張す る。 発明の分野 本発明は、一つには、新たに同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド 、ならびにそれらの製造および使用、ならびにそれらの変種、アゴニストおよび アンタゴニスト、そしてそれらの使用に関する。詳細には、これらの点および他 の点に関して、本発明は、ｓｐｓＢのポリヌクレオチドおよびポリペプチド（以 下、ＳｐｓＢという）に関する。 発明の背景 合成部位から１またはそれ以上の膜を越えてトランスロケーションされる大部 分の蛋白は、まず、シグナルまたはリーダーペプチドとして知られるＮ−末端伸 長部分から合成される(Wickner，W.，et al.，(1991)Ann．Rev．Biochem．60:10 1-124)。成熟蛋白を生じるシグナル配列の蛋白分解的開裂は、トランスロケーシ ョン中またはそのすぐ後に起こり、原核生物および真核生物の両方において該開 裂はシグナルまたはリーダーペプチダーゼ（ＳＰａｓｅ）として知られる酵素に より触媒される。細菌ＳＰａｓｅは、１つ（グラム陽性（Ｇ⁺）およびグラム陰 性（Ｇ^-）細菌）または２つ（Ｇ^-細菌）の膜貫通セクションにより固定された１ 本のポリペプチドからなる膜蛋白である。細菌ＳＰａｓｅの推定アミノ酸配列は 高レベルの類似性を示し、エシェリシア・コリ（Escherichia coli）（Wolfe，P ． B.，et al.，(1983)J．Biol．Chem．258:12073-12080）、シュードモナス・フル オレッセンス(Pseudomonas fluorescens)(Black，M．T.，et al.，(1992)Bioche m．J．282:539-543)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)（ van Diji，J．M.，et al,．(1990)Mol．Gen．Genet．223:233-240）、ヘモフィ ルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)(Fleischmann，R．D.，et al .，(1995)．Science 269：496-512)、フォルミジウム・ラミノスム（Phormidium laminosum）（Packer，J．C.，et al.，(1995)．Plant．Mol．Biol．27:199-20 4;K．Cregg，et al:Signal peptidase from Staphylococcus aureus Manuscript JB765-96）、ブラジリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobium japonicum） （Muller，P.，et al.，(1995)．Mol．Microbiol．18:831-840）、ロドバクター ・カプスラツス(Rhodobacter capsulatus)(Klug，G.，et al.，(1996)．GenBank 受託番号268305)、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）（２種の染色体 起源および２種のプラスミド起源のもの）（Akagawa，et al.，(1995)Microbiol ．141:3241-3245;Meljer，W．J．J.，et al.，(1995)．Mol．Microbiol．17:621 -631;van Diji，J．M.，et al.，(1992)．EMBO J．II:2819-2828）、バツルス・ リシェニフォルミス（Bacillus licheniformis）（Hoang，V.，et al.，(1993) ．embl/genbank/ddbjデータバンクに提出された配列P42668）、バチルス・カル ドチリクス（Bacillus caldtyricus）（van Diji，J．M．(1993)．embl/genbank /ddbjデータバンクに提出された配列p41027）、バチルス・アミロリクイファシ エンス(Bacillus amyloliquifaciens)(２種の染色体遺伝子)(Hoang，V．and J． Hofmeister．(1995)．Biochem．Biophys．Acta 1269:64-68;van Diji，J．M．(1 993)．emb/genbank/ddbjデータバンクに提出された配列P41026)のものが知られ おり、部分配列はバチルス・プミリス（Bacillus pumilis）に関して報告されて いる（Hoang，V．and Hofmaister．(1995)Biochem．Biophys．Acta 1269：64-68 ）。これらの酵素はまとめて１型シグナルペプチダーゼと定義されている（van Diji，J．M.，et al.，(1992)．EMBO J．II:2819-2828）。１５種の細菌ＳＰａ ｓｅのアミノ酸配列（および１６番目のものとして部分配列）が現在報告されて いるが、最もよく研究された例はイー・コリ（E．coli）由来のリーダーペプチ ダーゼ（ＬＰａｓｅまたは ＬｅｐＢ）およびビー・ズブチリス（B．subtilis）由来のＳＰａｓｅ（Ｓｉｐ Ｓ）である。 ＬＰａｓｅ活性はイー・コリにおける細胞増殖に必須であることが示されてい る。制御可能なａｒａプロモーター(Dalbey，R．E．and Wickner．260:15925-15 931)により、あるいは本来のプロモーターを部分的に欠失させること(Date，T． (1983)．J．Bacteriol．154:76-83)のいずいれかにより、ＬＰａｓｅをコードす るｌｅｐＢ遺伝子の発現を調節する実験により、ＬＰａｓｅ産生の最小化が細胞 増殖および分裂の停止に関連していることがわかった。さらに、変異したｌｅｐ Ｂ遺伝子を有するイー・コリ株（イー・コリＩＴ４１）は、増殖培地の温度を４ ２℃に上昇させた場合、劇的に増殖を減じ、急激かつ明白なプレ蛋白の蓄積を示 すことが示された(Inada，T.，et al.，(1988).J.Bacteriol.171:585-587)。こ れらの結果から、イー・コリにおいてはＬＰａｓｅに代わる遺伝子産物は他にな く、ｌｅｐＢはイー・コリ染色体において単一コピーの遺伝子であることが推論 される。このことは、少なくともＧ⁺バチルス属であるビー・ズブチリスおよび ビー・アミロリクイファシエンスに含まれる種とは対照的である。これらのバチ ルス種のそれぞれには少なくとも２種の相同的ＳＰａｓｅ遺伝子が存在すること が知られている。研究室条件下で細胞増殖速度または生存率に影響を与えること なくビー・ズブチリス１６８の染色体からｓｉｐＳ遺伝子を欠失させて、プレａ −アミラーゼをやはり産生しうる変異株を得ることができる（K．M．Cregg and M．T．Black，未公表）。推定ＳＰａｓｅ配列（Akagawa，et al，(1995)Microbi ol．141:3241-3245）はこの活性の原因となる遺伝子産物であるかもしれず、そ して／あるいはビー・ズブチリスは２種よりも多いＳＰａｓｅ遺伝子を有してい るかもしれない。異なるＳＰａｓｅ相同体をコードする２種またはそれ以上の遺 伝子は、密接に関連しているビー・アミロリクイファシエンス種の染色体上に存 在しており（Hoang，V．and J．Hofmaister．(1995)Biochem．Biophys．Acta 12 69:64-68）、ビー・ジャポニクムが１種よりも多いＳＰａｓｅを有している可能 性を示唆する証拠が存在する（Muller，P.，et al，(1995)．Mol．Microbiol．1 8:831-840;Muller，P.，et al，(1995)．Planta 197:163-175）。７つの属のＧ⁺ 細菌由来のＳＳＰａｓｅ配列が現在知られているが、Ｇ⁺真正細菌のなかではバ チルス属のもののみＳＰａｓｅの特性について調べられている。それゆえ、ビー ・ズブチリスやビー・アミロリクイファシエンスとは違って、例外的な分泌活性 について知られていないＧ⁺真正細菌が基質特異性の重複した１種よりも多いＳ Ｐａｓｅをコードする遺伝子を有するかどうか、あるいは単一のＳＰａｓｅ遺伝 子を有するという点においてより密接に関連しているイー・コリやエイチ・イン フルエンザエ（およびおそらく他のＧ^-真正細菌）と類似して要るかどうかを調 べることは興味深いと思われる。また、絶対Ｇ⁺様細胞内細菌ミコプラズマ・ゲ ニタリウム（Mycoplasma genitalium）の全ゲノム配列の最近の公表によって、 ＳＰａｓｅ間の異種性に関する興味深い特徴が明らかとなっている(Fraser，C． M.，et al，(1995)．Science 270:397-403)。イー・コリＬＰａｓｅの阻害剤が 報告されている(Allsop，A．E.，et al，1995．Bioeng．& Med．Chem．Letts．5 :443-448)。 ＬＰａｓｅが、ヒスタミンを触媒塩基として使用しない新たなクラスのセリン プロテアーゼに属することを示唆する証拠が増加しているが(Black，M．T.，et al，(1992)．Biochem．J．282:539-543;Sung，M．and R．E．Dalbey．(1992)．J ．Biol．Chem．267:13154-13159)、そのかわり、この役割を遂行するためにリジ ン側鎖を用いる可能性があることも示唆されている(Black，M．T．(1993)．J．B acteriol．175:4957-4961;Tschantz，W．R.，et al，(1993)J．Biol．Chem．268 :27349-27354)。これらの観察結果およびイー・コリ由来のＬｅｘとの比較によ り、ＬｅｘＡにより触媒されるペプチド結合加水分解中に作動すると考えられる もの(Slilaty，S．N．and J．Little．(1987)．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84 :3987-3991)と同様のセリン−リジン触媒ダイアッドがLPaseにおいて作動してい るかもしれないという提案を導いた(Black，M．T．(1993)．J．Bacteriol．175: 4957-4961)。ビー・ズブチリス由来のＳＰａｓe(van Diji，J．M.，et al，(1995 )．J．Biol．Chem．270:3611-3618)およびイー・コリ由来のＴｓｐペリプラスム プロテアーゼ（Keiler，K．C．and R．T．Sauer．(1995)．Biol．Chem．270:288 64-28868）に関して同様の観察結果がかつてあった。ＬｅｘＡに対するＳｉｐＳ の類似性が、１次構造のいくつかの領域について示唆されている(van Diji， J．M.，et al，(1995)．J．Biol．Chem．270:3611-3618)。イー・コリＬＰａｓ ｅ（Black，M．T．(1993)．J．Bacteriol．175:4957-4961;Tschantz，W．R.，et al，(1993)J．Biol．Chem．268:27349-27354）およびビー・ズブチリスＳＰａ ｓｅ（van Diji，J．M.，et al，(1995)．J．Biol．Chem．270:3611-3618）の両 方において触媒活性にとり重要であることが知られており、触媒ダイアッドを形 成すると考えられるセリンおよびリジン残基（イー・コリＬＰａｓｅの番号では ９０および１４５番）は、いずれもエス・アウレウス（S．aureus）蛋白Ｓｐｓ Ｂにおいて保存されている（Ｓ３６およびＫ７７）。さらに、位置１５５のアス パラギン酸（イー・コリＬＰａｓｅでは２８０番）も保存されている（この残基 はＳｉｐＳ ＳＰａｓｅの活性に重要であると思われているが(van Diji，J．M. ，et al，(1995)．J．Biol．Chem．270:3611-3618)、イー・コリ由来のＬＰａｓ ｅについてはさほど重要とは思われていない(Sung，M．and R．E．Dalbey．(199 2)．J．Biol．Chem 267:13154-13159)）。本発明は、とりわけ、エス・アウレウ ス由来のこの新規ＳＰａｓｅ（ｓｐｓＢ）を提供する。 明らかに、抗生物質活性に関して化合物をスクリーニングするのに使用でき、 感染、機能不全および疾病の発生におけるそれらの役割を調べるのにも有用であ る因子に対する必要性がある。感染、機能不全または疾病の予防、改善または修 正において役割を果たしうるかかる因子に対する必要性もある。 本発明ポリペプチドは、既知のセリンプロテアーゼに対するアミノ酸配列相同 性を有する。 発明の概要 これらの目的および他の目的のために、図２に示すアミノ酸配列およびバチル ス・ズブチリスのｓｉｐＳのごとき他の蛋白の既知アミノ酸配列との間の相同性 により、とりわけ新規ｓｐｓＢであると同定されたポリペプチド提供することが 本発明の目的である。 ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、詳細には本明細書でｓｐｓ Ｂと命名されたポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを提供すること が本発明のさらなる目的である。 本発明の特に好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは、図１(配列番号 ：１)に示す配列中のｓｐｓＢをコードする領域を含むポリヌクレオチド、また はそのフラグメント、アナログもしくは誘導体がある。 本発明のもう１つの特に好ましい具体例において、表２（配列番号：２）のア ミノ酸配列を含むスタフィロコッカス・アウレウス由来の新規セリンプロテアー ゼ、またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体がある。 本発明のもう１つの態様によれば、ＮＣＩＭＢ寄託番号４０７７１に含まれる スタフィロコッカス・アウレウス細菌により発現可能な成熟ポリペプチドをコー ドしている単離核酸分子が提供される。 本発明のさらなる態様は、ｓｐｓＢ、詳細にはスタフィロコッカス・アウレウ スのｓｐｓＢをコードしている単離核酸分子が提供され、それにはｍＲＮＡ、ｃ ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡが包含される。本発明のさらなる具体例において、生物学 的、診断学的、予防的、臨床的もしくは治療的に有用なその変種、アナログもし くは誘導体、またはそのフラグメント、さらには変種、アナログおよび誘導体の フラグメント、ならびにそれらを含む組成物がある。 本発明のもう１つの態様によれば、治療または予防を目的とした、特に遺伝学 的免疫を目的とした、本発明ポリヌクレオチドの使用が提供される。 本発明の特に好ましい具体例には、ｓｐｓＢの天然の対立遺伝子変種およびそ れによりコードされるポリペプチドがある。 本発明のもう１つの態様において、本明細書においてｓｐｓＢと称されるスタ フィロコッカス・アウレウスの新規ポリペプチド、ならびに生物学的、診断学的 、予防的、臨床的もしくは治療的に有用なそのフラグメント、変種および誘導体 、ならびにフラグメントの変種および誘導体、ならびに上記のもののアナログ、 ならびにそれらを含む組成物が提供される。 本発明の特に好ましい具体例には、ｓｐｓＢ遺伝子の天然の対立遺伝子により コードされるｓｐｓＢポリペプチドの変種がある。 本発明のこの態様の好ましい具体例において、上記ｓｐｓＢポリペプチドの製 造方法がある。 本発明のさらに別の態様によれば、例えば、抗体を含め、抗細菌剤として有用 なかかるポリペプチドの阻害剤が提供される。 本発明の特定の好ましい具体例によれば、ｓｐｓＢ発現の評価、疾病の治療、 例えば上気道感染（例えば、中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎） 、下気道感染（例えば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓感染（例えば、感染性心内膜炎 ）、胃腸感染（例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（例 えば、大脳膿瘍）、眼感染（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔 および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎）、腎および尿管感染（例えば、副睾丸炎、腎内およ び腎周囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚感染（例えば、膿痂疹、毛嚢 炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）、ならびに骨および関節感染（ 例えば、敗血症性関節炎、骨髄炎）のごとき疾病の治療、遺伝学的変異のアッセ イ、ならびに細菌、特にスタフィロコッカス・アウレウス細菌に対する免疫学的 応答を生起するための生物へのｓｐｓＢポリペプチドまたはポリヌクレオチドの 投与のための、製品、組成物および方法が提供される。 本発明のこのおよび他の態様の特定の好ましい具体例によれば、特に、厳密な 条件下でｓｐｓＢポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするポリヌク レオチドが提供される。 本発明の特定の好ましい具体例において、ｓｐｓＢポリペプチドに対する抗体 が提供される。 本発明のさらにもう１つの態様によれば、好ましくは静細菌性または殺細菌性 のｓｐｓＢアンタゴニストが提供される。 本発明のさらなる態様において、単細胞または多細胞生物に投与するための、 ｓｐｓＢポリヌクレオチドまたはｓｐｓＢポリペプチドを含む組成物が提供され る。 開示した本発明の精神および範囲内での種々の変更および修飾は、以下の記載 を読むこと、および本明細書のその他の部分を読むことにより、当業者に容易に 明らかとなろう。 図面の簡単な説明 以下の図面は本発明の特定の具体例を示すものである。それらは説明のみを目 的とし、本明細書開示の本発明を限定するものではない。 図１は、スタフィロコッカス・アウレウスのｓｐｓＢのポリヌクレオチド配列 を示す［配列番号：１］。 図２は、図１のポリヌクレオチド配列から推定されるスタフィロコッカス・ア ウレウスのｓｐｓＢのアミノ酸配列を示す［配列番号：２］。 図３は、スタフィロコッカス・アウレウスのｓｐｓＡおよびｓｐｓＢのポリヌ クレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す［配列番号：３］。 用語 以下の説明は、本明細書、とりわけ実施例において汎用される特定の用語の理 解を容易にするために示すものである。 本明細書で用いるｓｐｓＢ−結合分子は、例えば酵素基質、細胞膜成分および 古典的なレセプターを含め、本発明のｓｐｓＢポリペプチドまたはポリヌクレオ チドと特異的に結合または相互作用する分子またはイオンをいう。本発明のポリ ペプチドと、結合または相互作用分子を含め、そのような分子間の結合は、本発 明のポリペプチドに対して独占的であることが好ましく、またはその結合は本発 明のポリペプチドに高度に特異的であることもまた好ましく、またはその結合は 本発明のポリペプチドを包含する蛋白群に高度に特異的であることも好ましく、 または本発明のポリペプチドを含む、少なくともその一つが数種の蛋白に特異的 であってもよい。結合分子はまた、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗 体および抗体由来の物質をも包含する。 「遺伝学的エレメント」は、一般に、ポリペプチドをコードする領域、もしく は複製、転写もしくは翻訳、もしくは宿主細胞においてポリペプチドを発現する のに重要なその他の過程を制御するポリヌクレオチド領域を含むポリヌクレオチ ド、またはポリペプチドをコードする領域およびそれらに機能的に連結した発現 を制御する領域の両方を含むポリヌクレオチドを意味する。遺伝学的エレメント は、エピソームエレメント、すなわち、宿主細胞ゲノムと物理的に独立した分子 として、複製するベクター内に含まれていてもよい。該エレメントはプラスミド 内に含まれていてもよい。遺伝学的エレメントはまた、自然の状態ではなく、む しろ単離、クローニングおよび宿主細胞への導入のような操作の後に、精製ＤＮ Ａの形態で宿主細胞ゲノム内またはとりわけベクター内にも含まれていてもよい 。 「宿主細胞」は外来性ポリヌクレオチド配列により形質転換もしくはトランス フェクションされた、または形質転換またはトランスフェクションすることので きる細胞である。 当該分野にて周知であるように「同一性」または「類似性」は、場合によって は、配列を比較して測定されるような、二つまたはそれ以上のポリペプチド配列 間または二つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該分野 において、「同一性」とはまた、時には、かかる配列の２つの鎖の間の合致によ り決定されるような２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の関連性 の程度をも意味する。「同一性」および「類似性」は共に容易に算出できる（Co mputational Molecular Biology,Lesk,A.M.編、オックスフォード・ユニバーシ ティー・プレス、ニューヨーク、1988年;Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、1993年;Comput er Analysis of Sequence Data,パートI,Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、 ヒューマナ・プレス、ニュージャージー、1994年；Sequence Analysis in Molec ular Biology,von Heinje,G.、アカデミック・プレス、1987年;およびSequence Analysis Primer,Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍストックトン・プレス、 ニューヨーク、1991年）。２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド間 の同一性および類似性を測定するための多くの方法がある一方で、その両方の用 語は当業者に周知である(Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje ，G.，Academic Press,1987;Squence Analysis Primer，Gribskov，M.およびDev ereux，J.,編、M Stockton Press，New York,1991;およびCarillo，H.,およびLi pman，D.，SIAM J.，Applied Math.，48:1073(1988))。２つの配列間で同一性または類似性を測 定するのに通常用いられる方法は、Carillo，H.およびLipman，D.，SIAM J.Appl ied Math.，48:1073(1988)に開示されている方法を包含するが、これらに限定さ れるものではない。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する２つの配 列間で最も良く適合するように設計される。同一性および類似性を測定する方法 は、コンピュータープログラムに集成されている。二つの配列間の同一性および 類似性を測定する好ましいコンピュータープログラム法は、ＧＣＧプログラムパ ッケージ（Devereux，J．ら、Nucleic Acids Research 12(1)：387（1984）、BL ASTP、BLASTNおよびFASTA（Atschul，S．F．ら、J．Molec．Biol．215:403（199 0）））を包含するが、これらに限定されるものではない。 「単離」とは、「人工的に」天然の状態から変化させられた、すなわち、天然 物の場合、その本来の環境から変化または除去あるいはその両方が行われたこと を意味する。例えば、生体に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチ ドは、「単離」されていないが、その天然状態で共存する物質から分離された同 じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書に用いる用語としての「単 離」がなされている。例えば、ポリヌクレオチドに関して、「単離」なる用語は 、天然の染色体および細胞から分離されていることを意味する。単離の一部とし て、または単離の後に、かかるポリヌクレオチドは、例えば、突然変異誘発のた めに、ＤＮＡなどの他のポリヌクレオチドに結合し、宿主における伸長および発 現のために、融合蛋白を形成したりすることができる。単離ポリヌクレオチドは 単独で、またはベクターなどの他のポリヌクレオチドと結合して、培養物中また は全生物中の宿主細胞に導入できる。培養物中または全生物中の宿主細胞に導入 されたかかるＤＮＡも本明細書に用いる用語である、「単離」されたといえる。 というのはこれらは天然の形態または環境にはないからである。同様に、ポリヌ クレオチドおよびポリペプチドは、組成物、例えば、培地処方、例えば細胞にポ リヌクレオチドまたはポリペプチドを導入するための溶液、化学的または酵素的 反応のための組成物または溶液中に生じさせてもよく、これらは自然には存在し ない組成物であり、本明細書に用いる用語の「単離」されたポリヌクレオチドま たはポリ ペプチドの範囲内である。 「ポリヌクレオチド（複数でも可）」は、一般に、修飾されていないＲＮＡも しくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、いずれの ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをも意味する。従っ て、例えば、本明細書で用いるポリヌクレオチドは、とりわけ一本鎖および二本 鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物または一本鎖、二本鎖および三本鎖 領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および 二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖もしく は三本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡおよび ＲＮＡを含むハイブリッド分子を意味する。加えて、本明細書で用いるポリヌク レオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領 域を意味する。かかる領域における鎖は同一の分子または異なる分子由来のもの でよい。この領域はこれらの分子の一つまたはそれ以上の全てを含んでいてもよ いが、より典型的にはいくつかの分子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分 子の一つは、オリゴヌクレオチドであることがしばしばである。本明細書で用い る場合、「ポリヌクレオチド」なる用語は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基 を含有する、前記したＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。このように、安定性また は他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも、該用語を本明細書 が意図するろところの「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシン等の普通 でない塩基、またはトリチル化塩基等の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ（二 つの例だけを示す）も、かかる用語を本明細書で用いる場合の「ポリヌクレオチ ド」である。当業者に既知の多くの有用な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡに 、非常に多くの修飾がなされていることは、明らかであろう。「ポリヌクレオチ ド」なる用語は、本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチドのこのような化学的 、酵素的または代謝的に修飾した形態、ならびにウイルス、とりわけ単純型細胞 および複雑型細胞を含む、細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包 含する。ポリペプチドは、しばしば、オリゴヌクレオチド（複数でも可）と称さ れる短鎖ポリヌクレオチドを包含する。 本明細書で用いる「ポリペプチド」は、以下に記載する全てのポリペプチドを 包含する。ポリペプチドの基本的な構造は周知であり、非常に多くのテキストお よび当該分野の他の発行物に記載されている。これに関連して、この用語は、本 明細書において、ペプチド結合により直鎖で互いに結合している２個またはそれ 以上のアミノ酸を含むいずれかのペプチドまたは蛋白をいうのに用いる。本明細 書で用いる場合、この用語は、当該分野で通常例えばペプチド、オリゴペプチド およびオリゴマーとも称される短鎖、および多くの型があり、当該分野で一般的 に蛋白と称する長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは、しばしば、一般に２０ 種の天然アミノ酸と称される２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含有し、末端ア ミノ酸を含め、多くのアミノ酸は、プロセッシングおよび他の翻訳後修飾のよう な自然の工程により所定のポリペプチドで修飾されたものが含まれるが、当業者 に周知の化学的修飾技術によっても修飾できることは理解されよう。ポリペプチ ドに自然に起こる一般的な修飾でさえ余り多すぎて、余すところなく掲示するこ とはできないが、基礎的なテキストおよびさらに詳細な論文ならびに多数の研究 文献にも詳しく記載されており、これらは当業者に周知である。本発明のポリペ プチドに施すことができる既知の修飾には、例を挙げると、アセチル化、アシル 化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合 、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の 共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィ ド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋形成、シスチン形成、ピログルタミン酸 塩形成、ホルミル化、ガンマー−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカー形 成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白加水分 解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、 アルギニル化などの転移ＲＮＡ媒介の蛋白へのアミノ酸付加、およびユビキチネ ーションがある。かかる修飾は当業者に周知であり、科学文献に非常に詳細に記 載されている。いくつかの特に一般的な修飾、例えば糖鎖形成、脂質結合、硫酸 化、グルタミン酸残基のガンマーカルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ リボシル化は最も基礎的なテキスト、例えばProteins-Structure and Molecular Properties、第２版、T．E．Creighton、W．H．Freeman and Company、ニューヨ ーク(1993)に記載されている。例えば、Posttranslational Covalent Modificat ion of Proteins、B．C．Johnson編、アカデミック・プレス、ニューヨーク（19 83）のWold，F.，Posttranslational Protein Modifications：Perspective and Prospects、1〜12頁；Seifterら、Meth．Enzymol．182:626-646（1990）および Rattanら、Protein Synthesis:Posttranslational Modifications and Aging，A nn．N．Y．Acad．Sci．663:48-62（1992）で提供される論文などの多くの詳細な 論文が、本主題に利用できる。ポリペプチドはいつも完全に直鎖であるとは限ら ないということは周知であり、前記した通りであると理解されよう。例えばポリ ペプチドはユビキチン化の結果分岐していてもよく、一般には、天然のプロセッ シング事象を含む翻訳後の事象、および天然では起こらない人為的操作によりも たらされる事象の結果、分岐のある、または分岐のない環状にできる。環状、分 岐および分岐した環状ポリペプチドは、非翻訳天然のプロセッシングにより、お よび同様に全く合成的な方法で合成できる。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖 およびアミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリペプチドのどこででも起こり 得る。実際、共有結合の修飾による、ポリペプチドのアミノまたはカルボキシル 基またはその両方の遮断は、天然および合成ポリペプチドに共通し、かかる修飾 は同様に本発明のポリペプチドにも存在し得る。例えば、イー・コリ（E.coli） または他の細胞で作られるポリペプチドのアミノ末端残基は、蛋白溶解のプロセ ッシングの前にほとんど必ずＮ−ホルミルメチオニンになるであろう。ペプチド の翻訳後の修飾の間に、ＮＨ₂末端においてメチオニン残基を除去できる。従っ て、本発明は、本発明蛋白のメチオニン含有およびメチオニン不含の両方のアミ ノ末端変種の使用を意図する。ポリペプチドに起こる修飾はしばしばそれの作り 方に影響される。例えば、宿主にクローン化遺伝子を発現することにより作られ るポリペプチドでは、修飾の特性および程度は、大部分、宿主細胞の翻訳後修飾 能力およびポリペプチドアミノ酸配列に存在する修飾シグナルにより決定される 。例えば、周知のように、糖鎖形成はイー・コリのような細菌宿主では起こらな いことがはしばしばである。従って、糖鎖形成が望ましい場合、ポリペプチドを 、糖 鎖形成宿主、一般に、真核細胞にて発現させるべきである。昆虫細胞は、しばし ば、哺乳動物細胞と同じ翻訳後糖鎖形成を行う；この理由で昆虫細胞発現系が、 とりわけ、糖鎖形成の本来のパターンを有する哺乳動物蛋白を効率よく発現する ように開発されている。同様の考察が他の修飾にも適用される。修飾の同一の型 が、所定のポリペプチドのいくつかの部位で、同じまたは異なる程度で存在し得 ることは理解されよう。また、所定のポリペプチドは多くの型の修飾を有してい てもよい。一般に、本明細書で用いる場合、「ポリペプチド」なる用語は、全て のこのような修飾、特に宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現することによ り合成したポリペプチドに存在する修飾を包含する。 本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「変種(複数 でも可)」なる用語は、対照標準のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは各 々異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。この意味の変種は、本明 細書の以下およびその他の部分でより詳細に記載する。（１）ヌクレオチド配列 にて他の対照標準のポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチド。一般に、違い は対照標準と変種のヌクレオチド配列が、全体的に非常に類似しており、多くの 領域で同一であるものに限られる。以下に記すように、変種におけるヌクレオチ ドの配列の変化はサイレントであってもよい。すなわち、その変化がポリヌクレ オチドによりコードされるアミノ酸を変えなくてもよい。変化がこの型のサイレ ント変化に限定される場合、変種は、対照標準と同一のアミノ酸配列を有するポ リペプチドをコードする。また以下に記すように、変種のヌクレオチド配列にお ける変化が、対照標準のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのア ミノ酸配列を変化させてもよい。このようなヌクレオチドの変化は、以下に論じ るように、対照標準配列によりコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換 、付加、欠失、融合および切断をもたらす。（２）アミノ酸配列にて他の対照標 準のポリペプチドと異なるポリペプチド。一般に、違いは対照標準と変種の配列 が全体的に非常に類似しており、多くの領域で同一であるものに限られる。変種 および対照標準のポリペプチドは、１またはそれ以上の置換、付加、欠失、融合 および切断（いずれかの組み合わせで生じていてもよい）により、アミノ酸配列 に て異なっていてもよい。 発明の詳細な説明 本発明は、とりわけ、以下により詳細に記載する、新規ｓｐｓＢポリペプチド およびそれをコードするポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、バチルス ・ズブチリスのｓｉｐＳポリペプチドに対するアミノ酸配列相同性により関連付 けられる、スタフィロコッカス・アウレウスの新規ｓｐｓＢ遺伝子のポリペプチ ドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、それぞれ図１および図２ に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するｓｐｓＢ、ならびに本明細書に おいて「寄託クローン」または「寄託クローンのＤＮＡ」と称するＮＣＩＭＢ受 託番号４０７７１中のＤＮＡのｓｐｓＢヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関す る。図１（配列番号１）および図２（配列番号２）に示すヌクレオチドおよびア ミノ酸配列は寄託クローンのＤＮＡを配列決定することにより得られたことが理 解されよう。従って、寄託菌の配列は、その配列（およびそれをコードする配列 ）と図１（配列番号１）および図２（配列番号２）の配列の間のいずれの不一致 についても支配的である。 ポリヌクレオチド 本発明の別の態様は単離ポリヌクレオチドに関するものであり、それには図２ （配列番号：２）の推定アミノ酸配列を有するｓｐｓＢポリペプチドをコードす る全長遺伝子およびそれに密接に関連するポリヌクレオチドおよびそれらの変種 が包含される。 本明細書に提供される情報を用いて、例えば図１（配列番号：１）に示すポリ ヌクレオチド配列を用い、出発物質スタフィロコッカス・アウレウスWCUH29細胞 からの染色体ＤＮＡフラグメントをクローニングおよび配列決定するために用い るような標準的なクローニングおよびスクリーニングを用いて、ｓｐｓＢポリペ プチドをコードしている本発明ポリヌクレオチドを得て、次いで、全長のクロー ンを得てもよい。例えば、本発明ポリヌクレオチド配列、例えば図１（配列番号 ： １）に示す配列を得るために、イー・コリ（E.coli）またはいくつかの他の適切 な宿主におけるスタフィロコッカス・アウレウスWCUH29の染色体ＤＮＡのクロー ンの典型的なライブラリーを、部分的配列に由来する、好ましくは１７量体また はそれ以上の長さの放射性標識化オリゴヌクレオチドにてプローブする。プロー ブのＤＮＡに同一であるＤＮＡを担持するクローンは厳密な条件を用いて区別で きる。元の配列から設計した配列決定プライマーを用いてこのように同定した個 々のクローンを配列決定することにより、両方向で配列が伸長できるようになり 、全遺伝子配列を決定できる。このような配列決定は便宜的にプラスミドクロー ンから調製した変性二本鎖ＤＮＡを用いて実施する。適切な技法については、Ma niatis,T.、Fitsch,F.F.およびSambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory M anual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コ ールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク(1989)に記載されている(Screeni ng By Hybridization 1.90およびSequencing Denatured Double-Stranded DNA T emplates 13.70参照)。本発明の典型例において、図１（配列番号：１）に示す ポリヌクレオチドが、スタフィロコッカス・アウレウスWCUH29由来のＤＮＡライ ブラリー中に見いだされた。 寄託クローンのｓｐｓＢをコードするＤＮＡの配列決定結果により示されるよ うに、本発明ｓｐｓＢは構造的に他のｓｐｓＢ蛋白に関連性がある。かくして得 られたＤＮＡ配列を図１（配列番号：１）に示す。それは、図２（配列番号：２ ）に示すアミノ酸残基数とほぼ同数のアミノ酸からなる蛋白をコードしている読 み枠を含んでおり、蛋白の推定分子量は、当該分野でよく知られたアミノ酸の分 子量を用いて算出できる。当該蛋白は、他の蛋白のなかでもバチルス・ズブチリ スのｓｉｐＳ蛋白に対して最大の相同性を示す。図２（配列番号：２）のｓｐｓ Ｂは、バチルス・ズブチリスのｓｉｐＳのアミノ酸配列に対する相同性を有する 。 本発明のポリヌクレオチドは、クローニングにより得るか、もしくは化学合成 技術により得るか、またはそれらを組み合わせて得た、ｍＲＮＡ等のＲＮＡの形 態、または例えばｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態であってもよ い。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖のいずれであってもよい。一本鎖ＤＮＡはセン ス鎖としても知られているコーディング鎖であってもよく、またはアンチャンス 鎖とも称される非コーディング鎖であってもよい。 ポリペプチドをコードするコーディング配列は、図１（配列番号１）に示すポ リヌクレオチドのコーディング配列と同一であってもよい。さらに、それは、遺 伝暗号の縮重の結果、図２（配列番号２）のポリペプチドをコードする異なる配 列を有するポリヌクレオチドであってもよい。 図２（配列番号２）のポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドは 、成熟ポリペプチドのコーディング配列自体；成熟ポリペプチドのコーディング 配列および付加コーディング配列、例えばプレ、プロ、プレプロ蛋白配列等のリ ーダーまたは分泌配列をコードするコーディング配列；付加非コーディング配列 と一緒に、前記した付加コーディング配列と共にまたはなしで、例えば、限定す るものではないが、転写にて役割を果たす転写された非翻訳配列（例えば、終止 シグナルを含む）などの非コーディング配列５’および３’配列、リボソーム結 合部位、ｍＲＮＡ安定性エレメント、付加機能を供給する配列などの付加アミノ 酸をコードする付加コーディング配列を有する成熟ポリペプチドのコーディング 配列を包含するが、これらに限定されるものではない。かくして、例えば、該ポ リペプチドは、融合ポリペプチドの精製を促す、ペプチドなどのマーカー配列に 融合していてもよい。本発明のこの態様のある具体例において、マーカー配列は ヘキサ−ヒスチジンペプチド、例えば、とりわけｐＱＥベクター（キアゲン・イ ンコーポレーティッド（Qiagen,Inc.）より得られるタグであり、多くが市販に より入手可能である。例えば、Gentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86:821-824( 1989)に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは融合蛋白の通常の精製法を提 供する。インフルエンザ・ヘマググルチニン・蛋白由来のエピトープに対応する 、ＨＡタグもまた融合蛋白の生成に使用でき、これについては例えばWilsonら、 Cell,37：767（1984）に記載されている。本発明のポリヌクレオチドはまた、構 造遺伝子およびその天然において関連している遺伝学的エレメントを含むポリヌ クレオチドを包含するが、これに限定されるものではない。 前記によれば、本明細書で用いる「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ ド」なる用語は、本発明のポリペプチド、特に細菌性、さらに詳細には、図２（ 配列番号２）に示すアミノ酸配列を有する、スタフィロコッカス・アウレウスの ｓｐｓＢポリペプチドをコードする配列を有するポリヌクレオチド包含する。こ の用語は、さらにコーディングおよび／または非コーディング配列を含有してい てもよい、付加領域と共に該ポリペプチドをコードする単一の連続領域または不 連続領域（例えば、組み込まれたファージもしくは挿入配列またはエディティン グ（editing）により分断される）を含む、ポリヌクレオチドを包含する。 本発明はさらに、図２（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプチ ドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、本明細書で前記したポ リヌクレオチドの変種に関する。ポリヌクレオチドの変種は、天然の対立遺伝子 変種などの天然の変種であってもよく、または自然に発生することが知られてい ない変種であってもよい。このようなポリヌクレオチドの非天然変種は、ポリヌ クレオチド、細胞または生物に適用される方法を含め、突然変異誘発技術により 作ることができる。 この点における変種には、ヌクレオチド置換、欠失または付加により前記のポ リヌクレオチドとは異なる変種がある。置換、欠失または付加は１またはそれ以 上のヌクレオチドに起こる。変種はコーディングもしくは非コーディング領域ま たはその両方において変化していてもよい。コーディング領域における変化が保 存的または非保存的アミノ酸置換、欠損または付加を生成するかもしれない。 この点に関する本発明の特に好ましい具体例には、図２（配列番号２）に示す ｓｐｓＢのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； それらの変種、アナログ、誘導体およびフラグメントならびに変種、アナログお よび誘導体のフラグメントがある。 この点において、さらに特に好ましくは、図２（配列番号２）のＳｐｓＢポリ ペプチドで、そのうち、数個、わずかな、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１ま たは０個のアミノ酸残基がいずれかの組み合わせで置換、欠失または付加されて いるアミノ酸配列を有する、ＳｐｓＢ変種、アナログ、誘導体およびフラグメン ト、ならびにそのフラグメントの変種、アナログおよび誘導体をコードするポリ ヌクレオチドである。中でもとりわけ好ましいものは、サイレント置換、付加お よび欠失であり、ＳｐｓＢの特性および活性を変えないものである。また、この 点に関してとりわけ好ましいものは、保存的置換である。最も好ましいものは、 置換されていない、図２（配列番号２）のアミノ酸配列を有するポリペプチドを コードするポリヌクレオチドである。 本発明のさらに好ましい態様は、図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列を有 するｓｐｓＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して全長にわたっ て少なくとも７０％同一のポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレオチドに 相補的なポリヌクレオチドである。また、寄託クローンのスタフィロコッカス・ アウレウスＤＮＡのＳｐｓＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対し て全長にわたって少なくとも８０％同一である領域を含むポリヌクレオチド、お よびそれらに相補的なポリヌクレオチドが最も好ましい。この点において、その 同じものに対して全長にわたって少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレ オチドがとりわけ好ましい。さらには、少なくとも９５％の同一性を有するもの の中でも少なくとも９７％であるのがより好ましく、その中でも少なくとも９８ ％および少なくとも９９％であるのが特に好ましく、さらに少なくとも９９％で あるのがより好ましい。 この点に関して好ましい具体例は、さらには、図１（配列番号１）のＤＮＡに よりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能または活性を 保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。 本発明はさらに本明細書で前記した配列にハイブリダイゼーションするポリヌ クレオチドに関する。この点において、本発明は、特に、厳密な条件下で本明細 書で前記したポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド に関する。本明細書で用いる「厳密な条件」なる用語は、ハイブリダイゼーショ ンが配列間で少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場 合にのみ起こることを意味する。 本発明のポリヌクレオチドアッセイについて本明細書でさらに説明するように 、例えば、前記したように本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよ び ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして用い、ＳｐｓＢをコード する完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し、ならびにＳｐｓＢ遺伝子に 対して高度な配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを 単離することができる。かかるプローブは、一般に、少なくとも１５塩基を含む 。好ましくは、かかるプローブは少なくとも３０塩基を含み、少なくとも５０塩 基を含んでいてもよい。特に好ましいプローブは少なくとも３０塩基を含み、５ ０以下の塩基を含む。 例えば、ｓｐｓＢ遺伝子のコーディング領域は、既知ＤＮＡ配列を用いてスク リーニングし、オリゴヌクレオチドプローブを合成することにより単離できる。 ついで、本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチド を用いて、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニ ングし、ライブラリーのどのメンバーがプローブとハイブリダイズするかを決定 する。 本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、さらにはポリヌクレオチド アッセイに関連して本明細書でさらに説明するように、疾患、特にヒト疾患の治 療法および診断法の発見のための研究試薬および材料として使用できる。 配列番号３および４を含め、配列番号１または２の配列より誘導される、オリ ゴヌクレオチドである本発明のポリヌクレオチドは、本明細書において同定され た配列、特にスタフィロコッカス・アウレウスの遺伝子が、全体としてまたは部 分的に、感染組織にて転写されるかどうかを決定するために、本明細書にて記載 した方法、好ましくはＰＣＲにて使用できる。かかる配列はまた、病原体が達成 した感染の段階および型の診断にも有用であると思われる。 ポリヌクレオチドは、成熟蛋白に、さらなるアミノもしくはカルボキシル末端 アミノ酸が加わるか、またはその内部にアミノ酸が加わった（例えば成熟形態が 一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）ポリペプチドをコードできる。かかる 配列は前駆体から成熟形態への蛋白のプロセッシングにおいて役割を有し、蛋白 を運び、蛋白の半減期を長くしたり短くしたり、またはとりわけアッセイもしく は製造のための蛋白の取り扱いを容易にすることができる。インビボで一般的な ように、付加アミノ酸は、細胞酵素により成熟蛋白からプロセッシングで取り除 かれる。 １またはそれ以上のプロ配列と融合したポリペプチドの成熟形態を有する前駆 体蛋白は、ポリペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除去されると 、このような不活性前駆体は一般に活性化される。プロ配列のいくつかまたは全 てを、活性化の前に除去してもよい。一般に、このような前駆体はプロ蛋白と称 される。 総じて、本発明のポリヌクレオチドは成熟蛋白、リーダー配列を加えた成熟蛋 白（プレ蛋白と称することもできる）、プレ蛋白のリーダー配列ではない１また はそれ以上のプロ配列を有する成熟蛋白の前駆体、またはリーダー配列および１ またはそれ以上のポリペプチドの活性および成熟形態を生じるプロセッシング工 程で除去されるプロ配列を有するプロ蛋白の前駆体であるプレプロ蛋白をコード していてもよい。 寄託物質 寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件 下で行われている。特許が発行されると何らの制限または条件もなく、最終的に は株は分譲される。寄託は当業者の便宜のためにのみ提供され、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ. １１２条のもとに要求されるような、寄託が実施可能要件であることを承認する ものではない。 スタフィロコッカス・アウレウス菌のＷＣＵＨ２９を含む寄託菌は、ナショナ ル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リ ミテッド(ＮＣＩＭＢ)、スコットランド、アバディーンＡＢ２ １ＲＹ、マーカ ー・ドライブ２３ストリートに１９９５年９月１１日に寄託され、ＮＣＩＭＢ受 託番号４０７７１を付された。そのスタフィロコッカス・アウレウス細菌クロー ン寄託菌を、以下、「寄託クローン」または「寄託クローンのＤＮＡ」と称する 。 寄託材料は、寄託により「ＮＣＩＭＢ４０７７１」と称される。 寄託材料に含まれるｓｐｓＢポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコ ー ドされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の配列の記載と矛盾する事象 において支配的である。 寄託材料を製造、使用または販売するためにはライセンスが必要であるが、そ のようなライセンスはここで付与されるものではない。 ポリペプチド さらに本発明は、図２（配列番号：２）に示す、長さ１５１アミノ酸の推定ア ミノ酸配列を有し、推定分子量２１.６９２キロダルトンを有するｓｐｓＢポリ ペプチドに関する。 本発明はまたこれらのポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に も関する。「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」なる用語は、図２ （配列番号２）のポリペプチドをいう場合、かかるポリペプチドと本質的に同一 の生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。従って、アナロ グは、プロ蛋白部分を切断して活性成熟ポリペプチドを生成して活性化できるプ ロ蛋白を包含する。 図２（配列番号２）のポリペプチドのフラグメント、誘導体もしくはアナログ は、（ｉ）１またはそれ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残 基（好ましくは保存的アミノ酸残基）により置換されたもので、かかる置換アミ ノ酸残基は遺伝暗号によりコードされたものであってもなくてもよい、または（ ｉｉ）１またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ） 成熟ポリペプチドが別の化合物、例えばポリペプチドの半減期を長くする化合物 （例えばポリエチレングリコール）と融合したもの、または（ｉｖ）付加アミノ 酸がリーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドもしくはプロ蛋白配列 の精製に用いられる配列などの成熟ポリペプチドと融合したものであってもよい 。かかるフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書の教示より当業者に 明らかであると考えられる。 この点において、本発明の特に好ましい具体例には、図２（配列番号２）のｓ ｐｓＢのアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変種、アナログ、誘導体お よびフラグメント、およびそのフラグメントの変種、アナログおよび誘導体があ る。また、この点において、本発明の特に好ましい具体例は、ＳｐｓＢのアミノ 酸配列を有するポリペプチド、その変種、アナログ、誘導体およびフラグメント 、およびそのフラグメントの変種、アナログおよび誘導体である。 好ましい変種には、保存的アミノ酸置換により対照標準と異なる変種がある。 かかる置換は、ポリペプチドの所定のアミノ酸を特性の類似した別のアミノ酸で 置換したものである。典型的には、保存的置換として認められるのは、脂肪族ア ミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間での相互の置換；ヒドロキシル残 基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基 ＡｓｎおよびＧｌｎ間での置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換および芳 香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ間での置換である。 この点においてさらに好ましいのは、数個、わずかな、５〜１０、１〜５、１ 〜３、２、１または０個のアミノ酸残基をいずれか組み合わせて置換、欠失また は付加した、図２（配列番号２）のＳｐｓＢポリペプチドのアミノ酸配列を有す る、変種、アナログ、誘導体およびフラグメント、ならびにそのフラグメントの 変種、アナログおよび誘導体である。これらの中でもとりわけ好ましいのは、Ｓ ｐｓＢの特性および活性を変化させないサイレント置換、付加および欠失である 。またこの点において特に好ましいのは、保存的置換である。最も好ましいのは 、置換していない図２（配列番号２）のアミノ酸配列を有するポリペプチドであ る。 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは単離形態で提供されるのが好 ましく、均質になるまで精製するのが好ましい。 本発明のポリペプチドは、図２（配列番号２）のポリペプチド(特に成熟ポリ ペプチド)ならびに図２(配列番号２)のポリペプチドに対して少なくとも７０％ の同一性を有するポリペプチド、好ましくは図２（配列番号２）のポリペプチド に対して少なくとも８０％の同一性、さらに好ましくは図２（配列番号２）のポ リペプチドに対して少なくとも９０％の類似性（さらに好ましくは少なくとも９ ０％の同一性）、そのうえさらに好ましくは図２（配列番号２）のポリペプチ ドに対して少なくとも９５％の類似性（そのうえさらに好ましくは９５％の同一 性）を有するポリペプチドを包含し、また一般に少なくとも３０個のアミノ酸、 さらに好ましくは少なくとも５０個の連続アミノ酸を含むポリペプチドのそのよ うな部分を有する、かかるポリペプチドの部分も包含する。 本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成による対応 完全長ポリペプチドの製造に用いることができる；従って、該フラグメントは完 全長のポリペプチドを製造するための中間体として用いることができる。本発明 のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分を用いて本発明の完全長のポリヌ クレオチドを合成することができる。 フラグメント また本発明のこの態様の好ましい具体例には、ｓｐｓＢのフラグメント、特に 図２（配列番号２）に示すアミノ酸を有するｓｐｓＢのフラグメント、および図 ２（配列番号２）のｓｐｓＢの変種および誘導体のフラグメントを含むポリペプ チドがある。 この点において、フラグメントは前記のｓｐｓＢポリペプチドおよびその変種 または誘導体のアミノ酸配列が、全てではなく一部に対して全く同一であるアミ ノ酸配列を有するポリペプチドである。 かかるフラグメントは、「自立している」、すなわち他のアミノ酸またはポリ ペプチドの一部ではないか、もしくはそれに融合しておらず、または一部もしく は領域を形成するより大きなポリペプチド内に含まれていてもよい。より大きな ポリペプチド内に含まれる場合、本明細書で説明するフラグメントは単一の連続 した領域を形成するのが最も好ましい。しかしながら、数個のフラグメントが単 一の、より大きなポリペプチド内に含まれてもよい。例えば、ある好ましい具体 例は、ｓｐｓＢのフラグメントのアミノ末端に融合した異型のプレおよびプロポ リペプチド領域、および該フラグメントのカルボキシル末端に融合した付加領域 を有し、宿主中に発現するように設計された前駆体ポリペプチド内に含まれる本 発明のｓｐｓＢポリペプチドのフラグメントに関する。従って、本明細書の意図 するところの一の態様におけるフラグメントは、ｓｐｓＢ由来の融合ポリペプチ ドまたは融合蛋白の一つのまたは複数の部分を意味する。 本発明のポリペプチドフラグメントの典型例は、例えば、アミノ酸番号１ない し２０、２１ないし４０、４１ないし６０、６１ないし８０、８１ないし１００ および１０１ないし１５１、ならびにこれらの２０個のアミノ酸からなるフラグ メントの組み合わせを包含する。 この意味からすると、本明細書で用いる「約」は、詳細には、いずれかの末端 または両末端において数個、少し、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ 酸だけ長いまたは短いことを包含する。 本発明の好ましいフラグメントは、例えば、ｓｐｓＢの末端切断ポリペプチド を包含する。末端切断ポリペプチドは、アミノ末端を含む一連の残基（すなわち 、連続領域、一部または部分）もしくはカルボキシル末端を含む一連の残基の欠 失、または二重末端切断突然変異体のように一つはアミノ末端を含み、一つはカ ルボキシル末端を含む二つの連続した一連の残基の欠失を除けば、図２のアミノ 酸配列を有するｓｐｓＢポリペプチド、またはその変種もしくは誘導体を包含す る。前記した大きさの範囲のフラグメントもまた末端切断フラグメントの好まし い具体例であり、一般に、フラグメントの中でも特に好ましい。宿主細胞、特に スタフィロコッカスにおける本発明ポリヌクレオチドの縮重形態もまた好ましい 。 また本発明のこの態様にて、ｓｐｓＢの構造的または機能的属性により特徴づ けられるフラグメントも好ましい。この点において本発明の好ましい具体例は、 ｓｐｓＢのアルファーヘリックスおよびアルファーヘリックス形成領域、ベータ シートおよびベータシート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよ びコイル形成領域、親水領域、疎水領域、アルファー両親媒性領域、ベータ両親 媒性領域、可変領域、界面形成領域、基質結合領域および高抗原指数領域からな るフラグメントおよびかかるフラグメントの組み合わせを包含する。 好ましい領域は、ｓｐｓＢの活性を媒介する領域である。この点において、類 似活性もしくは改善された活性を有するもの、または望ましくない活性を減じた フラグメントを含め、ｓｐｓＢの化学的、生物学的またはその他の活性を有する フラグメントが最も好ましい。さらに好ましいポリヌクレオチドフラグメントは 、動物特にヒトにおいて抗原的または免疫原的であるフラグメントである。 本発明はまた、とりわけ、前記のフラグメントをコードするポリヌクレオチド 、そのフラグメントをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションす るポリヌクレオチド、特に、厳密な条件下でハイブリダイゼーションするポリヌ クレオチド、およびそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを増幅する ためのＰＣＲプライマーなどのポリヌクレオチドに関することが理解されよう。 この点において、好ましいポリヌクレオチドは、前記するような、好ましいフラ グメントに対応するポリヌクレオチドである。 ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを含 むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作される宿主細胞および組換え技術に よる本発明のポリペプチドの製造にも関する。 宿主細胞は、遺伝子操作して、ポリヌクレオチドを組み込み、本発明のポリペ プチドを発現することができる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、リン 酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェ クション、トランスベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介 トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレ ープ・ローディング、弾道導入、感染または他の方法により行うことができる。 かかる方法は多くの標準的実験室マニュアル、例えば、Davisら、Basic Methods in Molecular Biology，(1986)およびSambrookら、Molecular Cloning;A Labor atory Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレ ス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）に記載されている 。 宿主細胞内のポリヌクレオチド構築物を従来の方法に用いて、組換え配列によ りコードされる遺伝子産物を製造することができる。また、本発明のポリペプチ ドは従来のペプチド合成により合成的に製造できる。 成熟蛋白は、哺乳動物細胞、酵母、細菌または他の細胞中、適当なプロモータ ー の制御下で発現させることができる。無細胞翻訳系を用いて、本発明のＤＮＡ構 築物に由来するＲＮＡを用いてかかる蛋白を製造することもできる。原核および 真核生物宿主で用いる適当なクローニングおよび発現ベクターは、Sambrookら、 Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第２版、コールド・スプリング・ハ ーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー ク（1989）に記載されている。 本発明のこの態様によれば、ベクターは、例えば、プラスミドベクター、一本 鎖または二本鎖ファージベクター、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイ ルスベクターであってもよい。プラスミドは、一般に、当業者に馴染みの標準的 命名法に従って、小文字ｐを前に、および／または大文字および／または数字が 続くようにデザインされている。本明細書に記載の出発プラスミドは、市販され ているか、汎用されているか、または周知の公知操作を常套的に適用することに より利用可能なプラスミドより構築することができる。本発明に従って用いるこ とのできる、多くのプラスミドおよび他のクローニングおよび発現ベクターが周 知であり、当業者であれば容易に利用することもできる。 ある点において、とりわけ好ましいベクターは、本発明のポリヌクレオチドお よびポリペプチの発現のためのベクターである。一般に、かかるベクターは、発 現させるべきポリヌクレオチドに機能的に連結した、宿主における発現に有効な シス作用調節領域を含む。適当なトランス作用性因子は宿主により供給されるか 、補足ベクターにより供給されるか、または宿主への導入時にベクター自身によ り供給されるかのいずれかである。 この点におけるある好ましい具体例では、ベクターは特異的発現を提供する。 かかる特異的発現は、誘導可能な発現であるか、もしくはあるタイプの細胞での み起こる発現であるか、または誘導可能かつ細胞特異的な発現であってもよい。 誘導可能なベクターのうち、特に好ましいベクターは、温度および栄養添加物な どの操作が容易である環境因子により発現を誘導できるベクターである。本発明 のこの態様に適当な種々ベクターは、原核および真核宿主で用いられる構成的お よび誘導可能な発現ベクターを含め、当業者に周知であり、かつ慣用されている 。 非常に多くの種類の発現ベクターを用いて、本発明のポリペプチドを発現でき る。かかるベクターには、とりわけ染色体、エピソームおよびウイルス由来のベ クター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン 由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、 例えばバキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス 、アデノウイルス、ニワトリポックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロ ウイルス等のウイルス由来のベクター、ならびにコスミドおよびファージミド(p hagemids)のプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝的エレメント由来のベク ターのごとき、その組み合わせに由来するベクターがあり、全て本発明のこの態 様に準じた発現に用いることができる。一般に、宿主にてポリペプチドを発現す るためにポリヌクレオチドを保持、伸長または発現するのに適したいずれのベク ターも、この点における発現に使用できる。 適当なＤＮＡ配列は、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning；A Laborator y Manual、第２版；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、 コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1989）に記載されている方法 などの種々の周知かつ慣用的技法によりベクターに挿入できる。 発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、例えば、プロモーターを含め、適当な発 現調節配列（複数でも可）に機能的に連結し、ｍＲＮＡ転写を指令する。かかる プロモーターの代表例としては、ファージラムダＰＬプロモーター、イー・コリ ・ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモー ターならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターが挙げられるが、これらに限 定されない。 一般に、発現構築物は転写開始および終止部位を含み、転写された領域では翻 訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物により発現される成熟転写物のコ ーディング部分は、開始部分に翻訳開始ＡＵＧ、そして翻訳されるべきポリペプ チドの終末部分に適当に位置する終止コドンを含む。 加えて、構築物は、発現を制御および誘起する調節領域を含有してもよい。一 般に、多くの常套手段によれば、かかる領域は、転写、例えばとりわけ転写因子 、 レプレッサー結合部位および終止部位を調節することにより機能するであろう。 増幅および発現のためのベクターは、一般に、選択可能なマーカーおよび増幅 領域、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning；A Laboratory Manual、第２版 ；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリ ング・ハーバー、ニューヨーク（1989）に記載されている領域を有するであろう 。 適当な宿主の代表例は、細菌細胞、例えばストレプトコッカス（連鎖球菌）、 スタフィロコッカス（ブドウ球菌）、イー・コリ（大腸菌）、ストレプトマイセ スおよびバチルス・ズブチリス細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペル ギルス細胞；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２およびスポドプテラSf９細胞； 動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、HeLa、Ｃ１２７、３T３、ＢＨＫ、２９３お よびボーウェス（Bows）黒色腫細胞；ならびに植物細胞を包含する。 市販されている以下のベクターを例示として示す。細菌中で使用するのに好ま しいベクターには、キアゲン（Qiagen）より入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０ およびｐＱＥ−９；ストラタジン（Stratagene）より入手可能なｐＢＳベクター 、ファージェスクリプト(Phagescript)ベクター、ブルースクリプト(Bluescript )ベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ＡおよびｐＮＨ４６Ａ；な らびにファルマシア（Pharmacia）より入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２ ３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５；およびｐＢＲ３２２（ ＡＴＣＣ３７０１７）がある。好ましい真核生物ベクターには、ストラタジンよ り入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳ Ｇ；ならびにファルマシアより入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよ びｐＳＶＬがある。これらのベクターは単に多くの市販されている周知のベクタ ーを例示するために列挙してあるにすぎず、本発明のこの態様に従って使用する のに、当業者に入手可能なベクターである。宿主にて本発明のポリヌクレオチド またはポリペプチドを、例えば、導入、保持、伸長または発現するのに適した他 のプラスミドまたはベクターが、本発明のこの態様において使用できることは理 解されよう。 制限部位または候補プロモーターフラグメント、すなわちプロモーターを有す るかもしれないフラグメントを導入するための部位の下流に、プロモーター領域 を欠いたリポーター転写ユニット、例えばクロラムフェニコールアセチルトラン スフェラーゼ（「ＣＡＴ」）転写ユニットを含有するベクターを用いて、いずれ か望ましい遺伝子からプロモーター領域を選択することができる。周知のように 、プロモーター含有フラグメントをｃａｔ遺伝子の上流の制限部位でベクターに 導入すると、ＣＡＴ活性の産生を引き起こし、その活性は標準的なＣＡＴアッセ イにより検出できる。ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７などのこの目的に適する ベクターが周知であり、容易に入手可能である。本発明のポリヌクレオチドを発 現するためのプロモーターには、周知の容易に入手できるプロモーターのみなら ず、リポーター遺伝子を用いて前記の技術により容易に得ることができるプロモ ーターもある。 本発明に係るポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適した公知の原核 生物プロモーターには、E.coliのｌａｃＩおよびｌａｃＺならびにプロモーター 、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモ ーターおよびｔｒｐプロモーターがある。 この点において適当な公知の真核生物プロモーターには、ＣＭＶ即時型プロモ ーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモ ーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター、例えばラウス肉腫ウイルス（「 ＲＳＶ」）のプロモーターならびにメタロチオネインプロモーター例えばマウス ・メタロチオネイン−Ｉプロモーターがある。 組換え発現ベクターは、例えば、複製起点、好ましくは、高発現遺伝子に由来 し、下流の構造配列の転写を指令するプロモーターおよびベクターに暴露した後 の細胞を含有するベクターの単離を可能とする選択可能なマーカーを含む。 本発明のポリペプチドの異種構造配列をコードする本発明のポリヌクレオチド を、一般に、標準法を用いてベクターに挿入し、発現用プロモーターに機能的に 連結させる。ポリヌクレオチドを、転写開始部位がリボソーム結合部位に対して 適当に５’側にあるように位置させる。リボソーム結合部位は、発現させるべき ポリペプチドの翻訳を開始するＡＵＧの５’側にある。一般に、開始コドン（通 常にはＡＵＧ）から始まり、リボソーム結合部位および開始ＡＵＧの間にある、 他の読み枠はない。また、一般に、ポリペプチドの末端に翻訳停止コドンがあり 、真核生物宿主で用いられる構築物中に、ポリアデニル化シグナルがあるであろ う。転写領域の３’末端に適当に配置される転写終止シグナルはまた、ポリヌク レオチド構築物に含まれていてもよい。 翻訳蛋白を、小胞体、ペリプラスム空間または細胞外環境へ分泌するために、 適当な分泌シグナルが発現するポリペプチドに組み込まれていてもよい。これら のシグナルはポリペプチドに内在性であってもよく、または異種シグナルであっ てもよい。 ポリペプチドは、修飾された形態、例えば融合蛋白の形態で発現してもよく、 分泌シグナルのみならず付加的な異種機能性領域を有していてもよい。このよう に、例えば付加アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域を、ポリペプチドのＮ−末端 に付加し、精製中またはその後の操作および貯蔵中の、宿主細胞内での安定性お よび持続性を改善する。また、精製を容易にするために、ポリペプチドに領域を 付加することもできる。かかる領域はポリペプチドの最終的な調製の前に除去で きる。ペプチド部分をポリペプチドに付加し、とりわけ、分泌または放出を誘起 し、安定性を改善するかまたは精製を容易にするのは、当該分野でよくあること であり、慣用される技術である。好ましい融合蛋白は、ポリペプチドを可溶化ま たは精製するのに有用な免疫グロブリンに由来する異種領域を含む。例えばＥＰ −Ａ−０４６４ ５３３（カナダ国の対応特許２０４５８６９）は、免疫グロブ リン分子の定常領域の種々の部分と、別の蛋白またはその一部とからなる融合蛋 白を開示する。薬物の開発において、例えば、蛋白を、高処理能カスクリーニン グアッセイの目的で抗体のＦｃ部分と融合させ、アンタゴニストを同定すること ができる。D.Bennettら、Journal of Molecular Recognition,8巻：52-58（1995 ）およびK.Johansonら、The Journal of Biological Chemistry,270巻(16)：94 59-9471（1995）を参照のこと。 ついで、典型的には、細胞を遠心分離により収穫し、物理的または化学的手段 により破壊し、得られた粗抽出物をさらに精製するために保存する。 蛋白の発現に用いた微生物細胞は、凍結−融解サイクル、ソニケーション、機 械的破壊または細胞溶解剤の使用を含め、常法により破壊でき、かかる方法は当 業者に周知である。 哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサー を有していてもよく、さらにいずれかの必須リボソーム結合部位、ポリアデニル 化部位、スプライスドナー部位およびアクセプター部位、転写終止配列および発 現に必要な５’非転写配列を有していてもよい。 ｓｐｓＢポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、 陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグ ラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフ ィーを含む、周知方法により、組換え細胞培養物から回収かつ精製できる。最も 好ましくは、高性能液体クロマトグラフィーを精製に用いる。ポリペプチドが単 離および／または精製中に変性する場合、再び活性なコンホーメーションを得る ために、蛋白を再生するための周知の技術を用いてもよい。 ポリヌクレオチドアッセイ 本発明はまた、例えば診断用試薬として相補的ポリヌクレオチドを検出するた めのｓｐｓＢポリヌクレオチドの使用にも関する。真核生物、特に哺乳動物、特 にヒトにおいてｓｐｓＢを検出することにより、疾患の診断方法が得られるであ ろう。ｓｐｓＢ遺伝子を有する生物に感染した真核生物（本明細書において「個 体」とも称する）、特に哺乳動物、特にヒトを、種々の技術により、ＤＮＡまた はＲＮＡレベルで検出できる。診断用の核酸は感染した個体の細胞および組織、 例えば骨、血液、筋肉、軟骨および皮膚から入手できる。ゲノムＤＮＡは検出に 直接使用してもよく、または分析前にＰＣＲを用いて酵素的に増幅させてもよい （Saikiら、Nature 324：163-166（1986））。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同様 に用いることができる。一例として、ｓｐｓＢをコードする核酸に相補的なＰＣ Ｒプライマーを用いて、ｓｐｓＢの存在および／または発現を同定および分 析できる。ＰＣＲを用いて、真核生物、特に哺乳動物、特にヒトに存在する原核 生物の株を、原核生物遺伝子の遺伝子型の分析により特徴づけできる。例えば、 対照標準の配列の遺伝子型と比較し、増幅産物の大きさの変化により欠失および 挿入を検出できる。点突然変異は増幅したＤＮＡを放射性標識したｓｐｓＢＲＮ Ａに、また別法として放射性標識したｓｐｓＢアンチセンスＤＮＡにハイブリダ イゼーションさせることにより同定できる。完全に対合する配列は、RNaseA消化 により、または融解温度の差異により、誤対合二重らせんと区別できる。 対照標準の遺伝子および突然変異を有する遺伝子間の配列の違いはまた、直接 的ＤＮＡ配列決定により明らかにすることもできる。加えて、クローン化ＤＮＡ セグメントを特異的ＤＮＡセグメントを検出するためのプローブとして用いるこ とができる。かかる方法の感度は、ＰＣＲまたは別の増幅法を適宜使用すること により、非常に増強させることができる。例えば、配列決定プライマーを二本鎖 ＰＣＲ生成物または修飾ＰＣＲにより生じた一本鎖鋳型分子と共に用いる。配列 決定は、放射標識したヌクレオチドを用いる従来の方法により、または蛍光タグ を用いる自動配列決定法により行うことができる。 ＤＮＡ配列の差異に基づく遺伝的特徴付けは、変性剤を含むまたは含まないゲ ル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動度の変化を検出することにより達成できる 。小さな配列の欠失および挿入は高分解ゲル電気泳動により可視化できる。種々 の配列のＤＮＡフラグメントは、その個々の融解または部分的融解温度によって 、種々のＤＮＡフラグメントの移動がゲル中の異なる位置で遅くなる、変性ホル ムアミド勾配ゲル上にて区別できる（例えばMeyersら、Science,230:1242（1985 ）参照）。 特異的な位置での配列の変化はまた、RNaseおよびＳ１保護などのヌクレアー ゼ保護アッセイまたは化学的切断法によって明らかにすることができる(例えば 、cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4397-4401（1985）)。 このように、ハイブリダイゼーション、RNase保護、化学的切断、直接的ＤＮ Ａ配列決定または制限酵素の使用、例えば、制限フラグメント長多形性（restri ction fragment length polymorphism「ＲＦＬＰ」）およびゲノム ＤＮＡのサザンブロッティングなどの方法により、特異的ＤＮＡ配列を検出でき る。 従来のゲル電気泳動法およびＤＮＡ配列決定法に加えて、突然変異をまたイン シトゥ分析（in situ analysis）により検出することもできる。 本発明の遺伝子の突然変異または多形型を有する細胞をまた、例えば、抗原型 決定を可能とする種々の技法により、ＤＮＡレベルで検出することもできる。例 えば、ＲＴ−ＰＣＲを突然変異を検出するのに使用できる。ＲＴ−ＰＣＲを、例 えば、GeneScanなどの自動検出系と組み合わせて用いるのが特に好ましい。 ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ目的でＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲに用いること ができる。一例として、ｓｐｓＢをコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマー を変異を同定および分析するのに用いることができる。これらのプライマーを、 個体由来の試料から単離されたｓｐｓＢ ＤＮＡの増幅に使用してもよい。 本発明は、疾患、好ましくは細菌感染、さらに好ましくはスタフィロコッカス ・アウレウス感染、最も好ましくは上気道疾患（例えば、中耳炎、細菌性気管炎 、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道疾患（例えば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓疾 患（例えば、感染性心内膜炎）、胃腸疾患（例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹 膜後膿瘍）、ＣＮＳ疾患（例えば、大脳膿瘍）、眼疾患（例えば、眼瞼炎、結膜 炎、角膜炎、眼内炎、前中隔および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎）、腎および尿管疾患（ 例えば、副睾丸炎、腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚 疾患（例えば、膿痂疹、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）な らびに骨および関節疾患（例えば、敗血症性関節炎、骨髄炎）を診断する方法で あって、個体由来のサンプルより、図１（配列番号１）の配列を有するポリヌク レオチドの発現レベルの増加を測定することからなる方法を提供する。ＳｐｓＢ ポリヌクレオチドの発現の増加は、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、RNase保護 、ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション法などのポリヌク レオチドの定量について当該分野にて周知の方法を用いて測定することができる 。 ポリペプチドアッセイ 本発明はまた、正常および異常なレベルの測定を含め、細胞および組織中のｓ ｐｓＢ蛋白のレベルを検出するための定量および診断アッセイなどの診断アッセ イに関する。このように、例えば、正常な対照標準の組織サンプルと比較し、ｓ ｐｓＢ蛋白の過剰発現を検出することについて本発明に係る診断アッセイを用い て、感染の存在を検出することができる。宿主由来のサンプル中のｓｐｓＢ蛋白 のレベルを測定するために用いることができるアッセイ技法は当業者に周知であ る。かかるアッセイ方法は、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウエス タンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイを包含する。このうちＥＬＩＳＡが 好ましい。ＥＬＩＳＡアッセイではまず、ｓｐｓＢに特異的な抗体、好ましくは モノクローナル抗体を調製する。加えて、一般に、モノクローナル抗体に結合す るリポーター抗体が調製される。リポーター抗体は放射活性、蛍光または酵素試 薬、この例においてはセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼなどの検出可能な試薬 に結合する。 抗体 ポリペプチド、そのフラグメントもしくは他の誘導体、またはそのアナログ、 またはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を生成する免疫原として用 いることができる。本発明は、例えば、モノクローナルおよびポリクローナル抗 体、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメントまたはＦａ ｂ発現ライブラリーの産物を包含する。 発明の配列に対応するポリペプチドに対して得られる抗体は、ポリペプチドを 、動物に直接注射するかまたは該ポリペプチドを動物、好ましくはヒト以外の動 物に投与することにより得ることができる。このようにして得られた抗体はポリ ペプチドその物と結合する。この方法ではポリペプチドのフラグメントのみをコ ードする配列でさえも、元のポリペプチド全体に結合する抗体の生成に用いるこ とができる。かかる抗体を用いて、ポリペプチドを発現する組織から該ポリペプ チドを単離することができる。 モノクローナル抗体を調製するには、連続的細胞系培養により産生される抗体 を提供する当該分野において公知のいずれかの技術を用いることができる。例え ば、Kohler,G.およびMilstein,C.,Nature,256：495-497（1975）；Kozborら、Im munology Today,4：72（1983））；Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss,Inc.、77-96頁（1985）に記載の方法などの種々の方法が 挙げられる。 一本鎖抗体の生成のために記載された技術（米国特許第４９４６７７８号）を 適用して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する一本鎖抗体を産生するこ とができる。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物などの他の生 物を用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現させ ることができる。 別法として、ファージディスプレイ技術を利用して、抗ＳｐｓＢの保持に関し てスクリーニングしたヒト由来のリンパ球のＰＣＲ増幅したｖ−遺伝子のレパー トリー由来の、または未処理のライブラリー由来のポリペプチドに対する結合活 性を有する抗体遺伝子を選択することができる（McCafferty,J.ら、Nature 348 ：552-554（1990）；Marks,J.ら、Biotechnology 10：779-783（1992））。これ らの抗体の親和性は、チェーンシャフリング（chain shuffling）（Clackson,T. ら、Nature 352：624-628（1991））により改善することもできる。 ２つの抗原結合ドメインがあるならば、各ドメインを、「二特異的」抗体と称 される、異なるエピトープに向けることができる。 前記の抗体を用いて、本発明のポリペプチドを発現するクローンを単離もしく は同定し、アフィニティクロマトグラフィーにより該抗体を単離および／または 精製するための固体支持体に結合させることで、該ポリペプチドを精製すること ができる。 従って、とりわけｓｐｓＢに対する抗体を用いて、感染、特に細菌感染、とり わけ上気道疾患（例えば、中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎）、 下気道疾患（例えば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓疾患（例えば、感染性心内膜炎） 、胃腸疾患（例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ疾患（例え ば、大脳膿瘍）、眼疾患（例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中隔お よび 眼窩蜂巣炎、涙嚢炎）、腎および尿管疾患（例えば、副睾丸炎、腎内および腎周 囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚疾患（例えば、膿痂疹、毛嚢炎、皮 膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）ならびに骨および関節疾患（例えば、 敗血症性関節炎、骨髄炎）を抑制および／または治療することができる。 ポリペプチド誘導体は、本発明の特定の態様を形成する、抗原的に、エピトー プ的にまたは免疫学的に等価な誘導体を包含する。本明細書で用いる「抗原的に 等価な誘導体」なる用語は、本発明に従って、蛋白またはポリペプチドに対して 生成された場合、病原体および哺乳動物宿主間での即時的な物理的相互作用を妨 げるある種の抗体により特異的に認識されるであろうポリペプチドまたはそれの 同等物を包含する。本明細書で用いる「免疫学的に等価な誘導体」なる用語は、 脊椎動物において抗体を誘起させるのに適した処方にて用いた場合、抗体が病原 体および哺乳動物宿主間での即時的な物理的相互作用を妨げるように作用するペ プチドまたはその同等物を包含する。 ポリペプチド、例えば抗原的または免疫学的に等価な誘導体またはその融合蛋 白は、マウスまたはその他の動物、例えばラットもしくはニワトリを免疫するた めの抗原として使用できる。融合蛋白はポリペプチドに安定性を付与できる。抗 原は、例えば、接合することにより、免疫原性キャリヤ蛋白、例えばウシ・血清 アルブミン(ＢＳＡ)またはキーホール・リムペット・ヘモシアニン(keyhole limpe t haemocyanin：ＫＬＨ)に結合させることができる。別法として、蛋白もしくは ポリペプチド、またはその抗原的もしくは免疫学的に等価なポリペプチドの多重 コピーを含む多重抗原性ペプチドは、免疫原生を改良するために十分な抗原性を 有しており、キャリヤーを使用しなくてすむ。 抗体またはその誘導体を修飾して、個体における免疫原性を低下させるのが好 ましい。例えば、個体がヒトである場合、抗体は「ヒト化」されているのが最も 好ましく；その場合、ハイブリドーマ由来の抗体の相補性決定領域（複数でも可 ）がヒト・モノクローナル抗体に移されており、例えば、Jones,P.ら、Nature 3 21：522-525（1986）またはTempestら、Biotechnology ９：266-273（1991）に 記載されている。 本発明のポリヌクレオチドを遺伝的免疫に使用する場合、好ましくは、例えば プラスミドＤＮＡの筋肉への直接注射(Wolffら、Hum.Mol.Genet．1:363(1992)； Manthorpeら、Hum．Gene Ther．4：419（1963）)、特異的蛋白キャリヤを複合さ せたＤＮＡの送達（Wuら、J．Biol．Chem．264：16985（1989））、リン酸カル シウムを用いるＤＮＡ共沈(Benvenisty & Reshef,PNAS（USA）83：9551(1986)) 、種々の形態のリポソーム中へのＤＮＡ封入(Kanedaら、Science 243：375（198 9）)、微粒子爆撃（Tangら、Nature 356：152（1992）；Eisenbraunら、DNA Cel l Biol．12：791（1993））およびクローン化レトロウイルスを用いたインビボ 感染（Seegerら、PNAS（USA）81：5849（1984））などの適当な送達方法を用い る。 ｓｐｓＢ−結合分子およびアッセイ 本発明はまた、ｓｐｓＢに結合する結合分子などの分子の同定方法をも提供す る。ｓｐｓＢに結合する蛋白をコードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法 、例えばリガンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティングより同定できる。かか る方法は多くの実験室マニュアル、例えば、Coliganら、Current Protocols in Immunology、1（2）：第５章（1991）に記載されている。また、標識されたリガ ンドを細胞抽出物に光親和性結合させることもできる。また、本発明のポリペプ チドを用いて、細胞中、または無細胞調製物中の、ｓｐｓＢ結合分子のｓｐｓＢ 結合能力を評価することができる。 本発明のポリペプチドを用いて、例えば、細胞、無細胞調製物、化学的ライブ ラリー、および天然産物の混合物中における小型分子基質とリガンドとの結合を 評価してもよい。これらの基質およびリガンドは天然基質およびリガンドであっ てもよく、あるいは構造もしくは機能を模したものであってもよい。 アンタゴニスト−アッセイおよび分子 本発明はまた、Ｆａｂ結合分子との相互作用などの、ｓｐｓＢポリペプチドま たはポリヌクレオチドの作用を遮断（アンタゴニスト）する化合物を同定するた めの化合物のスクリーニング方法をも提供する。 例えば、アンタゴニストをスクリーニングするために、膜、細胞エンベロープ もしくは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、またはそれらのいずれかの調製 物を、ｓｐｓＢに結合する分子を発現する細胞より調製することができる。該調 製物を、ｓｐｓＢアンタゴニストであるかもしれない候補分子の存在下または不 在下で標識したｓｐｓＢと一緒にインキュベーションする。候補分子が結合分子 に結合する能力は、標識リガンドの結合の低下に反映される。結合しても影響を 及ぼさない分子、すなわちｓｐｓＢ結合分子の結合において、ｓｐｓＢの効果を 誘起しない分子は、ほとんどの場合、良好なアンタゴニストであろう。 潜在的アンタゴニストのｓｐｓＢ様効果は、例えば、候補分子と細胞または適 当な細胞調製物との相互反応の後の、リポーターシステムの活性を測定し、ｓｐ ｓＢまたはｓｐｓＢと同じ効果を惹起する分子の効果を比較することにより測定 される。この点に関して有用なリポーターシステムは、生成物に転換される比色 標識基質、ｓｐｓＢ活性の変化に応答するリポーター遺伝子、および当該分野で 公知の結合アッセイを包含するが、これらに限定するものではない。 ｓｐｓＢアンタゴニストのアッセイの別の例は、競争阻害アッセイに適した条 件下で、ｓｐｓＢおよび潜在的なアンタゴニストを、膜結合ｓｐｓＢ結合分子、 組換えｓｐｓＢ結合分子、天然基質もしくはリガンド、または基質もしくはリガ ンド擬似物質と混合する、競合アッセイである。ｓｐｓＢを例えば放射活性また は比色化合物により標識し、結合分子に結合した、または生成物に変換したｓｐ ｓＢ分子の数を正確に決定して、潜在的なアンタゴニストの効果を評価できる。 潜在的なアンタゴニストは、本発明のポリペプチドに結合し、それによりその 活性を阻害し、消滅させる小型有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体を 包含する。潜在的アンタゴニストはまた、ｓｐｓＢ誘発活性を誘導しない結合分 子のような、結合分子の同一部位に結合し、ｓｐｓＢを結合より排除することに よりｓｐｓＢの作用を妨げる、密接に関連した蛋白または抗体のような小型有機 分子、ペプチド、ポリペプチドであってもよい。 潜在的なアンタゴニストは、ポリペプチドの結合部位に結合して占領し、それ により細胞性結合分子への結合を妨げ、正常な生物学的活性を妨げる小型分子を 包含する。小型分子の例は、小型有機分子、ペプチド、ペプチド様分子を包含す るが、これらに限定するものではない。 その他の潜在的なアンタゴニストはアンチセンス分子を包含する（これらの分 子についての記載に関しては、Okano,J.,Neurochem.56:60(1991);Oligodeoxynuc leotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression,ＣＲＣプレス、ボッカ ラートン、フロリダ州（1988）を参照のこと）。 好ましい潜在的アンタゴニストはｓｐｓＢ関連化合物およびｓｐｓＢ誘導体を 包含する。 特定の態様において、本発明は、感染の続発症に関与する、病因および哺乳動 物宿主間の最初の物理的相互作用を妨害するための本発明のポリペプチド、ポリ ヌクレオチドまたは阻害剤の使用を提供する。特に本発明の分子を、ｉ）細菌、 特にグラム陽性細菌の内在装置上の哺乳動物細胞外マトリックス蛋白、または創 傷部の細胞外マトリックス蛋白への付着の妨げ；ｉｉ）例えば、哺乳動物チロシ ンキナーゼのリン酸化の開始により、哺乳動物細胞侵入を媒介するマロニルＣｏ Ａ:ＡＣＰトランスアシラーゼ蛋白の遮断(Rosenshineら、Infect.Immun.60：221 1(1992))；ｉｉｉ)哺乳動物細胞外マトリックス蛋白と組織損傷を媒介する細菌 性マロニルＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ蛋白との間の細菌付着の遮断；ｉ ｖ）内在装置の埋め込みまたはその他の手術以外により開始した感染における病 状の正常な進行の遮断に使用することができる。 本明細書で提供する各々のＤＮＡ配列は抗細菌化合物の発見および開発に用い ることができる。発現された場合、コードされた蛋白は、抗菌薬物のスクリーニ ングのための目的物質として用いることができる。加えて、コードされた蛋白の アミノ末端をコードしているＤＮＡ配列または個々のｍＲＮＡのShine-Delgarno もしくは他の翻訳容易化配列をコードするＤＮＡ配列を用いて、目的のコーディ ング配列の発現を調節するアンチセンス配列を構築することができる。 アンタゴニストは、例えば、上気道疾患（例えば中耳炎、細菌性気管炎、急性 咽頭蓋炎、甲状腺炎）、下気道疾患（例えば蓄膿症、肺膿瘍）、心臓疾患（例え ば感染性心内膜炎）、胃腸疾患（例えば分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、 ＣＮＳ疾患（例えば大脳膿瘍）、眼疾患（例えば眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内 炎、前中隔および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎）、腎および尿管疾患（例えば副睾丸炎、 腎内および腎周囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚疾患（例えば膿痂疹 、毛嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）ならびに骨および関節疾 患（例えば敗血症性関節炎、骨髄炎）の抑制に用いることができる。 ワクチン 本発明の別の態様は、個体、特に哺乳動物における免疫学的応答を誘起する方 法であって、抗体を生成するのに適当なｓｐｓＢ、またはその抗原性フラグメン トもしくは変種を個体に接種し、該個体を感染、特に細菌感染、とりわけスタフ ィロコッカス感染から保護することからなる方法に関する。本発明のまた別の態 様は、個体にて免疫学的応答を誘起する方法であって、遺伝子治療により免疫学 的応答を誘発させるためにｓｐｓＢまたはそのフラグメントもしくは変種をイン ビボで発現させるのにｓｐｓＢまたはそのフラグメントもしくは変種をコードす る遺伝子を送達し、抗体を生成し、該個体を疾患から防御する方法に関する。 本発明のさらなる態様は、免疫学的応答を宿主内に誘起できる、または誘起し た宿主に導入した場合、そのような宿主中でｓｐｓＢまたはそれによりコードさ れる蛋白に対する免疫学的応答を誘起する免疫学的組成物であって、該ｓｐｓＢ の抗原をコードし、発現するＤＮＡまたはそれによりコードされる蛋白を含んで なる、組換えｓｐｓＢまたはそれによりコードされる蛋白を含んでなる組成物に 関する。 ｓｐｓＢまたはそのフラグメントは、それ自身は抗体を産生しないが、第１の 蛋白を安定化し、免疫原性があり防御特性を有する融合蛋白を形成することがで きる補蛋白（co-protein）と融合できる。このように融合した組換え蛋白は、好 ましくはさらに抗原性補蛋白、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ ＧＳＴ）またはベーターガラクトシダーゼ、蛋白を可溶化し、その生成および 精製を容易にする比較的大きな補蛋白を含む。さらには、補蛋白は、免疫系の全 身的刺激を提供するという意味で、アジュバントとして作用し得る。補蛋白は第 １の蛋白のアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれに結合してもよい。 また、本発明は、スタフィロコッカス・アウレウスに感染した動物モデルにお ける、このような遺伝的免疫化実験で用いるＤＮＡ構築物の、細菌性細胞表面蛋 白の不変領域をコードすることがわかっている前記のポリヌクレオチドまたはと りわけそのフラグメントを用いる方法であって、とりわけ予防的または治療的免 疫反応を生じることができる蛋白エピトープを同定するのに有用な方法を提供す るものである。このアプローチは、哺乳動物、とりわけヒトにおけるスタフィロ コッカス・アウレウス感染の予防薬または治療的処置の開発のために、感染に抵 抗しまたは一掃するのに成功した動物（特にヒト）の必須器官から特に価値ある モノクローナル抗体をうまく調製することを可能にすると考えられる。 ポリペプチドは、例えば細菌の損傷組織への付着を阻害することにより、細菌 の侵入に対して防御的な特異的抗体を産生するための宿主のワクチン化のための 抗原として使用することができる。組織損傷の例は、例えば機械的、化学的もし くは熱損傷により、または内在装置の埋め込みにより、引き起こされた皮膚また は結合組織の創傷、または粘膜例えば口、乳腺、尿道または膣の創傷を包含する 。 本発明はまた、免疫原性組換え蛋白および適当な担体を含んでなるワクチン処 方を包含する。蛋白は胃で分解するので、例えば、皮下、筋肉内、静脈内または 皮内投与を含め、非経口的に投与するのが好ましい。非経口投与に適した処方は 、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤およびその処方を個体の体液、好ましくは血液と等 張にする溶質を含有してもよい水性または非水性滅菌注射液；および懸濁化剤ま たは増粘剤を含有していてもよい水性または非水性滅菌懸濁液を包含する。処方 は単位投与または複数回投与用容器、例えば密封したアンプルおよびバイアルに 入れてよく、使用直前に滅菌液体担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵 することができる。ワクチン処方はまた、処方の免疫原性を高めるアジュバント 系、例えば水中油系または当該分野で公知の他の系を含んでいてもよい。投与量 はワクチンの比活性に依存し、慣用的実験操作により容易に決定できる。 本発明はある種のｓｐｓＢに関して記載されているが、これは天然の蛋白およ び、実質的に組換え蛋白の免疫原特性に影響しない付加、欠失または置換を施し た類似の蛋白のフラグメントを包含することが理解されよう。 組成物 本発明はまた前記のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニス トもしくはアンタゴニストを含んでなる組成物にも関する。従って、本発明のポ リペプチドは、対象に投与するのに適した医薬担体などの、細胞、組織または生 物で使用するための非滅菌もしくは滅菌した担体と組み合わせて用いることがで きる。このような組成物は、例えば溶媒添加物または治療上有効量の本発明のポ リペプチド、および医薬上許容できる担体または賦形剤からなる。このような担 体は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールお よびそれらの組み合わせを包含するが、これらに限定するものではない。処方は 投与法に適合させなければならない。 キット 本発明はさらに、前記した本発明の組成物の成分を１またはそれ以上を充填し た１またはそれ以上の容器からなる診断用および医薬用パックおよびキットに関 する。このような容器（複数でも可）に、医薬または生物学的生成物の製造、使 用または販売を規制する政府機関により規定された形態の、ヒトへの投与用の産 物の製品、使用または販売に関する該政府機関の承認を示す注意書きを添付する ことができる。 投与 本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独でまたは治療用化合物などの 他の化合物と組み合わせて用いることができる。 医薬組成物は、例えば、とりわけ局所、経口、経肛門、経膣、静脈内、腹膜腔 内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内の経路を含め、効果的な、都合のよい方法 で投与できる。 医薬組成物は、一般に、個々の適応症または複数の適応症の治療または予防に 有効な量にて投与される。一般に、この組成物は少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体 重の量で投与される。大抵の場合、投与量は１日あたり約８ｍｇ／ｋｇ体重を越 えない量で投与される。好ましくは、大抵の場合、投与量は１日あたり約１０μ ｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ体重である。至適投与量は、適応症、その重篤度、 投与経路、合併症等を考慮に入れて、各々の治療様式および適応症についての標 準法により決定されることは理解されよう。 治療において、または予防用に、活性物質を注射用組成物として、例えば、好 ましくは等張の滅菌水性分散物として個体に投与できる。 また、組成物は、局所塗布用に、例えば軟膏、クリーム、ローション、眼軟膏 、点眼液、点耳液、洗口剤、含浸包帯および縫合糸ならびにエアゾルの形態に処 方してもよく、例えば保存剤、薬物の浸透を補助する溶媒、ならびに軟膏および クリームにおける軟化剤を含め、適当な慣用的添加剤を含有してもよい。このよ うな局所用処方はまた、適合する慣用的な担体、例えばクリームまたは軟膏基剤 、およびローションの場合、エタノールまたはオレイルアルコールも含めること ができる。このような担体は処方の約１％から約９８重量％であってもよく；よ り一般的には、処方の約８０重量％までとする。 哺乳動物、特にヒトに投与する場合、有効成分の１日あたりの投与量は、０. ０１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には約１ｍｇ／ｋｇである。 医者はいずれの場合も、個体に最も適した実際の投与量を決定し、個々の個体の 年齢、体重および応答に応じて変える。前記の投与量は、平均的なケースの一例 である。もちろん、高いおよび低い用量の範囲が適当な個体もあり、それらも本 発明の範囲内である。 内在装置には外科移植、補綴およびカテーテル、即ち個体の体内に導入され、 長時間その位置に止まる装置が包含される。このような装置には、例えば人工関 節、心臓弁、ペースメーカー、血管移植片、血管カテーテル、脊髄液シャント、 尿カテーテル、連続歩行腹膜透析（ＣＡＰＤ）カテーテル等を包含する。 本発明の組成物を注射により投与し、内在装置の挿入の直前に、関連する細菌 に対する全身的効果を得ることができる。手術後、装置が体内に在る時間、治療 を続けてよい。加えて、手術用の手術周辺カバーを広げて、スタフィロコッカス 創傷感染を防御するために用いることができる。 多くの整形外科医は、補綴関節を有するヒトは、菌血症が生じ得る歯の治療前 に、抗生物質による予防を考慮すべきであると考えている。後の重い感染は、重 篤な合併症であり、時には補綴関節を喪失し、著しい羅病率および死亡率を伴う 。従って、該活性物質をこの状況の予防的抗生物質の代替品として使用すること にまで拡張することが可能である。 前記の治療に加え、本発明の組成物は、一般に、創傷組織に露出したマトリッ クス蛋白に細菌が付着するのを防ぐための創傷治療薬として使用でき、歯科治療 において抗生物質の予防法に代わって、またはそれと組み合わせて、予防的に使 用できる。 また、本発明の組成物は、挿入直前に内在装置を浸すのに使用できる。有効成 分は、創傷または内在装置を浸す場合、１μｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度 であるのが好ましい。 ワクチン組成物は、注射可能な形態であるのが都合がよい。慣用的なアジュバ ントは免疫応答を高めるために用いることができる。 ワクチン化に適した単位投与量は、抗原０.５〜５μｇ／ｋｇであり、このよ うな投与量は１〜３週間隔で１〜３回投与するのが好ましい。 提示した投与量範囲では、本発明の化合物で、適当な個体への投与を妨げるよ うな、不利な毒性効果は観察されない。 前記の抗体もまた、ｓｐｓＢ蛋白を含有する細菌の存在を検出するための診断 試薬として使用できる。 本明細書に開示したすべての文献および特許出願を、参照により、それら全体 が本明細書に記載されているものとみなす。 以下の実施例を容易に理解するために、汎用される特定の方法および／または 用語を説明する。 実施例 本発明を以下の実施例を用いてさらに詳しく説明する。これらの例示は本発明 の特定の具体的な態様を説明するものであり、本発明に開示する範囲を限定また は規定するものではない。 本明細書で用いる特定の用語は前記した用語説明で説明されている。 以下の細菌株をこれらの実験に使用した：イー・コリ（E．coli）XL-1-Blue、 ＪＭ１０９および１Ｔ４１、エス・アウレウス（S．aureus）ＲＮ４２２０、Ｈ （ＡＴＣＣ１３８０１）、Oxford（ＡＴＣＣ９１４４）およびＷＣＵＨ２９（Ｎ ＣＩＭＢ４０７７１）。エス・アウレウス株はトリプトンソーヤブロス（TSB,Ox ford）またはLuria-Bertaniブロス（Sambrook，J.，et al(1989)．Molecular Cl oning:a Laboratory manual．2nd ed Cold Spring Harbor Laboratory Press Co ld Spring Harbor NY）中において知られている。イー・コリはLuria-Bretaniブ ロス中で培養された。固体培地には１.５％（ｗ／ｖ）寒天を添加した。適宜、 １００μｇ／ｍｌのアンピシリン（イー・コリの場合）および５μｇ／ｍｌのク ロラムフェニコール（エス・アウレウスの場合）を培地に添加した。エス・アウ レウスＷＣＵＨ２９ゲノムライブラリーはStratageneによりベクターλＺａｐＩ Ｉ中に構築された。λＺａｐＩＩエス・アウレウスＨライブラリーは、λＺａｐ ＩＩの製造者（Stratagene）の説明に従ってこの研究室で構築された。イー・コ リからエス・スレウスＷＣＵＨ２９へと移行されたすべてのシャトルベクター構 築物を、まず、リストリクション−マイナス（restriction-minus）のエス・ア ウレウス株ＲＮ４２２０の形質転換に使用し、ついで、そこからプラスミドを精 製して、エス・アウレウスＷＣＵＨ２９の形質転換に使用した。この研究に使用 したプラスミドを下記実施例において説明する。 実施例１ ＤＮＡクローニング （Ａ）ＤＮＡ方法および材料 RPM Kit（Bio 101 Inc.）またはWizard Midiprep DNAPurification System (Promega)を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。水平アガロースゲル電気泳動 、アガラーゼ(Boehringer Mannheim)での処理、Wizard DNA Clean-Up System(Pr omega)によりＰＣＲ生成物を単離した。Genomic DNA Purification Kit（Bacter ial）(Advanced Genetic Technologies Corp.)または公表されている方法（Marm ur，J．(1961)．J．Mol．Biol．3:208-218）のいずれかを用いてイー・コリおよ びエス・アウレウスから染色体ＤＮＡを単離した。エス・アウレウスからのプラ スミドおよび染色体ＤＮＡの調製において細胞溶解を容易にするためにインキュ ベーションおよび適当量のリソタフィン（Applied Microbiology Inc.）を用い た。製造者の説明書に記載のようにしてλＺａｐＩＩライブラリークローンを末 端切断し、再環化させて組み換えファージミドを作成した。ＤＮＡ制限消化およ び脱リン酸化、アガロースゲル電気泳動、ＰＣＲおよびコンピテントなイー・コ リ細胞の形質転換は、本質的にはSambrookらの文献(Sambrook,J.,et al(1989)． Molecular Cloning:a Laboratory manual．2nd ed Cold Spring Harbor Laborat ory Press Cold Spring Harbor NY)に記載のごとく行った。電気的にコンピテン トとなったエス・アウレウス細胞を、以下の変更を加えながらSchenkおよびLadd aga（Schenk，S．and R．A．Laddags．1992．Microbiol．Letts．94:133-138） により記載されたようにして調製した：その変更とは、細菌をＴＳＢ中で増殖さ せ、２５００ｘｇで５分間洗浄することであった。パルスコントローラー付きGe ne Pulser装置（Bio-Rad Laboratories Ltd.）中の１ｍｍのギャップのエレクト ロポレーションキュベット中、２０℃、１００Ω、２５μＦ、２.３ｋＶにて、 コンピテント細胞およびプラスミドＤＮＡをエレクトロポレーションした。制限 酵素および子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼをPromegaから購入した。製造者 の説明書に従ってDNA Lgation Kit(Amersham)を用いて連結反応を行った。Seque nce Version 2.0 DNA Sequencing Kit(Amersham)を用いて配列決定を行った。Op ti-Prime Kit(Stratagene)を用いて最適化されたＰＣＲ反応を、Ｐｆｕ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Promega）およびTa-Cloning Kit(Invitrogen)、pGEM-T Cloning Kit(Promega)またはDNA Ligation Kit(Amersham)のいずれかを用いてHybaid Omn iGeneサーマルサイクラー上で行った。Cruachem LtdまたはR&D Systems Europe Ltd.によりオリゴヌクレオチドが合成された。ＰＣＲプライマー配列（配列番号 ：４〜１３）（鋳型配列との相異を大文字で示す）は以下のとおり： （Ｂ）プライマーペアーに関するＰＣＲサイクル条件 Ａ＋Ｂ（配列番号：４および５）：９４℃で５分、（９４℃で１分、４２℃で１ 分、７２℃で１分）を３０サイクル、７２℃で５分。 Ｃ＋Ｄ（配列番号：６および７）：９４℃で５分、（９４℃で１分、５０℃で１ 分、７２℃で１分）を１５サイクル、７２℃で５分。 Ｅ＋Ｆ（配列番号：８および９）：９４℃で５分、（９４℃で１分、６０℃で１ 分、７２℃で１分）を１５サイクル、７２℃で５分。 Ｇ＋Ｈ（配列番号：１０および１１）：９４℃で５分、（９４℃で１分、４５℃ で１分、７２℃で２分）を１５サイクル、７２℃で５分。 Ｉ＋Ｊ（配列番号：１２および１３）：９４℃で５分、（９４℃で１分、４２℃ で１分、７２℃で３分）を３０サイクル、７２℃で５分。 製造者の説明書に従って、ＤＮＡを０.７％（ｗ／ｖ）アガロースゲルからナ イロン膜(Hybond-N,Amersham)上にサザンブロットした。ライブラリーのスクリ ー ニングを目的として、製造者の説明書に従ってプラークをナイロン膜(Hybond-N, Amersham)に移した。適宜、ＥＣＬ ３’−オリゴラベリングキットまたはＥＣＬ ランダムプライムラベリングキット（Amersham）を製造者の説明書に従って用い て標識したオリゴヌクレオチドまたは全遺伝子プローブに膜をハイブリダイゼー ションさせた。製造者の説明書に従って洗浄および検出工程を行った。すべての 配列データの処理をWisconsin Package(7)を用いて行った。 （Ｃ）ＰＣＲクローニング プライマーＡ＋Ｂ（配列番号：４および５）を用いるＰＣＲによりＳＰａｓｅ をクローニングするために方法を工夫した（材料および方法参照）。既知サイズ のバチルス（Bacillus）由来のＳＰａｓｅに基づいて、適当な長さのＤＮＡフラ グメントをエス・アウレウスOxford由来のゲノムＤＮＡ調合品から得た。そのよ うにして得られた１６３塩基対の配列はビー・ズブチリス（B．subtilis）のｓ ｉｐＳ遺伝子の１６３塩基対に対して非常に相同的であり、タイプＩのＳＰａｓ ｅをコードする遺伝子がクローニングされたことが示された。ＰＣＲ生成物を標 識し、これを用いてエス・アウレウスＷＣＵＨ２９のゲノムＤＮＡのλＺａｐＩ Ｉライブラリーをプローブして配列全体の情報を得た。陽性クローンを同定し、 組み換えプラスミド（ｐＫＣ１０）を数種の制限酵素で消化し、ブロッテイング し、上記と同じ標識ＤＮＡフラグメントでプローブした。ＳａｌＩ消化したｐＫ Ｃ１０調合品を再連結してプラスミドｐＫＣ１１を得た。元々ＰＣＲにより得ら れた配列中から両方向にオリゴヌクレオチドを調べることにより、３０９３塩基 対のインサートＤＮＡの配列を決定した。図３は、エス・アウレウスＷＣＵＨ２ ９の染色体由来の１２２０個のヌクレオチドのＤＮＡ配列を示し、ヌクレオチド ８１７〜１０２５はプローブ領域である。プローブ配列は潜在的な読み枠（ＯＲ Ｆ）を含み、その読み枠は全体として１５１個のアミノ酸残基のポリペプチドを コードし、その算定分子量は２１６９２Ｄａであり、Ｎ末端近傍に疎水性残基の 単一セクションを有し、おそらくそれが単一の膜貫通アンカーを形成するのであ ろう。小型の表面露出ドメインおよび単一の膜貫通アンカーはグラム陽性真正細 菌由来のＳＰａｓｅに典型的である。推定蛋白はすべての既知グラ ム陽性ＳＰａｓｅに対する相同性を示し、その遺伝子をｓｐｓＢ(スタフィロコ ッカス由来のシグナルペプチダーゼ)と命名した。既知ＳＰａｓｅの最高に保存 されている領域に対応する蛋白の領域において最高レベルの配列類似性がみられ ることは特筆に値する。ビー・ズブチリスのＳＰａｓｅ中のこれらの３つの領域 すべて、およびイー・コリのＬＰａｓｅ中の２つの領域は、触媒活性にとり重要 な少なくとも１個の残基を含んでいる（Black，M．T．(1993)．J．Bacteriol．1 75:4957-4961;Tschantz，W．R.，et al，(1993)J．Biol．Chem．268:27349-2735 4;van Diji，J．M.，et al，(1995)．J．Biol．Chem．270：3611-3618）。ｓｐ ｓＢ遺伝子近傍の（１５ヌクレオチド離れている）、ｓｐｓＡと命名された第２ のＯＲＦは、１７４個のアミノ酸からなり分子量２０１４６Ｄａと計算される蛋 白をコードしていると推定される。配列の比較により、この蛋白もまた、既知Ｓ Ｐａｓｅ配列に類似していることが明らかである。ＳｐｓＡとＳｐｓＢとを最適 に並べると、２つの配列間には６２％の類似性および３１％の同一性がある。最 高に配列を保存している領域は同じ場所または近接した場所に存在する。しかし ながら、驚くべき観察結果は、タイプＩのＳＰａｓｅの触媒活性に必須であるこ とが知られているセリンおよびリジン残基がいずれもＳｐｓＡにおいて保存され ていないという事実である。ｓｐｓＡの存在がエス・アウレウスＷＣＵＨ２９株 に独特のものでないことを確かめるために、エス・アウレウスＨから単離された ＤＮＡのλＺａｐＩＩライブラリーを、元々ＷＣＵＨ２９株由来のｓｐｓＡ／Ｂ 遺伝子を含むクローンを同定するのために使用したプローブを用いてプローブし た。ｓｐｓＡおよびｓｐｓＢ両方に極めて近い相同体はエス・アウレウスＨにお いても見出され、ＳｐｓＡもまた、活性部位のセリンおよびリジン残基を欠いて いる。 実施例２ イー・コリにおけるｓｐｓＢ遺伝子の発現 プラスミド上にクローン化されたｌｅｐＢからの活性ＬＰａｓｅの有意な発現 レベルをイー・コリにおいて得ることができる（Dalbey,R.E.and Wickner.260:1 5925-15931;Wolfe，P．B．et al，（1983）J．Biol．Chem．258:12073-12080） 。 酵素源としてイー・コリのＬＰａｓｅを産生するビー・ズブチリスの無細胞抽出 物を用いた場合、遺伝子は転写され、翻訳されていたが、ＬＰａｓｅは膜に正し くアッセンブリーされず、インビトロにおいて検出可能な活性は得られなかった （van Diji，J．M.，et al，(1991)．J．Gen．Microbiol．137:2073-2083）。こ れとは逆に、ビー・ズブチリスのｓｉｐＳによりコードされるＳＰａｓｅのイー ・コリにおける機能的発現が示され、ｓｉｐＳ遺伝子のクローニング成功の手段 となった（van Diji，J．M.，et al，(1992)．EMBO J．II:2819-2828）。Ｓｉｐ Ｓがイー・コリ膜において正しい方向にアッセンブリーされたことは、記載され た研究から明らかである。しかしながら、モニターされた活性は、シグナル配列 の中心部の疎水的領域の伸長を１つの特質とする人工的に加工されたプレ蛋白の 開裂のみであった。それゆえ、ｓｐｓＢ遺伝子がイー・コリにおいて機能的に発 現されうるのかどうか、そしてそのようにして産生されたＳＰａｓｅが天然のイ ー・コリプレ蛋白のシグナル配列の開裂を触媒できるのかどうかを調べることは 興味深いものであった。鋳型配列に対するミスマッチを含むプライマーペアーＣ ＋Ｄを用いるＰＣＲにより、プラスミドＰＫＣ１１からｓｐｓＢ遺伝子を増幅し た。２つの大きな変化を与えるように各ＰＣＲプライマーを設計した。それらの 変化は、遺伝子の各末端に制限部位（５’末端にＥｃｏＲＩ、３’末端のＨｉｎ ｄＩＩＩ）を導入してクローニングを容易にすること、およびサイレントコドン 変化を生じさせる３個の塩基への変化であった。後者の変化を行って、イー・コ リにおいては比較的珍しいスタフィロコッカスのコドンによるｍＲＮＡ翻訳に対 する制限を最小限にし、かつＴＴＧ開始コドンをＡＴＧコドンに変更した。ＰＣ Ｒ生成物をプラスミドｐＤＢ５７５中にクローン化してｐＫＣ１６を得た。クロ ーン化されたインサートの正しい配列を確認し、ｐＫＣ１６を用いてイー・コリ ＸＬ１−Ｂｌｕｅをアンピシリン耐性に形質転換し、イスプロピル−β−チオガ ラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）での誘導後のＳｐｓＢの誘導に関して細胞を試験 した。培養を対数増殖期の中期まで増殖させ、誘導し、誘導後２.５時間後に細 胞を集めた。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＩＰＴＧでのＳｐ ｓＢ発現の誘導がない場合でさえも、イー・コリ（ｐＫＣ１６）により有意 な量のＳｐｓＢが産生されたことが明らかである。分子量２１０００の蛋白に対 応する位置における、対照（レーン２および４）と比較した場合の染色度の増加 (レーン３および５)は、ＩＰＴＧ誘導あり(レーン４および５)およびなし(レー ン２および３)の両方において明らかである。 イー・コリにおいてＳｐｓＢが機能的に活性を有するかどうかを調べるために 実験を行った。イー・コリ株ＩＴ４１はｌｅｐβ遺伝子の単一変異体コピーを有 し、プレ蛋白プロセッシングに関してＴｓである（Inada，T.，et al，(1988).J ．Bacteriol．171:585-587）。ＩＴ４１株は、プレ蛋白プロセッシングおよび細 胞分裂速度が４２℃において厳密に抑制されるが、プラスミドから生じる活性Ｌ Ｐａｓｅでの相補により回復できるので、ＬＰａｓｅの機能および活性の研究に おいて広く使用されている(Black，M．T．(1993)．J．Bacteriol．175:4957-496 1;Black，M．T.，et al，(1992).Biochem．J．282:539-543;Inada，T.，et al， (1988)．J．Bacteriol．171:585-587)。これらの実験条件においてはイー・コリ ＩＴ４１の増殖速度およびプレ蛋白プロセッシング速度の間のはっきりとした関 連性は明らかにされていないことに留意すべきである(Black，M．T．(1993)．J ．Bacteriool．175:4957-4961;Black，M.T.，et al，(1992).Biochem．J．282:5 39-543;Sung，M．and R.E.Dalbey．(1992)．J．Biol．Chem．267:13154-13159;T schantz，W．R.，et al，（1993）J．Biol．Chem．268:27349-27354)。イー・コ リＩＴ４１をｐＫＣ１６および対照プラスミドｐＤＢ５７５で形質転換した。４ ２℃におけるイー・コリＩＴ４１（ｐＤＢ５７５）およびイー・コリＩＴ４１（ ｐＫＣ１６）を、ＩＰＴＧ不存在下（高レベルのＳｐｓＢ産生に対して毒性を示 す可能性があるため）で８時間にわたりモニターした。イー・コリＩＴ４１（ｐ ＤＢ５７５）と比較した場合イー・コリＩＴ４１（ｐＫＣ１６）の増殖速度にお いて実質的な増加があり、ＳｐｓＢの機能的発現が示される。１¹/₂時間という 世代時間は、イー・コリＬＰａｓｅを過剰発現するプラスミドでイー・コリＩＴ ４１を形質転換し、同じ条件で増殖させた場合に観察される世代時間(Black,M． T．(1993)．J．Bacteriool．175:4957-4961)と同様である。しかしながら、イー ・コリＩＴ４１は野生型の増殖特性に復帰することが知られているので、変 異ｌｅｐＢ遺伝子配列が実験中に変化しなかったことを確認する必要があると思 われた。イー・コリＩＴ４１のｌｅｐＢ遺伝子配列はこれまで決定されたことが ないので、相補の研究に用いた細胞のストック由来のこの配列を決定することも 必要であった。イー・コリＩＴ４１（許容温度２８℃で増殖させたイー・コリＩ Ｔ４１、および４２℃で増殖させた後のイー・コリＩＴ４１（ｐＫＣ１６））の 遺伝子をプラスミドpBluescriptII SK中にクローン化した。ついで、各ＰＣＲ生 成物の配列を決定し、同一であることを確認した。いずれの場合も、野生型イー ・コリ ｌｅｐＢ配列と比較すると単一塩基の変化のみが明らかとなった。いず れの場合もイー・コリＩＴ４１ ｌｅｐＢ遺伝子中の塩基変化はｌｅｐＢコーデ ィング配列中のヌクレオチド位置１１５におけるＣ→Ｔトランジションであり、 グルタミンコドン（ＬＰａｓｅ中のＧｌｎ−３９）をＴＡＧアンバーターミネー ションコドンに変化させるものであった。イー・コリＩＴ４１ ｌｅｐＢ遺伝子 の配列が実験中に変化しなかったことが示された。それゆえ、ＳｐｓＢはイー・ コリのプレ蛋白プロセッシングＴｓ変異株ＩＴ４１をインビボにおいて相補する と結論できる。このことから、ＳｐｓＢがイー・コリ形質膜において正しくアッ センブリーされ、すべての必須のイー・コリのプレ蛋白プロセッシングを触媒す るということが推論される。 実施例３ 発現の分析 本質的にはLaemmli（Laemmli，U．K．(1970)．Nature（London）227:680-685 ）の方法に従って、Mini PROTEAN II装置（Bio-Rad Laboratories，Inc.）を用 いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。培養を対数期の中期まで増殖させ、ついで、１ ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより誘導を行った。誘導から２.５時間後に細 胞を集め、Sambrook et al．(Kurosky，A.，et al，Proc．Natl．Acad．Sci．US A 77:3388-3392)に説明されたようにして全細胞溶解物を調製し、１５％（ｗ／ ｖ）アクリルアミド分離ゲルを用いる電気泳動により蛋白を分離した。 相補の研究のために、イー・コリＩＴ４１を適当なプラスミドで形質転換し、 ２８℃で増殖させた寒天プレートから拾ったアンピシリン耐性形質転換体を、許 容温度２８℃においてブロス中で一晩培養した。新鮮培地中に培養を１００倍希 釈し、非許容温度４２℃において振盪しながらインキュベーションした。８時間 にわたり３０分間隔で５４０ｎｍにおけるＯＤを記録した。 ダブルクロスオーバープラスミド組み込み／分離およびプラスミド除去に関す る選択を、クロラムフェニコール存在下、２８℃で一晩増殖したエス・アウレウ スＷＣＵＨ２９（ｐＩＭ０５）およびＷＣＵＨ２９（ｐＩＭII）を用いて行った 。クロラムフェニコール不含新鮮培地中に培養を１００倍希釈し、４３℃でイン キュベーションした。クロラムフェニコール不存在下、４３℃で５６時間培養を 増殖させてプラスミドコピー数を減少させ、その間、培養を新鮮培地中に５回（ １日２回）サブクローンした。ついで、試料を希釈し、クロラムフェニコール存 在下（組み込み／分離）または不存在下（プラスミド除去）、２８℃においてプ レートに撒いた。 染色体由来ｓｐｓＢの、プラスミドから生じたコピーを有するコロニーの同定 を次のようにして行った。マイクロタイタープレート中の、５μｇ／ｍｌのクロ ラムフェニコールを含有する１００μｌのＴＳＢ中にコロニーを撒き、２８℃で 一晩インキュベーションした(Plfai，S.，et al，(1989)J．Clin．Micribiol．2 7:504-506)。マイクロタイタープレートを１０００ｘｇで１０〜２０分遠心分離 し、上清を捨てた。３ユニットのリソタフィンを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ，ｐＨ７.５，１４５ｍＭ ＮａＣｌ ２０μｌ中にペレットを再懸濁し、 ３７℃で３０〜４５分インキュベーションした。製造者の説明書に記載のとおり 、細胞溶解物（２μｌ）をナイロン膜（Hybond-N⁺,Anlersham）にスポットし、 ＤＮＡを変性させ、膜に固定した。製造者の説明書に従ってＥＣＬランダムプラ イムラベリングキット（Amersham）を用いて標識したｓｐｓＢ遺伝子または下流 フランキング領域のいずれかに膜をハイブリダイゼーションさせた。 実施例４ エス・アウレウスにおけるｓｐｓＢ遺伝子の必要性 ビー・ズブチリスおよびビー・アミロリクエファシエンス(B．amyloliquefacien s)はそれぞれ少なくとも２種のＳＰａｓｅ遺伝子を有することが知られているの で、 エス・アウレウスもまた、活性のあるＳＰａａｓｅをコードする第２の遺伝子を 有するかどうかを調べることは興味深いことであった。それゆえ、エス・アウレ ウスにおいて活性のあるクロラムフェニコール耐性決定因子を含むプラスミドｐ ＴＳ１、ＰＥ１９４変異体由来のＴｓＧ複製機能(Villafane,R.,et al，(1987). Ｊ．Bacteriol．169:4822-4829)、ならびにイー・コリにおける複製および選択 を可能にするｐＵＣ１８(Dr．T．Foster，Trinity College，Dublinから贈られ た）を用いるダブルクロスオーバー相同的組み換えにより、エス・アウレウスＷ ＣＵＨ２９染色体からのｓｐｓＢ遺伝子の欠失を試みた。一般的方法および方法 の詳細は、イーコリについてHanmiltonら（Hamilton，C.M.，et al，1989．Newm ethod for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli ．J．Bacteriol．171：4617-4622）により記載されたものである。方法の要旨は 、目的遺伝子に近接した上流（Ｉ）および下流（Ｄ）領域をＴｓ複製機能ととも にプラスミド中にクローン化することである。非許容温度における増殖は、相同 的組み換えによる組み込み（Campbellタイプの組み込み）について選択するもの であり、許容温度における同時組み込み体のその後の増殖は２回目の組み込みを 誘導し、プラスミド分離を引き起こす。１回目の組み込みが領域Ｕにおいて起こ り、２回目の組み込みが領域Ｄにおいて起こったとしても、あるいはその逆であ ったとしても、目的遺伝子は染色体からプラスミドに移されるであろう。目的遺 伝子がなくても済む場合、その後、温度を上昇させることにより組み換えプラス ミドを細胞から除去することができるが、遺伝子が必須のものである場合、プラ スミドを除去することはできない（あるいは、さらなる組み換えが全プロセスを 逆行させ、遺伝子を染色体に戻す場合には除去できない）。ｓｐｓＢ遺伝子の上 流および下流の両方、それぞれ８５０塩基対のＤＮＡの領域を、プライマーペア ーＥ＋ＦおよびＧ＋Ｈそれぞれを用いてプラスミドｐＫＣ１１からＰＣＲ増幅し た。これらのペアーは末端制限酵素部位を生じさせて、その後のクローニング工 程を容易化させる。ＰＣＲ生成物をクローン化し、ＫｐｎＩ部位を介してｐＵＣ １８（ｐＩＭ０４）中に連結し、増幅中にＤＮＡ配列にエラーが生じなかったこ とを確認した。ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位を用いて１７００塩基対のフラグメ ント をｐＴＳ１のマルチプルクローニング部位中にサブクローン化し、構築物ｐＩＭ ０５をイーコリからエス・アウレウスＲＮ４２２４中に形質転換し、ついで、エ レクトロポレーションによりエス・アウレウスＷＣＵＨ２９に形質転換した。相 同的組み換えによる染色体中への組み込みならびにそこからのプラスミド除去に 関して選択するために適当な温度サイクリングを行った後、個々のコロニーから 細胞溶解物を調製し、ｓｐｓＢ用のプローブへのハイブリダイゼーションにより 、染色体由来のｓｐｓＢのコピーを有するプラスミドの存在についてスクリーニ ングした。１のかかるクローンを単離し（ｐＩＭ１１）、制限分析およびサザン ブロッティングによりそのアイデンティティを確認した。細胞からこのクローン を除去するために４３℃における温度サイクリングに供した。クロラムフェニコ ール不存在下で細胞を撒き、１４６個のコロニーをプレートからクロラムフェニ コール含有または不含プレートへとレプリカした。７６個のコロニーがクロラム フェニコール存在下でよく増殖したが、残のコロニーは増殖しないか、またはほ とんど増殖しなかった。クロラムフェニコール感受性コロニーからプラスミドは 単離できず、すべての場合において、クロラムフェニコール耐性コロニーから単 離されたプラスミドは野生型ｓｐｓＢを有していた。エス・アウレウス（ＰＩＭ １１）からのクロラムフェニコール感受性コロニーの出現について２つの説明が 可能である。１つは、ｓｐｓＢは必須遺伝子ではないという説明であり、もう１ つは、染色体とともに組み換えられたプラスミドｐＩＭ１１が分離し、ｓｐｓＢ が染色体上に置かれ、その後プラスミドが細胞から消失したという説明である。 これら２つの可能性のいずいれかを見極めるために、１０個のかかるコロニー、 エス・アウレウス（ｐＩＭ１１）およびエス・アウレウスＷＣＵＨ２９からゲノ ムＤＮＡを単離し、オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーＩ＋Ｊを用いて染色体 ＤＮＡをそれらから増幅した。プライマーは、ｐＩＭ１１中にクローン化された 配列の上流および下流に存在する染色体ＤＮＡの領域に対応し、そのことにより 、検出されないプラスミドから生じた標的配列の増幅の可能性は排除される。そ のようにして得られたＤＮＡフラグメントをアガロースゲル上でサイズ分画し、 ナイリン膜にブロットした。２枚の同じ膜を用意し、ｓｐｓＢを認識す る標識オリゴヌクレオチドでプローブしてｓｐｓＢの存在または不存在を確認し 、あるいは下流近接領域に結合する標識オリゴヌクレオチドでプローブした。最 初にｓｐｓＢを染色体に戻すことなくプラスミドｐＩＭ１１がエス・アウレウス から失われる場合はなかった。なぜなら、増幅フラグメントは、エス・アウレウ スＷＣＵＨ２９ＤＮＡから増幅されたものと同じサイズ（２５５４塩基対）であ り、生成物はｓｐｓＢおよび下流近接領域の両方についてのプローブにハイブリ ダイゼーションしたからである。エス・アウレウス（ｐＩＭ１１）由来の染色体 ＤＮＡを増幅することにより得られた生成物は小さく（１９７９塩基対）、ｓｐ ｓＢ用のプローブにハイブリダイゼーションせず、ｓｐｓＢが染色体から欠失さ れ、プラスミドＤＮＡでなく染色体ＤＮＡが増幅されたことが確認された。これ らのデータから、ｓｐｓＢ遺伝子によりコードされるタイプＩのＳＰａｓｅはエ ス・アウレウスにおけるプレ蛋白プロセッシングにおいて不可欠な役割を有して おり、この活性はエス・アウレウスの生存に必須であることが推論される。対照 実験としてエス・アウレウスＷＣＵＨ２９をプラスミドｐＩＭ１１で形質転換し 、温度サイクリングに供し、上記のごとくレプリカプレーティングを行った。プ ラスミドから生じたｓｐｓＢはｓｐｓＢ部分二倍体から容易に除去された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 48/00 45/00 Ａ６１Ｐ 31/04 48/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ａ６１Ｐ 31/04 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 16/40 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/48 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ 9/48 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 33/53 37/54 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ６０／０２７，２２０ (32)優先日 平成８年10月１日(1996．10．1) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 オドワイヤー，カレン・エム アメリカ合衆国19460ペンシルベニア州フ ェニックスビル、カーネル・ウィリアム・ デウィーズ・プレイス1311番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）配列番号２のアミノ酸１から１９１までを含むポリペプチドをコー ドするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレ オチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相捕的なポリヌクレオチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続した 塩基を含むポリヌクレオチド からなる群より選択されるメンバーを含む単離ポリヌクレオチド。 ２．ＤＮＡである請求項１のポリヌクレオチド。 ３．ＲＮＡである請求項１のポリヌクレオチド。 ４．ｓｐｓＢをコードする配列番号：１に示すヌクレオチドを含む請求項２の ポリヌクレオチド。 ５．配列番号：１に示すｓｐｓＢコーディング配列を含む請求項２のポリヌク レオチド。 ６．配列番号：２のアミノ酸１から１９１までを含むポリペプチドをコードす る請求項２のポリヌクレオチド。 ７．（ａ）ＮＣＩＭＢ受託番号４０７７１中に含まれるＤＮＡにより発現され るのと同じ成熟ポリペプチドをコードしており、配列番号：１のポリヌクレオチ ド配列を有するポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポ リヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相捕的なポリヌクレオチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の塩基を含 むポリヌクレオチド からなる群より選択されるメンバーを含む単離ポリヌクレオチド。 ８．請求項２のＤＮＡを含むベクター。 ９．請求項８のベクターを含む宿主細胞。 １０．上記ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを請求項９の宿主細胞から 発現させることを含むポリペプチドの製造方法。 １１．細胞が、ベクター中に含まれるｃＤＮＡによりコードされるポリペプチ ドを発現するように、請求項８のベクターで細胞を形質転換またはトランスフェ クションすることを含む、ポリペプチドを発現する細胞の製造方法。 １２．配列番号：２のアミノ酸１から１９１までに対して少なくとも７０％同 一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド。 １３．配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド。 １４．請求項１２のポリペプチドに対する抗体。 １５．請求項１２のポリペプチドの活性を阻害するアンタゴニスト。 １６．治療上有効量の請求項１２のポリペプチドを個体に投与することを含む 、ｓｐｓＢを必要とする個体の治療方法。 １７．前記ポリペプチドをコードしていて、前記ポリペプチドをインビボで発 現するＤＮＡを個体に提供することにより、該治療上有効量の前記ポリペプチド が個体に投与される、請求項１６の方法。 １８．治療上有効量の請求項１５のアンタゴニストを個体に投与することを含 む、ｓｐｓＢポリペプチドの阻害を必要とする個体の治療方法。 １９．請求項１２のポリペプチドをコードする核酸配列を決定することを含む 、請求項１２のポリペプチドの発現に関連した疾病の診断方法。 ２０．宿主由来の試料中の請求項１２のポリペプチドの存在につき分析するこ とを含む診断方法。 ２１．請求項１２のポリペプチドに対する結合分子を表面に発現する細胞を、 結合分子への結合を可能にする条件下でスクリーニングすべき化合物と接触させ ること（該結合分子は、化合物の該結合分子への結合に応答して検出可能なシグ ナルを発生しうる第２の成分に結合している）、 ついで、化合物と結合分子との相互作用により生じるシグナルの存在または不 存在を検出することにより、化合物が結合分子に結合し、結合分子を活性化また は阻害するかどうかを決定すること を含む、請求項１２のポリペプチドに結合し、請求項１２のポリペプチドの活性 を阻害する化合物の同定方法。 ２２．上気道感染（例えば、中耳炎、細菌性気管炎、急性咽頭蓋炎、甲状腺炎 ）、下気道感染（例えば、蓄膿症、肺膿瘍）、心臓感染（例えば、感染性心内膜 炎）、胃腸感染（例えば、分泌性下痢、脾臓膿瘍、腹膜後膿瘍）、ＣＮＳ感染（ 例えば、大脳膿瘍）、眼感染(例えば、眼瞼炎、結膜炎、角膜炎、眼内炎、前中 隔および眼窩蜂巣炎、涙嚢炎)、腎および尿管感染（例えば、副睾丸炎、腎内お よび腎周囲膿瘍、トキシックショック症候群）、皮膚感染（例えば、膿痂疹、毛 嚢炎、皮膚膿瘍、蜂巣炎、創傷感染、細菌性筋炎）、ならびに骨および関節感染 （例えば、敗血症性関節炎、骨髄炎）のごとき疾病から哺乳動物を防御する抗体 を生成するに十分なｓｐｓＢまたはそのフラグメントまたはその変種を哺乳動物 に接種することを含む、哺乳動物における免疫学的応答の誘導方法。 ２３．遺伝子治療により、ｓｐｓＢまたはそのフラグメントまたはその変種を コードしている遺伝子をデリバリーし、ｓｐｓＢまたはそのフラグメントまたは その変種をインビボで発現させて、哺乳動物を疾病から防御する抗体を生成させ る免疫学的応答を誘導することを含む、哺乳動物において免疫学的応答を誘導す る方法。 ２４．ｓｐｓＢポリヌクレオチドまたはそれによりコードされる蛋白をコード し発現するＤＮＡを含む免疫学的組成物であって、該ＤＮＡが哺乳動物中に導入 された場合にｓｐｓＢポリヌクレオチドまたはそれによりコードされる蛋白に対 する免疫学的応答が哺乳動物において誘導されるものである組成物。