JP2001501819A

JP2001501819A - アデノ随伴ウィルスベクターの非侵襲性投与

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Publication number: JP2001501819A
Application number: JP10515805A
Authority: JP
Inventors: スナイダー、リチャード; デイノス、オリヴァー; マッカーサー、ジェイムズ; マリガン、リチャード
Original assignee: Cell Genesys Inc
Current assignee: Cell Genesys Inc
Priority date: 1996-09-25
Filing date: 1997-09-25
Publication date: 2001-02-13
Also published as: CA2266619A1; EP0928202A4; KR20000048623A; EP0928202A1; AU743335B2; AU4736797A; WO1998013070A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトを含む動物において、対象遺伝子の効果的な長期発現のためのリコンビナントＡＡＶベクターを投与する新規な方法を提供する。遺伝子治療のために、拡散可能なポリペプチド、リボザイム、核酸又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかをコードする対象遺伝子を含むリコンビナントＡＡＶベクターを皮下投与する方法がここで提供される。本発明の方法は、皮下注入を介して定義されたサイズの拡散可能ポリペプチド又は核酸のいずれをもデリバリーし、適当な又は皮下注入の部位から遠位の領域において高レベル長期発現を得る能力を含む重要な利点をもたらす。

Description

【発明の詳細な説明】アデノ随伴ウィルスベクターの非侵襲性投与序背景アデノ随伴ウィルス(ＡＡＶ'ｓ)はアデノウィルスの調製物に存在するサテライトウィルスとして発見された。ＡＡＶ単離物（ヒト、サル及びトリ）は、明白な疾患を引き起こさず、ガン又は他の如何なる副作用にも関連しない。いくつかの研究では、ＡＡＶが他のウィルス、例えばアデノウィルスの腫瘍形成株及びウシパピローマウィルスにより仲介される発癌において防御効果を有することを示している。リコンビナントＡＡＶベクターは、in vitro（普通、組織培養物）での遺伝子産物を発現するため及び、普通、肺又は口腔粘膜、ＡＡＶ感染の通常部位だけでなく、中央神経系及び心組織において、動物での遺伝子産物を発現するために用いられている。例えば米国特許第5,193,941号及びWO94137898号を参照のこと。リコンビナントＡＡＶベクターによる形質導入は、動物において、より直接的な投与経路、例えば腹腔内注入、気管内注入及び直接的な気管支内滴注によって達成されている。例えばFlotte及びCarter，Gene Therapy 2:357-362(1995)を参照のこと。ｒＡＡＶをデリバリーするこのような方法は、実験が嚢胞性線維症の患者を治療することに向けられた場合に、肺に最も近い部位にリコンビナントＡＡＶベクターを配置することに焦点が絞られている。しかしながら、例えば、感染及び付着を起こす危険性から、腹腔内、気管内及び気管支内注入はヒトにおける常習使用には望ましくない臨床的技術であるとよく言われている。Goodman及びGilman，”The Pharmacological Basis of Therapeutics”pp.1-32(第８版，1 993)を参照のこと；また"Remington's Pharmaceutical Sciences"p.1686（18版1 990年）も参照のこと。遺伝子治療のある到達点は、特定の対象遺伝子の長期間にわたる治療効果的レベルの発現を、このような遺伝子発現が治療的に有益である組織に又はこの組織の近傍にもたらすことである。効果的な遺伝子治療の開発のための多くの挑戦が行われており、これには、標的組織内での対象遺伝子の発現を得ることが含まれ、これは少なくとも、標的組織内で作用するリコンビナントＡＡＶベクター中のプロモータと、適当な組織へリコンビナントＡＡＶベクターをデリバリー（体内配送）する投与方式を必要とする。従って、遺伝子治療のためのリコンビナントＡＡＶベクターの安全で効果的な投与方法について当業界に要請がある。発明の要約本発明は、ヒトを含む動物において、対象遺伝子の効果的な長期発現のためのリコンビナントＡＡＶベクターの新規な投与方法を提供する。遺伝子治療のために、拡散可能なポリペプチド、リボザイム、核酸又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかをコードする対象遺伝子を含むリコンビナントＡＡＶベクターを皮下注入する方法がここで提供される。本発明はまた、ホストに対するｒＡＡＶの局所投与手段についても提供する。本発明の方法は、重要な利点をもたらし、これには適当な対象遺伝子のいずれもを皮下注入又は局所手段を介してデリバリーし、投与部位に接近した又は離れた領域内での高いレベルの長期間発現をもたらす能力が含まれる。本発明の投与経路は、ここで記述されるリコンビナントＡＡＶベクターの投与のための安全で効果的な非侵襲性手法を提供する。遺伝子治療のためのリコンビナントＡＡＶベクターの皮下注入が効果的であり、高レベルの持続された発現をもたらすという発見は、特に肺及び口腔路によるＡＡＶの通常の関連性と、遺伝子発現の標的となる組織内で作用可能となるためのリコンビナントＡＡＶベクターのためのプロモータに対する必要条件と、普通、皮下注入されたリコンビナントＡＡＶベクターのリンパ節への急速な排出及びホスト免疫系における急速なクリアランスをもたらす皮下注入の希釈効果との観点から、特に驚くべきことである。ここで記述される方法及びリコンビナントＡＡＶベクターは、リコンビナントＡＡＶベクター遺伝子治療の分野における重要な発展をもたらす。図面の簡単な説明図１は、ｒＡＡＶ−ＭＦＧ−ヒト一第IX因子ベクターの模式図である。ＩＴＲ：ＡＡＶ逆方向末端繰返し配列；ＭＦＧ：マウスモロニーウイルス長末端繰返し配列；ＭｕＬＶＩＶＳ；ｍＲＮＡスプライスドナー／スプライスアクセプター；ヒトＦＩＸ：ヒト第IX因子ｃＤＮＡ；ｂＧＨｐＡ：ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位。図２は、ｒＡＡＶ−ＭＤ−ヒト−インターフェロンベクターの模式図である。ＩＴＲ：ＡＡＶ逆方向末端繰返し配列；ＣＭＶ：サイトメガロウィルス前初期プロモータ；β−ｇｂＩＶＳ：β−グロビンｍＲＮＡスプライスドナー／スプライスアクセプター；ヒトＩＦＮ：ヒトインターフェロンｃＤＮＡ；β−ｇｂｐＡ：β−グロビンポリアデニル化部位。図３は、ｒＡＡＶ−ＭＤ−マウスエリスロポエチンベクターの模式図である。ＩＴＲ：ＡＡＶ逆方向末端繰返し配列；ＣＭＶ：サイトメガロウィルス前初期プロモータ；β−ｇｂＩＶＳ：β−グロビンｍＲＮＡスプライスドナー／スプライスアクセプター；マウスＥＰＯ：マウスエリスロポエチンｃＤＮＡ；β−ｇｂｐＡ：β−グロビンポリアデニル化部位。図４は、ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺベクターの模式図である。ＩＴＲ：ＡＡＶ逆方向末端繰返し配列；ＣＭＶ：サイトメガロウィルス前初期プロモータ；ＳＶ４０ＩＶＳ：ＳＶ４０ｍＲＮＡスプライスドナー／スプライスアクセプター；ＬａｃＺ：大腸菌β−ガラクトシダーゼｃＤＮＡ；ＳＶ４０ｐＡ：ＳＶ４０ポリアデニル化部位。図５は、５.９×１０¹⁰粒子のｒＡＡＶ−ＭＦＧ−ｈ第ＩＸ因子を皮下注入された免疫応答性マウスにおけるヒト第ＩＸ因子の長期発現を示すグラフである。図６は、５.９×１０⁹粒子のｒＡＡＶ−ＭＦＧ−ｈ第ＩＸ因子を皮下注入された免疫応答性マウスにおけるヒト第ＩＸ因子の長期発現を示すグラフである。図７は、５.９×１０⁸粒子のｒＡＡＶ−ＭＦＧ−ｈ第ＩＸ因子を皮下注入された免疫応答性マウスにおけるヒト第ＩＸ因子の長期発現を示すグラフである。図８Ａ及び８Ｂは、ｒＡＡＶ−ＭＦＧ−ｈ第ＩＸ因子の粒子の単一の注入で皮下注入された動物における抗ヒト第ＩＸ因子抗体レベル及び抗ＡＡＶ抗体レベルをそれぞれ示す２つのチャートである。図８Ａは、抗ＦＩＸ活性についての抗体力価を描いている。図８Ｂは、抗ＡＡＶ活性についての抗体力価を描いている。図９Ａ及び９Ｂは、リコンビナントＡＡＶ−ＭＦＧ−ヒト第ＩＸ因子による皮下注入（各注入は、５.９×１０¹⁰、５.９×１０⁹又は５.９×１０⁸粒子を含む）後の免疫応答性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）と免疫無防備状態マウス（ＮＩＨ−３）におけるヒト第ＩＸ因子の長期発現を描いている。図１０は、図９で記述された動物の抗ヒト第ＩＸ因子抗体レベルを示している。図１１Ａ及び１１Ｂは、リコンビナントＡＡＶ−ＭＤ−インターフェロンによる皮下注入（８.５×１０¹⁰、８.５×１０⁹又は８.５×１０⁸粒子）後の免疫応答性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）と免疫無防備状態マウス（ＮＩＨ−３）におけるヒトインターフェロンの長期発現を描いている。図１２は、ｒＡＡＶ−ＭＤ−マウス−ＥＰＯの皮下注入（８.９×１０⁹又は８ .９×１０¹⁰粒子）の後に続くＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるマウスＥＰＯの発現を示している。マウスＥＰＯの発現は、ヘマトクリットをモニターすることによって測定された。図１３は、ｒＡＡＶ−ＭＤ−ＥｐｏのＳＣ注入の後、第１０５日目でのＥＰＯタンパク質レベル。タンパク質レベルは、ＲＩＡにより測定された。図１４Ａ及び１４Ｂは、ｒＡＡＶ−ＭＤ−マウス−エリスロポエチンの皮下又は筋肉注入後でのＢＡＬＢ／ｃマウスのヘマトクリットを描いている。図１５は、ｒＡＡＶ−ＭＤ−ＥＰＯの皮下又は筋肉注入後、第１８０日目でのＥＰＯタンパク質のレベルである。図１６は、ｒＡＡＶ−ＭＤ−ヒトＩＦＮの皮下注入後のＢＡＬＢ／ｃマウスの血清におけるヒトインターフェロンレベルを示すチャートである。図１７は、ｒＡＡＶ−ＭＦＧ−Ｆ９の筋肉注入後のＢＡＬＢ／ｃマウスの血清におけるヒト第ＩＸ因子レベルを示すチャートである。図１８ β−ガラクトシダーゼ発現は、未感染動物の皮筋層において検出されなかった。図１９ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺの皮下注入後の皮筋層におけるβ−ガラクトシダーゼ発現。図２０は、ｐＳＳＶ９ＭＤ−２ＡＡＶ発現ベクターのダイアグラムである。図２１は、ＳＳＶ９ＭＤ２−ｍＥＰＯＡＡＶベクターのダイアグラムである。図２２は、ＳＳＶ９ＭＤ２−ヒトアルファ２Ａインターフェロンベクターのダイアグラムである。図２３は、ＳＳＶ９ＭＦＧ−ＳｈｕＦ９ベクターのダイアグラムである。図２４は、ＭＦＧ−Ｓ−ｈＦＩＸベクターのダイアグラムである。特定実施形態の記載遺伝子治療のために、拡散可能なポリペプチド、リボザイム、核酸若しくはアンチセンスポリヌクレオチドのいずれかをコードする外来対象遺伝子を含むリコンビナントＡＡＶベクターを皮下注入する又は局所適用する方法が、ここで提供される。本発明の方法は重要な利益を提供し、これには、投与部位の近位又は遠位の領域においで高いレベルでの長期発現を得るために、拡散可能な対象遺伝子のいずれかを皮下注入又は局所適用を介してデリバリーする能力を含む。例えば、ヒト第ＩＸ因子は、ヒト第ＩＸ因子遺伝子を含むリコンビナントＡＡＶベクターを皮下注入された免疫応答性マウスのおよそ２／３において、高いレベルで発現された。ヒト第ＩＸ因子を発現した免疫応答性マウスは、１回の注入の後、約３６５日にわたり高い血清レベルのヒト第ＩＸ因子を含んでいた(図６参照)。ヒトインターフェロン遺伝子又はマウスエリスロポエチン遺伝子を含むリコンビナントＡＡＶベクターの皮下注入は、また高い血清レベルの双方の遺伝子産物をもたらし、これは皮下注入後、それぞれ少なくとも１７５日及び３５日持続した。ここで記述される方法及びリコンビナントＡＡＶベクターにより得られる高レベルの長期発現のために、くり返し投与は常習的なものである必要はなく、周期的な間隔での投与とすることができる。遺伝子治療のための皮下注入又は局所適用は、リコンビナントＡＡＶベクターを投与する簡単で安全且つ非侵襲性の方法であり、これは、他のもの、既述された侵襲性の投与方法（例えば、腹腔内、気管内及び気管支のもの）に対してすこぶる好ましい。リコンビナントＡＡＶベクターの皮下又は局所デリバリーは、操作及び投与の簡便性の利点ももたらす(例えば、自己投与)。リコンビナントＡＡＶベクター粒子の皮下注入は、免疫応答動物が長期間にわたる対象遺伝子を高いレベルで発現できるようにし、一方、特定のリコンビナントＡＡＶベクター粒子の他のデリバリー経路は、比較可能な発現レベルをもたらさない。図１２、１６及び１７を比較のこと。免疫無防備状態の動物における対象遺伝子の発現は、投与量依存性であり、終始変わらないことがわかった。発現は、試験された期間において上昇することがわかった。更に、免疫応答性マウスにおいてリコンビナントＡＡＶベクターを介して注入されたマウスエリスロポエチンのような同系遺伝子のデリバリーは、投与量依存性であり、高いレベルで且つ終始一貫した発現となった。図１２を参照のこと。本発明のリコンビナントベクターは、次の成分を含む：(１)非ＡＡＶ起源に由来するプロモータ、（２）ｍＲＡＮスプライスドナー／スプライスアクセプター、（３）対象遺伝子、例えば治療ポリペプチド又はその治療効果性部位、（４）ポリアデニル化部位並びに、（５）上記(1)−(4)の成分に隣接する２つのＡＡＶ末端繰返し配列。対象遺伝子は、拡散可能ポリペプチド、すなわち、全身性デリバリーに作用するために投与部位から拡散することができるポリペプチド、又は拡散可能な核酸をコードする如何なるポリヌクレオチドであることができる。例えば、遺伝子治療に有用であり得る拡散可能ポリペプチドには、インシュリン、第ＶＩＩＩ因子並びに、インターフェロン(ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−γ)、インターロイキン、ＧＭ−ＣＳＦ(顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子)、Ｍ−ＣＳＦ(マクロファージコロニー刺激因子)、腫瘍壊死因子及び増殖因子（ＴＧＦ−β （トランスフォーミング増殖因子−β）及びＰＤＧＦ(血小板由来増殖因子)）を含む如何なるサイトカインをも含まれる。当業者にとって、治療対象の如何なる拡散可能ポリペプチドをも皮下注入又は局所投与を介して発現するために、ここで記述された方法を用いることができることはすぐに明らかになるであろう。対象遺伝子はまた、アンチセンスポリヌクレオチド又はリボザイムであってもよい。プロモータは、多くの特徴付けられた如何なるウィルス（例えば、チミジンキナーゼ及びラウス肉腫ウィルス）でも又は細胞性プロモータ（例えば神経系特異的エノラーゼ、ビメンチン及びフィブロネクチン）でもあることができる。付随する調節シグナルもまた、そのベクター骨格における導入遺伝子の発現のために用いられることができる。誘導可能プロモータ（メタロチオネインなど）による調節された遺伝子発現もまた、そのリコンビナントＡＡＶベクターにおける導入遺伝子の発現を指揮することができる。ＣＭＶ発現カセットもまた、制御された遺伝子発現のために使用できる。分泌治療外来遺伝子産物をコードするリコンビナントＡＡＶベクターのin viv o投与に指向した簡単な非侵襲性手法についての研究が、ここで記述される。ヒト第ＩＸ因子因子（ｈｕＦＩＸ）又はヒトα−インターフェロン（ｈｕＩＦＮ）をコードするリコンビナントＡＡＶベクター粒子は、調製されて、免疫応答性ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮膚下に注入された(３００μＬの量のＨＢＳＳ（ハンクス調整塩溶液）中１０⁸から１０¹⁰粒子)。分泌タンパク質の存在は、１回の皮下注入の後のある期間にわたり回収した血清試料中でモニターした。いずれかのベクターを使用して、ヒトタンパク質の永続性全身性の放出が、再現可能に観察された。普通、５−５０ｎｇ／ｍｌのレベルのｈｕＦＩＸ及び２− ７ｎｇ／ｍｌのレべルのｈｕＩＦＮが、数週間にわたり達成された。このレベルは、最も後の到達時点まで、一定を保つかわずかに上昇した。この状況は普通、５つの実験グループにおいて２又は３の動物で観察された。実験が充分に免疫不全となったＮＩＨ−３マウスにおいて繰り返された場合、長期発現は全ての動物において観察された。これに対して、ｈｕＦＩＸをコードするＡＡＶベクターがＢＡＬＢ／ｃマウスへ筋肉注入を用いてデリバリーされた場合には、タンパク質は全ての動物の血清中に一過性的に検出され、強いホルモン応答が均一に観察された。この結果は、外来遺伝子の長期全身性デリバリー及び発現が、機能的な免疫系の存在下でリコンビナントＡＡＶの皮下注入後に観察できることを示している。マウスエリスロポエチンをコードするリコンビナントＡＡＶベクター粒子もまた、免疫応答性ＢＡＬＢ／ｃマウスに上述のように調製されて皮下注入された。対象遺伝子はホストとは同系のものであった。マウスエリスロポエチンの発現は、ある期間にわたり回収された血清試料においてモニターされた。モニターされた期間にわたり、マウスエリスロポエチンの発現は、ヘマトクリットによりアッセイされて、高いレべルの発現が観察された。皮下デリバリーは、皮膚が生命維持器官でなく、アクセスするのがかなり容易であるため、in vivo遺伝子デリバリーにはかなり魅力的な様式である。生成される及び／又は分泌されることが必要であるような欠損遺伝子産物に疾病が起因するもの、例えば血友病、糖尿病及びゴシェ病などであるならば、皮下デリバリーは遺伝子産物をデリバリーする良好な候補方式である。リコンビナントＡＡＶベクターの実際のデリバリーは、ＡＡＶリコンビナントベクターをホストの皮下領域へ移行し得るいずれかの物理的方法を用いることによって達成される。本発明において「ＡＡＶベクター」とは、裸のリコンビナントＡＡＶベクターと、ＡＡＶ投与について周知である場合のウィルスコートタンパク質にパッケージされたリコンビナントＡＡＶベクターポリヌクレオチドとの双方を意味する。ＡＡＶベクターをハンクス調整食塩水又はリン酸緩衝食塩水に簡単に溶解することは、皮下注入とそれに続く注入部位から遠くでの発現に有用なビヒクルを提供するのに充分であると実証されている。ベクターと共に投与できるキャリア又は他の成分における制約は知られていない(しかし、ポリヌクレオチドを分解する組成物は、ベクターによる通常の方法において排除されるべきである)。医薬組成物は、皮下的に又は経皮的輸送によりデリバリーされるべき注入可能な配合物として又は局所配合物として調製されることができ、これには、移植可能な皮下ポンプ（当業者に既知であり、例えば米国特許第5,474,552号に既述されている）が含まれる。皮下注入及び経皮輸送のための多くの配合剤が開発されており、本発明の実施において使用できる。本ベクターは投与及び取り扱いの容易性から、いずれかの医薬的に許容可能なキャリアと共に使用できる。皮下注入の目的のために、アジュバント、例えばゴマ若しくはピーナッツ油中の又は水性プロピレングリコール中の溶液と、滅菌水溶液とが使用できる。このような水性溶液は、所望する場合には緩衝化し、食塩水又はグルコースによりまず等張化された液体希釈剤にすることができる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含有する）としてのＡＡＶベクターの溶液又は医薬的に許容可能な塩は、界面活性剤、例えばヒドロキシプロピルセルロースと適当に混合された水中で調製できる。ＡＡＶウィルス粒子の分散物はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びこれらの混合物並びに油中でも調製できる。保管及び使用の通常の条件下で、調製物は微生物の成長を妨げるために防腐剤を含有する。全てに用いられる滅菌水性培地は、当業者に周知の標準技術により簡便に入手可能である。注入可能使用に適当な医薬形態には、滅菌水溶液若しくは分散物と、滅菌注入可能溶液若しくは分散物の調合調製についての滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、この形態は、最終調製物が、選択された装置手段により投与できる程度まで、滅菌されなければならず、流体でなければならない。医薬物は、操作及び保管の条件下で安定でなければならず、細菌及びカビのような微生物の汚染活性に対して防御されなければならない。キャリアは、溶媒又は分散物培地であることができ、これには、例えば水、エタノール、ポリオール (例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)、これらの適当な混合物、並びに植物油が含まれる。適度な流動性が、例えば、レシチンのような被覆物の使用によって、分散物の場合における必要な粒子サイズの維持によって、並びに界面活性剤の使用によって、維持できる。微生物の活性の防止は、種々の抗菌剤及び抗カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張薬剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むように調製可能であろう。注入可能組成物の延長された吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばアルミニウムモノステアレート及びゼラチンの使用によりもたらされることができる。滅菌注入可能溶液は、必要量のＡＡＶベクターを適当な溶媒に、必要ならば上掲の他の種々の配合剤と共に混和し、それからフィルターを通した滅菌を行うことによって、調製される。一般に、分散物は、滅菌活性成分を、基本分散培地及び上掲ものからの必要な他の不活性成分を含有する滅菌ビヒクルに混和することによって調製される。滅菌注入可能溶液の調製物用の滅菌粉末の場合、調製の好適な方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これらは、活性成分と、既にフィルターで滅菌されたその溶液からの如何なる付加的な所望配合剤との粉末をもたらす。局所投与のために、希釈滅菌水性溶液は、普通約０.１％から５％、又は必要であればそれ以上の濃度であり、或いは上記非経口溶液と同様であるが、これは、経皮パッチによるデリバリーに適当な容器内で調製され、またこれは既知のキャリア、例えば医薬品級ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。或いは、局所調製物を製造するための他の既知の配合物、例えば軟膏、クリーム、洗浄液、滴剤、スプレーなどは、皮膚表面での、又は滴注用、例えば目又は鼻用の滴剤及びスプレーとして使用のために、このような形態に調製する当業界で既知であるように実施できる。本発明の内容において、「局所」とは、対象となる本発明の適用のために、局部的又は特定の容易にアクセス可能なホストの部位のいずれをも示すことを意味する。従って、皮膚の表面に対する軟膏及びクリーム、耳又は鼻での滴注のための滴剤又は軟膏、鼻又は口での滴注のためのスプレー又はミスト、坐薬などは、本発明の範囲内に適合すると意図される。局所投与は、皮膚をわずかに摩擦することと組み合わされて、ケラチン化表皮を通過して、皮膚、下層結合組織、筋肉、組織間隙及び循環系へ容易にアクセス可能にすることができる。本発明の治療化合物は、単独で又は医薬的に許容可能なキャリアと組合わせて、哺乳類に投与してもよい。上述したように、活性配合剤とキャリアの相対比は、化合物の溶解性及び化学的性質、選択された投与経路及び標準医薬実施方法（プラクティス）により決定される。また、当業界で周知のように、ｒＡＡＶ粒子は、微小管、例えばリポソーム、微小カプセル、微小ビーズなどに封入されることができる。標準治療操作方法は、微小カプセル及び微小ビーズを作製するために使用できる。また、リポソーム及び、そのような水性コアを取り巻く他の脂質膜構造物を作製する標準方法を、当業界で既知の実施方法とすることができる。予防又は治療に最も適しているであろう本治療剤の用量は、投与の形態、選ばれた特定のリコンビナントＡＡＶベクター及び治療における特定の患者の生理学的特徴により変えることができる。一般に、最初は少量が用いられ、必要であればある状況下での最適な効果が達成されるまで、少量の増加量で増やすことかできる。ヒトの例示用量は、約３−１０ｍＬまでの総量中、１０⁸からおよそ５× １０¹⁴粒子の範囲内に含まれ、これは大腿、腕及び背中を含むヒトの身体における異なる部位へ少量で皮下注入される。ＡＡＶが過去において広いホスト範囲を有することが示され、今では皮下注入を介して操作されることが実証されているので、ホストにおける制限は知られておらず、ここで記述されるデリバリーの方法は、特に哺乳類、鳥類、魚類及び爬虫類、特に家畜哺乳類及び鳥類、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ニワトリ及び七面鳥に行うことができる。ヒト及び獣医学使用の双方が好適である。発現される遺伝子は、ユーザに望まれている全ての制御エレメント（例えば、プロモータ、オペレータ）を伴うタンパク質をコードするＤＮＡセグメントか、その転写物が所定のＲＮＡ含有分子、例えばリボザイム又はアンチセンス分子の全部又は部分を生成する非コード化ＤＮＡセグメントかのいずれでもあることができる。本発明の精神が、デリバリーされる物質よりもデリバリーの経路及びベクターに向けられているので、ベクターによりデリバリーされる外来ＤＮＡ（非ＡＡＶＤＮＡ）における制限はない。ホストの血管系が身体の他の部分へ遺伝子産物をデリバリーするであろうから、遺伝子は皮下又は局所領域においてそのような厳格な有用性に制限される必要はない。また、ＡＡＶ粒子はそれ自身、循環系に入り、投与地点よりも遠位の部位に輸送されるであろう。異なるベクター、例えば裸のＤＮＡ、アデノウィルス及びレトロウィルスは、筋肉を含む種々の組織へ種々の導入遺伝子をデリバリーするために用いられている。しかしながら、このようなシステムは、高い効能と長期間の発現の双方を提供することはできない。筋肉組織へ直接デリバリーされる裸のプラスミドＤＮＡについては、効能は低い。導入遺伝子発現を維持できるのは、注入部位の近傍のわずかな細胞のみである。しかも、細胞内のプラスミドＤＮＡは、非複製エピソームとして、すなわち非導入形態で残される。従って、万一の場合、それは失われてしまう。アデノウィルスベクターは、非分裂細胞に感染でき、従って、成熟組織、例えば筋肉へ直接デリバリーされることができる。しかしながら、アデノウィルスベクターによりデリバリーされた導入遺伝子は、長期発現を維持するには有用でない。アデノウィルスベクターはウィルス遺伝子の殆どを保持しているので、このようなベクターは潜在的な問題、即ち、安全性の問題を持ち出す。このような遺伝子の発現は、ベクターを含有する細胞を破壊するための免疫系を引き起こしてしまう(例えば、Yangら、1994、Proc．Natl Acad．Sci.91:4407-4411を参照のこと)。従って、アデノウィルスベクターを、繰り返しデリバリーすることはできない。また、アデノウィルスは組込みウィルスではないので、ＤＮＡが細胞内で場合によっては希釈され、分解され得る。レトロウィルスベクターがホストの染色体へ安定した移入を達成するが、かなり多くの標的細胞が非分裂性である一方で、現在使用のベクターが分裂細胞にのみ感染するので、その使用は拘束される。アデノ随伴ウィルスベクターは、上記言及のベクター系において特定の利点を有する。まず、アデノウィルスの様に、ＡＡＶは非分裂細胞に感染できる。第二に、ＡＡＶウィルス遺伝子は全てベクターに排除されている。ウィルス遺伝子発現誘導性免疫応答は最早考慮されないので、ＡＡＶベクターはアデノウィルスよりも安全である。第三に、ＡＡＶは性質上、組込みウィルスであり、ホスト染色体への組込みは細胞内において導入遺伝子を維持し得る。第四に、ＡＡＶは多くの洗剤、ｐＨ変化及び熱（１時間以上５６℃で安定）に対して耐性であるかなり安定なウィルスである。ＡＡＶはまた、重要な活性を失うことなく、凍結乾燥して解凍できる。最後に、ＡＡＶはヒトにおいて既知の疾患又は病原性症状の原因とならない。従って、遺伝子治療のためのかなり有望なデリバリービヒクルである。２つの最近の総説記事は、ＡＡＶベクターを用いた遺伝子治療の最近の状況についての特に完全な概説を提供し、これにはこの分野における更なる最近の科学文献の列記も含まれている：本発明は、ここで下記の非限定例において説明される。実施例実施例１．リコンビナントＡＡＶベクター：ｒＡＡＶ−ＭＦＧ−ヒト第ＩＸ因子ヒト第ＩＸ因子を発現するためのリコンビナントＡＡＶベクターは、マウスモロニーウィルス長末端繰返し配列に由来するＭＦＧプロモータ、全ヒト第ＩＸ因子ｃＤＮＡ及び、ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位であるｂＧＨｐＡを含む。図１を参照のこと。簡単に言えば、ＳＳＶ９−ＭＦＧ−ＳｈＦ９(ｈｕＦＩＸ)(図２３)を、モロニーマウス白血病ウィルス（ＭＬＶ）５’ＬＴＲと、これに隣接するスプライスドナー／アクセプター配列と、プラスミドＭＦＧ−Ｓ−ｈｕＦＩＸ由来のＭＬＶｅｎｖＡＴＧに予め連結されたｈｕＦＩＸｃＤＮＡ配列とを含有する３.２４ｋｂｐのNheI−BamHIフラグメントを、XbaI消化ＳＳＶ９へクローニングすることによって創製した。ＭＦＧ−Ｓ−ｈｕＦＩＸベクターのＭＬＶ３’ＬＴＲを、ｐＲｃ／ＣＭ(Invitrogen)からのウシ成長ホルモンのポリ（Ａ）部位で置換した。ＭＦＧ−Ｓの既述については、Dranoffら(1993)Proc．N atl Acad．Sci.90:3539-3543を参照のこと。ＭＦＧ−Ｓ−ｈｕＦＩＸ中のｈｕＦＩＸｃＤＮＡ（図２４）をｐＡＦＦＩＸＳＶＮｅｏから得た。St.Louis & Verm a(1988)PNAS 85:3150-3154を参照のこと。実施例２．リコンビナントＡＡＶベクター：ｒＡＡＶ−ＭＤ−ヒトインターフェロンヒトインターフェロンを発現するためのリコンビナントＡＡＶベクター（図２）は、サイトメガロウィルスの前初期遺伝子に由来するＭＤプロモータ、全ヒトインターフェロンｃＤＮＡ及び、β−グロビンポリアデニル化部位を含む。プラスミドＳＳＶ９−ＭＤＡＡＶ(ｐＳＳＶ９／ＭＤ−2）(図２０)を、ｐＭＤＧ(Naldiniら、（1996）Science 272:263-267)由来の２.３５ｋｂｐのXbaIフラグメントをサブクローニングすることによって構築した。ｐＳＳＶ９２２ＭＤ −２は、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモータ／エンハンサー(ヌクレオチド位置１９５−９９３)、エクソン２及び３、介在配列２（ＩＶＳ２）(ヌクレオチド位置１０３６−１５６１)及びヒトβ−グロビン遺伝子由来のポリアデニル化部位（ヌクレオチド位置１５７３−２３５５）を含む。フラグメントを、選択された導入遺伝子のサブクローニングのために、PmlI、EcoRI及びB glIIの制限部位をヌクレオチド位置１５６２，１５６７及び１５７３にそれぞれ含むように、ＰＣＲにより増幅した。ｐＳＳＶ９−ＭＤ−ｈｕαインターフェロン(ｈｕＡＩＦＮ)(図２２)を、ｐＳＳＶ９−ＭＤ２(図２０)のPmlI及びBglIIクローニング部位の間にｈｕＩＦＮ配列を挿入することによって構築した。ｈｕＩＦＮｃＤＮＡもまた、多重複オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより創製した(図２２)。実施例３．リコンビナントＡＡＶベクター：ｒＡＡＶ−ＭＤ−マウスＥＰＯマウスＥＰＯを発現するためのリコンビナントＡＡＶベクターは、サイトメガロウィルス前初期プロモータ由来のＭＤプロモータ、全マウスエリスロポエチンｃＤＮＡ及びβ−グロビンポリアデニル化部位を含む(図３)。ｐＳＳＶ９−ＭＤ２−マウスエリスロポエチン(ｍｕＥＰＯ)(図２１)を、ｐＳＳＶ９−ＭＤ−２(図２０)のPmlI及びBglIIクローニング部位の間にｍｕＥＰＯｃＤＮＡを挿入することによって構築した(図２１)。この構築物（コンストラクト）では、ｍｕＥＰＯ遺伝子は、ＣＭＶプロモータ、β−グロビンイントロン及びβ−グロビンポリ（Ａ）に隣接（フランキング）している。５７９塩基対のｍｕＥＰＯコード領域を、多重複オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより創製し (Dillion & Rosen（1990）Biotechniques 9;298-299)、これは、ベクター骨格へサブクローニングするための適合性PmlI及びBglII部位を含んだ。実施例４．リコンビナントＡＡＶベクター：ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬＡＣＺｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺコンストラクトは、図４に参照されるが、これはｐｄｘ−３１−ＬａｃＺとして既知であり、McCownら(1996)Brain Rex．713:99- 107に記述されている。実施例５．リコンビナントＡＡＶベクターのパッケージングリコンビナントＡＡＶベクターを、Snyderら、"Production of recombinant a deno-associated viral vector"、Current Protocols in Human Genetics，pp.1 2.1.1-12.1.24、N.Dracopoliら編（John Wiley & Sons，New York,1996）に記述されているようにパッケージした。実施例６．免疫応答性マウスにおける第IX因子発現リコンビナントＡＡＶ−ＭＦＧ−ヒト第ＩＸ因子を、３００μＬの容量のハンクス調整塩溶液（ＨＢＳＳ）中、５.９×１０¹⁰、５.９×１０⁹及び５.９×１０⁸ 粒子のいずれかの１回の注入として、ＢＡＬＢ／ｃマウスの背面に皮下投与した(リコンビナントＡＡＶの各用量を５匹のマウス群に投与した)。マウスから、ヘパリン被覆キャピラリーチューブを用いて採血した。血液を図５，６及び７に示されるように皮下注入された後の日数を示したＥＤＴＡ被覆チューブに集められ、凍結保存された。ヒト第ＩＸ因子の発現は、ヒト第ＩＸ因子のためのモノクローナル又はポリクローナル抗体（Boehringer MannheimからのCat.#1199277のモノクローナル抗第ＩＸ因子抗体、DAKOからのCat.#A300及びAsserachrom(商品名)IX:Agテストキット、Cat#00564のウサギ抗ヒト第ＩＸ因子）を用いてＥＬＩＳＡを用いて実証した。ヒト第ＩＸ因子を検出可能なレベルで発現する個々の動物を、１００、１０８、２０２、２０４、２０８及び３０６の番号で識別した。実施例７．遺伝子発現に相関した抗ヒト第ＩＸ因子及び抗ＡＡＶ抗体のレベル図５、６及び７の動物を、ヒト第ＩＸ因子及びＡＡＶに対する抗体の存在下で試験した。図８Ａ及び８Ｂを参照のこと。動物の番号は、図５、６及び７で示された番号と一致している。動物４００番は、ＨＢＳＳで注入されたコントロール動物である。ＡＡＶキャプシドタンパク質に対する抗体の存在を、下記のようなＥＬＩＳＡによって検出した：１×１０¹⁰の機能性ｒＡＡＶ−ＬａｃＺ精製ビリオン（〜５ ×１０¹²の全粒子）１００μＬを用いて、９６ウェルプレートのウェルを１６時間被覆した。非結合ビリオンを、プレートから洗い落とし、プレートをブロックし、１：５０、１：８００及び１：６００のマウス血清希釈物で２時間インキュベートした。プレートを、７.５％Ｈ₂Ｏ₂の抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体及び１ｍｇ／ｍｌのＯ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド基質(S igma)を用いて発色させた。力価を、ＯＤ値が最大値の半分となる血清希釈を決定することによって演算した。ｈＦＩＸの抗体の力価を、選択された注入後の日数でのＥＬＩＳＡにより測定した。実験期間において検出可能レベルのｈＦＩＸを発現した動物は、プラス（＋）記号により示した。実施例８．免疫応答性及び免疫無防備状態マウスにおける長期遺伝子発現の比較ｒＡＡＶ−ＭＦＧ−ヒト第ＩＸ因子を、３００μＬの量のＨＢＳＳの５.９× １０¹⁰、５.９×１０⁹又は５.９×１０⁸粒子の注入として１回、ＢＡＬＢ／ｃ又はＮＩＨ−３マウスの背面に皮下投与した(各用量のベクターを、５匹のマウス群に投与した)。マウスから、ヘパリン被覆キャピラリーチューブを用いて採血した。血液を図９Ａ及び９Ｂに示す時点でＥＤＴＡ被覆チューブに集め、凍結保存した。ヒト第ＩＸ因子の発現は、ＥＬＩＳＡにより測定し、結果を図９Ａ及び９Ｂに示した。ヒト第ＩＸ因子を検出可能なレベルで発現する個々のＢＡＬＢ／ｃ動物を、１０３、１０４及び２０４の番号で識別した。免疫応答性マウスにおけるヒト第ＩＸ因子の発現は、投与されたリコンビナントＡＡＶベクターの量に正方向で相関していた。実施例９．遺伝子発現に相関した抗ヒト第ＩＸ因子のレベル図９Ａからの動物を、ヒト第ＩＸ因子に対する抗体の存在について試験した。抗体力価を、ＥＬＩＳＡにより測定し、図１０に示した。実施例１０．免疫応答性及び免疫無防備状態マウスにおけるヒトインターフェロンの長期発現ｒＡＡＶ−ＭＤ−ヒトインターフェロンを、３００μＬの量のＨＢＳＳの８. ５×１０¹⁰、８.５×１０⁹又は８.５×１０⁸粒子の注入として１回、ＢＡＬＢ／ｃ又はＮＩＨ−３マウスの背面に皮下投与した(各用量のベクターを、５匹のマウス群に投与した)。マウスから、ヘパリン被覆キャピラリーチューブを用いて採血した。血液を図１１Ａ及び１１Ｂに示す時点でＥＤＴＡ被覆チューブに集め、凍結保存した。ヒトインターフェロンの発現は、ＥＬＩＳＡにより測定した。実施例１１．免疫応答性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるマウスエリスロポエチンの発現ｒＡＡＶ−ＭＤ−マウスエリスロポエチンを、１００μＬの量のＨＢＳＳの８ .９×１０¹⁰又は８.９×１０⁹粒子の注入として１回、ＢＡＬＢ／ｃマウスの背面に皮下投与した(各用量のベクターを、５匹のマウス群に投与した)。血液を図１２に示す時点でマウスから採血し、ヘマトクリットを測定した。実施例１２．ＥＰＯ発現ＥＰＯタンパク質レベルを、図１２に示す１０５日目で測定した。ＥＰＯタンパク質レベルは、ラジオイッムノアッセイ（ＩＲＡ）で測定した。図１３を参照のこと。実施例１３．免疫応答性マウスにおけるマウスエリスロポエチンの筋肉注入と皮下注入との比較ｒＡＡＶ−ＭＤ−マウスエリスロポエチンを、１００μＬのＨＢＳＳの８.９ ×１０¹⁰、８.９×１０⁹又は８.９×１０⁸粒子の注入として１回、ＢＡＬＢ／ｃマウスの背部に皮下投与、又は、３０μＬのＨＢＳＳの８.９×１０¹⁰、８.９× １０⁹又は８.９×１０⁸粒子の注入として１回、ＢＡＬＢ／ｃマウスの四頭に筋肉内投与した(各用量のベクターを、３匹のマウス群に投与した)。マウスから、図１４Ａ及び１４Ｂに示す時点で採血し、ヘマトクリットを測定した。実施例１４．ＥＰＯ発現ＥＰＯタンパク質レベルを、図１４Ａ及び１４Ｂのマウスについて１８０日目で測定した。ＥＰＯタンパク質レベルをＲＩＡにより測定した。図１５を参照のこと。実施例１５．免疫応答性マウスにおける静脈内投与されたヒトインターフェロンの発現ｒＡＡＶ−ＭＤ−ヒトインターフェロン（８.５×１０¹⁰粒子）を、１００μ Ｌの量のＨＢＳＳの注入として１回、ＢＡＬＢ／ｃの尾静脈に静脈内投与した( 各用量のベクターを、５匹のマウス群に投与した)。マウスから、ヘパリン被覆キャピラリーチューブを用いて採血した。血液を、指示された時点でＥＤＴＡ被覆チューブに集め、凍結保存した。ヒトインターフェロンの発現は、ＥＬＩＳＡ (Endogen)により測定し、図１６に結果を示した。実施例１６．免疫応答性マウスにおける筋肉へ投与されたヒト第ＩＸ因子の発現ｒＡＡＶ−ＭＦＧ−ヒト第ＩＸ因子(２.５×１０¹⁰粒子)を、５０μＬの量のハンクス調整塩溶液の注入として１回、ＢＡＬＢ／ｃマウスの四頭に筋内投与した(各用量のベクターを、５匹のマウス群に投与した)。マウスから、ヘパリン被覆キャピラリーチューブを用いて採血した。血液を指示された時点でＥＤＴＡ被覆チューブに集め、凍結保存した。ヒト第ＩＸ因子の発現は、ＥＬＩＳＡにより測定され、図１７に結果を示す。実施例１７．ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺ発現の位置リコンビナントＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺ（６.９×１０⁷機能性粒子）を、３００μＬの量のＰＢＳの注入として１回、ＢＡＬＢ／ｃマウスの背部に皮下投与した。注入後２週間と６週間で、ｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＬａｃＺ群からの２匹のマウスとＰＢＳコントロール群からの１匹のマウスとを安楽死させて、皮膚試料、筋肉試料、鼡径リンパ節、鼡径脂肪パッド及び脾臓を組織標本のために採取した。皮膚試料を、鉗子で注入部位の皮膚を持ち上げ、注入のために既述されたようなテントを形成し、皮膚のテントの基点の周りを切断することによって得た。筋肉試料を、腰領域の背中心線の横方向両側で採取した。単径リンパ節及び脂肪パッドを、各マウスの左及び右側の双方から採取した。 β−ガラクトシダーゼタンパク質を検出するために、組織試料を、フラッシュ凍結し、１０μｍの切片に切り分け、ガラススライド上に集めた。切片を０.５％グルタルアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄して、標準的な手法を用いてＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）で染色した。それから切片をＰＢＳで洗浄し、しっかりとした赤い核で計測した。 β−ガラクトシダーゼタンパク質活性を、皮膚組織、すなわち皮膚に位置した皮筋層、骨格筋層において検出した。図１９を参照のこと。β−ガラクトシダーゼ活性は、非注入動物では検出されなかった。図１８を参照のこと。明細書中に挙げた全ての文献を、全文にわたり、個々の文献又は特許出願が特別に及び個別的に提示されて援用して本文の一部とされているならば、そこまで拡張して、援用して本文の一部とする。本発明をここで充分に記述したが、ここに添付の請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、多くの変更及び改良が当業者に成され得ることは、明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/43 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 48/00 Ａ６１Ｋ 37/66 ＺＣ１２Ｎ 5/10 37/465 // Ｃ１２Ｐ 21/02 37/24 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者マッカーサー、ジェイムズアメリカ合衆国、カリフォルニア州、ヘイワード、オークス・ドライブ 2854 (72)発明者マリガン、リチャードアメリカ合衆国、マサチューセッツ州、リンカーン、サンド・ポンド・ロード２

Claims

【特許請求の範囲】１．動物において遺伝子産物を発現する方法であって：動物にリコンビナントアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターを皮下又は局所投与することを含み、ここで該ベクターがＡＡＶベクターに連結された非ＡＡＶ対象遺伝子を含む当該方法。２．請求項１に記載の方法であって、前記投与ステップが１回又は間隔を置いて繰り返し行われる当該方法。３．請求項１に記載の方法であって、前記ベクターが医薬的に許容可能なキャリア中に溶解又は懸濁されて投与される当該方法。４．請求項３に記載の方法であって、前記液体キャリヤが水性溶液を含む当該方法。５．請求項１に記載の方法であって、前記遺伝子が、前記リコンビナントＡＡＶベクターが投与された後に前記ポリペプチドの発現が生じるように、プロモータに作用可能に連結された治療遺伝子産物をコードするＤＮＡセグメントを含む当該方法。６．請求項５に記載の方法であって、前記発現遺伝子産物が投与部位から拡散可能である当該方法。７．請求項１に記載の方法であって、前記リコンビナントＡＡＶベクターが１,０００から５,３００ヌクレオチド長の長さの範囲でＡＡＶベクターに連結された非ＡＡＶ対象遺伝子を含む当該方法。８．請求項１に記載の方法であって、前記遺伝子がアンチセンスＲＮＡ分子又は遺伝制御エレメントをコードするポリヌクレオチドを含む当該方法。９．請求項１に記載の方法であって、前記動物が哺乳類である当該方法。１０．請求項１に記載の方法であって、前記動物がヒトである当該方法。１１．請求項１に記載の方法であって、前記非ＡＡＶ対象遺伝子がインターフェロンをコードするポリヌクレオチドを含む当該方法。１２．請求項１に記載の方法であって、前記非ＡＡＶ対象遺伝子が第ＩＸ因子をコードするポリヌクレオチドである当該方法。１３．請求項１に記載の方法であって、前記非ＡＡＶ対象遺伝子がエリスロポエチンをコードするポリヌクレオチドである当該方法。１４．請求項１に記載の方法であって、前記投与ステップが皮下投与である当該方法。１５．請求項１４に記載の方法であって、前記皮下投与が移植ポンプを使用することを含む当該方法。１６．遺伝子治療方法であって、リコンビナントアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターを動物に皮下又は局所投与することを含み、ここで前記ベクターがＡＡＶベクターに連結された非ＡＡＶ対象遺伝子を含み、また、前記リコンビナントＡＡＶベクターの発現産物が投与部位から拡散可能である当該方法。１７．リコンビナントアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターであって、非ＡＡＶ対象遺伝子であって、該対象遺伝子は拡散可能ポリペプチドをコードするものプロモータ及びポリアデニル化配列であって、該リコンビナントＡＡＶベクターが皮下注入に適切であり、該拡散可能ポリペプチドの発現をもたらすもの、を含む当該ベクター。１８．非アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）遺伝子及びこれの発現のための調節エレメントを含むリコンビナントＡＡＶベクター並びに、皮下又は局所投与に適当な医薬的に許容可能なキャリア、希釈剤又は賦形剤を含む組成物。１９．請求項１８に記載の組成物であって、更にジメチルスルホキシドを含む当該組成物。