KR20030070702A - 전기적 자극을 이용한 ｄｎａ 전달방법 및 이를 이용한 에리스로포이에틴 발현 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전기적 자극을 이용한 DNA 전달방법 및 이를 이용한 에리스로포이에틴 발현방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 50 내지 150 mM의 염을 함유하는 전달 조성물 및 DNA를 포함하는 혼합물을 세포에 투여하고, 세포에 전기적 자극을 가하는 것을 포함하는 세포내 DNA 전달방법, 유전자 치료용 조성물 및 pJDK-mEPO 벡터를 제공한다. 본 발명의 DNA 전달방법은 외래유전자의 생체내, 외 발현효율을 증가시켜 각종 질병에 대한 유전자 치료 효율을 향상시킨다.

Description

전기적 자극을 이용한 ＤＮＡ 전달방법 및 이를 이용한 에리스로포이에틴 발현방법 {METHOD OF ELECTROPORATION-MEDIATED DNA DELIVERY AND ITS APPLICATION TO THE EXPRESSION OF ERYTHROPOIETIN}

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 전기적 자극을 이용한 DNA 전달방법 및 이를 이용한 에리스로포이에틴 발현방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 50 mM 내지 150 mM의 염을 포함하는 전달 조성물 및 노출 DNA를 주입하고 전기 자극을 세포에 인가하여 외래 유전자 발현효율을 증가시키는 방법 및 이를 이용하여 에리스로포이에틴 단백질을 세포내에서 발현시키는 방법에 관한 것이다.

[종래기술]

1990년부터 선천성 유전질환치료를 위해 본격적으로 시작된 유전자 요법(gene therapy)은 모든 질환의 치료에까지 그 적용이 확대되었다.

현재 유전자치료 기술이 대중화/산업화되고 있지 못한 가장 큰 이유는 기존에 사용되고 있는 벡터들이 안전하고 효율적으로 유전자를 전달할 수 없었기 때문이다. 특히 재조합 단백질의 발현효율이 질병 치료효과를 나타낼 수 있을 만큼 충분하지 못하고, 유전자 발현이 단기간에 그쳐 발현 안정성이 확립되지 않았기 때문이다.

유전자요법의 핵심은 실제 치료효과를 나타내는 치료유전자, 유전자를 인체에 전달해주는 매개체(벡터), 그리고 생체내 유전자전달 기술에 있으며, 이러한 유전자 요법의 평가는 생체내에서 유전자의 전달효율, 유전자 전달 방법의 안전성, 및 유전자 전달후에 달성할 수 있는 치료효과를 중심으로 이루어진다.

지금까지 DNA를 세포 내로 전달하는 방법으로는 화학적인 방법, 물리적인 방법 및 레트르바이러스, 아데노바이러스, 아데노-부속바이러스 등의 바이러스를 이용한 생물학적인 방법들이 있다.

전기적 자극(electroporation)은 생체외 실험에서 세포내 노출 DNA의 전달을위하여 리포솜, CaPO4 등과 더불어 널리 사용되고 있는 방법이다. 1999년 미르 등은 골격근에 노출 DNA를 주입한 다음 전기적 자극을 가하여 유전자 발현이 100-1000배 증가됨을 보고하였다(Mir LM et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:4262-4267). 이러한 높은 유전자 발현은 최대 관찰 기간인 6개월까지 지속되었고, 원숭이를 이용한 실험에서도 입증되었다. 전기적 자극에 의한 유전자 발현의 증가 기전은 현재 잘 알려져 있지 않으나. 전기적 자극에 의한 세포막의 손상에 의하여 인공적인 구멍이 생성되고(electropermeabilization) 이후 음전하를 띄는 DNA가 양극으로 이동하는 전기영동(electrophoresis) 과정을 거쳐 세포 내로 유입되는 것으로 추정된다. 기존의 노출 DNA을 생체내로 투여하면 노출 DNA가 세포내로 유입되기 위하여는 엔도사이토시스를 거치고 이러한 과정에서 효소에 의하여 DNA가 분해될 수 있다. 또한 내부로 유입되기까지 오랜 시간이 소요되어 세포외 기질의 비특이적 DNAase 에 의하여 분해됨으로서 유전자 전달의 효율이 매우 낮은 것으로 알려져 있다.

전기적 자극방법에서 노출 DNA의 생체내 전달 및 발현효율에 영향을 미치는 여러 가지 변수가 알려져 있으며, 이러한 예로는 노출 DNA의 양, 전기 자극의 세기(volt), 전기 자극 기간(duration), 주파수(frequency) 및 횟수 등이 있다. 그러나 전기적 자극시 투여되는 노출 DNA를 포함하는 용매에 대한 연구는 미비한 실정이다.

한편, 실제 임상시험에 사용되고 있는 벡터는 생물학적 벡터(바이러스), 물리화학적 벡터(liposome, naked DNA 등) 2가지로 나눌 수 있다.

2000년도 전세계 유전자요법 임상시험 데이터에서는 70 %의 임상시험이 바이러스를 이용하는 것으로 집계되었고, 그중 54 %가 레트로바이러스였다. 그러나, 바이러스 벡터는 야생형 바이러스에 의한 감염의 위험성, 숙주 염색체상의 간헐적 삽입으로 인한 유전자 변이, 바이러스 단백질에 대한 체내의 면역반응 발생 등의 문제점을 가지고 있다.

노출(naked) 벡터는 벡터 자체를 의미하는 것으로 유전자요법에서 노출 벡터를 주입하는 방법으로 실시되고 있다. 노출 벡터를 이용한 유전자요법은 치료유전자를 쉽게 노출 벡터에 재조합시킬 수 있고, 대량의 벡터 DNA를 다량 확보할 수 있으며, 준비 및 시술 시간이 적게 소요될 뿐만 아니라 자체의 독성이 거의 없다는 장점을 가진다.

그러나, 현재 사용되는 노출 벡터는 생체내 유전자 전달 효율이 매우 낮아 (1 % 이내) 치료유전자의 치료 효과를 기대하기가 어렵고, 재조합 단백질의 발현 효율 역시 매우 낮다. 일반적으로 사용되는 노출 벡터는 암피실린 저항 유전자를 포함하고 있어, 노출 벡터의 선별 및 대량증식시 배지내 암피실린을 첨가하고 있다. 이러한 암피실린이 노출 벡터와 함께 생체내로 도입될 경우, 페니실린에 대하여 알레르기가 있는 환자에게 독성인자로 작용할 수 있다. 또한 일반적인 노출 벡터는 바이러스 전달 벡터로 사용되지 못하여 그 활용이 제한되어 있다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 외래유전자의 발현효율을 증가시킬 수 있는 노출 유전자의 생체내 전달방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 외래 유전자의 발현효율을 증가시킬 수 있는 전기적 자극 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 효율적인 외래 유전자 발현을 위한 노출 벡터 전달 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 에리스로포이에틴을 포함하는 노출 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 에리스로포이에틴을 생체내에서 효율적으로 발현시킬 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 pCN-루시퍼라제 벡터를 마우스에 주입하고, 전기 자극 실시유무 및 전달 조성물의 염농도에 따른 루시퍼라제 발현효율을 측정한 그래프이고,

도 2는 다양한 전달 조성물을 사용하여 pCN-LacZ를 근육에 전달한 다음 베타-갈락토시데이즈의 발현을 확인한 현미경사진이고,

도 3은 pJDK-mEPO 벡터의 구조도이고,

도 4는 본 발명의 pJDK-mEPO를 골격근 세포에 도입하여 EPO의 생성량을 측정한 그래프이고,

도 5는 pJDK-mEPO의 골격근내 주입후 시간에 따른 혈액내 적혈구 용적율을 나타낸 그래프로, ○는 대조군이고, ●는 pJDK-mEPO를 주입한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 50 내지 150 mM의 염을 함유하는 전달 조성물 및 DNA를 포함하는 혼합물을 세포 또는 조직에 투여하고, 세포 또는 조직에 전기적 자극을 가하는 것을 포함하는 세포내 DNA 전달방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 50 mM 내지 150 mM의 염을 포함하는 용액 및 (b) 외래 유전자 및 동물세포발현벡터를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 유전자 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) CMV 프로모터, (b) 아데노-부속 바이러스(adeno-associated virus)의 ITR(inverted terminal repeat);, (c) 에리스로포이에틴 유전자(GenBank, Accession No, M12482), (d) BGH(Bovine Growth Hormone) 폴리아데닐레이션 신호 및 (e) 카나마이신 저항 유전자를 포함하는 pJDK-mEPO 벡터를 제공한다.

본 발명은 상기의 pJDK-mEPO 벡터를 이용하여 생산된 재조합 아데노-부속 바이러스를 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 유전자 요법에 유용한 전기적 자극 방법 및 이를 이용한 외래 유전자, 바람직하게는 에리스로포이에틴 유전자의 전달방법에 관한 것이다.

본 발명에서 언급하는 전기적 자극(electroporation)은 조직 또는 세포에 일정한 전하를 인가하여 조직 또는 세포내로 DNA를 전달하는 것을 의미한다. 상기 DNA는 바람직하게는 노출 동물세포발현 벡터이다.

본 발명에서는 외래 유전자의 발현효율을 높일 수 있는 전기적 자극 조건을 실험하였다. 또한 전기적 자극이 DNA를 세포 내로 이동시키는데 중요한 기전이라면 DNA의 전하에 의하여 전기적 자극 효율에 차이가 있을 것으로 추정하였다. 이에 전달 조성물의 전하에 의한 외래 유전자의 발현효율을 확인하였다. 상기 전달 조성물은 외래 유전자 또는 벡터 DNA를 포함하는 조성물로, 전기적 자극시 DNA의 전달을 용이하게 하는 물질이다.

본 발명의 바람직한 전기적 자극방법은 노출 DNA는 10 ㎍ 내지 100 ㎍을 사용 100 내지 150 V/cm, 4 내지 12 회, 20 내지 80 msec간 실시하는 것이며, 전달 조성물은 50 내지 150 mM의 염을 포함하는 것이다. 노출 DNA의 투여량은 상기에 한정되지 않으며, DNA의 종류, 크기, 개체에 따라 달리 적용하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 노출 DNA를 60 내지 80 mM의 염을 포함하는 전달 조성물에 혼합하여세포 또는 생체내에 주입한 다음 125 V/cm, 8회, 50 msec간 전기적 자극을 인가하는 것이다. 전달 조성물의 염농도가 50 mM 미만인 경우 전기적 자극이 세포의 손상을 유발할 수 있으며, 염농도가 150 mM 초과하는 경우 고농도의 염이 세포에 손상을 주어 노출 DNA의 발현효율이 낮아질 수 있다. 또한 전기적 자극 세기가 100 V/cm 미만인 경우 노출 DNA의 전달효율이 낮아질 수 있으며, 150 V/cm를 초과할 경우 세포가 손상될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 노출 DNA 투여 세포는 통상의 세포 또는 조직이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 횡문근(striated muscle)세포이고, 가장 바람직하게는 골격근이다. 상기 골격근은 다수의 혈관이 잘 분포되어 있어 노출 DNA의 전달이 용이할 뿐만 아니라 골격근은 단백질을 생산, 분비하는 능력이 있어 외부에서 유전자를 주입할 경우 내분비기관으로 작용할 수 있다.

본 발명의 노출 DNA는 pJDK(KCCM 10343) 벡터 및 외래 유전자를 포함하는 벡터로, 상기 외래 유전자는 통상의 유전자를 사용할 수 있으며, 바람직한 유전자는 각종 호르몬, 사이토카인, 효소, 성장인자 등이 있다.

본 발명에서 다양한 염농도의 전달 조성물에 루시퍼라제 유전자를 포함하는 노출 DNA를 전기적 자극 방법으로 생체내로 전달하여 루시퍼라제 단백질의 발현효율을 확인하였다(도 1). 그 결과 전기적 자극방법에 따른 노출 DNA의 생체내 전달이 단순 투여법에 따른 방법에 비하여 월등히 높은 외래 유전자 발현율을 나타내었을 뿐만 아니라 염농도에 따라서도 다양한 발현율을 나타내었다. 특히 염농도 50 내지 150 mM에서 최적의 발현효율을 나타내었으며, 세포 손상도 극히 미약하였다.

또한 리포터 유전자로 LacZ 유전자를 이용한 실험에서 역시 염농도 50 내지 150 mM의 살린용액에서 최적의 발현효율을 나타내었을 뿐만 아니라 세포손상도 미비하였다(도 2).

본 발명에서는 상기에 언급한 전기적 자극 방법을 이용하여 에리스로포이에틴(erythropoietin; 이하 "EPO" 라 함) 유전자를 생체내 또는 생체외에서 발현시킬 수 있는 방법을 개발하기 위하여 EPO을 포함하는 벡터를 제조하였다.

만성신부전시 동반되는 빈혈의 중요한 원인은 신장으로부터의 EPO 생산 감소이다. EPO는 신장 간세포(renal interstitial cell)에서 생산되는 165개의 아미노산으로 구성된 30.4 kD의 당단백질이며, 특이적인 수용체를 통해 골수에 있는 혈구모세포에 대해 필수적인 성장인자로 작용한다. 현재, 재조합 사람 EPO(rhEPO)은 만성 신부전환자의 빈혈 치료를 위하여 널리 사용되고 있다.

본 발명의 EPO 유전자를 포함하는 벡터는 pJDK-mEPO이다. 상기 pJDK-mEPO는 3.97 kb로, CMV 프로모터, 아데노-부속 바이러스(adeno-associated virus; 이하 'AAV'라 함)의 ITR(inverted terminal repeat), EPO 유전자, BGH(Bovine Growth Hormome) 폴리아데닐레이션 신호, 카나마이신 저항 유전자를 포함한다(도 3). 상기 카나마이신 저항 유전자는 pJDK 벡터의 대량생산 및 pJDK 벡터를 이용한 형질전환주 및 재조합 벡터 제조나 선별에 선별인자로 사용되며, 생체에서 안전하여 pJDK 벡터에 카나마이신이 오염되어 있더라도 생체에 유독하게 작용하지 않는다. 미국 식품의약품안전청 및 한국 식품의약품안전청의 유전자 치료 지침에 카나마이신의 안전성이 명시되어 있다.

본 발명의 EPO 생체내 또는 생체외 전달방법은 pJDK-mEPO를 50 내지 150 mM의 염화나트륨 수용액에 혼합하는 단계, 상기 혼합액을 주입하는 단계 및 주입 후 전기적 자극을 실시하는 단계를 포함한다.

상기 혼합액 주입법은 통상적인 주사방법으로 실시하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 생체내, 외에 주입하는 것이고, 가장 바람직하게는 근육주사하는 것이다.

상기 전기적 자극은 100 내지 150 V/cm, 4 내지 12회, 20 내지 80 msec간 실시하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 125 V/cm, 8회, 50 msec를 가하는 것이다.

또한 본 발명은 유전자 치료용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 노출 DNA 및 전달 조성물을 포함하며, 전달 조성물은 50 내지 150 mM의 염을 포함하는 용액이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 60 내지 80 mM의 살린용액이다. 상기 노출 DNA는 외래 유전자 및 동물세포발현벡터를 포함하는 재조합 벡터가 바람직하다. 동물세포발현벡터는 통상의 진핵세포발현벡터가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 pJDK(KCCM 10343)이다. 외래 유전자를 통상의 유전자, 특히 호르몬, 효소, 성장인자, 사이토카인 등이며, 가장 바람직하게는 EPO이다.

본 발명의 유전자 치료용 조성물은 1종 이상의 허용가능한 약리학적 조성물을 더욱 포함할 수 있다. 약리학적 조성물은 부형제 또는 희석제로, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 것이다. 하지만 상기 부형제 또는 희석제 이에 국한되지 않는다. 당해 기술분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 기재되어 있다.

또한 본 발명의 pJDK-mEPO는 EPO를 생산하는 재조합 아데노-부속 바이러스를 제조할 수 있다. 보다 상세하게는 렙-캡(Rep-Cap) 발현벡터, 아데노바이러스 유전자 발현벡터와 함께 293 세포주에 동시에 트랜스펙션하여 ITR을 이용한 재조합 아데노-부속 바이러스를 제조할 수 있다. 렙-캡 발현 벡터는 아데노-부속 바이러스의 증식과 표면단백질 제조에 필요한 유전자를 제공한다. 293 세포주는 상기 유전자들을 발현시켜 아데노-부속 바이러스가 패키징되어 생산되도록 하는 숙주세포이다.

본 발명의 pJDK-mEPO은 전기적 자극을 통하여 최적의 EPO 단백질 발현효율을 나타내어 EPO 이상에 의한 각종 질병, 예를들어 빈혈, 혈액질환 등의 예방 및 치료에 이용될 수 있다. 또한 아데노-부속 바이러스로 제조하여 동일한 목적으로 이용할 수 있다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 외래단백질의 발현효율 측정

(1) 루시퍼레이즈 분석

동물실험은 미국 국립보건연구원 제정 "실험동물의 치료 및 사용에 대한 지침서(Guide for the care and use of laboratory animals, NIH publication No. 85-2, revised 1996)"와 삼성서울병원 임상의학연구소 동물실험 규칙에 따라 실시하였다.

5주령의 암컷 BALB/c-AnNCrj 마우스를 사용하였다. 50 ㎍ pCN-루시퍼라제 DNA를 30 ㎕ 증류수, 살린 용액(150 mM 염화나트륨) 및 소듐 포스페이트(150 mM)에 각각 희석하여 희석액을 제조하였다. 마우스를 케타민과 자일라진으로 복강 마취하고, 상기 희석액 30 ㎕ 을 30 게이지 인슐린 주사기(Beckton Dickinson 회사제)를 이용하여 앞정강근에 주사하였다. 주사바늘에 P10 튜브를 끼워 주사바늘이 3 mm 이상 들어가지 않도록 하였다. 상기 방법으로 유전자를 주입한 다음 일부는 주입 30초 지나 전기영동기(ECM 830, BTX Division of Genetronics 회사제)로 전기자극(125 V/cm, 4 pulses x 2 times, 50 ms, 1 Hz)을 가하였다. 전극봉(Tweezertrodes, BTX Division of Genetronics 회사제)는 핀셋모양의 전극봉으로, 노출 DNA 주입 부위의 양 측면 피부에 전기 자극을 가하였다. 7일 후 마우스를 희생하여 정강근을 채취 후 루시퍼라제 발현을 정량하였다.

또한 50 ㎍의 pCN-루시퍼라제 DNA를 다양한 농도의 살린 용액에 희석한 다음 마우스 앞정강근에 주입하고, 전기자극을 가하였다. 희석액은 ICP-AES(Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometer)를 이용하여 염농도를 확인하였다.

루시퍼레이즈는 루시퍼레이즈 분석용 키트(Promega, Madison, WI)를 이용하여 정량하였다. 채취한 근육을 리포터 용해 반응액(reporter lysis reagent)에 넣고 균등화한 다음 4 ℃, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 부유액을 수득하였다. 10 ㎕의 부유액에 루시퍼레이즈 분석용 기질 100 ㎕를 첨가한 다음 TD-20/20루미노미터(Turner Designs, Sunnyvale, CA)에서 30초간 발광반응을 측정하였다.

도 1은 pCN-루시퍼라제 벡터를 마우스에 주입하고, 전기 자극 실시유무 및 전달 조성물의 염농도에 따른 루시퍼라제 발현효율을 측정한 그래프이다. 도 1에서 DW, NS, NaP는 pCN-루시퍼라제 벡터의 전달 조성물로, 각각 증류수, 살린용액 및 소듐포스페이트를 나타낸다. 도 1a는 전기자극을 실시하지 않고 pCN-루시퍼라제를 주입하였을 때 루시퍼라제 발현효율을 나타낸 것이고, b는 주입 30초 후 전기 자극을 가하였을 때 루시퍼라제 발현효율을 나타낸 것이고, C는 다양한 농도의 살린용액을 이용하여 pCN-루시퍼라제 벡터를 주입한 다음 전기 자극 후 루시퍼라제 발현효율을 나타낸 것이다.

도 1에서 나타난 바와 같이 전기 자극을 가한 경우 루시퍼라제 발현 효율이 월등히 높게 나타났으며(도 1a < 도 1b), 전달 조성물의 종류에 따라 발현효율 역시 큰 차이를 나타내었다. 도 1b의 전기 자극을 가한 경우 증류수를 이용하였을때 가장 높은 발현효율을 나타내었으나 전기 자극을 가하지 않은 경우 증류수에서 발현효율이 가장 낮게 나타났고, 소듐 포스페이트에 의한 발현효율이 가장 높았다. 이에 전기충격시 염농도에 따른 발현효율을 측정한 결과 도 1c에 나타난 바와 같이 60 내지 80 mM(최적 71 mM)의 염농도에서 최고의 발현효율을 확인할 수 있었으며, 이는 증류수를 사용하였을 때 비하여 높은 수치이다.

(2) 전기영동에 따른 세포손상도 측정

증류수, 0.9% 살린용액(150 mM 염화나트륨), 0.45% 살린용액(약 75 mM의 염화나트륨)을 전달 조성물로 사용하여 골격근세포에 주입한 다음 30초 후 전기 자극을 가한 다음 골격근세포의 손상도를 조직 절편을 만들어 현미경 하에서 관찰하여 전체 골격근세포 중 손상을 받은 세포수를 측정하였다.

DNA 베시클	전기충격시 손상도 (%)	전기충격 미실시시 손상도(%)
증류수	32.4 ± 2.6	<3
0.45% 살린용액	6.9 ± 1.8	<3
0.9% 살린용액	4.7 ± 1.4	<3

표 1에서, 골격근 세포에 전기충격을 가하더라도 0.45% 내지 0.9%의 살린용액에서는 큰 손상을 입히지 않음을 확인하였다.

상기 실험들에서 확인한 결과, 전기적 자극을 가하지 않은 조건에서는 증류수, 살린용액, 소듐 포스페이트 용액을 사용할 경우 소듐 포스페이트를 전달 조성물로 사용할 때 유전자 발현이 가장 높음을 알 수 있었다. 이는 염, 특히 소듐 포스페이트의 인산기가 DNA를 분해하는 효소인 DNAase의 인산기 공격에 대하여 노출 DNA와 길항적으로 작용하기 때문으로 생각된다. 그러나 전기적 자극을 가한 조건에서는 상반된 현상을 관찰할 수 있었다. 즉 유전자 발현은 증류수에서 가장 높게 나타났다. 이는 증류수에서 노출 DNA의 음전하가 가장 잘 보존되기 때문으로 여겨진다. 노출 DNA를 다양한 농도의 염화나트륨 용액에 녹인 후 전기적 자극을 실시한 결과 약 71 mM의 염화나트륨에서 유전자 발현이 가장 높게 나타났다. 이와 같이 염 농도가 감소함에 따라 유전자 발현이 증가하다가 다시 감소하는 것은 저농도에서 골격근의 손상정도가 증가하고, 고 농도에서는 삼투압에 의한 손상이 증가하기 때문으로 생각된다.

(3) 베타-갈락토시데이즈 발현효율 측정

50 ㎍의 pCN-lacZ DNA를 다양한 전달 조성물(증류수, 50 mM 살린, 100 mM 살린, 150 mM 살린, 200 mM 살린)에 혼합하고 마우스의 앞정강근에 주입하였다. 그 중 일부는 전기충격을 가하였다. 7일 후 앞정강근을 적출하여 X-gal로 염색하였다.

적출한 앞정강근을 차가운 PBS로 세척하고, 틀(Tissue mold)에 넣은 다음 O.C.T 용액(Lipshow)을 틀안에 기포가 생기지 않도록 서서히 첨가하여 -70 ℃에서 냉동하였다. 조직을 10 ㎛ 두께로 자른 후 차가운 4 % 파라포름알데하이드(pH 7.4, Sigma)에 5분간 고정하였다. 2 mM MgCl₂/PBS(pH 7.4, Sigma)으로 세척하고, X-gal 용액(4 mM potassium ferricyanide, 4 mM potassium ferrocyanide, 2 mM MgCl₂, 400 ㎍/mL X-Gal)으로 실온에서 4시간 동안 반응시켜 lacZ 유전자가 발현되는 것을 확인한 후 에오신으로 대조염색하였다. 이후 80 % 알콜, 90 % 알콜, 100 % 알콜 탈수과정, 크실렌으로 청명과정을 거쳐 커버 글라스로 봉합한 다음 광학현미경(Olympus 회사제)으로 관찰한 후 사진을 촬영하였다. X-gal로 염색된 부분은 푸른색으로 확인되었다.

도 2는 다양한 전달 조성물을 사용하여 pCN-LacZ를 근육에 전달한 다음 베타-갈락토시데이즈의 발현을 확인한 현미경사진이다. A(x 25)와 B(x 200)는 전달 조성물로 증류수를 사용한 근육세포이고, C는 50 mM 살린, D는 100 mM 살린, E와 F는 150 mM 살린, G는 200 mM 살린에 대한 것이고, H는 150 mM 살린을 사용하고 전기 자극을 실시하지 않은 근육세포이다. 도 2에서 LacZ 유전자에서 발현된베타-갈락토시데이즈는 루시퍼레이즈 발현효율과 거의 유사한 양상으로 나타났다. 전달 조성물의 염농도가 50 mM 내지 150 mM에서 베타-갈락토시데이즈의 발현이 가장 높았으며, 골격근의 손상도 가장 적음을 관찰할 수 있었다.

또한 도 2B의 화살표시는 증류수 사용시 골격근의 손상된 부분으로 에오신 염색으로 넓은 부위의 세포손상을 확인할 수 있었지만, 50 내지 200 mM의 염농도를 사용한 경우 극히 일부의 세포손상을 확인할 수 있었다(화살표시 부분).

따라서, 전달체의 염 농도 50 mM 내지 150 mM에서 외래 유전자 발현이 가장 높았으며, 골격근의 손상 역시 가장 적음을 확인할 수 있었다.

실시예 2: pJDK-mEPO의 제조

pJDK(KCCM 10343, 서열번호 1)벡터의 EcoRV에 mEPO(GenBank, Accession No, M12482)를 삽입하여 3.97 kB의 pJDK-mEPO를 제조하였다(도 3).

실시예 2: pJDK-mEPO 벡터의 효율성 검증

C3H 마우스의 골격근아세포주인 C2C12에 pJDK-mEPO를 도입하여 EPO 생성여부를 확인하였다.

형질도입하기 하루 전에 2×10⁵/well의 C2C12 세포를 직경 4 cm의 세포배양판(Nunc, 152795)에 분주하고, 10% FBS(Gibco BRL, 16000-044), 100 U 페니실린, 100 ug의 스트렙토마이신(Gibco BRL, 15140-122)이 함유된 둘베코스 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM, Gibco BRL, 23700-057)로 37 ℃에서 배양하였다. 다음날, 15 ㎕의 FuGENE^TM6 (Roche, 1815075)를 85 ㎕의 FBS가 없는 DMEM과 잘 혼합한 뒤 서로 다른 양의의 pJDK-mEPO를 더해서 20분 동안 실온에서 정치시켰다. 이후 PBS로 세포를 2번 세척하고 3 ml 의 새 배지로 갈아주고, 미리 혼합한 DNA와 FuGENE^TM6를 세포배지 위에 방울방울 떨어뜨린 뒤 37 ℃에서 배양하였다. 48시간 뒤에 세포배양액을 모아 4 ℃, 10,000×g, 5분 동안 원심분리하였고, 상등액에 대해 엘리자 키트(R&D system, DEP00)를 이용하여 생성된 EPO를 정량하였다. 마이크로플레이트 리더(Thermomax, USA)로 450 nm의 파장에서 측정하고, 표준 mEPO에 의해 환산하였다.

도 4는 본 발명의 pJDK-mEPO를 골격근 세포에 도입하여 EPO의 생성량을 측정한 그래프이다. 형질도입한 pJDK-mEPO의 DNA 농도 증가함에 따라 mEPO의 생산이 증가됨을 관찰할 수 있었다. 따라서 pJDK-mEPO는 골격근세포주인 C2C12에서 면역반응성을 가지는 EPO를 생산, 배출함을 알 수 있었다.

실시예 3: pJDK-mEPO에서 발현된 EPO의 활성측정

pJDK-mEPO에서 발현된 EPO가 생리활성을 가지는 단백질인지 확인하였다. 또한 전기영동에 의하여 주입한 pJDK-mEPO에 의한 치료효과를 확인하였다. 실험은 pJDK-mEPO를 마우스 앞 정강근에 전기영동으로 주입한 후 혈중 적혈구 용적율(hematocrit; Hct)을 측정하였다.

7-10주령 Balb/C 마우스의 앞 정강근(tibialis anterior muscle), 장딴지근(gastrocnemius) 각각에 30 ㎕의 75 mM 살린용액에 들어있는 pJDK-mEPO 50 ug을 근육주사 후 전기 자극(125 V/cm, 50 ms, 4*2 pulse)을 주어 유전자를 전달하였다. 이후 1주 간격으로 마우스 레트로오비탈 시너스(retroorbital sinus)로부터 유리 파이펫을 이용하여 혈액을 채취, 원심분리한 다음 적혈구 용적율(hematocrit)을 측정하였다.

도 5는 pJDK-mEPO 주입후 시간에 따른 혈액내 적혈구 용적율을 나타낸 그래프로, ○는 대조군이고, ●는 pJDK-mEPO를 주입한 것이다. 도 5에서 1회의 pJDK-mEPO 주입 후 적혈구 용적율이 1주 후에 크게 상승하였고, 4주에 정체기(plateau)에 도달하여 큰 변화없이 19주까지 높은 수치를 유지하였다. 이는 pJDK-mEPO가 골격근에 전달된 다음 생리활성을 가지는 EPO가 생산되어 적혈구 생성이 증가되며, 이러한 현상이 5개월까지 오랜 기간 지속됨을 입증한다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 전기적 자극을 이용한 DNA 전달방법 및 이를 이용한 에리스로포이에틴 발현방법은 외래유전자의 생체내, 외 발현효율을 증가시켜 각종 질병에 대한 유전자 치료 효율을 향상시킨다.

Claims (14)

1. 50 내지 150 mM의 염을 함유하는 전달 조성물 및 DNA를 포함하는 혼합물을 조직에 투여하고, 조직에 전기적 자극을 가하는 것을 포함하는 세포내 DNA 전달방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 전달 조성물은 염화나트륨 수용액인 DNA 전달방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 전기적 자극은 100 내지 150 V/cm를 20 내지 80 msec로 4 내지 12회간 실시하는 DNA 전달방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 세포는 횡문근(striated muscle)세포인 DNA 전달방법.
5. 제 1항에 있어서, 상기 DNA는 동물세포발현벡터인 DNA 전달방법.
6. 제 5항에 있어서, 상기 동물세포발현벡터는 외래유전자를 더욱 포함하는 pJDK(KCCM 10343) 벡터인 DNA 전달방법
7. 제 6항에 있어서, 상기 외래유전자는 에리스로포이에틴 유전자인 DNA 전달방법.
8. (a) 50 mM 내지 150 mM의 염을 포함하는 용액; 및

   (b) 외래 유전자 및 동물세포발현벡터를 포함하는 재조합 벡터;

   를 포함하는 유전자 치료용 조성물.
9. 제 8항에 있어서, 상기 동물세포발현벡터는 pJDK(KCCM 10343)인 유전자 치료용 조성물.
10. 제 8항에 있어서, 상기 외래 유전자는 에리스로포이에틴 유전자인 유전자 치료용 조성물.
11. 제 8항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 pJDK-mEPO인 유전자 치료용 조성물.
12. (a) CMV 프로모터;

    (b) 아데노-부속 바이러스(adeno-associated virus)의 ITR(inverted terminal repeat);

    (c) 에리스로포이에틴 유전자;

    (d) BGH(Bovine Growth Hormone) 폴리아데닐레이션 신호; 및

    (e) 카나마이신 저항 유전자;

    를 포함하는 pJDK-mEPO 벡터.
13. 제 12항의 pJDK-mEPO 벡터를 이용하여 생산된 재조합 아데노-부속 바이러스.
14. 제 12항에 있어서, 상기 재조합 아데노-부속바이러스는

    (a) CMV 프로모터;

    (b) 아데노-부속 바이러스(adeno-associated virus)의 ITR(inverted terminal repeat);

    (c) 에리스로포이에틴 유전자; 및

    (c) BGH(Bovine Growth Hormome) 폴리아데닐레이션 신호

    을 포함하는 재조합 아데노-부속 바이러스.