KR20000048623A

KR20000048623A - 아데노-수반 바이러스 벡터의 비침습성 투여방법

Info

Publication number: KR20000048623A
Application number: KR1019990702564A
Authority: KR
Inventors: 스나이더리차드; 대노스올리비에; 맥아더제임스; 멀리건리차드
Original assignee: 쎌 제네시스, 인코퍼레이티드
Priority date: 1996-09-25
Filing date: 1997-09-25
Publication date: 2000-07-25
Also published as: EP0928202A4; CA2266619A1; JP2001501819A; WO1998013070A1; AU743335B2; EP0928202A1; AU4736797A

Abstract

본 발명은 사람을 포함하는 동물에서 목적하는 바의 유전자를 효율적이고 장기적으로 발현시킬 수 있는 재조합 AAV 벡터의 새로운 투여방법을 제공한다. 본 발명에서는 임의의 확산가능한 폴리펩티드, 리보자임, 핵산 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자 요법용 재조합 AAV 벡터를 피하주사하는 방법이 제공된다. 본 발명의 방법에 따르면, 한정된 크기의 임의의 확산가능한 폴리펩티드 또는 핵산을 피하주사를 통해 전달하여 피하주사된 부위 부근 또는 그로부터 떨어져 있는 영역에서 고농도의 장기적 발현을 실현할 수 있다는 잇점이 있다.

Description

아데노-수반 바이러스 벡터의 비침습성 투여방법 {Non-invasive administration of adeno-associated viral vector}

아데노-수반 바이러스는 아데노바이러스의 제조시에 존재하는 위성 바이러스로서 발견되었다. (인간, 유인원 및 조류로부터의) AAV 분리주는 뚜렷한 질환을 일으키지 않으며 암이나 기타 다른 좋지않은 증상과도 관련이 없다. 여러 연구 결과, AAV가 아데노바이러스 및 소의 파필로마바이러스의 종양형성 균주와 같은 다른 바이러스에 의해 매개되는 발암현상에 대하여 예방효과를 가지는 것으로 나타났다.

재조합 AAV 벡터는 생체외적으로 (통상, 조직 배양) 유전자 생성물을 발현시키는데 사용되어 왔으며, 동물 생체내, 예를 들면 정상적인 AAV 감염 부위인 폐 또는 구강 점막은 물론 중추신경계와 심장조직에서 유전자 생성물을 발현시키는데 사용되어 왔다 (미국특허 제5,193,941호 및 국제특허출원공개공보 WO9413788호 참조).

재조합 AAV 벡터를 이용한 동물 생체 내로의 형질도입은 복강내주사, 기관내주사 및 기관지내로의 직접점적주입과 같은 보다 직접적인 투여 경로를 통해 이루어져 왔다 [참조. Flotte and Carter, Gene Therapy 2:357-362 (1995)]. 이러한 rAAV 전달방법은 폐에서 가장 근접한 부위에 재조합 AAV가 위치하도록 하는데 촛점이 맞추어져 있는데, 이는 이러한 실험이 낭포성 섬유증 환자의 치료에 관한 것이기 때문이었다. 그러나, 복강내, 기관내 및 기관지내 주사법은 감염과 유착을 일으킬 위험이 있기 때문에 인간에게 통상적으로 사용하기에는 바람직하지 않은 임상기법인 것으로 이미 알려져 있다 [Goodman and Gilman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics" pp.1-32 (8th ed., 1993); "Remington's Pharmaceutical Sciences" p.1686 (18th ed., 1990) 참조].

유전자 요법의 한가지 목표는 목적하는 바의 특정 유전자의 발현이 치료학적으로 유용한 조직내 또는 그 조직의 인접부위에 목적하는 바의 특정 유전자를 장기적이고 치료학적으로 효과적인 수준으로 발현시키는 방법을 제공하는 것이다. 목적하는 바의 유전자를 표적조직 내에서 발현시키는 방법을 포함하여 표적조직 내에서 작동하는 재조합 AAV 벡터에 적어도 하나의 프로모터를 필요로 하는 효과적인 유전자 요법, 및 재조합 AAV 벡터를 적절한 조직으로 전달하는 투여방법을 개발하기 위한 많은 연구가 이루어졌다.

따라서, 본 발명의 분야에서는 유전자 요법용 재조합 AAV 벡터를 투여하는 안전하고 효과적인 방법이 요구된다.

도 1은 rAAV-MFG-인간-Factor IX 벡터를 개략적으로 나타낸 도면이다. ITR: AAV 역전(逆轉) 말단반복부 (inverted terminal repeat); MFG: 쥐의 몰로니 바이러스의 길다란 말단반복부 (long terminal repeat); MuLV IVS: mRNA 스플라이스 공여체/스플라이스 수용체; Human FIX: 인간의 Factor IX cDNA; bGH pA: 소의 성장 호르몬의 폴리아데닐화 부위.

도 2는 rAAV-MD-인간-인터페론 벡터를 개략적으로 나타낸 도면이다. ITR: AAV 역전 말단반복부; CMV: 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터 (immediate early promoter); β-gb IVS: β-글로빈 mRNA 스플라이스 공여체/스플라이스 수용체; 인간 IFN: 인간의 인터페론 cDNA; β-gb pA; β-글로빈 폴리아데닐화 부위.

도 3은 rAAV-MD-마우스 에리트로포이에틴 벡터를 개략적으로 나타낸 도면이다. ITR: AAV 역전 말단반복부; CMV: 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터; β-gb IVS: β-글로빈 mRNA 스플라이스 공여체/스플라이스 수용체; 마우스의 EPO: 마우스의 에리트로포이에틴 cDNA; β-gb pA: β-글로빈 폴리아데닐화 부위.

도 4는 rAAV-CMV-LacZ 벡터를 개략적으로 나타낸 도면이다. ITR: AAV 역전 말단반복부; CMV: 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터; SV40 IVS: SV40 mRNA 스플라이스 공여체/스플라이스 수용체; LacZ: E-coli β-갈락토시다아제 cDNA; SV40 pA: SV40 폴리아데닐화 부위.

도 5는 5.9×10¹⁰개의 rAAV-MFG-hFactor IX 입자를 피하주사한 면역적격 마우스에서 인간의 Factor IX의 장기 발현을 나타내는 그래프이다.

도 6은 5.9×10⁹개의 rAAV-MFG-hFactor IX 입자를 피하주사한 면역적격 마우스에서 인간의 Factor IX의 장기 발현을 나타내는 그래프이다.

도 7은 5.9×10⁸개의 rAAV-MFG-hFactor IX 입자를 피하주사한 면역적격 마우스에서 인간의 Factor IX의 장기 발현을 나타내는 그래프이다.

도 8a 및 8b는 1회 주사분의 rAAV-MFG-hFactor IX 입자를 피하주사한 동물에서의 항-인간 Factor IX 항체 농도 및 항-AAV 항체 농도를 각각 나타내는 두개의 챠트이다. 도 8a는 항-FIX 활성에 대한 항체 역가를 나타내고, 도 8b는 항-AAV 활성에 대한 항체 역가를 나타낸다.

도 9a 및 9b는 재조합 AAV-MFG-인간의 Factor IX (주사량은 각각 5.9×10⁸개, 5.9×10⁹개 또는 5.9×10¹⁰개임)를 피하주사한 후 면역적격 (BALB/c) 및 면역부전 (NIH-3) 마우스에서의 인간 Factor IX의 장기 발현을 도시한 것이다.

도 10은 도 9에 기재된 동물들의 항 인간 Factor iX 항체 농도를 나타낸다.

도 11a 및 11b는 재조합 AAV-MD-인터페론 (주사량은 각각 5.9×10⁸개, 5.9×10⁹개 또는 5.9×10¹⁰개임)를 피하주사한 후 면역적격 (BALB/c) 및 면역부전 (NIH-3) 마우스에서의 인간 인터페론의 장기 발현을 도시한 것이다.

도 12는 rAAV-MD-마우스 EPO (8.9×10⁸개 또는 8.9×10⁹개)를 피하주사한 후 BALB/c 마우스에서의 마우스 EPO의 발현을 나타내는 챠트이다. 마우스 EPO의 발현은 적혈구 용적율을 모니터링함으로서 측정되었다.

도 13은 rAAV-MD-Epo를 피하주사한지 105일째의 Epo 단백질 농도를 나타낸다. 단백질 농도는 RIA에 의해 측정하였다.

도 14a 및 14b는 rAAV-MD-마우스 에리트로포이에틴을 피하주사 (subcutaneous injection: SC) 또는 근육내주사 (intramuscular injection: IM)한후 BALB/c 마우스의 적혈구용적율 (hematocrit)을 나타낸다.

도 15는 rAAV-MD-Epo를 피하 또는 근육내주사한지 180일째의 Epo 단백질 농도를 나타낸다. 단백질 농도는 RIA에 의해 측정하였다.

도 16은 AAV-MD-인간 IFN을 정맥내주사한후 BALB/c 마우스의 혈청중의 인간 인터페론 농도를 나타내는 챠트이다.

도 17은 rAAV-MFG-F9을 정맥내주사한후 BALB/c 마우스의 혈청중의 인간 Factor IX 농도를 나타내는 챠트이다.

도 18은 미감염된 동물의 광경근에서 β-갈락토시다아제 발현이 일어나지 않은 것을 보여주는 사진이다.

도 19는 rAAV-CMV-LacZ를 피하주사한 후 광경근에서 β-갈락토시다아제 발현이 일어난 것을 보여주는 사진이다.

도 20은 pSSV9 MD-2 AAV 발현 벡터의 유전자지도이다.

도 21은 SSV9 MD-mEPO AAV 벡터의 유전자지도이다.

도 22는 SSV9 MD-2 인간 알파 2A 인터페론 벡터의 유전자지도이다.

도 23은 SSV9-MFG-ShuF9 벡터의 유전자지도이다.

도 24는 MFG-S-hFIX 벡터의 유전자지도이다.

구체적인 구현예에 대한 설명

본 발명은 확산가능한 폴리펩티드, 리보자임, 핵산 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 특정의 외래 유전자를 포함하는 유전자 요법용 재조합 AAV 벡터를 피하주사하거나 국소투여하는 방법이 제공된다. 본 발명의 방법은 피하주사 또는 국소적 투여를 통해 목적하는 바의 임의의 확산가능한 유전자를 전달하여 투여위치 부근 또는 그로부터 떨어져 있는 부위에 고농도의 장기적인 고농도의 유전자 발현을 얻을 수 있다는 현저한 잇점이 있다.

예를 들어, 인간 Factor IX는 인간 Factor IX 유전자를 포함하는 재조합 AAV 벡터가 피하주사된 면역적격 마우스의 약 2/3에서 고농도로 발현되었다. 인간 Factor IX를 발현하는 면역적격 마우스는 1회 투여하고난 후 약 365일 동안 인간 Factor IX를 혈청내에 고농도로 함유하고 있었다 (도 6 참조). 인간 인터페론 유전자 또는 마우스 에리트로포이에틴 유전자를 포함하는 재조합 AAV 벡터를 피하주사한 경우에도 피하주사한지 각각 175일 이상 및 35일 이상 상기 두종류의 유전자 생성물의 혈청내 농도가 높게 지속되는 것으로 나타났다.

본 명세서에 개시된 방법과 재조합 AAV 벡터를 이용하면 고농도의 장기적인 발현이 얻어지기 때문에 빈번하게 반복적으로 투여할 필요가 없으며 일정한 간격을 두고 주기적으로 투여하면 된다. 유전자 요법을 위한 피하주사 또는 국소 투여방법은 간편하고 안전하며 비침습적인 재조합 AAV 벡터 투여방법으로서, 앞서 언급된 보다 침습적인 다른 투여방법 (예: 복강내, 기관내 및 기관지내 투여방법)보다 바람직한 방법이다.

재조합 AAV 벡터의 피하 또는 국소 전달방법은 취급과 투여 (예를 들면, 자가투여)가 용이하다는 잇점도 있다. 재조합 AAV 벡터 입자를 피하주사하면 면역적격 동물들로 하여금 목적하는 바의 유전자를 장기간에 걸쳐 고농도로 발현시킬 수 있는 반면, 어떤 재조합 AAV 벡터 입자를 다른 전달 경로로 투여하면 상기와 필적할만한 정도의 발현 결과가 얻어지지 않는다 (도 12, 16 및 17 참조).

면역부전 동물에서의 목적하는 바의 유전자의 발현은 용량에 비례하여 일관성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 발현은 시험된 기간 중에는 증가하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 재조합 AAV 벡터를 통해 면역적격 마우스에 마우스 에리트로포이에틴를 주사하는 것과 같은 동계 유전자 (syngeneic gene)의 전달 결과, 용량에 비례하여 고농도로 발현되었다 (도 12 참조).

본 발명의 재조합 벡터는 다음과 같은 성분을 포함한다: (1) 비-AAV 소스로부터 유래하는 프로모터, (2) mRNA 스플라이스 공여체/스플라이스 수용체, (3) 예를 들면 치료학적 폴리펩티드 또는 그의 치료학적으로 효과적인 부분을 코딩하는 특정 유전자, (4) 폴리아데닐화 부위 및 (5) 상기 성분 (1)-(4)와 근접하고 있는 두개의 AAV 역전 말단반복부를 포함한다.

목적하는 바의 유전자는, 예를 들어 투여 부위로부터 확산되어 전신적인 전달을 이룰 수 있는 폴리펩티드와 같은 확산가능한 폴리펩티드 또는 확산가능한 핵산을 코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 유전자 요법용으로 이용될 수 있는 확산가능한 폴리펩티드로는 인슐린, Factor Ⅷ 및 임의의 사이토킨류가 포함되며, 그 예로서 인터페론 (IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ), 인터루킨, 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF: granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), 마크로파지 콜로니-자극 인자 (M-CSF: macrophage colony-stimulating factor), 종양괴사인자 (tumor necrosis factors), 및 성장 인자 (growth factors) [TGF-β: transforming growth factor-β) 및 혈소판-유도 성장 인자 (PDGF: platelet-derived growth factor)]가 있다. 본 명세서에 개시된 방법이 피하주사 또는 국소투여를 통하여 임의의 치료용 확산가능한 폴리펩티드를 발현시키는데 사용될 수 있다는 것이 당업자들에게는 명백할 것이다. 목적하는 바의 유전자는 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 리보자임일 수도 있다.

프로모터는 여러가지 특성화된 바이러스 프로모터 (예를 들면, 티미딘 키나아제 및 라우스 육종 바이러스) 또는 세포성 프로모터 (예를 들면, 신경-특이적 에놀라아제, 비멘틴 및 피브로넥틴)중 임의의 것일 수 있다. 동반되는 조절 신호 역시 본 발명의 벡터 골격에서 트란스유전자 (transgenes)를 발현시키는데 사용될 수 있다. 유도가능한 프로모터 (예를 들면, 메탈로티오네인 등)로부터 유전자 발현을 조절함으로써 본 발명의 재조합 AAV 벡터에서 트란스유전자를 발현시킬 수도 있다. CMV 발현 카셋트 역시 유전자 발현 조절에 사용될 수 있다.

본 명세서에는 분비된 치료용 외래 유전자 생성물을 코딩하는 재조합 AAV 벡터를 생체내에 직접 투여하는 간편하고 비침습적인 방법에 대해 기재되어 있다. 인간의 Factor IX (huFIX) 또는 인간의 α-인터페론 (huIFN)을 코딩하는 재조합 AAV 벡터 입자를 제조하고, 이 벡터 입자 10⁸내지 10¹⁰개를 300㎕의 HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)중에 용해시켜 제조한 주사액을 면역적격 BALB/c 마우스의 피하에 주사하였다. 1회 피하주사한 후, 수거된 혈청 샘플중에 분비 단백질이 존재하는지를 일정 시간에 걸쳐 관찰하였다.

상기 두개의 벡터 모두를 이용하여 인간의 단백질이 지속적이고 전신적으로 분비되는 것을 반복적으로 관찰하였다. 통상, 수주에 걸쳐 huFIX가 5-50ng/㎖의 농도로, 그리고 huIFN가 2-7ng/㎖의 농도로 얻어졌다. 이러한 농도는 최종 시점까지 일정하게 유지되거나 약간 증가하였다. 이러한 현상은 통상 5마리의 실험동물군중 2 또는 3마리에서 관찰되었다.

이러한 실험이 완전한 면역결핍 NIH-3 마우스에서 반복될 경우, 모든 동물에게서 장기적인 발현이 이루어졌다. 반대로, huFIX를 코딩하는 AAV 벡터를 근육내주사하는 방법에 의해 BALB/c 마우스에게 전달한 경우에는 모든 동물의 혈청에서 일시적으로 단백질이 검출되었으며 강력한 체액 반응이 일정하게 관찰되었다. 이러한 결과는 기능성 면역체계의 존재하에서는 후속하는 재조합 AAV의 피하주사 이후에 외래 유전자의 장기적이고 전신적인 전달 및 발현이 관찰될 수 있음을 의미한다.

마우스의 에리트로포이에틴을 코딩하는 재조합 AAV 벡터 입자를 제조하고 전술한 바와 같이 면역적격 BALB/c 마우스에 피하주사하였다. 목적하는 바의 유전자는 숙주와 동계 유전자이다. 소정 시간에 걸쳐 수거된 혈청 샘플에서 마우스의 에리트로포이에틴의 발현이 관찰되었다. 관찰이 진행되는 시간 동안 적혈구 용적법 (hematocrit)에 의해 마우스 에리트로포이에틴의 발현에 대해 분석하여 고농도의 발현이 일어나는 것을 관찰하였다.

피부는 생명유지에 절대적인 기관이 아니며 접근이 매우 용이하기 때문에 피하 전달방법은 생체내로 유전자를 전달하는 매우 효과적인 방법이다. 생산 및/또는 분비될 필요가 있는 결손 유전자 생성물에 의하여 야기되는 혈우병, 당뇨병 및 고셔병과 같은 질병의 경우에 있어서는 피하 전달법이 유전자 생성물을 전달하기에 좋은 방법이다.

재조합 AAV 벡터의 실질적인 전달은 AAV 재조합 벡터를 숙주의 피하 영역으로 운반하는 임의의 물리적 방법에 의하여 이루어진다. 본 명세서에서 사용되는 "AAV 벡터"라는 용어는 패키징되지 않은 재조합 AAV 벡터와, 바이러스 피복 단백질내로 패키징된 재조합 AAV 벡터 폴리뉴클레오티드를 모두 의미하는 것이다. HBSS 또는 인산염 완충 식염수 (phosphate buffered saline)에 AAV 벡터를 단순히 용해시켜 제조한 용액은 피하주사후 주사부위로부터 떨어져 있는 부위에서 발현을 일으키는데 유용한 운반체 (vehicle)를 제공한다. (벡터를 이용하는 정상적인 방식에서는 폴리뉴클레오티드를 분해하는 조성물이 기피되어야 하지만) 벡터와 함께 투여될 수 있는 캐리어 또는 기타 성분이 특별하게 제한되지 않는다.

약학적 조성물은 피하 전달되거나 (당업자들에게는 이미 공지된 것으로서 예를 들면 미국특허 제5,474,552호에 개시된 것과 같은) 매몰식 피하 펌프 (implantable subcutaneous pumps)에 의해 피하 또는 경피 전달되는 주사형 제제 또는 국소형 제제의 형태로 제조될 수 있다. 여러가지 피하주사용 및 경피 운반용 제제가 개발되었으며 이들 제제들이 본 발명의 구현에 사용될 수 있다. 벡터는 투여 및 취급이 용이한 약학적으로 허용가능한 임의의 캐리어와 함께 사용될 수 있다.

피하주사용으로는, 멸균 수용액은 물론 참기름 또는 땅콩 오일과 같은 보조액이나 수성 프로필렌글리콜 중에 용해시켜 제조한 용액이 사용될 수 있다. 필요에 따라서는 이러한 수용액을 완충용액으로 만들 수 있으며, 식염수나 글루코오스를 사용하여 희석액이 등장액이 되도록 할 수 있다. 유리산 (DNA는 산성 인산염기를 포함한다) 또는 약학적으로 허용가능한 염으로서 AAV 벡터의 용액은 물에서 히드록시프로필셀룰로오즈와 같은 계면활성제와 적절하게 혼합함으로써 제조될 수 있다. AAV 바이러스 입자의 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 그의 혼합물과, 오일에서 제조될 수도 있다. 제조된 용액에 방부제를 첨가하여 통상의 보관 및 사용 조건 하에서 미생물이 성장하는 것을 방지할 수 있다. 사용된 모든 성분을 포함하는 멸균된 수성 매질은 당업자에게는 잘 알려진 표준 기법에 의해 수득될 수 있다.

주사용으로 적합한 약학적 제형으로는 멸균 수용액이나 멸균 분산액, 및 멸균 주사용액이나 분산액을 즉석에서 제조하는데 이용되는 멸균 분말이 있다. 모든 경우에 약학적 제형은 멸균된 것이어야 하고 최종 제제가 선택된 수단에 의해 투여될 수 있을 정도로 유동성이 있는 것이어야 한다.

약학적 제형은 제조 및 보관 조건 하에서 안정한 것이어야 하며 박테리아나 곰팡이와 같은 미생물의 오염작용에 대하여 보존성을 갖는 것이어야 한다. 캐리어는 물, 에탄올, 폴리올 (예: 글리세롤, 프로필렌글리콜, 액상 폴리에틸렌글리콜 등), 적당한 그의 혼합물 및 식물성 오일과 같은 용매 또는 분산 매질일 수 있다.

적절한 유동성이 유지될 수 있어야 하는데, 그러한 유동성 유지방법의 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅을 이용하는 방법, 분산액인 경우에는 요구되는 입자 크기를 유지하는 방법 또는 계면활성제를 사용하는 방법을 들 수 있다. 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 여러가지 항박테리아제 및 항진균제를 이용하여 미생물의 작용을 막을 수 있다.

많은 경우에 설탕 또는 염화나트륨과 같은 등장제를 포함하는 것이 바람직하다. 주사형 조성물의 흡수력을 지속적으로 유지하기 위해서 모노스테아린산알루미늄 및 젤라틴과 같은 흡수지연제를 이용할 수 있다.

멸균 주사용액은 소정량의 AAV 벡터를 상기 언급된 여러가지 기타 성분과 함께 적절한 용매에 혼합한 다음, 여과 멸균시킴으로써 제조될 수 있다. 통상, 분산액은 염기성 분산 매질과 상기 언급된 기타 성분중 필요한 불활성 성분을 포함하는 멸균 운반체에 멸균된 활성 성분을 혼합함으로써 제조될 수 있다.

멸균 주사액을 제조하기 위한 멸균 분말인 경우에 바람직한 제조방법은 진공건조법과 동결건조법인데, 이 방법들에 따라 상기 언급된 멸균 주사액의 멸균-여과 용액으로부터 활성성분과 기타 부가적인 성분의 혼합 분말을 수득할 수 있다.

국소 투여용으로서, 필요에 따라서 0.1% 내지 5% 또는 그 이상의 농도나, 상기 비경구용 용액과 유사한 농도로 희석된 멸균 수용액은 경피용 패치에 의해 전달하기 적당한 용기에서 제조되며 약제학적 등급의 디메틸설폭사이드 (DMSO)와 같은 공지의 캐리어를 포함할 수 있다.

이와는 달리, 연고, 크림, 바니스, 드롭, 스프레이 등과 같이 공지된 다른 국소 제제용 제형은 피부표면에, 또는 눈이나 코에 투여하기 위한 드롭 및 스프레이로서 본 발명의 분야에서 알려져 있는 바와 같이 사용될 수 있다. 본 발명의 명세서에서, "국소"라는 용어는 본 발명을 적용하기에 적합한 임의의 또는 특히 용이하게 접근가능한 숙주의 소정 부위를 의미한다. 따라서, 피부 표면에 도포할 수 있는 연고와 크림, 귀 또는 코에 투여할 수 있는 드롭 또는 연고, 코 또는 입에 투여할 수 있는 스프레이 또는 미스트, 좌제 등도 본 발명의 범주에 속하는 것이라 할 수 있다.

각질화된 표피에서 진피, 하부의 결합조직, 근육, 조직공간 및 순환계로 용이하게 전달되도록 국소투여와 함께 피부를 약간 문질러줄 수도 있다.

본 발명의 치료 화합물만을 포유동물에게 투여하거나, 이 화합물을 약학적으로 허용가능한 캐리어와 혼합하여 투여할 수 있다. 전술한 바와 같이, 활성성분과 캐리어의 상대적 비율은 화합물의 용해성과 화학적 특성, 선택된 투여경로 및 표준 약학 실무에 따라 결정된다.

또한, 당분야에서는 이미 공지된 바와 같이, rAAV 입자를 리포좀, 마이크로캡슐, 마이크로비드 등과 같은 마이크로베셀내에 넣어 캡슐화할 수 있다. 표준 약학적 제조방법을 사용하여 마이크로캡슐과 마이크로비드를 제조할 수 있다. 또한, 액상의 코어 구조를 둘러싸는 지질막 구조와 같은 리포좀 등의 표준 제조는 당분야에서 공지된 방법에 따라 실시될 수 있다.

예방 또는 치료용으로 가장 적합한 본 발명의 치료제 용량은 투여형태, 선택된 특정 재조합 AAV 벡터 및 치료를 받을 환자의 생리적 특성에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 초기에는 소량을 사용하다가 필요에 따라서 적절한 효과가 얻어질 때까지 조금씩 용량을 증가시킨다. 사람인 경우를 예로 들면 10⁸내지 약 5×10¹⁴개의 입자가 포함된 약 3-10㎖ 이하의 주사액을 넓적다리, 팔 및 등을 포함하는 인체의 여러 부위에 피하주사할 수 있다.

AAV가 종전에는 다양한 숙주 범위를 갖는 것으로 알려져 왔고 현재 피하주사를 통해 그 작용을 발휘하는 것으로 설명되고 있기 때문에, 본 명세서에 기재된 전달방법을 적용할 수 있는 숙주의 종류에는 제한이 없으나, 특히 바람직하게는 포유류, 조류, 어류 및 파충류이고 더 바람직하게는 소, 양, 돼지, 말, 개, 고양이, 닭 및 칠면조와 같은 가축화된 포유류와 조류이다.

발현되는 유전자는 사용자가 소망하는 제어인자 (예를 들면, 프로모터, 작동유전자)를 가지고 있는 단백질을 코딩하는 DNA 단편이거나, 전사에 의해 리보자임 또는 안티센스 분자와 같은 소정의 RNA-포함 분자의 전부 또는 일부를 생산하는 비-코딩 DNA 단편일 수 있다. 본 발명의 범주가 전달 경로와, 전달되어질 물질이라기보다는 벡터에 관한 것이기 때문에 벡터에 의해 전달되는 외래 DNA (비-AAV DNA)에 대해서는 특별하게 제한되지 않는다. 유전자 생성물이 숙주의 혈관계를 통해 신체의 다른 부위로 전달되기 때문에 유전자가 피하 또는 국소 투여 영역에서 유용한 것으로만 한정될 필요는 없다. 또한, AAV 입자 자체가 순환계로 들어가서 투여부위로부터 떨어져있는 부위로 운반될 수도 있다.

각종 트란스유전자를 근육을 포함한 여러 조직으로 전달하는데 노출된 DNA (naked DNA), 아데노바이러스 및 레트로바이러스와 같은 여러가지 벡터들을 이용하고 있다. 그러나, 이러한 시스템은 고효율의 장기적 발현을 제공할 수 없다. 근조직으로 직접 전달된 노출성 플라스미드 DNA의 경우에는 효율이 낮다. 주사 부위 부근에서 트란스유전자의 발현을 유지할 수 있는 세포는 몇개에 불과하다. 또한, 세포내의 플라스미드 DNA는 예를 들면 미통합형의 비복제 에피좀으로서 남아있는다. 그러므로, 그것은 결국에는 소실될 것이다.

아데노바이러스 벡터는 미분열 세포를 감염시킬 수 있으며, 따라서 근육과 같은 성숙된 조직으로 직접 전달될 수 있다. 그러나, 아데노바이러스 벡터에 의해 전달된 트란스유전자는 장기적인 발현을 유지하는데 있어 유용하지 않다. 아데노바이러스 벡터가 대부분의 바이러스 유전자를 가지고 있기 때문에 이러한 벡터들은 안전성이라는 잠재적인 문제점을 가지고 있다. 이러한 유전자가 발현하게 되면 면역체계가 이러한 벡터들을 포함하는 세포들을 파괴할 수 있다 (Yang et al. 1994, Proc. Natl Acad. Sci. 91-4407-4411 참조). 따라서, 아데노바이러스 벡터는 반복적으로 전달될 수 없다. 또한, 아데노바이러스는 통합되는 바이러스가 아니기 때문에 DNA는 최종적으로 세포 내에서 희석되거나 분해된다.

레트로바이러스 벡터는 숙주의 크로모좀 내로 안전하게 통합될 수 있지만 현재 사용되는 벡터는 분열 세포만을 감염시키는데 반하여 표적 세포의 대부분은 미분열 세포이기 때문에 그의 이용은 제한될 수 밖에 없다.

아데노-수반 바이러스 벡터는 상기 언급된 벡터 시스템 상에서 유용하다. 첫째, 아데노바이러스와 마찬가지로 AAV는 미분열 세포를 효과적으로 감염시킬 수 있다. 둘째, 모든 AAV 바이러스 유전자는 벡터에서 제거된다. 바이러스 유전자 발현-유도 면역 반응이 더 이상은 중요하지 않기 때문에 AAV 벡터는 아데노바이러스 벡터보다 더 안전하다. 셋째, AAV는 원래 통합 바이러스이고 숙주의 염색체로의 통합은 트란스유전자를 세포내에 유지한다. 넷째, AAV는 많은 세정제, pH 변화 및 열에 대하여 내성을 갖는 지극히 안정한 바이러스이다 (56℃에서 1시간 이상 안정하다). 또한, AAV는 활성을 크게 상실하지 않으면서 동결건조 및 재용해될 수 있다. 마지막으로, AAV는 인간에게 공지된 질병이나 병리학적 증상을 일으키지 않는다. 그러므로, AAV는 유전자 요법용으로 매우 유망한 전달 운반체이다.

하기에 기재한 두종류의 최근 참고문헌은 AAV 벡터를 이용한 유전자 요법의 현황에 대한 완벽한 개요를 제공하며, 본 발명의 분야에서의 일련의 최신 학술자료를 포함하고 있다: Samulski, R.J., "Adeno-associated Viral Vectors," Chapter 3 in "Viruses in Human Gene Therapy", Chapman & Hall, J.-M.H. Vos., ed. (1994), 및 Samulski, R.J., "Adeno-associated Virus-based Vectors for Human Gene Therapy", Chapter 11 in "Gene Therapy: From Laboratory to the Clinic". World Scientific, K.M.Hui, ed. (1994) 참조.

이제, 하기의 실시예를 들어 본 발명을 설명할 것이며, 이들 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 인간을 포함한 동물에서 목적하는 바의 유전자를 효과적이고 장기적으로 발현시키기 위한 재조합 AAV 벡터의 투여방법을 제공한다. 본 발명은 임의의 확산가능한 폴리펩티드, 리보자임, 핵산 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 코딩하는 특정 유전자를 포함하는 유전자 요법용 재조합 AAV 벡터를 피하주사하는 방법이제공된다. 본 발명은 또한 숙주에 rAAV를 국소투여하는 수단을 제공한다.

본 발명의 방법은 피하주사 또는 국소적 수단을 통해 목적하는 바의 임의의 적절한 유전자를 전달하여 투여위치 부근 또는 그로부터 떨어져 있는 부위에 고농도의 장기적인 유전자 발현을 얻을 수 있다는 현저한 잇점이 있다. 본 발명의 투여 경로는 본 명세서에서 언급한 재조합 AAV 벡터를 투여하는데 있어 안전하고 효과적이며 비침습적인 방법을 제공한다.

유전자 요법용 재조합 AAV 벡터를 피하주사하는 방법이 효과적인 방법이며 지속적인 고농도의 유전자 발현을 제공한다는 사실의 발견은, 특히 폐와 경구 통로와 AAV의 정상적인 연관성, 재조합 AAV 벡터용 프로모터가 유전자 발현이 일어나게될 조직에서 작동할 수 있어야 하는 필요조건, 및 림프절로의 피하주사된 재조합 AAV 벡터의 급속한 누출과 숙주의 면역체계에 의한 급속한 손실을 가져오는 피하주사액의 희석 효과의 측면에서 볼때, 놀랄만한 것이다.

본 명세서에 개시된 방법과 재조합 AAV 벡터는 유전자 요법용 재조합 AAV 벡터 분야에 현저한 발전을 제공한다.

실시예 1. 재조합 AAV 벡터: rAAV-MFG-인간-FACTOR IX

인간의 Factor IX를 발현시키는 재조합 AAV 벡터는 쥐의 몰로니 바이러스의 길다란 말단반복부로부터 유래하는 MFG 프로모터, 인간의 Factor IX cDNA 전체, 및 소의 성장호르몬 폴리아데닐화 부위인 bGH pA를 포함한다 (도 1 참조). 간략하게는, SSV9-MFG-ShF9 (huFIX) (도 23 참조)는 몰로니 쥐의 백혈병 바이러스 (MLV) 5' LTR, 인접한 스플라이스 공여체/수용체 서열, 및 플라스미드 MFG-S-huFIX의 MLV env ATG에 정확하게 결합된 huFIX cDNA 서열을 포함하는 3.24kbp NheI-BamHI 단편을 XbaI에 의해 분해된 SSV9에 클로닝함으로써 얻어질 수 있다. MFG-S-huFIX 벡터의 MLV 3' LTR은 pRc/CM (인비트로겐)으로부터의 소의 성장 호르몬의 폴리(A) 부위로 대체될 수 있다. MFG-S에 대해서는 참고문헌 [Dranoff 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:3539-3543]에 기재되어 있다. MFG-S-huFEX 중의 huFIX cDNA (도 24 참조)는 pAFFIXSVNeo로부터 수득될 수 있다 [St. Louis & Verma (1988) PANS 85:3150-3154 참조]

실시예 2. 재조합 AAV 벡터: rAAV-MD-인간 인터페론

인간의 인터페론을 발현시키는 재조합 AAV 벡터 (도 2 참조)는 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터로부터 유래하는 MD 프로모터, 인간 인터페론 cDNA 전체, 및 β-글로빈 폴리아데닐화 부위를 포함한다.

플라스미드 SSV9-MD AAV (pSSV9/MD-2) (도 20 참조)는 pMDG로부터의 2.35kbp XbalI를 서브클로닝함으로써 제조되었다 (Naldini 등 (1996) Science 272:263-267 참조). pSSV922 MD-2는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 즉시 초기 유전자 프로모터/인핸서 (뉴클레오티드 위치 195-993), 엑손 2 및 3, 삽입서열 2 (intervening sequence 2: IVS2) (뉴클레오티드 위치 1036-1561), 및 인간의 β-글로빈 유전자로부터 유래하는 폴리아데닐화 부위 (뉴클레오티드 위치 1573-2355)를 포함한다. 이 단편은 PCR에 의해 변형되어 선택된 트란스유전자의 서브클로닝을 위해 뉴클레오티드 위치 1562, 1567 및 1573에 각각 PmlI, EcoRI 및 BglII에 대한 제한 위치를 포함한다.

pSSV9-MD-hu 알파 인터페론 (huAIFN) (도 22 참조)은 huIFN 서열을 pSSV9-MD2 (도 20 참조)의 PmlI와 BglII 클로닝 위치 사이에 삽입함으로써 제조된다. huIFN cDNA는 다중 중복 올리고뉴클레오티드 (도 22 참조)를 이용하여 PCR에 의해 생성되었다.

실시예 3. 재조합 AAV 벡터: rAAV-MD-마우스 Epo

마우스의 Epo를 발현시키는 재조합 AAV 벡터는 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터로부터 유래하는 MD 프로모터, 마우스 에리트로포이에틴 cDNA 전체, 및 β-글로빈 폴리에데닐화 위치를 포함한다 (도 3 참조).

pSSV9-MD2-쥐의 에리트로포이에틴 (muEPO) (도 21 참조)은 pSSV9-MD-2 (도 20 참조)의 PmlI와 BglII 클로닝 위치 사이에 muEPO cDNA를 삽입함으로써 제조되었다. 이 생성물에서, muEPO 유전자는 CMV 프로모터, β-글로빈 인터페론 및 β-글로빈 폴리(A)에 의해 플랭킹된다. 579개의 염기쌍 EPO 코딩영역은 다중 중복 올리고뉴클레오티드 (Dillion & Rosen (1990) Biotechniques 9:298-299)를 이용한 PCR에 의해 생성되었으며, 벡터의 골격 내로 서브클로닝을 위해 화합성 PmlI 및 BglII를 포함하고 있었다.

실시예 4. 재조합 AAV 벡터: rAAV-CMV-LACZ

rAAV-CMV-LacZ 구조체 (도 4 참조)는 pdx-31-LacZ로 알려져 있으며 참고문헌 [McCown등, (1996) Brain Res. 713:99-107]에 기재되어 있다.

실시예 5. 재조합 AAV 벡터의 패키징

재조합 AAV 벡터를 참고문헌 [R. Snyder 등, "Production of recombinant adeno-associated viral vectors'" in Current Protocols in Human Genetics, pp.12.1.1-12.1.24, N.dracopoli 등, eds. (John Wiley & Sons, New York, 1996)]에 기재된 대로 패키징하였다.

실시예 6. 면역적격 마우스에서의 FACTOR IX의 발현

5.9×10¹⁰, 5.9×10⁹또는5.9×10⁸개의 재조합 AAV-MFG-인간 Factor IX 입자를 각각 300㎕의 행크스 발란스 솔트 용액 (Hanks' Balanced Salt Solution: HBSS)에 용해시켜 1회용 주사제로서 제조한 다음, BALB/c 마우스의 등쪽에 피하주사하였다 (각 용량의 재조합 AAV 벡터를 5마리로 이루어진 동물군에 투여하였다). 헤파린으로 피복된 캐필러리 튜브를 이용하여 마우스에서 채혈하였다. 피하주사한지 도 5, 6 및 7에 도시된 날짜만큼 경과한 시점에서 혈액을 EDTA-피복 튜브에 수거한 다음, 냉동 보관하였다. 인간의 Factor IX에 대한 모노클론 또는 폴리클론 항체 (Boehringer Mannheim사에서 제조된 모노클론 항-factor IX 항체 [Cat. # 1199 277), DAKO사에서 제조된 토끼의 항-인간 factor IX (Cat. # A300) 및 Asserachrom IX:Ag 테스트 킷트 (Cat. # 00564)]를 이용하여 ELISA 방법에 따라서 인간의 Factor IX의 발현 여부를 검출하였다. 인간의 Factor IX를 검출가능한 정도로 발현시키는 각각의 동물은 번호: 100, 108, 202, 204, 208 및 306인 것으로 확인되었다.

실시예 7. 유전자 발현과 관련이 있는 항-인간 Factor IX 및 항-AAV 항체의 농도

도 5, 6 및 7에서 사용된 동물에 대하여 인간의 Factor IX 및 AAV에 대한 항체가 존재하는지를 테스트하였다 (도 8A 및 8B 참조). 동물 번호들은 도 5, 6 및 7에 나타낸 번호에 해당하는 것이다. 동물 번호 400은 HBSS를 주사한 대조군 동물이다.

AAV 캡시드 단백질에 대한 항체의 존재여부를 하기와 같이 ELISA 방법으로 검출하였다: 100㎕ 중에 용해된 1×10¹⁰개의 정제된 작용성 rAAV-LacZ 비리온 (총입자수: ∼5×10¹²)을 이용하여 96-웰 플레이트의 웰을 16시간 동안 피복하였다. 결합되지 않은 비리온을 세척하여 플레이트로부터 제거하고 플레이트를 봉쇄한 다음, 마우스 혈청의 1:50, 1:800 및 1:600 희석액 200㎕을 이용하여 2시간 동안 배양시켰다. 항-마우스 호오스래디쉬 퍼옥시다아제-콘쥬게이트 항체와 7.5% H₂O₂중에 용해시킨 1㎎/㎖ O-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드 기질 (Sigma 제품)을 이용하여 상기 플레이트를 현상하였다. OD값이 최고치의 절반인 혈청 희석액을 측정하여 역가를 산출하였다.

주사후 소정 날짜에 ELISA 방법에 의해 hFIX의 항체 역가를 측정하였다. 실험 기간 동안 hFIX를 검출가능한 수준으로 발현시킨 동물은 플러스 (＋) 표시로 나타내었다.

실시예 8. 면역적격 마우스와 면역부전 마우스에서의 장기 유전자 발현의 비교

5.9×10¹⁰, 5.9×10⁹또는5.9×10⁸개의 rAAV-MFG-인간 Factor IX 입자를 300㎕ 부피의 HBSS에 각각 용해시켜 주사제를 제조한 다음, BALB/c 마우스 또는 NIH-3 마우스의 등쪽에 1회 피하주사하였다 (각 용량의 재조합 AAV 벡터를 5마리로 이루어진 각각의 군에 투여하였다). 헤파린으로 피복된 캐필러리 튜브를 이용하여 마우스에서 채혈하였다. 피하주사한지 도 9A 및 9B에 도시된 날짜만큼 경과한 시점에서 혈액을 EDTA-피복 튜브에 수거한 다음, 냉동 보관하였다. 인간 Factor IX의 발현여부를 ELISA 방법으로 검출한 다음, 그 결과를 도 9A 및 9B에 도시하였다. 인간의 Factor IX를 검출가능한 수준으로 발현시키는 BALB/c 동물은 각각 동물번호: 103, 104 및 204로 확인된다. 면역적격 마우스에 대한 Factor IX의 발현은 재조합 AAV 벡터의 투여량에 대하여 정비례하였다.

실시예 9. 유전자 발현과 관련이 있는 항-인간 Factor IX의 농도.

도 9A에 나타낸 동물들에 대하여 인간 Factor IX에 대한 항체의 존재여부를 테스트하였다. 항체 역가를 ELISA 방법에 의해 측정하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

실시예 10. 면역적격 마우스와 면역부전 마우스에서의 인간 인터페론의 장기 발현

8.5×10¹⁰, 8.5×10⁹또는8.5×10⁸개의 rAAV-MFG-인간 Factor IX 입자를 300㎕ 부피의 HBSS에 각각 용해시켜 주사제로 제조한 다음, BALB/c 마우스 또는 NIH-3 마우스의 등쪽에 1회 피하주사하였다 (각 용량의 재조합 AAV 벡터를 5마리로 이루어진 각각의 군에 투여하였다). 헤파린으로 피복된 캐필러리 튜브를 이용하여 마우스에서 채혈하였다. 피하주사한지 도 11a 및 11b에 도시된 날짜만큼 경과한 시점에서 혈액을 EDTA-피복 튜브에 수거한 다음, 냉동 보관하였다. 인간 인터페론의 발현여부를 ELISA 방법에 의해 검출하였다.

실시예 11. 면역적격 BALB/c 마우스에서의 마우스 에리트로포이에틴의 발현

8.9×10¹⁰또는8.9×10⁹개의 rAAV-MD-마우스-에리트로포이에틴 입자를 100㎕ 부피의 HBSS에 각각 용해시켜 주사제로 제조한 다음, BALB/c 마우스의 등쪽에 1회 피하주사하였다 (각 용량의 재조합 AAV 벡터를 6 또는 8마리로 이루어진 동물군에 투여하였다). 도 12에 나타난 시점에서 마우스로부터 채혈하고 적혈구 용적율을 측정하였다.

실시예 12. EPO 발현

도 12에서 사용된 마우스에 대하여 105일째에 Epo 단백질 농도를 측정하였다. Epo 단백질 농도는 방사선면역분석법 (radioimmunoassay: RIA)에 의해 측정하였다. 도 13 참조.

실시예 13. 면역적격 마우스에서의 마우스 에리트로포이에틴의 근육내 발현과 피하 발현의 비교

8.9×10¹⁰, 8.9×10⁹또는8.9×10⁸개의 rAAV-MD-마우스-에리트로포이에틴 입자를 100㎕ 부피의 HBSS에 각각 용해시켜 주사제로 제조한 다음, BALB/c 마우스의 등쪽에 1회 피하주사하거나, 30㎕ 부피의 HBSS에 8.9×10¹⁰, 8.9×10⁹또는8.9×10⁸개의 입자를 각각 용해시켜 제조한 1회용 주사제를 BALB/c 마우스의 대퇴부에 근육내주사하였다 (각 용량의 벡터를 3마리로 이루어진 동물군에 투여하였다). 도 14A 및 14B에 나타난 시점에서 마우스로부터 채혈하고 적혈구 용적율을 측정하였다.

실시예 14. EPO 발현

도 14a 및 14b에서 사용된 마우스에 대하여 180일째에 Epo 단백질 농도를 측정하였다. Epo 단백질 농도는 RIA에 의해 측정하였다. 도 15 참조.

실시예 15. 면역적격 마우스에 정맥내 투여된 인간 인테페론의 발현

rAAV-MFG-인간 인터페론 (8.5×10¹⁰개)을 100㎕ 부피의 HBSS에 용해시켜 1회용 주사제로 제조한 다음, BALB/c 마우스의 꼬리 혈관에 정맥내주사하였다 (상기 용량의 벡터를 5마리로 이루어진 군에 투여하였다). 헤파린으로 피복된 캐필러리 튜브를 이용하여 마우스에서 채혈하였다. 표시된 날짜만큼 경과한 시점에서 혈액을 EDTA-피복 튜브에 수거한 다음, 냉동 보관하였다. 인간 인터페론의 발현여부를 ELISA (엔도겐) 방법에 의해 검출한 다음, 그 결과를 도 16에 도시하였다.

실시예 16. 면역적격 마우스에서 근육에 투여된 인간 FACTOR IX의 발현

rAAV-MFG-인간 Factor IX (2.5×10¹⁰개)을 50㎕ 부피의 HBSS에 용해시켜 1회용 주사제로 제조한 다음, BALB/c 마우스의 대퇴부에 근육내주사하였다 (상기 용량의 벡터를 5마리로 이루어진 군에 투여하였다). 헤파린으로 피복된 캐필러리 튜브를 이용하여 마우스에서 채혈하였다. 표시된 날짜만큼 경과한 시점에서 혈액을 EDTA-피복 튜브에 수거한 다음, 냉동 보관하였다. 인간 Factor IX의 발현여부를 ELISA 방법에 의해 검출한 다음, 그 결과를 도 17에 도시하였다.

실시예 17. rAAV-CMV-LACZ 발현부위

재조합 AAV-CMV-LacZ (6.9×10⁷개의 기능성 입자)를 300㎕ 부피의 PBS에 용해시켜 1회용 주사제로 제조한 다음, BALB/c 마우스의 등쪽에 피하주사하였다. 주사한지 2주 및 6주가 경과한 후에 rAAV-CMV-LacZ를 투여한 그룹으로부터 선택된 2마리의 마우스와 PBS만을 투여한 대조군으로부터 선택된 1마리의 마우스를 안락사시킨 다음, 피부 샘플, 근육 샘플, 서혜부 림프절, 서혜부 지방층 및 비장을 조직학적으로 채취하였다. 주사 부위의 피부를 핀셋으로 집어올려 텐트 모양이 되도록 한 다음, 텐트 모양의 피부 바닥 주변부를 절단하여 피부 샘플을 수득하였다. 근육 샘플은 요추 영역의 등 중심선에 인접한 양 측면부로부터 얻었다. 서혜부 림프절과 서혜부 지방층은 각각의 마우스의 좌측 및 우측 모두에서 얻어졌다.

β-갈락토시다아제 단백질을 검출하기 위하여 조직 샘플을 급속 냉동시키고 10㎛ 크기의 단편으로 절단한 다음, 글라스 슬라이드 상에 놓았다. 표준 방법에 따라서, 상기 단편을 0.5%의 글루타르알데히드로 10분 동안 고정시키고, PBS로 세척한 다음, X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드)로 염색하였다. 이어서, 상기 단편을 PBS로 세척한 다음, 뉴클리어 패스트 래드로 대비염색하였다.

β-갈락토시다아제 단백질 활성이 피부 조직, 예를 들면 피부에 있는 골격 근육층인 광경근에서 검출되었다. 주사되지 않은 동물에서는 β-갈락토시다아제 활성이 나타나지 않았다. 도 18 참조.

본 명세서에 인용된 모든 참고문헌들은 각각의 간행물 및 특허출원이 참고자료로서 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 그 전체가 참고문헌으로서 인용된 것이다.

이제, 본 발명은 충분하게 설명되었으며, 본 발명의 범주를 벗어나지 않는 범위 내에서는 본원 발명에 대한 변경 및 수정이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게는 명백할 것이다.

Claims

재조합 아데노-수반 바이러스 (AAV) 벡터를 통물에게 피하 또는 국소투여하는 단계를 포함하며 상기 벡터가 AAV 벡터내로 결합되어 있는 목적하는 바의 비-AAV 유전자를 가지고 있는 것을 특징으로 하는 동물에서의 유전자 생성물 발현 방법.
제1항에 있어서, 상기 투여 단계가 1회 또는 주기적으로 반복하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 벡터가 약학적으로 허용가능한 캐리어 중에 용해되거나 현탁된 상태로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 액상 캐리어가 수용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 유전자가 상기 재조합 AAV 벡터의 투여후 폴리펩티드가 발현되도록 프로모터에 작동하게 결합된 치료 유전자 생성물을 코딩하는 DNA 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 발현된 유전자 생성물이 투여 부위로부터 확산가능한 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터가, 길이가 1,000 내지 5,300개의 뉴클레오티드이고 하나의 AAV 벡터에 결합된 목적하는 바의 비-AAV 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 유전자가 안티센스 RNA 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 유전제어요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 동물이 포유동물인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 동물이 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 목적하는 바의 비-AAV 유전자가 인터페론을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 목적하는 바의 비-AAV 유전자가 Factor IX를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 목적하는 바의 비-AAV 유전자가 에리트로포이에틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 투여 단계가 피하 투여에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 피하 투여가 매몰식 펌프를 이용하는 것임을 특징으로 하는 방법.
동물에게 재조합 아데노-수반 바이러스 (AAV) 벡터를 피하 또는 국소 투여하는 단계를 포함하며, 상기 벡터가 AAV 벡터에 결합되어 있는 목적하는 바의 비-AAV 유전자를 포함하며 상기 재조합 AAV 벡터의 발현 생성물이 투여 부위로부터 확산가능한 것임을 특징으로 하는 유전자 치료방법.
확산가능한 폴리펩티드를 코딩하는 목적하는 바의 비-아데노-수반 바이러스 (AAV)유전자,

프로모터 및 폴리아데닐화 서열을 포함하며,

피하주사용으로 적합하고 상기 확산가능한 폴리펩티드를 발현시키는 것을 특징으로 하는 재조합 AAV 벡터.
비-AAV 유전자와 이 유전자를 발현시키는 제어요소를 가지고 있는 재조합 아데노-수반 바이러스 (AAV) 벡터, 및 약학적으로 허용가능한 피하 또는 국소투여용 캐리어, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물.
제18항에 있어서, 디메틸설폭사이드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.