KR20240063110A

KR20240063110A - 치료제의 역행성 관상 정맥 또는 정맥동 투여

Info

Publication number: KR20240063110A
Application number: KR1020247007654A
Authority: KR
Inventors: 아서 엠. 펠드먼; 발레리 마이어스; 마르시아 볼로냐
Original assignee: 템플 유니버시티-오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션; 리노바코, 인코포레이티드
Priority date: 2021-08-12
Filing date: 2022-08-12
Publication date: 2024-05-10
Also published as: WO2023019272A1; AU2022325237A1; IL310763A; CA3228581A1; EP4384269A1; AU2022325237A2

Abstract

본 발명은 치료제를 심장에 전달하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 방법은 역행성 관상 정맥 또는 정맥동 전달을 통해 대상체에게 치료제를 투여함으로써 치료제를 심장에 전달하는 것을 포함한다.

Description

치료제의 역행성 관상 정맥 또는 정맥동 투여

도입

[0001] 최근 연구는 심장 유전자의 기능적 돌연변이가 확장성 심근병증(DCM)의 발달을 초래할 수 있음을 보여주었다. 유전자 요법이 비-심장 가족성 질환에서 질병을 성공적으로 개선한 반면, DCM에서 유전자 발현을 교정하려는 시도는 성공적이지 못하여, 심장이 바이러스 벡터를 사용하여 성공적으로 형질도입될 수 있는지에 대한 의문이 제기된다.

개요

[0002] BCL2-관련 아타노겐(Athanogene) 3(BAG3) 유전자의 돌연변이는 가족성 DCM의 발달과 관련이 있으며, 환자는 야생형(WT) BAG3의 심장 형질도입에 의해 치료될 수 있다. 심장으로의 상이한 전달 경로의 효능을 평가하기 위해, 전행성 전달 및 역행성 전달을 대형 동물 모델에서 연구하였다.

[0003] 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터 및 재조합 아데노-관련 바이러스의 전행성 전달을 위한 좌관상 동맥 및 역행성 전달을 위한 대심정맥 원위부의 선택적인 카테터 삽입을 사용하여, 혈청형 2/9(AAV2 ITR, AAV9 캡시드; rAAV2/9)-BAG3 유전자를 Yucatan 미니피그에 적용하였다. rAAV 벡터의 투여 후 심장의 다양한 영역에서 후속 벡터 유전자 형질도입을 측정하였다.

[0004] 본 발명에 따르면, 치료제를 심장에 전달하는 방법이 제공된다. 일 구체예에서, 방법은 역행성 관상 정맥 또는 정맥동 전달을 통해 대상체에게 치료제를 투여함으로써 치료제를 심장에 전달하는 것을 포함한다.

[0005] 또 다른 구체예에서, 방법은 좌측 주관상동맥을 폐색시키지 않거나 전행성 흐름을 폐색하지 않으면서, 역행성 관상 정맥 또는 정맥동 전달을 통해 대상체에게 치료제를 투여함으로써, 치료제를 심장에 전달하는 것을 포함한다.

[0006] 또 다른 구체예에서, 방법은 좌측 주관상동맥을 폐색시키거나 전행성 흐름을 폐색시키면서, 역행성 관상 정맥 또는 정맥동 전달을 통해 대상체에게 치료제를 투여함으로써, 치료제를 심장에 전달하는 것을 포함한다.

[0007] 특정 양태에서, 치료제는 관상 정맥동의 근위 및 대심정맥의 원위에 위치된 카테터에 의해 심장에 전달된다.

[0008] 특정 양태에서, 치료제는 관상 정맥동 및 대심정맥의 기원의 원위 또는 대심정맥에 위치하거나 이를 폐색시키는 카테터에 의해 심장에 전달된다.

[0009] 특정 양태에서, 단백질은 BCL2-관련 아타노겐 3(BAG3)을 포함한다.

[0010] 특정 양태에서, 핵산은 발현 벡터를 포함한다.

[0011] 특정 양태에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터, 진핵생물 또는 효모 벡터를 포함한다.

[0012] 특정 양태에서, 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터를 포함한다.

[0013] 특정 양태에서, AAV 벡터는 AAV 혈청형: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 또는 AAV12 중 어느 하나로부터의 캡시드 또는 역 말단 반복부를 포함한다.

[0014] 특정 양태에서, 발현 벡터는 심장에서 기능성인 프로모터를 포함한다.

[0015] 특정 양태에서, 프로모터는 심장 특이적이다.

[0016] 특정 양태에서, 발현 벡터는 심장에서 기능성인 프로모터 및 BAG3 폴리뉴클레오티드 또는 cDNA 서열을 포함한다.

[0017] 특정 양태에서, 대상체는 인간이다.

[0018] 특정 양태에서, 대상체 또는 인간은 심부전을 앓고 있다.

[0019] 특정 양태에서, 대상체 또는 인간은 박출률이 감소된 심부전을 앓고 있다.

[0020] 특정 양태에서, 대상체 또는 인간은 박출률이 보존된 심부전을 앓고 있다.

[0021] 특정 양태에서, 대상체 또는 인간은 가족성 확장성 심근병증을 앓고 있다.

[0022] 특정 양태에서, 대상체 또는 인간은 비-가족성 확장성 심근병증을 앓고 있다.

[0023] 특정 양태에서, 대상체 또는 인간은 허혈성 심장 질환 또는 심근병증을 앓고 있다.

[0024] 특정 양태에서, 대상체 또는 인간은 비허혈성 심장 질환 또는 심근병증을 앓고 있다.

[0025] 특정 양태에서, 대상체 또는 인간은 허혈/재관류 손상의 위험이 있다.

[0026] 특정 양태에서, 대상체 또는 인간은 허혈/재관류 손상이 있을 수 있는 혈관 중재적 또는 의학적 절차가 예정되어 있거나 이에 대한 후보이다.

[0027] 특정 양태에서, 혈관 중재적 또는 의학적 절차는 카테터, 스텐트, 혈관성형술, 우회 수술 또는 관상 동맥 우회술을 사용하는 절차를 포함한다.

[0028] 특정 양태에서, 대상체 또는 인간은 말초 혈관 질환 수술이 예정되어 있거나 이에 대한 후보이다.

[0029] 특정 양태에서, 대상체 또는 인간은 내인성 BAG3 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 돌연변이를 갖는다.

[0030] 특정 양태에서, 대상체 또는 인간은 내인성 BAG3 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 감소된 발현 또는 활성을 갖는다.

[0031] 특정 양태에서, 치료제는 대심정맥을 통해 대상체 또는 인간에게 투여된다.

[0032] 특정 양태에서, 치료제는 근위이지만 대심정맥의 원위에 위치된 카테터를 통해 투여된다.

[0033] 특정 양태에서, 치료제는 대심정맥, 좌홀정맥 또는 관상 정맥동에서 공급되는 임의의 정맥으로 전달된다.

[0034] 특정 양태에서, 치료제는 최대 약 20분의 시간 동안 주입을 통해 투여된다.

[0035] 특정 양태에서, 치료제는 분당 약 1 ml 내지 분당 5 ml의 속도로 투여된다.

[0036] 특정 양태에서, 치료제는 분당 약 1 ml의 속도로 투여된다.

[0037] 특정 양태에서, 치료제는 약 10 ml 내지 약 100 mL의 부피로 투여된다.

[0038] 특정 양태에서, 치료제는 약 20 ml 내지 약 75 mL의 부피로 투여된다.

[0039] 특정 양태에서, 치료제는 약 30 ml 내지 약 60 mL의 부피로 투여된다.

[0040] 특정 양태에서, 치료제는 약 40 ml 내지 약 50 mL의 부피로 투여된다.

[0041] 특정 양태에서, 치료제는 전방 좌심실, 전방 가쪽 좌심실, 하부 좌심실, 하부 가쪽 심실, 중격 또는 우심실 중 하나 이상에 전달되고/거나 발현된다.

[0042] 특정 양태에서, 치료제는 심장 전체에 걸쳐 발현된다.

[0043] 특정 양태에서, 치료제는 심장 질환의 하나 이상의 증상을 감소시킨다.

[0044] 특정 양태에서, 치료제는 심장 기능 또는 심장 수축성을 개선한다.

[0045] 특정 양태에서, 치료제는 좌심실 박출률을 증가시킨다.

[0046] 특정 양태에서, 바이러스 벡터와 같은 치료제가 투여되거나 사용된다.

[0047] 특정 양태에서, 바이러스 벡터는 약 1x10¹¹ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁴ vg/kg의 용량으로 투여되거나 사용된다.

[0048] 특정 양태에서, 바이러스 벡터는 약 1.0x10¹² vg/kg 내지 약 0.5x10¹⁴ vg/kg의 용량으로 투여된다.

[0049] 특정 양태에서, 바이러스 벡터는 약 3.0x10¹² vg/kg 내지 약 1.0x10¹³ vg/kg의 용량으로 투여된다.

[0050] 특정 양태에서, 바이러스 벡터는 약 3.0x10¹² vg/kg 내지 약 9.0x10¹² vg/kg의 용량으로 투여된다.

[0051] 특정 양태에서, 바이러스 벡터는 약 3.0x10¹² vg/kg 내지 약 8.0x10¹² vg/kg의 용량으로 투여된다.

[0052] 특정 양태에서, 바이러스 벡터는 약 3.0x10¹² vg/kg 내지 약 5.0x10¹² vg/kg의 용량으로 투여된다.

도면의 설명

[0053] 도 1a는 역행성 관상 투여를 보여준다.

[0054] 도 1b는 전행성 관상 투여를 보여준다.

[0055] 도 1c는 역행성 관상 정맥동 투여를 보여준다.

[0056] 도 2는 큰 동물 모델에서 역행성 및 전행성 투여를 비교하는 초기 연구에서 선택 샘플에서 GFP(27kDa)에 대한 웨스턴 블롯을 보여준다. GFP는 역행성 투여 후 LV에서 발현된다. 대조적으로, 전행성 투여 후 LV에서 GFP의 발현은 검출되지 않았다.

[0057] 도 3은 대부분의 영역에서 심근세포 당 ≥1 벡터 게놈(vg) 복사체 수를 보여준다. 역행성 관상 정맥동 주입(RCSI)에 의한 심장 섹션 전체에 걸친 광범위한 발현. 비히클(그래프에 보이지 않음), 5e13vg(저용량), 1e14vg(중간 용량), 2.5e14vg(고용량).

[0058] 도 4는 제외 기준을 적용한 후, AAV9-BAG3의 역행성 주입 후 돼지의 관상 정맥동에서 심근에 걸친 벡터 게놈(vg)의 분포를 예시한다: 각 개별 동물에 대한 평균으로부터 3 표준 편차를 초과하는 모든 결과는 제외되었다. 이 기준을 적용하면 3개의 값이 제외되었고, 각 동물은 심장 당 1개의 조직 섹션이 평가되었고, 연구에는 8마리의 동물이 있었기 때문에 3/144개의 샘플이 제외 기준을 충족시켰다. 근세포 당 평균 SEM vg. 5개의 좌심실 영역에서 수득된 조직으로부터의 측정. 전방(AN), 전방 가쪽(AL), 하부 가쪽(IL), 하부(IN), 중격(S) 및 우심실(RV).

[0059] 도 5는 심장 고리 및 영역을 라벨링하는데 사용되는 명명법을 예시한다. 샘플은 급속 동결되거나 포르말린 고정된다.

[0060] 도 6은 역행성 관상 정맥동 주입(RCSI)을 통해 투여된 BAG3의 심장 생체분포를 보여준다. BAG3은 광범위하게 분포되어 있고, 용량 의존적이고 강력하며 확산된 BAG3 형질도입이 있었다. 약 1, 3, 및 6의 평균 VCN(각각 저-, 중간-, 및 고용량 코호트; 동물 당 저=1e14vg, 중간=2.5e14 및 고=5e14vg).

[0061] 도 7은 심장에서 광범위한 BAG3 분포를 보여준다. 일원 ANOVA 사후: Tukey's 테스트 * = p≤0.05, ** = p≤0.01, *** = p≤0.001, **** = p≤0.0001.

[0062] 도 8a는 심장으로의 BAG3의 용량 의존적 형질도입을 보여준다. 일원 ANOVA 사후: Tukey's 테스트 * = p≤0.05, ** = p≤0.01, *** = p≤0.001, **** = p≤0.0001

[0063] 도 8b는 심장으로의 BAG3의 용량 의존적 형질도입을 보여준다. 일원 ANOVA 사후: Tukey's 테스트 * = p≤0.05, ** = p≤0.01, *** = p≤0.001, **** = p≤0.0001

[0064] 도 8c는 심장으로의 BAG3의 용량 의존적 형질도입을 보여준다. 일원 ANOVA 사후: Tukey's 테스트 * = p≤0.05, ** = p≤0.01, *** = p≤0.001, **** = p≤0.0001

상세한 설명

[0065] 본 발명은 치료제를 심장에 전달하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 방법은 역행성 관상 정맥 또는 정맥동 전달을 통해 대상체에게 치료제를 투여함으로써 치료제를 심장에 전달하는 것을 포함한다.

[0066] 본 발명은 또한 핵산 또는 단백질(또는 둘 모두)을 심장에 전달하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 방법은 역행성 관상 정맥 또는 정맥동 전달을 통해 핵산 또는 단백질을 대상체에게 투여함으로써 핵산 또는 단백질을 심장에 전달하는 것을 포함한다.

[0067] 본 발명은 또한 발현 벡터를 심장에 전달하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 방법은 역행성 관상 정맥 또는 정맥동 전달을 통해 대상체에게 발현 벡터를 투여함으로써 발현 벡터를 심장에 전달하는 것을 포함한다.

[0068] 본 발명은 또한 바이러스 벡터를 심장에 전달하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 방법은 역행성 관상 정맥 또는 정맥동 전달을 통해 대상체에게 바이러스 벡터를 투여함으로써 바이러스 벡터를 심장에 전달하는 것을 포함한다.

[0069] 본 발명의 방법 및 용도에 사용될 수 있는 바이러스 벡터. 특정 구체예에서, 본 발명에 사용될 수 있는 바이러스 벡터는, 예를 들어, 비제한적으로, 레트로바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV)를 포함한다.

[0070] BCL2-관련 아타노겐 3으로도 알려진 Bcl-2 관련 안타노겐-3(BAG3); MFM6; Bcl-2-결합 단백질 Bis; CAIR-1; 도킹 단백질 CAIR-1; BAG 패밀리 분자 샤페론 조절자 3; BAG-3; BCL2-결합 아타노겐 3; 또는 BIS는 HSP 70에 대한 결합에 대해 Hip-1과 경쟁하는 세포보호 폴리펩티드이다. BAG3에 대한 NCBI 참조 아미노산 서열은 Genbank에서 수탁 번호 NP_004272.2; Public GI:14043024로 찾을 수 있다. Genbank 수탁 번호 NP_004272.2; Public GI:14043024의 아미노산 서열은 본원에서 SEQ ID NO: 1로 지칭된다. BAG3에 대한 NCBI 참조 핵산 서열은 Genbank에서 수탁 번호 NM_004281.3 GI:62530382로 찾을 수 있다. Genbank 수탁 번호 NM_004281.3 GI:62530382의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 2로 지칭된다. 다른 BAG3 아미노산 서열은, 예를 들어, 비제한적으로, 095817.3 GI:12643665(SEQ ID NO: 3); EAW49383.1 GI:119569768(SEQ ID NO: 4); EAW49382.1 GI:119569767(SEQ ID NO: 5); 및 CAE55998.1 GI:38502170(SEQ ID NO: 6)을 포함한다. 본 발명의 BAG3 폴리펩티드는 기능성을 유지한다면 본원에 기재된 폴리펩티드의 변이체일 수 있다.

[0071] 본원에서 사용되는 "제제"는 질병, 장애 또는 다른 의학적 상태를 예방, 개선, 또는 치료할 수 있는 임의의 분자, 화학적 실체, 조성물, 약물, 치료제, 또는 생물학적 제제 또는 실체를 포함하는 것을 의미한다. 상기 용어는 소분자 화합물, 안티센스 시약, siRNA, 시약, 항체, 효소, 펩티드 유기 또는 무기 분자, 천연 또는 합성 화합물, 세포 및 소기관, 예를 들어, 미토콘드리아를 포함한다. 제제는 임상 시험 동안, 전-임상 시험 동안, 또는 FDA-승인 후 임의의 단계에서 본 발명의 방법 및 용도에 따라 검정될 수 있다.

[0072] 용어 "폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. "폴리뉴클레오티드 서열"에 의해 인코딩되는 "폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"는 자연 발생 단백질과 마찬가지로 전장 천연 서열을 포함함은 물론, 기능성 하위서열, 변형된 형태 또는 서열 변이체가 천연 전장 단백질의 어느 정도의 기능을 보유하는 한 기능성 하위서열, 변형된 형태 또는 서열 변이체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 이러한 폴리펩티드, 단백질 및 펩티드는 치료되는 환자의 내인성 단백질과 동일할 수 있지만 반드시 동일할 필요는 없다.

[0073] 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하는 모든 형태의 핵산, 올리고뉴클레오티드를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 핵산은 게놈 DNA, cDNA 및 안티센스 DNA, 및 스플라이싱되거나 스플라이싱되지 않은 mRNA, rRNA tRNA 및 억제성 DNA 또는 RNA(RNAi, 예를 들어, 작거나 짧은 헤어핀 (sh)RNA, 마이크로RNA(miRNA), 작거나 짧은 간섭 (si)RNA, 트랜스-스플라이싱 RNA, 또는 안티센스 RNA)를 포함한다.

[0074] 핵산은 자연 발생, 합성, 및 의도적으로 변형되거나 변경된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 핵산은 단일, 이중 또는 삼중, 선형 또는 원형일 수 있고, 임의의 길이일 수 있다. 핵산을 논의할 때, 특정 폴리뉴클레오티드의 서열 또는 구조는 5'에서 3' 방향으로 서열을 제공하는 규정에 따라 본원에 기술될 수 있다.

[0075] "이종성" 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 서열은 세포로의 폴리뉴클레오티드의 벡터 매개 이동/전달을 목적으로 플라스미드 또는 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이종성 핵산 서열은 바이러스 핵산과 별개이며, 즉, 바이러스 핵산에 대해 비-천연이다. 일단 세포 내로 이동/전달되면, 벡터 내에 포함된 이종성 핵산 서열은 발현될 수 있다(예를 들어, 전사되고, 적절한 경우 번역됨). 대안적으로, 벡터 내에 함유된 세포에서 이동/전달된 이종성 폴리뉴클레오티드는 발현될 필요가 없다. 용어 "이종성"이 핵산 서열 및 폴리뉴클레오티드와 관련하여 본원에서 항상 사용되는 것은 아니지만, 수식어 "이종성"이 없는 경우에도 핵산 서열 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 언급은 그 생략에도 불구하고 이종성 핵산 서열 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 의도된다.

[0076] 본원에서 사용되는 용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 유전자의 전부 또는 적어도 일부를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, BAG3)을 함유하는 벡터를 지칭한다. 일부 경우에, RNA 분자는 이후 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드로 번역된다. 다른 경우에, 이러한 서열은, 예를 들어, 안티센스 분자, siRNA, 리보자임 등의 생산에서 번역되지 않는다. 발현 벡터는 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 전사 및 가능하게는 번역에 필요한 핵산 서열을 지칭하는 다양한 "제어 서열"을 함유할 수 있다. 전사 및 번역을 지배하는 제어 서열에 추가하여, 벡터 및 발현 벡터는 다른 기능을 제공하는 핵산 서열도 함유할 수 있다.

[0077] 발현 제어 또는 조절 요소는 발현 벡터에서 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 서열의 전사를 부여하거나 향상시킨다. 발현 제어 요소는, 예를 들어, 프로모터 및 인핸서를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

[0078] 본원에서 사용되는 "프로모터"는 전형적으로 핵산 서열(예를 들어, BAG3)에 인접하여 위치하는 DNA 서열을 지칭할 수 있다. 프로모터는 전형적으로 프로모터가 존재하지 않을 때 발현되는 양과 비교하여 발현되는 핵산 서열(예를 들어, BAG3)의 양을 증가시킨다.

[0079] 본원에서 사용되는 "인핸서"는 핵산 서열(예를 들어, BAG3)에 인접하여 위치하는 서열을 지칭할 수 있다. 인핸서 요소는 전형적으로 프로모터 요소의 상류에 위치하며 기능도 하며 핵산 서열(예를 들어, BAG3)의 하류에 또는 내에 위치할 수 있다. 따라서, 인핸서 요소는 핵산 서열(예를 들어, BAG3)의 100개 염기쌍, 200개 염기쌍, 또는 300개 이상의 염기쌍 상류 또는 하류에 위치할 수 있다. 인핸서 요소는 전형적으로 프로모터 요소에 의해 제공되는 증가된 발현 이상으로 핵산 서열(예를 들어, BAG3)의 발현을 증가시킨다.

[0080] 본 발명에 따른 방법 및 용도에서 사용될 수 있는 발현 제어 요소 또는 발현 조절 요소의 예는, 예를 들어, 비제한적으로, 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 프로모터/인핸서, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터/인핸서, SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 프로모터, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터, 및 신장 인자-1 알파(EF1-알파) 프로모터를 포함한다.

[0081] 특정 구체예에서, 본 발명의 방법 및 용도에 사용될 수 있는 바이러스 벡터. 특정 구체예에서, 본 발명에 사용될 수 있는 바이러스 벡터는, 예를 들어, 비제한적으로, 레트로바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 아데노바이러스, 헬퍼-의존성 아데노바이러스, 하이브리드 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 백시니아 바이러스 및 인간 사이토메갈로바이러스 벡터(이들의 재조합 버전 포함)를 포함한다.

[0082] 벡터, 예를 들어, 재조합 AAV(rAAV) 벡터의 수식어뿐만 아니라 재조합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드와 같은 서열의 수식어로서 용어 "재조합"은 조성물이 일반적으로 자연에서 발생하지 않는 방식으로 조작(즉, 공학처리)되었음을 의미한다. 따라서, "재조합 바이러스 벡터"는 하나 이상의 이종성 유전자 생성물 또는 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 지칭한다.

[0083] 많은 바이러스 벡터는 패키징과 관련된 크기-제약을 나타내기 때문에, 이종성 유전자 생성물 또는 서열은 전형적으로 바이러스 게놈의 하나 이상의 부분을 대체함으로써 도입된다. 이러한 바이러스는 복제-불능이 될 수 있으며, 바이러스 복제 및 캡시드화 동안 결실된 기능(들)이 트랜스(즉, "헬퍼" 기능)로 제공될 것을 요구한다(예를 들어, AAV rep, AAV cap, 인간 아데노바이러스 E4 및 아데노바이러스 VA RNA와 같은 복제 및/또는 캡시드화에 필요한 유전자 생성물을 운반하는 패키징 세포주 또는 헬퍼 바이러스를 사용함으로써). 전달될 폴리뉴클레오티드가 바이러스 입자의 외부에 운반되는 변형된 바이러스 벡터가 또한 기술되었다(예를 들어, 문헌[Curiel, D T, et al., PNAS 88:8850-8854, 1991] 참조).

[0084] 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 벡터의 특정 예는 야생형 AAV 게놈에 정상적으로 존재하지 않는 핵산(이종성 폴리뉴클레오티드)이 AAV 게놈 내에 삽입된 경우일 것이다. 그 예는 치료용 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 핵산(예를 들어, 유전자)이, 유전자가 AAV 게놈 내에 정상적으로 결합되어 있는 5', 3' 및/또는 인트론 영역을 갖거나 갖지 않는 벡터 내로 클로닝되는 경우일 것이다. 용어 "재조합"이 AAV 벡터 뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드와 같은 서열과 관련하여 본원에서 항상 사용되는 것은 아니지만, AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드 등을 포함하는 재조합 형태는 임의의 이러한 생략에도 불구하고 명시적으로 포함된다.

[0085] 예를 들어, "rAAV 벡터"는 분자 방법을 사용하여 야생형 AAV 게놈의 전부 또는 일부를 제거하고 치료용 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 핵산과 같은 비-천연(이종성) 핵산으로 대체함으로써 AAV의 야생형 게놈으로부터 유래된다. 전형적으로, rAAV 벡터의 경우, AAV 게놈의 하나 또는 둘 모두의 역 말단 반복부(ITR) 서열이 유지된다. rAAV는 AAV 게놈의 전부 또는 일부가 AAV 게놈 핵산과 관련하여 비-천연 서열, 예를 들어, 치료용 단백질 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 이종성 핵산으로 대체되었기 때문에 AAV 게놈과 구별된다. 따라서, 비-천연(이종성) 서열의 혼입은 AAV를 "재조합" AAV 벡터로서 정의하며, 이는 "rAAV 벡터"로서 지칭될 수 있다.

[0086] 재조합 AAV 벡터 서열(또는 게놈)은 패키징될 수 있고- 생체 외, 시험관 내 또는 생체 내에서 세포의 후속 감염(형질도입)을 위한 "입자"로서 본원에서 지칭된다. 재조합 벡터 서열이 캡시드화되거나 AAV 입자로 패키징되는 경우, 입자는 "rAAV", "rAAV 입자" 및/또는 "rAAV 비리온"으로도 지칭될 수 있다. 이러한 rAAV, rAAV 입자 및 rAAV 비리온은 벡터 게놈을 캡시드화하거나 패키징하는 단백질을 포함한다. 특정 예는, AAV의 경우 캡시드 단백질을 포함한다.

[0087] "vg"로 축약될 수 있는 "벡터 게놈"은 궁극적으로 패키징되거나 캡시드화되어 rAAV 입자를 형성하는 재조합 플라스미드 서열의 부분을 지칭한다. 재조합 플라스미드가 재조합 AAV 벡터를 작제 또는 제조하는데 사용되는 경우, AAV 벡터 게놈은 재조합 플라스미드의 벡터 게놈 서열에 상응하지 않는 "플라스미드"의 부분을 포함하지 않는다. 재조합 플라스미드의 이러한 비-벡터 게놈 부분은 증식 및 재조합 AAV 벡터 생산에는 필요하지만, 자체적으로 rAAV 입자로 패키징되거나 캡시드화되지 않는 과정인 플라스미드의 클로닝 및 증폭에 중요한 "플라스미드 백본"으로 지칭된다. 따라서, "벡터 게놈"은 rAAV에 의해 패키징되거나 캡시드화된 핵산을 지칭한다.

[0088] AAV 벡터와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "혈청형"은 다른 AAV 혈청형과 혈청학적으로 구별되는 캡시드를 의미한다. 혈청학적 특수성은 다른 AAV에 비해 하나의 AAV에 대한 항체 간의 교차-반응성의 결여에 기초하여 결정된다. 교차-반응성의 차이는 일반적으로 캡시드 단백질 서열/항원성 결정인자의 차이 때문이다(예를 들어, AAV 혈청형의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열 차이 때문이다). 하나의 AAV에 대한 항체는 캡시드 단백질 서열의 상동성으로 인해 하나 이상의 다른 AAV 혈청형과 교차-반응할 수 있다.

[0089] 기존의 정의에서, 혈청형은 관심 바이러스가 중화 활성을 위해 기존의 모든 및 특성화된 혈청형에 특이적인 혈청에 대해 검사를 받았고 관심 바이러스를 중화시키는 항체는 발견되지 않았음을 의미한다. 더 많은 자연 발생 바이러스 분리물이 발견되고/되거나 캡시드 돌연변이체가 생성됨에 따라, 현재 존재하는 혈청형 중 임의의 것과 혈청학적 차이가 있을 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 따라서, 새로운 바이러스(예를 들어, AAV)가 혈청학적 차이를 갖지 않는 경우, 이 새로운 바이러스(예를 들어, AAV)는 상응하는 혈청형의 서브그룹 또는 변이체일 것이다. 많은 경우에, 중화 활성에 대한 혈청학적 검사는 혈청형의 전통적인 정의에 따라 다른 혈청형을 갖는지를 결정하기 위해 캡시드 서열 변형을 갖는 돌연변이체 바이러스에 대해 아직 수행되지 않았다. 따라서, 편의상 그리고 반복을 피하기 위해, 용어 "혈청형"은 혈청학적으로 별개인 바이러스(예를 들어, AAV) 뿐만 아니라 주어진 혈청형의 서브그룹 또는 변이체 내에 있을 수 있는 혈청학적으로 별개가 아닌 바이러스(예를 들어, AAV) 둘 모두를 지칭한다.

[0090] rAAV 벡터는 임의의 바이러스 균주 또는 혈청형을 포함한다. 예를 들어, 비제한적으로, rAAV 벡터 게놈 또는 입자(캡시드, 예를 들어, VP1, VP2 및/또는 VP3)는, 예를 들어, AAV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, AAV3B 또는 AAV-2i8과 같은 임의의 AAV 혈청형에 기초할 수 있다. 이러한 벡터는 동일한 균주 또는 혈청형(또는 서브그룹 또는 변이체)에 기초하거나, 서로 상이할 수 있다. 예를 들어, 비제한적으로, 한 혈청형 게놈에 기반한 rAAV 플라스미드 또는 벡터 게놈 또는 입자(캡시드)는 벡터를 패키징하는 캡시드 단백질 중 하나 이상과 동일할 수 있다. 또한, rAAV 플라스미드 또는 벡터 게놈은 벡터 게놈을 패키징하는 캡시드 단백질 중 하나 이상과 상이한 AAV 혈청형 게놈에 기초할 수 있고, 이 경우에 3개의 캡시드 단백질 중 적어도 하나는 상이한 AAV 혈청형, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV-2i8(AAV2/AAV8 키메라), AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 또는 이의 변이체일 수 있다. 보다 구체적으로, rAAV2 벡터 게놈은 AAV2 ITR을 포함할 수 있지만, 예를 들어, AAV1, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-2i8, 또는 이의 변이체와 같은 상이한 혈청형으로부터의 캡시드를 포함할 수 있다. 따라서, rAAV 벡터는 "슈도형"으로도 지칭될 수 있는 "혼합된" 혈청형 뿐만 아니라 특정 혈청형에 특징적인 유전자/단백질 서열과 동일한 유전자/단백질 서열을 포함한다.

[0091] 특정 구체예에서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV-2i8, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 또는 AAV12 캡시드 단백질(VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열)과 적어도 70% 이상(예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등) 동일한 캡시드 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 특정 구체예에서, rAAV 벡터는 하나 이상의 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 또는 AAV12 ITR(들)과 적어도 70% 이상(예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등) 동일한 서열을 포함하거나 이로 구성된다.

[0092] 특정 구체예에서, rAAV 벡터는, 예를 들어, WO 2013/158879(국제 출원 PCT/US2013/037170), WO 2015/013313(국제 출원 PCT/US2014/047670) 및 US 2013/0059732(US 출원 번호 13/594,773)에 제시된 바와 같은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV-2i8, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 또는 AAV12 변이체(예를 들어, ITR 및 캡시드 변이체, 예를 들어, 이의 아미노산 삽입, 첨가, 치환 및 결실)를 포함한다.

[0093] AAV1, AAV2, AAV3, AAV3B, AAV-2i8, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 및 변이체, 하이브리드 및 키메라 서열과 같은 rAAV는 하나 이상의 기능성 AAV ITR 서열에 측접한 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드 서열(트랜스진)을 포함하도록 당업자에게 공지된 재조합 기술을 이용하여 작제될 수 있다. 이러한 AAV 벡터는 전형적으로 rAAV 벡터 입자로의 재조합 벡터의 구제, 복제 및 패키징에 필요한 적어도 하나의 기능성 측면 ITR 서열(들)을 보유한다. 따라서, rAAV 벡터 게놈은 복제 및 패키징에 필요한 서열(예를 들어, 기능성 ITR 서열)을 시스로(in cis) 포함할 것이다.

[0094] 특정 구체예에서, 본 발명에서 사용되는 렌티바이러스는 인간 면역결핍-1(HIV-1), 인간 면역결핍-2(HIV-2), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 소 면역결핍 바이러스(BIV), 젬브라나병(Jembrana Disease) 바이러스(JDV), 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV), 또는 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV)일 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 시험관 내 및 생체 내 둘 모두에서 이종성 폴리뉴클레오티드 서열의 비분할 세포로의 효율적인 전달, 통합 및 장기간 발현을 제공할 수 있다. 다양한 렌티바이러스 벡터가 당 분야에 공지되어 있다(문헌[Naldini et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:11382-11388 (1996); Science, 272: 263-267 (1996)), Zufferey et al., (Nat. Biotechnol., 15:871-875, 1997), Dull et al., (J Virol. 1998 Nov;72(11):8463-71, 1998), U.S. Pat. Nos. 6,013,516 and 5,994,136] 참조, 이들 중 임의의 것은 본 발명에서 사용하기에 적합한 바이러스 벡터일 수 있다).

[0095] 재조합 바이러스 벡터 용량은 임의의 적절한 용량으로 제형화, 투여 또는 전달될 수 있다. 일반적으로, 용량은 효과를 달성하기 위해 환자의 체중 킬로그램 당 적어도 1x10⁸ 벡터 게놈(vg/kg) 또는 그 초과, 예를 들어, 킬로그램 당 1x10⁹, 1x10¹⁰, 1x10¹¹, 1x10¹², 1x10¹³ 또는 1x10¹⁴ 또는 그 초과의 벡터 게놈의 범위일 것이다. 마우스에서 1x10¹⁰ 내지 1x10¹¹ vg/kg 및 개에서 1x10¹² 내지 1x10¹³ vg/kg 범위의 rAAV 용량이 효과적이었다. 보다 구체적으로, 용량은 약 1x10¹¹ vg/kg 내지 약 5x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5x10¹¹ vg/kg 내지 약 1x10¹⁴ vg/kg, 또는 약 5x10¹¹ vg/kg 내지 약 5x10¹³ vg/kg, 또는 약 5x10¹¹ vg/kg 내지 약 1x10¹³ vg/kg, 또는 약 5x10¹¹ vg/kg 내지 약 5x10¹² vg/kg, 또는 약 5x10¹¹ vg/kg 내지 약 1x10¹² vg/kg이다. 용량은, 예를 들어, 약 5x10¹⁴ vg/kg 또는 약 5x10¹⁴ vg/kg 미만, 예를 들어, 약 2x10¹¹ 내지 약 2x10¹⁴ vg/kg의 용량, 특히, 예를 들어, 약 2x10¹² vg/kg, 약 6x10¹² vg/kg 또는 약 2x10¹³ vg/kg일 수 있다.

[0096] "유효량", "충분한 양" 또는 "치료적 유효량"은 단일 또는 다중 용량으로, 단독으로 또는 하나 이상의 다른 조성물, 치료, 프로토콜 또는 치료 요법 제제와 함께, 임의의 지속 기간(장기 또는 단기)의 검출 가능한 반응, 임의의 측정 가능하거나 검출 가능한 정도 또는 임의의 지속 기간 동안(예를 들어, 수 분, 수 시간, 수 일, 수 개월, 수 년 또는 치료되는 동안) 환자에 대한 이익에서 예상되거나 원하는 결과를 제공하는 양을 지칭한다. 질환, 장애 또는 질병의 치료를 위한(예를 들어, 질환, 장애 또는 질병의 치료적 이점 또는 개선을 제공하거나 개량하기 위한) "유효량" 또는 "충분한 양"의 용량은 전형적으로, 비록 질환, 장애 또는 질병의 진행 또는 악화를 감소, 축소, 억제, 저지, 제한 또는 제어하는 것이 만족스러운 결과이지만, 질병의 하나, 다수 또는 모든 부작용, 예후 또는 합병증, 하나 이상의 부작용, 장애, 질병, 병리, 또는 예를 들어, 질환, 장애 또는 질병으로 인해 발생하거나 이와 관련된 질환, 장애 또는 질병의 합병증에 대한 반응을 측정 가능한 정도로 제공하는데 효과적이다.

[0097] 유효량 또는 충분한 양은 반드시 그런 것은 아니지만 단일 제형 또는 투여로 제공될 수 있고, 다중 투여를 필요로 할 수 있고, 반드시 그런 것은 아니지만, 단독으로 또는 다른 조성물(예를 들어, 제제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법과 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 양은 환자의 필요, 치료되는 질환, 장애 또는 질환의 유형, 상태 및 중증도 또는 치료 부작용(있는 경우)에 따라 비례적으로 증가될 수 있다. 또한, 추가 용량, 이러한 용량 이상 및 미만의 양 또는 지속 기간, 또는 추가 조성물(예를 들어, 약물 또는 제제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법이 주어진 환자에서 효과적이거나 충분한 것으로 간주되기 위해 포함될 수 있으므로, 유효량 또는 충분한 양은 제2 조성물(예를 들어, 다른 약물 또는 제제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법 없이 단일 또는 다중 용량으로 제공되는 경우 효과적이거나 충분할 필요는 없다. 효과적인 것으로 간주되는 양은 또한 다른 치료, 치료 요법 또는 프로토콜의 사용을 감소시키는 양을 포함한다.

[0098] 유효량 또는 충분한 양은 치료되는 각각의 및 모든 환자, 또는 주어진 그룹 또는 집단에서 치료되는 환자의 대다수에서 효과적일 필요는 없다. 유효량 또는 충분한 양은 그룹 또는 일반 집단이 아닌 특정 환자에 대한 효과 또는 충분량을 의미한다. 이러한 방법에 대해 전형적인 바와 같이, 일부 환자는 주어진 치료 방법 또는 용도에 대해 더 큰 반응을 나타내거나, 반응을 덜 나타내거나 전혀 나타내지 않을 것이다.

[0099] 따라서, 본 발명의 방법, 용도 및 제형은 환자에게 검출 가능하거나 측정 가능한 유익한 효과, 또는 질환, 장애 또는 질병의 임의의 객관적 또는 주관적 일시적 또는 임시적, 또는 장기적 개선(예를 들어, 치유)을 제공하는 것을 포함한다. 따라서, 만족스러운 임상 종말점은 환자의 질환, 장애 또는 질병의 점진적인 개선 또는 질환, 장애 또는 질병의 하나 이상의 관련 부작용 또는 합병증의 중증도, 빈도, 지속 기간 또는 진행의 부분적 감소, 또는 질환, 장애 또는 질병의 생리학적, 생화학적 또는 세포적 소견 또는 특징 중 하나 이상의 억제, 감소, 제거, 예방 또는 역전이 있을 때 달성된다. 따라서, 치료적 이점 또는 개선("개량"이 동의어로 사용됨)은 질환, 장애 또는 질병과 관련된 임의의 또는 모든 부작용 또는 합병증의 완전한 제거일 필요는 없지만, 객관적 또는 주관적으로 측정 가능하거나 검출 가능한 질환, 장애 또는 질병의 의미 있는 개선이다. 예를 들어, 질환, 장애 또는 질병, 또는 관련 증상의 악화 또는 진행을 억제하는 것(예를 들어, 진행을 늦추거나 하나 이상의 증상, 합병증 또는 생리학적 또는 심리적 효과 또는 반응을 안정화시키는 것)은 질환, 장애 또는 질병, 또는 관련 부작용의 완전한 제거가 달성되지 않더라도, 단지 수 일, 수 주, 수 개월 동안이라도 유익한 효과로 간주된다.

[0100] "치료"는 질환, 장애 또는 질병의 발달을 예방하거나, 병리학 또는 하나 이상의 증상을 변경하거나, 질환, 장애 또는 질병의 진행 또는 악화를 지연시킬 의도로 수행되는 개입이다. 따라서, "치료"는 치료적 치료 및 예방적 또는 방지용 조치 둘 모두를 지칭한다. "치료"는 또한 완화 치료로 명시될 수 있다.

[0101] "예방" 및 이의 문법적 변형은 대상체에 대한 접촉, 투여 또는 생체 내 전달이 질환, 장애 또는 질병(또는 관련 증상 또는 생리학적 또는 심리적 반응)의 발현 또는 개시 전에 이루어져, 질환, 장애 또는 질병, 또는 관련 증상을 가질 확률, 감수성, 발병 또는 빈도를 제거, 예방, 억제, 감소 또는 저하시킬 수 있는 본 발명에 따른 방법을 의미한다. 예방을 위한 표적 환자는 심부전, 박출률이 감소된 심부전, 박출률이 보존된 심부전, 또는 관련 증상과 같은 질환, 장애 또는 질병에 걸릴 위험(확률 또는 감수성)이 높거나, 본원에 기재된 바와 같은, 이전에 진단된 질환, 장애 또는 질병, 또는 관련 증상의 재발 위험이 높은 환자일 수 있다.

[0102] 치료가 필요한 사람은 이미 질환, 장애 또는 질병을 앓고 있는 사람 뿐만 아니라 질환, 장애 또는 질병이 예방되어야 하는 사람을 포함한다. 따라서, 질환, 장애 또는 질병을 "치료하는" 또는 "치료"는; (1) 질환, 장애 또는 질환에 걸릴 수 있거나 걸리기 쉽지만 아직 질환, 장애 또는 질병의 임상적 또는 준임상적 증상을 경험하거나 나타내지 않은 인간 또는 다른 포유동물에서 질환, 장애 또는 질병의 임상적 증상의 출현을 예방하거나 지연시키거나; (2) 질환, 장애 또는 질병을 억제하거나, 즉, 질환, 장애 또는 질병의 발달 또는 이의 재발(유지 치료의 경우) 또는 이의 적어도 하나의 임상적 또는 준임상적 증상을 저지, 감소 또는 지연시키거나; (3) 질병을 경감시키는 것, 즉, 질환, 장애 또는 질병 또는 이의 임상적 또는 준임상적 증상 중 적어도 하나의 퇴행을 유발하는 것을 포함한다. 치료되는 환자에 대한 이점은 통계적으로 유의하거나 적어도 환자 또는 의사에게 인지될 수 있다.

[0103] 용어 "개선"은 환자의 질환, 장애 또는 질병 또는 이의 증상, 또는 기저 세포 반응에서 검출 가능하거나 측정 가능한 개선을 의미한다. 검출 가능하거나 측정 가능한 개선은 질환, 장애 또는 질병, 또는 질환, 장애 또는 질병에 의해 야기되거나 이와 관련된 합병증의 발생, 빈도, 중증도, 진행, 또는 지속 기간의 주관적 또는 객관적 감소, 저하, 억제, 저지, 제한 또는 제어, 또는 질환, 장애 또는 질병의 증상 또는 근본 원인 또는 예후의 개선, 또는 질환, 장애 또는 질병의 역전을 포함한다.

[0104] 제형은 1일 1회 이상; 격일로 1회; 1주에 1회 이상; 1개월에 1회 이상; 1년에 1회 이상; 또는 환자의 일생 동안 1-2회로 투여될 수 있다. 당업자는 질환, 장애 또는 질병의 중증도, 원하는 결과, 이전 치료, 환자의 전반적인 건강 상태 및/또는 연령, 및 다른 존재하는 질병을 포함하나 이에 제한되지 않는 특정 인자가 환자를 치료하는데 필요한 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본 발명에 따른 치료적 유효량으로의 환자의 치료는 단일 치료 또는 다중 치료, 예를 들어, 일련의 치료를 포함할 수 있다.

[0105] 본 발명의 제형, 조성물 및 약학적 조성물은 활성 제제가 의도된 치료 목적을 달성하기 위해 유효량으로 함유된 조성물을 포함한다. 유효 용량을 결정하는 것은 당 분야에 공지된 기술 및 지침을 사용하고 본원에 제공된 교시를 사용하여 충분히 숙련된 의사의 능력 내에 있다.

[0106] 핵산 전사 및 인코딩되는 단백질의 번역이 가능하도록 약학적 조성물과 같은 제형이 환자에게 전달될 수 있다. 특정 구체예에서, 제형, 예를 들어, 약학적 조성물은 질환, 장애 또는 질병을 치료하기 위해 환자에서 치료적 유효량의 BAG3의 생산을 가능하게 하기에 충분한 유전 물질을 포함한다.

[0107] 용어 "조절하다"는 본원에서 구현된 화합물의 언급된 활성 중 임의의 것이, 예를 들어, 증가, 향상, 증가, 촉진, 효능작용(효능제로서 작용), 감소, 저하, 억제, 저지, 차단 또는 길항작용(길항제로서 작용)하는 것을 의미한다. 조절은 활성을 기준선 값 미만으로 감소 또는 저하시킬 수 있고, 예를 들어, 1 내지 5배, 1 내지 10배, 5 내지 10배, 10 내지 20배, 20 내지 30배, 40 내지 50배 등, 또는 적어도 1배, 2배, 3배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 등의 감소 또는 저하일 수 있다. 조절은 또한 활성을 기준선 값 이상으로 증가 또는 향상시킬 수 있고, 예를 들어, 1 내지 5배, 1 내지 10배, 5 내지 10배, 10 내지 20배, 20 내지 30배, 40 내지 50배 등, 또는 적어도 1배, 2배, 3배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 등의 증가 또는 향상일 수 있다.

[0108] 본 발명의 방법 및 용도는 영장류(예를 들어, 인간) 및 수의적 의료 적용에 사용될 수 있다. 따라서 적합한 환자는 인간과 같은 포유동물 및 비인간 포유동물을 포함한다. 적합한 환자는 BAG3 발현 또는 BAG3 활성의 증가를 필요로 하거나 이로 인해 이익을 얻을 포유동물, 예를 들어, 인간을 포함한다.

[0109] 용어 "환자" 및 "대상체"는 동물, 전형적으로 포유동물, 예를 들어, 인간, 비인간 영장류(원숭이, 긴팔 원숭이, 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 원숭이), 가축(개 및 고양이), 농장 동물(가금류, 예를 들어, 닭 및 오리, 말, 소, 염소, 양, 돼지) 및 실험 동물(마우스, 래트, 토끼, 기니피그)을 지칭한다. 인간 환자는 태아, 신생아, 유아, 청소년 및 성인 대상체를 포함한다. 환자는 또한 동물 질병 모델, 예를 들어, BAG3 결핍의 마우스 및 다른 동물 모델을 포함한다.

[0110] 조성물 및 제형은 멸균될 수 있고, 방법 및 용도는 멸균 기술, 및 선택적으로 멸균 조성물 및 제형을 사용하여 실시될 수 있다. 조성물은 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스 및 물을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 생체적합성 약학적 담체로 제형화되거나 투여될 수 있다. 조성물은 단독으로, 또는 투여량, 투여 빈도 및/또는 치료 효능에 영향을 미치는 다른 제제와 함께 제형화되거나, 투여되거나 환자에게 전달될 수 있다.

[0111] 본 발명의 제형, 방법 및 용도는 전신으로, 부위적으로 또는 국소적으로(예를 들어, 특정 영역, 조직, 기관 또는 세포로), 또는 임의의 경로, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 전달 및 투여를 포함한다. 조성물, 제형 및 약학적 조성물의 생체 내 투여 또는 전달은 일반적으로 통상적인 주사기 또는 카테터를 사용하여 주사를 통해 달성될 수 있지만, 다른 전달 방법도 구상된다. 예를 들어, 제형 및 조성물은 역행성 관상 정맥 또는 정맥동 전달을 통해 환자에게 투여될 수 있다.

[0112] 또한, 본 발명에 따르면, 핵산, 바이러스 벡터를 포함하는 발현 벡터 및 바이러스 입자는 리포솜, 나노입자, 지질 나노입자, 폴리머, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 마이셀, 또는 세포외 소포로 캡슐화되거나 복합체화될 수 있다.

[0113] "지질 나노입자" 또는 "LNP"는 나노규모, 즉, 약 10 nm 내지 약 1000 nm, 또는 약 50 내지 약 500 nm, 또는 약 75 내지 약 127 nm의 치수를 갖는 핵산, 바이러스 벡터를 포함하는 발현 벡터의 투여 또는 전달에 유용한 지질-기반 소포를 지칭한다. 이론에 얽매이지 않고, LNP는 면역 시스템으로부터 부분적 또는 완전한 차폐와 함께 핵산, 발현 벡터 또는 재조합 바이러스 벡터를 제공하는 것으로 여겨진다. 차폐는 생체 내에서 핵산, 발현 벡터 또는 바이러스 벡터에 대한 실질적인 면역 반응이 유도되는 것을 피하면서 조직 또는 세포로의 핵산, 발현 벡터 또는 바이러스 벡터의 전달을 허용한다. 차폐는 또한 실질적인 면역 반응을 유도하지 않으면서 반복 투여를 허용할 수 있다. 차폐는 또한 전달 효율, 치료 효과의 지속 기간 및/또는 생체 내 치료 효능을 개선하거나 증가시킬 수 있다.

[0114] AAV 표면은 약간의 음전하를 운반한다. 따라서, LNP가, 예를 들어, 아미노 지질과 같은 양이온성 지질을 포함하는 것이 유리할 수 있다. 예시적인 아미노 지질은 미국 특허 번호 9,352,042, 9,220,683, 9,186,325, 9,139,554, 9,126,966, 9,018,187, 8,999,351, 8,722,082, 8,642,076, 8,569,256, 8,466,122 및 7,745,651 및 미국 특허 공개 번호 2016/0213785, 2016/0199485, 2015/0265708, 2014/0288146, 2013/0123338, 2013/0116307, 2013/0064894, 2012/0172411 및 2010/0117125에 개시되었다.

[0115] 용어 "양이온성 지질" 및 "아미노 지질"은 1개, 2개, 3개 이상의 지방산 또는 지방 알킬 사슬 및 pH-적정 가능한 아미노 기(예를 들어, 알킬아미노 또는 디알킬아미노 기)를 갖는 지질 및 이들의 염을 포함하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 양이온성 지질은 전형적으로 양이온성 지질의 pKa 미만의 pH에서 양성자화(즉, 양전하)되고 pKa 이상의 pH에서 실질적으로 중성이다. 양이온성 지질은 또한 적정 가능한 양이온성 지질일 수 있다. 특정 구체예에서, 양이온성 지질은 양성자화 가능한 3차 아민(예를 들어, pH-적정 가능한) 기; 각각의 알킬 사슬이 독립적으로 0 내지 3개(예를 들어, 0, 1, 2, 또는 3개)의 이중 결합을 갖는 C18 알킬 사슬; 및 헤드 그룹과 알킬 사슬 사이의 에테르, 에스테르, 또는 케탈 연결을 포함한다.

[0116] 특정 구체예에서, 양이온성 지질은 LNP의 약 10 중량% 내지 지질 나노입자의 약 85 중량%, 또는 LNP의 약 50 중량% 내지 LNP의 약 75 중량%의 양으로 존재할 수 있다.

[0117] LNP는 중성 지질을 포함할 수 있다. 중성 지질은 생리학적 pH에서 하전되지 않은 또는 중성 쯔비터이온 형태로 존재하는 임의의 지질 종을 포함할 수 있다. 이러한 지질은, 비제한적으로, 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라마이드, 스핑고미엘린, 디하이드로스핑고미엘린, 세팔린 및 세레브로시드를 포함한다. 중성 지질의 선택은 일반적으로, 특히, 입자 크기 및 필요한 안정성을 고려하여 안내된다. 특정 구체예에서, 중성 지질 성분은 2개의 아실 기를 갖는 지질(예를 들어, 디아실포스파티딜콜린 및 디아실포스파티딜에탄올아민)일 수 있다.

[0118] 특정 구체예에서, 중성 지질은 지질 나노입자의 약 0.1 중량% 내지 LNP의 약 75 중량%, 또는 LNP의 약 5 중량% 내지 LNP의 약 15 중량%의 양으로 존재할 수 있다.

[0119] 생물학적 샘플은 전형적으로 생물학적 유기체로부터 수득되거나 이에 의해 생산된다. 분석될 수 있는 환자로부터의 생물학적 샘플의 예는, 예를 들어, 비제한적으로, 전혈, 혈청, 혈장 등, 및 이들의 조합을 포함한다. 환자로부터의 다른 생물학적 샘플은, 예를 들어, 비제한적으로, 뇌척수액 또는 단순히 척수액을 포함한다. 생물학적 샘플에는 세포가 없거나, 세포(예를 들어, 적혈구, 혈소판 및/또는 림프구)를 포함할 수 있다.

[0120] 본 발명은 패키징 물질 및 그 안에 하나 이상의 성분을 포함하는 키트와 같은 조성물을 제공한다. 키트는 전형적으로 그 안의 성분의 설명 또는 성분의 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외 사용을 위한 설명서를 포함하는 라벨 또는 패키징 삽입물을 포함한다. 키트는 이러한 성분, 예를 들어, 핵산, 재조합 벡터, 바이러스(예를 들어, AAV, 렌티바이러스) 벡터, 또는 바이러스 입자의 집합을 함유할 수 있다.

[0121] 키트는 키트의 하나 이상의 성분을 수용하는 물리적 구조를 지칭한다. 패키징 물질은 성분을 멸균 상태로 유지할 수 있으며, 이러한 목적으로 일반적으로 사용되는 물질(예를 들어, 종이, 골판지 섬유, 유리, 플라스틱, 호일, 앰플, 바이알, 튜브 등)로 제조될 수 있다.

[0122] 라벨 또는 삽입물은 그 안의 하나 이상의 성분, 용량, 작용 메커니즘, 약동학 및 약역학을 포함하는 활성 성분(들)의 임상 약리학의 식별 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 제조업체, 로트 번호, 제조 위치 및 날짜, 만료 날짜를 식별하는 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 제조업체 정보, 로트 번호, 제조업체 위치 및 날짜를 식별하는 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 키트 성분이 사용될 수 있는 질환, 장애 또는 질병에 대한 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 방법, 용도, 또는 치료 프로토콜 또는 치료 요법에서 키트 성분 중 하나 이상을 사용하기 위한 임상의 또는 환자를 위한 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 투여량, 빈도 또는 지속 기간, 및 본원에 기재된 임의의 방법, 용도, 치료 프로토콜 또는 예방 또는 치료 요법을 실시하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.

[0123] 라벨 또는 삽입물은 예방적 또는 치료적 이점과 같이 성분이 제공할 수 있는 모든 이점에 대한 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 잠재적인 부작용, 합병증 또는 반응에 대한 정보, 예를 들어, 특정 조성물을 사용하는 것이 적절하지 않은 상황과 관련된 환자 또는 임상의를 향한 경고를 포함할 수 있다. 부작용 또는 합병증은 또한 환자가 조성물과 양립할 수 없는 하나 이상의 다른 약물을 복용해 왔거나, 복용할 것이거나 또는 현재 복용 중일 때, 또는 환자가 조성물과 양립할 수 없는 다른 치료 프로토콜 또는 치료 요법을 받았거나, 받을 예정이거나, 현재 받고 있을 때 발생할 수 있으므로, 설명서는 이러한 비양립성에 관한 정보를 포함할 수 있다.

[0124] 라벨 또는 삽입물은 "인쇄물", 예를 들어, 종이 또는 판지이거나, 성분, 키트 또는 패키징 물질(예를 들어, 상자)과 별도이거나 이에 부착되거나, 키트 성분을 함유하는 앰플, 튜브 또는 바이알에 부착된 것을 포함한다.

[0125] 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 이용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질이 본원에 기재되어 있다.

[0126] 본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 공보, 및 다른 참고문헌, GenBank 인용 및 ATCC 인용은 그 전체가 참조로 포함된다. 상충의 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다.

[0127] 본원에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나 동등하거나 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 개시된 특징은 동등하거나 유사한 특징의 부류의 예이다.

[0128] 본원에서 사용되는 단수 형태는 문맥상 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "핵산"에 대한 언급은 복수의 이러한 핵산을 포함하고, "벡터"에 대한 언급은 복수의 이러한 벡터를 포함하고, "바이러스" 또는 "입자"에 대한 언급은 복수의 이러한 바이러스 및 입자를 포함한다.

[0129] 항목, 조성물, 제형, 방법, 공정, 시스템 등의 정의되거나 기재된 요소와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "포함하는", "포함하다" 또는 "포함되는", 및 이들의 변형은 포괄적이고 개방형인 것을 의미하며, 추가 요소를 허용하여, 정의되거나 기재된 항목, 조성물, 제형, 방법, 공정, 시스템 등이 그러한 특정 요소(또는 적절한 경우 이의 등가물)를 포함하고 다른 요소가 포함될 수 있음을 나타내고, 여전히 정의된 항목, 조성물, 제형, 방법, 공정, 시스템 등의 범위/정의 내에 속한다.

[0130] 용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 바와 같은 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내에 있음을 의미하며, 이는 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들어, "약"은 당 분야의 관행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값 내에서 최대 20%, 또는 최대 10%, 또는 최대 5%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 상기 용어는 주어진 값의 10배 이내, 예를 들어, 5배, 4배, 3배, 2배, 또는 1배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구항에서 기재되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

[0131] 모든 수치 값 또는 수치 범위는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 이러한 범위 내의 정수 및 범위 내의 값 또는 정수의 분수를 포함한다. 따라서, 예시를 위해, 95% 이상의 감소에 대한 언급은 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 등을 포함할 뿐만 아니라 95.1%, 95.2%, 95.3%, 95.4%, 95.5% 등, 96.1%, 96.2%, 96.3%, 96.4%, 96.5% 등을 포함한다. 따라서, 또한 예시를 위해, "1-4"와 같은 수치 범위에 대한 언급은 2, 3 뿐만 아니라 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 등을 포함한다. 예를 들어, "1-4주"는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28일을 포함한다.

[0132] 또한, "0.01 내지 10"과 같은 수치 범위에 대한 언급은 0.011, 0.012, 0.013 등을 포함할 뿐만 아니라 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9 등을 포함한다. 예를 들어, 환자의 체중 kg 당 약 "1x10¹¹ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁴ vg/kg"의 투여량은 1.1x10¹¹ vg/kg, 1.2x10¹¹ vg/kg, 1.3x10¹¹ vg/kg, 1.4x10¹¹ vg/kg, 1.5x10¹¹ vg/kg 등을 포함할 뿐만 아니라 0.9x10¹⁴ vg/kg, 0.8x10¹⁴ vg/kg, 0.7x10¹⁴ vg/kg, 0.6x10¹⁴ vg/kg, 0.5x10¹⁴ vg/kg 등을 포함한다.

[0133] 초과(더 큰) 또는 미만과 함께 정수의 언급은 각각 참조 숫자보다 크거나 작은 임의의 수를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 2 초과에 대한 언급은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 등을 포함한다. 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터의 "2회 이상"의 투여는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15회 이상을 포함한다.

[0134] 또한, "1 내지 90"과 같은 수치 범위에 대한 언급은 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 등을 포함할 뿐만 아니라 81, 82, 83, 84, 85 등을 포함한다. 예를 들어, "약 1분 내지 약 90일"은 1.1분, 1.2분, 1.3분, 1.4분, 1.5분 등을 포함할 뿐만 아니라 1일, 2일, 3일, 4일, 5일... 81일, 82일, 83일, 84일, 85일 등을 포함한다.

[0135] "선택적" 또는 "선택적으로"는 후속하여 설명되는 상황이 발생할 수 있거나 발생하지 않을 수 있어, 설명이 상황이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우를 포함하는 것을 의미한다.

[0136] 본 발명은 본 발명의 다수의 구체예를 설명하기 위해 긍정적인 언어를 사용하여 본원에서 일반적으로 개시된다. 본 발명은 또한 구체적으로 조성물 또는 제형, 용도, 방법 단계 및 조건, 프로토콜 또는 절차와 같은 특정 주제가 전체적으로 또는 부분적으로 배제된 구체예를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 특정 구체예에서, 조성물 및/또는 방법 단계가 배제된다. 따라서, 본 발명이 본 발명에 포함되지 않은 사항에 관하여 본원에 일반적으로 명시하고 있지는 않지만, 그럼에도 불구하고 본 발명에서 명백하게 배제되지 않은 양태는 본원에 개시된 것이다.

[0137] 본 발명의 많은 구체예가 개시되었다. 그럼에도 불구하고, 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으며, 다양한 용도 및 조건에 본 발명을 채용하기 위해 이를 다양하게 변형하고 수정할 수 있다. 따라서, 하기 실시예는 청구된 본 발명의 범위를 예시하기 위한 것이며 어떤 식으로든 제한하지 않는다.

실시예

실시예 1

[0138] 전달 방법의 초기 평가는 리포터 유전자(GFP)를 갖는 AAV9를 사용하여 수행되었다. 이 연구는 2개의 AAV 용량, 1e13vg 및 5e13vg를 사용하여 수행되었다. 웨스턴 블롯팅은 좌심실로부터의 하나, 우심실로부터의 하나, 및 격막으로부터의 하나의 샘플에 대해 CRO(Absorption Systems)에 의해 수행되었다. 이 블롯에서, 1e13vg의 AAV9-GFP를 안와 후방으로 투여한 마우스의 조직을 대조군으로 사용하였다.

[0139] 이 연구의 결과(도 2)는 5e13vg가 투여된 동물에서 역행성 전달 방법의 명백한 우수성을 나타내었다.

실시예 2

[0140] rAAV2/9-BAG3 실험 설계:

경로: 역행성 관상 정맥동 주입(RCSI)

빈도: 1일에 한 번

용량 수준: 5e13vg(1,219μl), 1e14vg(2,439μl) 및 2.5e14 vg(6,097μl)

[0141] 방법: 건강한 수컷 Yucatan 미니피그(체중: 30-40 kg)를 진정시키고 무작위화하여 관상 정맥동(CS)에서 형광투시 하에 배치된 카테터의 팁을 통해 rAAV2/9-BAG3(vg= rAAV 벡터 게놈)의 3개 용량 5e13vg(A, n=4), 1e14vg(B, n=2), 2.5e14vg(C, n=1) 중 하나를 투여하였다. CS의 폐색은 주사 전에 정맥조영술에 의해 확인되었다. AAV9-BAG3 벡터를 40-80 mL의 비히클에서 2 내지 5 mL/분으로 20분에 걸쳐 소공에서 동시 풍선 폐색에 의해 주입하였다.

[0142] 투여 8주 후, 도 4에 도시된 바와 같이 장축 및 우심실 자유벽을 따라 6개 지점에 있는 좌심실 조직의 3개의 단축 원주 세그먼트로부터 18개의 조직 세그먼트를 수득하였다. AAV 벡터 게놈(vg)의 존재는 정량적 중합효소 연쇄 반응 및 트랜스진 플라스미드의 알려진 복사체 수의 표준 곡선에 의해 평가되었다. 벡터 메신저 RNA는 벡터 상보적 DNA를 표적화하는 정량적 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 평가되었고, 하우스키핑 18S 유전자에 대한 상대적인 양으로 표현되었다. BAG3 발현을 면역조직화학을 사용하여 평가하였다. 결과는 그룹별로 동물 당 상대적인 양, DNA vg/mg, 또는 가능한 경우 vg/심근세포의 평균 SEM으로 표현된다(예를 들어, n ≥ 1).

[0143] 해당 동물에 대한 평균으로부터 3 표준 편차(SD)를 초과하는 vg 또는 전사체에 대한 측정은 제외되었다. vg/심근세포를 표현하기 위해, 각각의 돼지 심근세포는 8개의 핵을 갖는 것으로 가정하였다.

[0144] 게놈 DNA(vg/μg)는 모든 조직 샘플에서 다양한 수준으로 존재하였다. (그룹 A: 7,043±3,579 vg/μg; 그룹 B: 24,832±3,307 vg/μg; 그룹 C: 15,744 vg/μg, n=1) vg의 평균 양은 그룹 B 및 C의 주어진 용량에서 돼지 심근세포 당 ≥1이었다(그룹 A: 0.70 ± 0.2; 그룹 B: 2.0 ± 0.8; 그룹 C: 1.3).

[0145] BAG3 트랜스진의 전사가 또한 그룹 A, B, 및 C에서 측정되었다. 18S 리보솜 RNA로 표준화된 벡터 전사체의 상대적인 양(±SEM)은 비히클 그룹: 0.99; 그룹 A: 4.1±1.0; 그룹 B: 9.0±4.5; 및 그룹 C: 8.5였다. 면역조직화학에 의해 측정된 BAG3 단백질 수준은 변하지 않았다.

[0146] 결과: 이 연구에서 RCSI를 사용하여 심근을 AAV9-BAG3으로 안전하고 효율적으로 형질도입하였다. 벡터 DNA/이배체 게놈의 광범위한 분포는 전방 좌심실, 전방 가쪽 좌심실, 하부 가쪽 좌심실, 하부 가쪽 심실, 중격 및 우심실을 포함하는 심근 전체에서 관찰되었다. 평균적으로, 각각의 심근세포는 1x10¹⁴ vg(3.45x10¹² vg/kg) 및 2.5x10¹⁴ vg(7.58x10¹² vg/kg)의 총 vg 용량을 사용하여 도입된 유전자의 적어도 1개 복사체를 가졌다. 상기 기재된 제외 기준을 적용한 후, 1e14vg 용량을 사용한 심장의 AAV 벡터 형질도입은 세포의 가장 큰 형질도입을 제공하는 것으로 보인다(도 3). 이 연구는 AAV 벡터를 포함하는 바이러스 벡터가 DNA를 심장에 전달할 수 있다는 강력한 증거를 제공한다. 예상대로, BAG3 단백질 수준은 아마도 BAG3이 자동 조절되기 때문에 변경되지 않았다.

[0147] 비교적 낮은 용량의 AAV9-BAG3의 투여 후 돼지 심장에서 벡터 게놈(vg)의 존재 및 전사를 고려할 때, RCSI는 기능성 BAG3 단백질의 발현을 효과적으로 제공할 수 있고, 이에 의해 반수체 부족과 같은 BAG3 결핍 환경에서 치료 효과를 발휘할 수 있다. 심근에 걸쳐 관찰되는 생체분포의 가변성은 유전자 분포가 심근 긴장의 고유한 불균일성에 의해 영향을 받을 수 있다는 가설을 뒷받침한다.

[0148] 결론적으로, 카테터-기반 경정맥 역행성 CS 투여를 사용한 비교적 낮은 용량의 AAV9-BAG3 vg의 안전한 전달은 심근의 광범위 형질도입을 초래하였다. 역행성 CS를 통한 국소/표적 전달을 사용하여 더 낮은 총 vg 용량을 사용하는 것은 임상에서 안전성 이점으로 해석될 수 있다.

실시예 3

[0149] 진행 중인 후속 용량 독성 연구는 AAV 벡터 용량, 투여되는 부피, 분당 용량을 하기 기재된 바와 같이 변형시킨 것을 제외하고는 실질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 AAV9-BAG3 벡터를 사용하여 수행되었다. 이 연구는 동물 당 3개의 AAV 벡터 용량, 1e14vg, 2.5e14 및 5e14vg를 사용하여 수행되었다. 용량 부피를 20 mL로 감소시키고, 이를 20분에 걸쳐 투여하였다(1 mL/분). 하기 논의된 결과는 주입 3개월 후에 분석된 동물로부터의 결과이다.

[0150] 방법: 건강한 수컷 Yucatan 미니피그(체중: 30-40 kg)를 진정시키고 무작위화하여 관상 정맥동(CS)에서 형광투시 하에 배치된 카테터의 팁을 통해 rAAV2/9-BAG3(vg= rAAV 벡터 게놈)의 3개 용량(1e14vg(n=6), 2.5e14vg(n=6), 2.5e14vg(n=6)) 중 하나를 투여하였다. CS의 폐색은 주사 전에 정맥조영술에 의해 확인되었다. AAV9-BAG3 벡터를 소공에서 동시 풍선 폐색에 의해 20 mL의 비히클에서 20분에 걸쳐 주입하였다. AAV9-BAG3 벡터의 투여 후, 폐색을 5분 동안 유지하여 벡터가 관상 정맥동에 남아 있도록 하였다.

[0151] 투여 3개월 후, 도 5에 도시된 바와 같이 장축 및 우심실 자유벽을 따라 6개 지점에 있는 좌심실 조직의 3개의 단축 원주 세그먼트로부터 18개의 조직 세그먼트를 수득하였다. AAV 벡터 게놈(vg)의 존재는 정량적 중합효소 연쇄 반응 및 트랜스진 플라스미드의 알려진 복사체 수의 표준 곡선에 의해 평가되었다. 벡터 메신저 RNA는 벡터 상보적 DNA를 표적화하는 정량적 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 평가되었고, 하우스키핑 18S 유전자에 대한 상대적인 양으로 표현되었다. BAG3 발현을 면역조직화학을 사용하여 평가하였다.

[0152] 결과: 이 후속 용량 독성 연구에서 RCSI를 사용하여 심근을 AAV9-BAG3으로 안전하고 효율적으로 형질도입하였다. 벡터 DNA/이배체 게놈의 광범위한 용량-의존적 분포가 전방 좌심실, 전방 가쪽 좌심실, 하부 가쪽 좌심실, 하부 가쪽 심실, 중격 및 우심실을 포함하는 심근 전체에서 다시 관찰되었다(도 6-8).

[0153] 핵당 BAG3 벡터 복사체(VCN)는 투여된 용량과 상관관계가 있었다. 특히, 1e14vg, 2.5e14 및 5e14vg 용량에 대해 각각 핵당 대략 1, 3 및 6개의 벡터 복사체가 존재하였다(도 6).

[0154] 역행성 관상 정맥동 주입(RCSI)에 의해 투여되는 이러한 예시적인 용량 각각은 BAG3을 제공한다. AAV 벡터 용량은, 예를 들어, 좌심실 질량 및/또는 표면적에 기초하여 인간에게 외삽될 수 있다.

[0155] 3개월을 초과하는 BAG3 발현의 추가적인 지속력(지속성)은 주입 후 6개월(n=4) 및 9개월(n=4)에 평가될 것이다.

실시예 4

[0156] 핵당 벡터 복사체(VCN) 계산 방법:

1) 표준 곡선 및 변환

a. XhoI 및 PacI 제한 효소로 분해된 트랜스진 플라스미드, 예상되는 밴드 정제 및 OD'd

b. hBag3 플라스미드 DNA의 ng/μL(또는 μg/mL) 농도는 하기 식에 따라 복사체 수/μL로 전환될 것이다:

복사체 (또는 분자)의 DNA / μL

= (DNA ng/μL x 10^-9 g/ng x 6.022 x 10²³ 분자/몰)

/ (6048 bp x 650 g/bp/몰)

i. 이러한 계산은 6048개 염기쌍에서 hBag3 플라스미드 DNA의 길이 및 염기쌍의 평균 분자량(bp)이 650 달톤, 아보가드로 수, 6.022 x 10²³ 분자/몰이라는 가정에 기반한다.

c. 반응 당 하기 복사체를 갖는 표준 곡선(하기 나타낸 예시적인 곡선)이 실행될 것이다: 10⁷, 10⁶, 10⁵, 10⁴, 10³, 10², 50, 25, 10, 및 0. 표준 곡선 방정식을 사용하여 1000ng 반응 당 복사체를 결정할 것이다(이 숫자는 하기 방정식에서 N 임)

2) 복사체 수/1μg의 DNA에서 복사체 수/이배체 게놈으로의 전환

a. Yucatan 미니피그의 이배체 게놈의 크기는 핵당 약 5.33pg DNA이다.

b. 1000ng/약 5.33pg = 약 187,600개 핵(또는 단일 핵을 갖는 경우, 세포)

c. 표준 곡선에서 AAV와 같은 ssDNA로 작업할 때 DNA 표준의 모든 복사체에 대해 2개의 벡터 게놈이 존재한다

d. # 복사체 ( N )/1ug DNA의 전환에 대한 방정식 및 핵당 vg로의 전환:

i. [2vg/복사체] x [ N 복사체/ug DNA] x [1 ug DNA/187,600개 핵] = vg/핵

3) 예:

a. CRO의 예 - 실제 데이터를 사용하지 않음

i. 2,000,000개 복사체/1 ug DNA * 1ug DNA/약 187,600개 세포 * 2vg/복사체 = 약 21.3 vg/세포 (이배체 게놈, 단일 핵)

Claims

좌측 주관상동맥을 폐색시키지 않거나 전행성 흐름을 폐색시키지 않으면서, 역행성 관상 정맥 또는 정맥동 전달을 통해 대상체에게 치료제를 투여함으로써, 치료제를 심장에 전달하는 것을 포함하는, 심장에 치료제를 전달하는 방법.
좌측 주관상동맥을 폐색시키거나 전행성 흐름을 폐색시키면서, 역행성 관상 정맥 또는 정맥동 전달을 통해 대상체에게 치료제를 투여함으로써, 치료제를 심장에 전달하는 것을 포함하는, 심장에 치료제를 전달하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 치료제가 핵산 또는 단백질을 포함하는 방법.
제3항에 있어서, 핵산이 단백질을 인코딩하는 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 단백질이 BCL2-관련 아타노겐 3(BAG3)을 포함하는 방법.
제3항에 있어서, 핵산이 발현 벡터를 포함하는 방법.
제6항에 있어서, 발현 벡터가 바이러스 벡터, 진핵생물 또는 효모 벡터를 포함하는 방법.
제7항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터를 포함하는 방법.
제8항에 있어서, AAV 벡터가 AAV 혈청형: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 또는 AAV12 중 어느 하나로부터의 캡시드 또는 역 말단 반복부를 포함하는 방법.
제6항에 있어서, 발현 벡터가 심장에서 기능성인 프로모터를 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 프로모터가 심장 특이적인 방법.
제6항에 있어서, 발현 벡터가 심장에서 기능성인 프로모터 및 BAG3 폴리뉴클레오티드 또는 cDNA 서열을 포함하는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 또는 인간이 심부전을 앓고 있는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 또는 인간이 박출률이 감소된 심부전 또는 박출률이 보존된 심부전을 앓고 있는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 또는 인간이 가족성 확장성 심근병증을 앓고 있는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 또는 인간이 비-가족성 확장성 심근병증을 앓고 있는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 또는 인간이 허혈성 심장 질환 또는 심근병증을 앓고 있는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 또는 인간이 비허혈성 심장 질환 또는 심근병증을 앓고 있는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 또는 인간이 허혈/재관류 손상의 위험이 있는 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 또는 인간이 허혈/재관류 손상이 있을 수 있는 혈관 중재적 또는 의학적 절차가 예정되어 있거나 이에 대한 후보인 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 관상 정맥동의 근위 및 대심정맥의 원위에 위치된 카테터에 의해 심장에 전달되는 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 관상 정맥동 및 대심정맥의 기원의 원위 또는 대심정맥에 위치하거나 이를 폐색시키는 카테터에 의해 심장에 전달되는 방법.
제23항에 있어서, 혈관 중재적 또는 의학적 절차가 카테터, 스텐트, 혈관성형술, 우회 수술 또는 관상 동맥 우회술을 사용하는 절차를 포함하는 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 또는 인간이 말초 혈관 질환 수술이 예정되어 있거나 이에 대한 후보인 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 또는 인간이 내인성 BAG3 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 돌연변이를 갖는 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 또는 인간이 내인성 BAG3 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 감소된 발현 또는 활성을 갖는 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 대심정맥을 통해 대상체 또는 인간에게 투여되는 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 근위이지만 대심정맥의 원위에 위치된 카테터를 통해 투여되는 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 대심정맥, 좌홀정맥 또는 관상 정맥동에서 공급되는 임의의 정맥으로 전달되는 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 최대 약 20분의 시간 동안 주입을 통해 투여되는 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 분당 약 1 ml 내지 분당 5 ml의 속도로 투여되는 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 분당 약 1 ml의 속도로 투여되는 방법.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 약 10 ml 내지 약 100 mL의 부피로 투여되는 방법.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 약 20 ml 내지 약 75 mL의 부피로 투여되는 방법.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 약 30 ml 내지 약 60 mL의 부피로 투여되는 방법.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 약 40 ml 내지 약 50 mL의 부피로 투여되는 방법.
제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 전방 좌심실, 전방 가쪽 좌심실, 하부 좌심실, 하부 가쪽 심실, 중격 또는 우심실 중 하나 이상에 전달되고/거나 발현되는 방법.
제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 심장 전체에 걸쳐 발현되는 방법.
제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 심장 질환의 하나 이상의 증상을 감소시키는 방법.
제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 심부전의 하나 이상의 증상을 감소시키는 방법.
제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 심장 기능 또는 심장 수축성을 개선시키는 방법.
제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 좌심실 박출률을 증가시키는 방법.
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 핵산 또는 단백질을 포함하는 방법.
제43항에 있어서, 핵산이 발현 벡터를 포함하는 방법.
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 바이러스 벡터를 포함하는 방법.
제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제 또는 단백질이 BCL2-관련 아타노겐 3(BAG3)을 포함하거나, 핵산 또는 발현 벡터가 BAG3을 인코딩하거나, 바이러스 벡터가 BAG3을 인코딩하는 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 방법.
제46항 또는 제47항에 있어서, 바이러스 벡터가 진핵생물 또는 효모 벡터인 방법.
제46항 또는 제47항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터를 포함하는 방법.
제49항에 있어서, AAV 벡터가 AAV 혈청형: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV49, AAV9, AAV10, AAV11 또는 AAV12 중 어느 하나로부터의 캡시드 또는 역 말단 반복부를 포함하는 방법.
제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 약 1x10¹¹ vg/kg 내지 약 1.0x10¹⁴ vg/kg의 용량으로 투여되는 방법.
제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 약 1.0x10¹² vg/kg 내지 약 0.5x10¹⁴ vg/kg의 용량으로 투여되는 방법.
제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 약 3.0x10¹² vg/kg 내지 약 1.0x10¹³ vg/kg의 용량으로 투여되는 방법.
제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 약 3.0x10¹² vg/kg 내지 약 9.0x10¹² vg/kg의 용량으로 투여되는 방법.
제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 약 3.0x10¹² vg/kg 내지 약 8.0x10¹² vg/kg의 용량으로 투여되는 방법.
제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 약 3.0x10¹² vg/kg 내지 약 5.0x10¹² vg/kg의 용량으로 투여되는 방법.
제2항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 폐색이 약 30초 내지 약 20분의 기간 동안 유지되는 방법.
제2항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 폐색이 약 1분 내지 약 15분의 기간 동안 유지되는 방법.
제2항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 폐색이 약 2분 내지 약 12분의 기간 동안 유지되는 방법.
제2항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 폐색이 약 3분 내지 약 10분의 기간 동안 유지되는 방법.
제2항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 폐색이 약 4분 내지 약 6분의 기간 동안 유지되는 방법.
제2항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 폐색이 약 5분의 기간 동안 유지되는 방법.
제2항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 폐색이 소공에 있거나 소공 근처에 있는 방법.