JP2001281249A - 特異的ＩｇＥ抗体測定方法 - Google Patents
特異的ＩｇＥ抗体測定方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 共存する特異的IgG抗体の競合による妨害を
受けずにELISA用プレートを用いて血清中の特異的IgE抗
体を測定する方法を提供する。 【解決手段】 IgG 抗体を特異的に吸着するリガンドを
用いて、血清を予め処理して、特異的IgG抗体を特異的I
gE抗体との競合が起きない程度まで除去した後に、特異
的IgE 抗体を測定することよりなる血清中の特異的IgE
抗体測定方法において、血清とIgG 抗体を特異的に吸着
するリガンドとをpH6.0〜7.5 にて反応させた後、そのI
gG 抗体を特異的に吸着するリガンドのIgG 抗体結合部
位をIgG 抗体によって飽和させ、さらに、そのIgG 抗体
を特異的に吸着するリガンドを酸処理することからなる
ことを特徴とする方法。
受けずにELISA用プレートを用いて血清中の特異的IgE抗
体を測定する方法を提供する。 【解決手段】 IgG 抗体を特異的に吸着するリガンドを
用いて、血清を予め処理して、特異的IgG抗体を特異的I
gE抗体との競合が起きない程度まで除去した後に、特異
的IgE 抗体を測定することよりなる血清中の特異的IgE
抗体測定方法において、血清とIgG 抗体を特異的に吸着
するリガンドとをpH6.0〜7.5 にて反応させた後、そのI
gG 抗体を特異的に吸着するリガンドのIgG 抗体結合部
位をIgG 抗体によって飽和させ、さらに、そのIgG 抗体
を特異的に吸着するリガンドを酸処理することからなる
ことを特徴とする方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、特異的IgE 抗体の
測定方法に関するものである。より詳細には、本発明
は、通常のELISA 用プレートを用いて、それに固定化し
た任意の抗原に対する血清中の特異的IgE 抗体を、共存
する特異的IgG 抗体の競合およびIgG 抗IgE自己抗体に
よるIgG-IgE 複合体の存在による妨害を受けずに測定す
る方法に関するもので、アレルギー原因抗原のより詳細
な解析に有用である。
測定方法に関するものである。より詳細には、本発明
は、通常のELISA 用プレートを用いて、それに固定化し
た任意の抗原に対する血清中の特異的IgE 抗体を、共存
する特異的IgG 抗体の競合およびIgG 抗IgE自己抗体に
よるIgG-IgE 複合体の存在による妨害を受けずに測定す
る方法に関するもので、アレルギー原因抗原のより詳細
な解析に有用である。
【０００２】
【従来の技術】アレルギー反応において決定的な役割を
担う抗体であるIgE抗体が発見されて以来、その測定方
法に関する数多くの研究が報告されており、アレルギー
反応における特異的IgE抗体を測定することの臨床的な
重要性も広く認識されている。その特異的IgE 抗体の測
定には、臨床検査ではキャップラスト（CAP-RAST）シス
テムが広く用いられている。そのCAP-RASTシステムで測
定された値はそれぞれのアレルゲンに対するRASTユニッ
ト(Ua/ml) として事実上のスタンダードとなっている
が、CAP-RASTシステムではアレルゲンの測定のために専
用のアレルゲンキャップが必要である。そのため、アレ
ルゲンキャップとしてCAP-RASTシステム用に商業的に供
給されていない種類のアレルゲンに対する特異的IgE 抗
体を測定することは実際には困難である。したがって、
原因となるアレルゲンをより詳細に解析するためには任
意のアレルゲンを用いて簡便に特異的IgE 抗体を測定で
きる方法を開発することが必要である。
担う抗体であるIgE抗体が発見されて以来、その測定方
法に関する数多くの研究が報告されており、アレルギー
反応における特異的IgE抗体を測定することの臨床的な
重要性も広く認識されている。その特異的IgE 抗体の測
定には、臨床検査ではキャップラスト（CAP-RAST）シス
テムが広く用いられている。そのCAP-RASTシステムで測
定された値はそれぞれのアレルゲンに対するRASTユニッ
ト(Ua/ml) として事実上のスタンダードとなっている
が、CAP-RASTシステムではアレルゲンの測定のために専
用のアレルゲンキャップが必要である。そのため、アレ
ルゲンキャップとしてCAP-RASTシステム用に商業的に供
給されていない種類のアレルゲンに対する特異的IgE 抗
体を測定することは実際には困難である。したがって、
原因となるアレルゲンをより詳細に解析するためには任
意のアレルゲンを用いて簡便に特異的IgE 抗体を測定で
きる方法を開発することが必要である。
【０００３】任意のアレルゲンを用いて測定を行うため
には、通常の96ウェルマイクロプレートを用いたELISA
法を用いる必要がある。しかしながら、血清中の特異的
IgEの測定は通常の96ウェルマイクロプレートを用いたE
LISA では容易ではない。その理由として、血清中のIgE
抗体はIgG 抗体に比べて通常数万分の1 という極めて
低い濃度でしか存在せず、さらに、血清中には測定する
特異的IgE抗体と特異性が同じであるIgG 抗体が共存し
ていることにより、その特異的IgG抗体との競合という
問題が生じるためである。
には、通常の96ウェルマイクロプレートを用いたELISA
法を用いる必要がある。しかしながら、血清中の特異的
IgEの測定は通常の96ウェルマイクロプレートを用いたE
LISA では容易ではない。その理由として、血清中のIgE
抗体はIgG 抗体に比べて通常数万分の1 という極めて
低い濃度でしか存在せず、さらに、血清中には測定する
特異的IgE抗体と特異性が同じであるIgG 抗体が共存し
ていることにより、その特異的IgG抗体との競合という
問題が生じるためである。
【０００４】例えば、通常の96ウェルマイクロプレート
を用いたELISA によって、プレートに固定化されたアレ
ルゲンに対する血清中の特異的IgE 抗体を測定する場合
を考えてみる。96ウェルマイクロプレートではアレルゲ
ンの固定化密度、すなわち単位面積あたりの固定化アレ
ルゲンの量は高くない。また、低い濃度の特異的IgE抗
体を測定するためには血清の希釈率をあまり高くできな
い。そのため、共存する特異的IgG 抗体の濃度が相当高
い状態となり、IgG 抗体及びIgE 抗体を合わせた特異的
抗体量が固定化アレルゲンの量に対して過剰な状態とな
る。この状態では、固定化アレルゲンは優勢に存在する
特異的IgG抗体 によってほとんど占められてしまうた
め、特異的IgE 抗体は固定化アレルゲンと結合すること
が困難となる(Zeiss et al., J. Allergy Clini Immumo
l. 67, 105(1981))。しかも、特異的抗体量が固定化ア
レルゲンの量より少ない状態にするために血清を高倍率
に希釈すると、IgE 抗体の濃度が非常に低くなり検出が
困難となる場合が多い。
を用いたELISA によって、プレートに固定化されたアレ
ルゲンに対する血清中の特異的IgE 抗体を測定する場合
を考えてみる。96ウェルマイクロプレートではアレルゲ
ンの固定化密度、すなわち単位面積あたりの固定化アレ
ルゲンの量は高くない。また、低い濃度の特異的IgE抗
体を測定するためには血清の希釈率をあまり高くできな
い。そのため、共存する特異的IgG 抗体の濃度が相当高
い状態となり、IgG 抗体及びIgE 抗体を合わせた特異的
抗体量が固定化アレルゲンの量に対して過剰な状態とな
る。この状態では、固定化アレルゲンは優勢に存在する
特異的IgG抗体 によってほとんど占められてしまうた
め、特異的IgE 抗体は固定化アレルゲンと結合すること
が困難となる(Zeiss et al., J. Allergy Clini Immumo
l. 67, 105(1981))。しかも、特異的抗体量が固定化ア
レルゲンの量より少ない状態にするために血清を高倍率
に希釈すると、IgE 抗体の濃度が非常に低くなり検出が
困難となる場合が多い。
【０００５】このような特異的IgG 抗体との競合によっ
て生じる問題を回避し、血清中の特異的IgE 抗体を正確
に測定するために、従来、以下に示すような方法が考え
られている。
て生じる問題を回避し、血清中の特異的IgE 抗体を正確
に測定するために、従来、以下に示すような方法が考え
られている。
【０００６】一つは、固定化アレルゲンの結合量を多く
することによって、希釈率の低い血清を用いた場合でも
固定化アレルゲンの量が特異的抗体量より多くなる状態
で測定できる方法である。これは、アレルゲンを高密度
に結合させたスポンジ様物質であるセルロースポリマー
を用いる方法である(Ceska et al., J. Allergy Clini
Immumol. 49,1(1972))。この方法は、現在、アレルギー
の臨床検査の分野で広範に用いられているCAP-RASTシス
テムに応用されており、そのデータはRASTユニットとし
て一般に知られている（Bousquet et al., J. Allergy
Clin. Immunol., 85, 1039(1990)）。しかし、アレルゲ
ンが高密度に固定化されたスポンジ様物質であるアレル
ゲンキャップを作製することが容易でないため、CAP-RA
STシステム用に商業的に供給されていないアレルゲン、
例えば熱変性、酵素分解、化学修飾等を受けたアレルゲ
ンに関して詳細な検討を行うことは困難である。また、
CAP-RASTシステムで測定を行うためには通常のELISA と
は異なる専用の装置が必要である。
することによって、希釈率の低い血清を用いた場合でも
固定化アレルゲンの量が特異的抗体量より多くなる状態
で測定できる方法である。これは、アレルゲンを高密度
に結合させたスポンジ様物質であるセルロースポリマー
を用いる方法である(Ceska et al., J. Allergy Clini
Immumol. 49,1(1972))。この方法は、現在、アレルギー
の臨床検査の分野で広範に用いられているCAP-RASTシス
テムに応用されており、そのデータはRASTユニットとし
て一般に知られている（Bousquet et al., J. Allergy
Clin. Immunol., 85, 1039(1990)）。しかし、アレルゲ
ンが高密度に固定化されたスポンジ様物質であるアレル
ゲンキャップを作製することが容易でないため、CAP-RA
STシステム用に商業的に供給されていないアレルゲン、
例えば熱変性、酵素分解、化学修飾等を受けたアレルゲ
ンに関して詳細な検討を行うことは困難である。また、
CAP-RASTシステムで測定を行うためには通常のELISA と
は異なる専用の装置が必要である。
【０００７】また、キャプチャーELISA という方法が用
いられており、これは固定化抗IgE抗体で血清中のIgE
抗体を選択した後、標識されたアレルゲンを反応させる
ことによって特異的IgE 抗体を検出する方法である(Ple
bani et al., J Immunol Methods.90, 241(1986); Saka
guchi et al., J Immunological Methods, 116, 181(19
89); Olivieri et al., J Immunol Methods, 157, 65(1
993)) 。この方法では、まず、IgE クラスの抗体のみが
捕獲されるためIgG 抗体との競合は起きない。しかし、
IgE クラスの抗体の中にはアレルゲン特異的IgE 抗体と
特異的ではないその他のIgE 抗体、すなわち非特異的Ig
E 抗体が存在する。そのため、特異的IgE 抗体と特異的
IgG 抗体との競合は避けられるが、新たに特異的IgE 抗
体と非特異的IgE 抗体との競合という問題が発生し、特
異的IgE 抗体の検出が妨害される可能性がある。さら
に、この方法は、調べるアレルゲン毎に標識体を作製す
る必要があると同時に、標識を行うことによるアレルゲ
ンの修飾が問題となる可能性もある。
いられており、これは固定化抗IgE抗体で血清中のIgE
抗体を選択した後、標識されたアレルゲンを反応させる
ことによって特異的IgE 抗体を検出する方法である(Ple
bani et al., J Immunol Methods.90, 241(1986); Saka
guchi et al., J Immunological Methods, 116, 181(19
89); Olivieri et al., J Immunol Methods, 157, 65(1
993)) 。この方法では、まず、IgE クラスの抗体のみが
捕獲されるためIgG 抗体との競合は起きない。しかし、
IgE クラスの抗体の中にはアレルゲン特異的IgE 抗体と
特異的ではないその他のIgE 抗体、すなわち非特異的Ig
E 抗体が存在する。そのため、特異的IgE 抗体と特異的
IgG 抗体との競合は避けられるが、新たに特異的IgE 抗
体と非特異的IgE 抗体との競合という問題が発生し、特
異的IgE 抗体の検出が妨害される可能性がある。さら
に、この方法は、調べるアレルゲン毎に標識体を作製す
る必要があると同時に、標識を行うことによるアレルゲ
ンの修飾が問題となる可能性もある。
【０００８】さらに、IgG 抗体を硫安塩析で減少させた
後に特異的IgE 抗体を通常のELISAで測定する方法も報
告されている(Haba et al., J. Immunological Method
s, 85, 39(1985))。しかしながら、この方法では硫安塩
析を行うことができる条件が限られており、また、少量
の血清ではその処理は困難である。
後に特異的IgE 抗体を通常のELISAで測定する方法も報
告されている(Haba et al., J. Immunological Method
s, 85, 39(1985))。しかしながら、この方法では硫安塩
析を行うことができる条件が限られており、また、少量
の血清ではその処理は困難である。
【０００９】そして、分子活性の極めて高い酵素である
アセチルコリンエステラーゼで標識した抗IgE ２次抗体
を用いる方法も報告されている（Wal et al., Food & A
gricultural Immunology, 7, 175(1995); Grssi et a
l., J. Immunological Methods, 123, 193(1989)）。こ
の方法では、特異的抗体量が固定化アレルゲンの量より
少ない状態にするために希釈した血清を用いるが、IgE
抗体が分子活性の極めて高い酵素で標識されているの
で、固定化アレルゲンに結合した特異的IgE 抗体が極微
量となった場合でも検出できる方法である。しかしなが
ら、アセチルコリンエステラーゼは通常のELISA に一般
的に使用されている酵素ではなく、現在、その酵素で標
識されている抗IgE 抗体は容易に入手できない。交差反
応性の問題がなく現実的に使用可能な抗IgE 抗体は限ら
れており、新たにアセチルコリンエステラーゼ標識抗Ig
E 抗体を作製することは時間と手間が非常にかかる作業
となる。また、極微量の物質を検出することになるため
非特異的なシグナルによる影響をいかに抑制するかとい
うことも大きな問題となってくる。
アセチルコリンエステラーゼで標識した抗IgE ２次抗体
を用いる方法も報告されている（Wal et al., Food & A
gricultural Immunology, 7, 175(1995); Grssi et a
l., J. Immunological Methods, 123, 193(1989)）。こ
の方法では、特異的抗体量が固定化アレルゲンの量より
少ない状態にするために希釈した血清を用いるが、IgE
抗体が分子活性の極めて高い酵素で標識されているの
で、固定化アレルゲンに結合した特異的IgE 抗体が極微
量となった場合でも検出できる方法である。しかしなが
ら、アセチルコリンエステラーゼは通常のELISA に一般
的に使用されている酵素ではなく、現在、その酵素で標
識されている抗IgE 抗体は容易に入手できない。交差反
応性の問題がなく現実的に使用可能な抗IgE 抗体は限ら
れており、新たにアセチルコリンエステラーゼ標識抗Ig
E 抗体を作製することは時間と手間が非常にかかる作業
となる。また、極微量の物質を検出することになるため
非特異的なシグナルによる影響をいかに抑制するかとい
うことも大きな問題となってくる。
【００１０】このように従来いくつかの測定法が提案さ
れているが、任意のアレルゲンに対する特異的IgE 抗体
を通常のELISA プレートを用いて簡便に測定すること
は、いずれの方法でも困難であった。そこで、本発明者
らは、競合する血清中のIgG 抗体を、それに特異的なリ
ガンド、例えば固定化プロテインＧ等によって予め除去
することで特異的IgG と特異的IgE 抗体との競合を防ぐ
ことが可能であることを見出した。例えば、固定化プロ
テインＧは殆どの哺乳類のIgG に結合することができ、
結合力も高く、また、遠心分離等による除去も容易であ
るから、予め競合するIgG抗体を除去するために用いら
れる。この方法によって、通常のELISA プレートを用い
て任意のアレルゲンに対する特異的IgE 抗体を測定する
ことが可能となった (特願平11-069483号) 。
れているが、任意のアレルゲンに対する特異的IgE 抗体
を通常のELISA プレートを用いて簡便に測定すること
は、いずれの方法でも困難であった。そこで、本発明者
らは、競合する血清中のIgG 抗体を、それに特異的なリ
ガンド、例えば固定化プロテインＧ等によって予め除去
することで特異的IgG と特異的IgE 抗体との競合を防ぐ
ことが可能であることを見出した。例えば、固定化プロ
テインＧは殆どの哺乳類のIgG に結合することができ、
結合力も高く、また、遠心分離等による除去も容易であ
るから、予め競合するIgG抗体を除去するために用いら
れる。この方法によって、通常のELISA プレートを用い
て任意のアレルゲンに対する特異的IgE 抗体を測定する
ことが可能となった (特願平11-069483号) 。
【００１１】しかし、アレルギー患者血清の中には、時
として自己のIgE 抗体に対する自己のIgG 抗体、すなわ
ちIgG 抗IgE 自己抗体の存在するケースのあることが知
られており（富岡、アレルギー、38、305(1989))、それ
はIgE 産生やアレルギー反応の調節に関与する可能性が
示唆されている(Shakib, Immunology and Cell Biolog
y, 73, 109(1995))。また、その自己抗体は血液中でIgG
-IgE 複合体として存在し正確な特異的IgE の測定を妨
げていることが指摘されている(Jensen-Jarolim.J. All
ergy Clin Immunol, 89, 31(1992)) 。
として自己のIgE 抗体に対する自己のIgG 抗体、すなわ
ちIgG 抗IgE 自己抗体の存在するケースのあることが知
られており（富岡、アレルギー、38、305(1989))、それ
はIgE 産生やアレルギー反応の調節に関与する可能性が
示唆されている(Shakib, Immunology and Cell Biolog
y, 73, 109(1995))。また、その自己抗体は血液中でIgG
-IgE 複合体として存在し正確な特異的IgE の測定を妨
げていることが指摘されている(Jensen-Jarolim.J. All
ergy Clin Immunol, 89, 31(1992)) 。
【００１２】そのIgG 抗IgE 自己抗体と結合したIgE 、
すなわちIgG-IgE 複合体は、複合体を形成していない通
常のIgG 抗体と共に固定化プロテインＧ等のIgG 抗体に
特異的なリガンドによって除去されてしまう。そのた
め、IgG-IgE 複合体の存在量の高い血清では、IgG 抗体
除去処理を行った場合にIgE抗体の測定値に影響が出て
しまうことは避けられない。このようなことから、アレ
ルギー患者血清に対して、固定化プロテインＧ等のIgG
抗体に特異的なリガンドによる処理を行った場合でも、
さらに測定しようとする特異的IgE 抗体に影響を及ぼさ
ない測定法の開発が切望される。
すなわちIgG-IgE 複合体は、複合体を形成していない通
常のIgG 抗体と共に固定化プロテインＧ等のIgG 抗体に
特異的なリガンドによって除去されてしまう。そのた
め、IgG-IgE 複合体の存在量の高い血清では、IgG 抗体
除去処理を行った場合にIgE抗体の測定値に影響が出て
しまうことは避けられない。このようなことから、アレ
ルギー患者血清に対して、固定化プロテインＧ等のIgG
抗体に特異的なリガンドによる処理を行った場合でも、
さらに測定しようとする特異的IgE 抗体に影響を及ぼさ
ない測定法の開発が切望される。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、以上に述べ
たような問題を解決するためになされたものであって、
通常のELISA 用プレートを用いてプレートに固定化した
アレルゲンに対する血清中の特異的IgE 抗体を測定する
場合に、競合するIgG抗体のみでなく、IgG-IgE複合体の
影響も排除できるような、血清中の特異的IgE 抗体の測
定法を提供することを課題とする。
たような問題を解決するためになされたものであって、
通常のELISA 用プレートを用いてプレートに固定化した
アレルゲンに対する血清中の特異的IgE 抗体を測定する
場合に、競合するIgG抗体のみでなく、IgG-IgE複合体の
影響も排除できるような、血清中の特異的IgE 抗体の測
定法を提供することを課題とする。
【００１４】
【課題を解決するするための手段】本発明は、血清中の
特異的IgE 抗体を、予めIgG 抗体除去処理を行った血清
を用いて測定する方法に関する。具体的には、(1) IgG
抗体を特異的に吸着するリガンドを用いて、特異的IgE
抗体と特異性を同じくする特異的IgG 抗体を、特異的I
gE 抗体との競合が起きない程度まで予め除去した後
に、特異的IgE 抗体を測定することからなる血清中の特
異的IgE 抗体測定方法において、特異的IgG抗体を予め
除去する工程が、血清とIgG 抗体を特異的に吸着するリ
ガンドとをpH6.0〜7.5にて反応させた後、そのIgG 抗体
を特異的に吸着するリガンドのIgG 抗体結合部位をIgG
抗体によって飽和させ、さらに、そのIgG 抗体を特異的
に吸着するリガンドを酸処理することを特徴とする方
法、(2) IgG 抗体を特異的に吸着するリガンドのIgG 抗
体結合部位をIgG 抗体によって飽和させ、さらに、その
IgG 抗体を特異的に吸着するリガンドを酸処理する工程
の酸処理条件が、pH2.7〜3.3で2〜8分間である上記(1)
の特異的IgE 抗体の測定方法、(3) IgG 抗体を特異的
に吸着するリガンドが、プロテインＧである上記(1)又
は(2)記載の特異的IgE 抗体の測定方法、(4) IgG 抗体
を特異的に吸着するリガンドが、不溶化担体に固定化さ
れたリガンドである上記(1)〜(3)のいずれかに記載の測
定方法、に関する。
特異的IgE 抗体を、予めIgG 抗体除去処理を行った血清
を用いて測定する方法に関する。具体的には、(1) IgG
抗体を特異的に吸着するリガンドを用いて、特異的IgE
抗体と特異性を同じくする特異的IgG 抗体を、特異的I
gE 抗体との競合が起きない程度まで予め除去した後
に、特異的IgE 抗体を測定することからなる血清中の特
異的IgE 抗体測定方法において、特異的IgG抗体を予め
除去する工程が、血清とIgG 抗体を特異的に吸着するリ
ガンドとをpH6.0〜7.5にて反応させた後、そのIgG 抗体
を特異的に吸着するリガンドのIgG 抗体結合部位をIgG
抗体によって飽和させ、さらに、そのIgG 抗体を特異的
に吸着するリガンドを酸処理することを特徴とする方
法、(2) IgG 抗体を特異的に吸着するリガンドのIgG 抗
体結合部位をIgG 抗体によって飽和させ、さらに、その
IgG 抗体を特異的に吸着するリガンドを酸処理する工程
の酸処理条件が、pH2.7〜3.3で2〜8分間である上記(1)
の特異的IgE 抗体の測定方法、(3) IgG 抗体を特異的
に吸着するリガンドが、プロテインＧである上記(1)又
は(2)記載の特異的IgE 抗体の測定方法、(4) IgG 抗体
を特異的に吸着するリガンドが、不溶化担体に固定化さ
れたリガンドである上記(1)〜(3)のいずれかに記載の測
定方法、に関する。
【００１５】すなわち、アレルギー患者血清と反応させ
た後のIgG抗体を特異的に吸着するリガンドに対して、
試薬IgG 抗体によるIgG 抗体結合部位の飽和処理および
酸処理を行い、リガンドに結合したIgG-IgE 複合体から
IgE抗体のみを遊離させる。この遊離されたIgE 抗体を
リガンド処理を行った元の血清に戻すことによって、Ig
G-IgE 複合体の存在量の高い血清でも正確な特異的IgE
抗体の測定が可能となる。以上によって、本発明は、ア
レルギーの原因抗原のより詳細な解析に有用となるので
ある。
た後のIgG抗体を特異的に吸着するリガンドに対して、
試薬IgG 抗体によるIgG 抗体結合部位の飽和処理および
酸処理を行い、リガンドに結合したIgG-IgE 複合体から
IgE抗体のみを遊離させる。この遊離されたIgE 抗体を
リガンド処理を行った元の血清に戻すことによって、Ig
G-IgE 複合体の存在量の高い血清でも正確な特異的IgE
抗体の測定が可能となる。以上によって、本発明は、ア
レルギーの原因抗原のより詳細な解析に有用となるので
ある。
【００１６】
【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
特異的IgE 抗体を測定する際に考慮しなければならない
重要な点の一つとして、特異性が同じ特異的IgG 抗体と
の競合によって正確な測定が妨害されてしまう可能性の
あることが指摘される。通常のELISA プレートを用いて
固定化された抗原に対する血清中の特異的IgE抗体を測
定している報告がしばしばみられるが、その場合、ELIS
A プレートに固定化できる抗原量は比較的少ないために
特異性が同じ他の種類の抗体との競合が生じ、正確な特
異的IgE抗体の測定が妨害されている可能性がある。そ
のような妨害は、血清を固定化プロテインＧ等のIgG 抗
体に特異的なリガンドによって処理した後に消去するこ
とができた (前記特願平11-069483号)。
特異的IgE 抗体を測定する際に考慮しなければならない
重要な点の一つとして、特異性が同じ特異的IgG 抗体と
の競合によって正確な測定が妨害されてしまう可能性の
あることが指摘される。通常のELISA プレートを用いて
固定化された抗原に対する血清中の特異的IgE抗体を測
定している報告がしばしばみられるが、その場合、ELIS
A プレートに固定化できる抗原量は比較的少ないために
特異性が同じ他の種類の抗体との競合が生じ、正確な特
異的IgE抗体の測定が妨害されている可能性がある。そ
のような妨害は、血清を固定化プロテインＧ等のIgG 抗
体に特異的なリガンドによって処理した後に消去するこ
とができた (前記特願平11-069483号)。
【００１７】しかしながら、その一方で、固定化プロテ
インＧ処理を行ったいくつかの血清においてIgE 抗体の
減少が認められた。固定化プロテインＧはpH6.0〜7.5に
おいてはIgG 抗体のみを結合しIgE 抗体は結合しない。
本発明者らは、血清の固定化プロテインＧ処理をpH6.0
〜7.5 で行っていることから、固定化プロテインＧ処理
によるIgE抗体の減少は、IgE抗体の固定化プロテインＧ
への結合によるのではなく、IgE 抗体が固定化プロテイ
ンＧに結合した抗IgE自己抗体であるIgG抗体と結合する
ことによって生じていると考えた。したがって、血清中
の特異的IgE抗体を正確に測定するためには、この固定
化プロテインＧ処理によるIgE 抗体の減少分の補正を行
う必要がある。
インＧ処理を行ったいくつかの血清においてIgE 抗体の
減少が認められた。固定化プロテインＧはpH6.0〜7.5に
おいてはIgG 抗体のみを結合しIgE 抗体は結合しない。
本発明者らは、血清の固定化プロテインＧ処理をpH6.0
〜7.5 で行っていることから、固定化プロテインＧ処理
によるIgE抗体の減少は、IgE抗体の固定化プロテインＧ
への結合によるのではなく、IgE 抗体が固定化プロテイ
ンＧに結合した抗IgE自己抗体であるIgG抗体と結合する
ことによって生じていると考えた。したがって、血清中
の特異的IgE抗体を正確に測定するためには、この固定
化プロテインＧ処理によるIgE 抗体の減少分の補正を行
う必要がある。
【００１８】一般的に、抗原抗体反応複合体は低pH処理
によって乖離させることができる。そこで、本発明者ら
は、固定化プロテインＧに結合したIgE-IgG 複合体も低
pH処理によってIgE 抗体のみを遊離させることができる
のではないかと考え、次のような試験を行った。最初
に、固定化プロテインＧとIgG またはIgE 抗体との反応
のpHによる影響を確認した。その結果、pH6.0〜7.5 に
おいては固定化プロテインＧはIgG 抗体のみを結合し、
IgE 抗体は全く結合しないことが分かった。しかし、pH
が6.0 未満では固定化プロテインＧはIgG 抗体のみなら
ずIgE 抗体をも結合することが判明した。
によって乖離させることができる。そこで、本発明者ら
は、固定化プロテインＧに結合したIgE-IgG 複合体も低
pH処理によってIgE 抗体のみを遊離させることができる
のではないかと考え、次のような試験を行った。最初
に、固定化プロテインＧとIgG またはIgE 抗体との反応
のpHによる影響を確認した。その結果、pH6.0〜7.5 に
おいては固定化プロテインＧはIgG 抗体のみを結合し、
IgE 抗体は全く結合しないことが分かった。しかし、pH
が6.0 未満では固定化プロテインＧはIgG 抗体のみなら
ずIgE 抗体をも結合することが判明した。
【００１９】このことは、酸処理を行いIgE 抗体を遊離
させても、その遊離したIgE 抗体が固定化プロテインＧ
と再び結合してしまうことを示している。そこで、この
ような低pHにおけるIgE 抗体と固定化プロテインＧとの
再結合を防ぐために、固定化プロテインＧ上のIgG 抗体
結合部位を高濃度の試薬IgG 抗体によって飽和させる操
作、すなわちブロッキングを行う必要がある。このブロ
ッキングはIgE 抗体遊離のための酸処理の前に行う必要
がある。ブロッキングを行った場合には固定化プロテイ
ンＧは低pHにおいてもIgE 抗体と結合しなくなる。
させても、その遊離したIgE 抗体が固定化プロテインＧ
と再び結合してしまうことを示している。そこで、この
ような低pHにおけるIgE 抗体と固定化プロテインＧとの
再結合を防ぐために、固定化プロテインＧ上のIgG 抗体
結合部位を高濃度の試薬IgG 抗体によって飽和させる操
作、すなわちブロッキングを行う必要がある。このブロ
ッキングはIgE 抗体遊離のための酸処理の前に行う必要
がある。ブロッキングを行った場合には固定化プロテイ
ンＧは低pHにおいてもIgE 抗体と結合しなくなる。
【００２０】酸処理の条件に関しては、実際にIgE-IgG
複合体を含んでいる血清を用いてIgE 遊離条件をより詳
細に検討した結果から、pH2.7〜3.3 で2〜8分間の低pH
処理が効果的であることが分かった。なお、この条件に
おいては、固定化プロテインＧに一旦結合したIgG 抗体
はほとんど遊離しないことが確認できた。以上の試験の
結果は、後述の試験例１〜４において詳しく説明する。
複合体を含んでいる血清を用いてIgE 遊離条件をより詳
細に検討した結果から、pH2.7〜3.3 で2〜8分間の低pH
処理が効果的であることが分かった。なお、この条件に
おいては、固定化プロテインＧに一旦結合したIgG 抗体
はほとんど遊離しないことが確認できた。以上の試験の
結果は、後述の試験例１〜４において詳しく説明する。
【００２１】実際に、この固定化プロテインＧ処理、試
薬IgG 抗体によるブロッキングおよび酸処理を組み合わ
せることで測定した特異的IgE 抗体の測定値は、実際の
臨床検査で測定されたRASTユニットと高い相関性を有す
ることも分かり、その方法の有効性も確認できた。この
ように、固定化プロテインＧ処理と酸処理の組み合わせ
によって、通常のELISA 用マイクロプレートを用いて、
競合するIgG 抗体及び抗IgE 自己抗体の影響を大きく受
けずに任意の抗原に対する血清中の特異的IgE 抗体の反
応性を簡便に解析することが可能となる。また、CAP-RA
STシステムのような通常のIgE 検査法では抗IgE 自己抗
体の存在量を知ることはできないが、その測定方法に本
発明の方法を応用することで、より詳細なIgE 検査を行
うことも可能となる。
薬IgG 抗体によるブロッキングおよび酸処理を組み合わ
せることで測定した特異的IgE 抗体の測定値は、実際の
臨床検査で測定されたRASTユニットと高い相関性を有す
ることも分かり、その方法の有効性も確認できた。この
ように、固定化プロテインＧ処理と酸処理の組み合わせ
によって、通常のELISA 用マイクロプレートを用いて、
競合するIgG 抗体及び抗IgE 自己抗体の影響を大きく受
けずに任意の抗原に対する血清中の特異的IgE 抗体の反
応性を簡便に解析することが可能となる。また、CAP-RA
STシステムのような通常のIgE 検査法では抗IgE 自己抗
体の存在量を知ることはできないが、その測定方法に本
発明の方法を応用することで、より詳細なIgE 検査を行
うことも可能となる。
【００２２】以下、実施例によって、本発明が、実際の
臨床検査で測定されたRASTユニットと高い相関を有する
こと、通常のELISA用マイクロプレートを用いて、詳細
なIgE抗体検査が可能であることを示す。
臨床検査で測定されたRASTユニットと高い相関を有する
こと、通常のELISA用マイクロプレートを用いて、詳細
なIgE抗体検査が可能であることを示す。
【００２３】
【実施例１】血清の固定化プロテインＧ処理:試験に用
いた牛乳アレルギー患者血清は41サンプルであり、牛乳
アレルゲンに関してRAST検査があらかじめ行われたもの
を用いた。RAST検査による牛乳RASTユニットの範囲は1.
01から85.67 であった。牛乳アレルギー患者血清をリン
酸緩衝生理食塩水 (PBS)で２倍に希釈したもの、および
固定化プロテインＧゲル（Pierce） をPBS で２倍に希
釈したものを等量混合し、pH7.0、室温で１時間、振盪
しながら反応させた。反応後、その混合溶液を遠心分離
（15000 rpm 、1 分間） し、固定化プロテインＧを沈
澱させた。
いた牛乳アレルギー患者血清は41サンプルであり、牛乳
アレルゲンに関してRAST検査があらかじめ行われたもの
を用いた。RAST検査による牛乳RASTユニットの範囲は1.
01から85.67 であった。牛乳アレルギー患者血清をリン
酸緩衝生理食塩水 (PBS)で２倍に希釈したもの、および
固定化プロテインＧゲル（Pierce） をPBS で２倍に希
釈したものを等量混合し、pH7.0、室温で１時間、振盪
しながら反応させた。反応後、その混合溶液を遠心分離
（15000 rpm 、1 分間） し、固定化プロテインＧを沈
澱させた。
【００２４】固定化プロテインＧビーズの酸処理:上述
した血清の固定化プロテインＧ処理によって残った固定
化プロテインＧビーズを含む懸濁液30μl に、40mg/ml
のウシIgG (Reagent grade, Sigma社, USA)を10μl 添
加し室温で1 時間反応させ固定化プロテインＧのIgG 結
合部位を飽和させた。その懸濁液に40μl の0.1Mクエン
酸緩衝液(pH3.0) を添加し、振盪しながら室温で5 分間
酸処理を行った。その後直ちに15000rpm.1分間遠心分離
し上清50μl を採取し、上述した血清の固定化プロテイ
ンＧ処理によって得た上清50μl と混合した。混合して
得られた上清100 μl に50μl の0.2Mリン酸水素二ナト
リウム一水酸化ナトリウム溶液（pH11.5) を添加し中和
した。
した血清の固定化プロテインＧ処理によって残った固定
化プロテインＧビーズを含む懸濁液30μl に、40mg/ml
のウシIgG (Reagent grade, Sigma社, USA)を10μl 添
加し室温で1 時間反応させ固定化プロテインＧのIgG 結
合部位を飽和させた。その懸濁液に40μl の0.1Mクエン
酸緩衝液(pH3.0) を添加し、振盪しながら室温で5 分間
酸処理を行った。その後直ちに15000rpm.1分間遠心分離
し上清50μl を採取し、上述した血清の固定化プロテイ
ンＧ処理によって得た上清50μl と混合した。混合して
得られた上清100 μl に50μl の0.2Mリン酸水素二ナト
リウム一水酸化ナトリウム溶液（pH11.5) を添加し中和
した。
【００２５】特異的IgE 抗体の測定:上述のように固定
化プロテインＧ処理およびその酸処理を施した牛乳アレ
ルギー患者血清中の牛乳タンパク質特異的IgE 抗体をEL
ISA によって測定した。96ウェルマイクロプレート(Nun
c)の各ウェルに、0.1M炭酸緩衝液 (pH8.7)に溶解した10
μg/ml濃度の脱脂乳溶液を50μl ずつ分注し、5 ℃で16
時間以上固定化した。非特異的吸着を減少させるブロッ
キング操作として、0.05% Tween20 含有リン酸緩衝生理
食塩水(PBS-T) に溶解した1%BSA 溶液(PBS-TB)を各ウェ
ルに0.2ml ずつ分注し、室温で1 時間静置した。各ウェ
ルをPBS-T で3 回洗浄した後、固定化プロテインＧ処理
およびその酸処理を施したアレルギー患者血清50μlを
各ウェルに添加し、室温で２時間反応させた。各ウェル
をPBS-Tで３回洗浄した後、PBS-TBで1000倍に希釈した
ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ヒトIgE 抗
体(生化学工業社製) を各ウェルに50μl ずつ分注し、
室温で2 時間反応させた。各ウェルをPBS-T で3 回洗浄
した後、発蛍光性ペルオキシダーゼ基質(Pierce)を各ウ
ェルに0.1 mlずつ添加し30分間〜1 時間反応させた。そ
の後、反応停止液を各ウェルに0.1 mlずつ添加し励起波
長 320nmおよび発光波長 440nmにおける蛍光強度をサイ
トフロー4000 (日本パーセプティブ社製) を用いて測定
した。測定した蛍光強度は、抗ヒトIgE 抗体を固定化し
たウェルに標準ヒトIgE を添加して測定したスタンダー
ドを用いてユニット(Ua/ml)として表した。固定化プロ
テインＧ処理および酸処理の効果を表１に示す。表１は
臨床検査項目として測定された牛乳RASTユニット(Ua/m
l) と、上述した測定法による脱脂乳特異的IgE 抗体と
の相関分析を行った結果である。
化プロテインＧ処理およびその酸処理を施した牛乳アレ
ルギー患者血清中の牛乳タンパク質特異的IgE 抗体をEL
ISA によって測定した。96ウェルマイクロプレート(Nun
c)の各ウェルに、0.1M炭酸緩衝液 (pH8.7)に溶解した10
μg/ml濃度の脱脂乳溶液を50μl ずつ分注し、5 ℃で16
時間以上固定化した。非特異的吸着を減少させるブロッ
キング操作として、0.05% Tween20 含有リン酸緩衝生理
食塩水(PBS-T) に溶解した1%BSA 溶液(PBS-TB)を各ウェ
ルに0.2ml ずつ分注し、室温で1 時間静置した。各ウェ
ルをPBS-T で3 回洗浄した後、固定化プロテインＧ処理
およびその酸処理を施したアレルギー患者血清50μlを
各ウェルに添加し、室温で２時間反応させた。各ウェル
をPBS-Tで３回洗浄した後、PBS-TBで1000倍に希釈した
ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ヒトIgE 抗
体(生化学工業社製) を各ウェルに50μl ずつ分注し、
室温で2 時間反応させた。各ウェルをPBS-T で3 回洗浄
した後、発蛍光性ペルオキシダーゼ基質(Pierce)を各ウ
ェルに0.1 mlずつ添加し30分間〜1 時間反応させた。そ
の後、反応停止液を各ウェルに0.1 mlずつ添加し励起波
長 320nmおよび発光波長 440nmにおける蛍光強度をサイ
トフロー4000 (日本パーセプティブ社製) を用いて測定
した。測定した蛍光強度は、抗ヒトIgE 抗体を固定化し
たウェルに標準ヒトIgE を添加して測定したスタンダー
ドを用いてユニット(Ua/ml)として表した。固定化プロ
テインＧ処理および酸処理の効果を表１に示す。表１は
臨床検査項目として測定された牛乳RASTユニット(Ua/m
l) と、上述した測定法による脱脂乳特異的IgE 抗体と
の相関分析を行った結果である。
【００２６】
【表１】 ─────────────────────────────── 処 理 ピアソンの相関係数 ─────────────────────────────── 未処理 0.755 固定化プロテインＧ処理 0.895 固定化プロテインＧ処理および酸処理 0.915 ───────────────────────────────
【００２７】表１に示すように、未処理に比べて固定化
プロテインＧ処理によって相関性が上昇し、さらに酸処
理を加えることで相関性がより上昇した。なお、酸処理
を加えたことによる効果が小さく見えるが、これは、す
べての血清がIgE-IgG 複合体を含んでいるわけではな
く、また、その複合体の存在量が血清によって異なるこ
とによるものと考えられる。実際の問題として、測定し
ようとする血清のIgE-IgG 複合体含有量をあらかじめ把
握しておくことは困難なため、固定化プロテインＧ処理
および酸処理を行うことが必須の操作と考えられる。
プロテインＧ処理によって相関性が上昇し、さらに酸処
理を加えることで相関性がより上昇した。なお、酸処理
を加えたことによる効果が小さく見えるが、これは、す
べての血清がIgE-IgG 複合体を含んでいるわけではな
く、また、その複合体の存在量が血清によって異なるこ
とによるものと考えられる。実際の問題として、測定し
ようとする血清のIgE-IgG 複合体含有量をあらかじめ把
握しておくことは困難なため、固定化プロテインＧ処理
および酸処理を行うことが必須の操作と考えられる。
【００２８】
【実施例２】実施例１で測定した脱脂乳アレルゲン特異
的IgE 抗体に加えて、カゼイン、αラクトアルブミン、
およびβラクトグロブリンに対する特異的IgE 抗体を実
施例１と同様に測定した。測定した特異的IgE 抗体の値
について、牛乳アレルギー患者血清の情報としてあらか
じめ分かっている牛乳RASTユニットとの相関性を検討し
た。その結果、図１に示すようにピアソンの相関係数は
脱脂乳では0.915 、カゼイン0.875 、αラクトアルブミ
ンでは0.476 、βラクトグロブリンでは0.467であっ
た。このように、牛乳RASTユニットとの相関性は、脱脂
乳およびカゼインに対する特異的IgE 抗体量と非常に良
く対応した。しかし、αラクトアルブミンおよびβラク
トグロブリンに対する特異的IgE 抗体量とは相関性が低
かった。
的IgE 抗体に加えて、カゼイン、αラクトアルブミン、
およびβラクトグロブリンに対する特異的IgE 抗体を実
施例１と同様に測定した。測定した特異的IgE 抗体の値
について、牛乳アレルギー患者血清の情報としてあらか
じめ分かっている牛乳RASTユニットとの相関性を検討し
た。その結果、図１に示すようにピアソンの相関係数は
脱脂乳では0.915 、カゼイン0.875 、αラクトアルブミ
ンでは0.476 、βラクトグロブリンでは0.467であっ
た。このように、牛乳RASTユニットとの相関性は、脱脂
乳およびカゼインに対する特異的IgE 抗体量と非常に良
く対応した。しかし、αラクトアルブミンおよびβラク
トグロブリンに対する特異的IgE 抗体量とは相関性が低
かった。
【００２９】この結果から、牛乳RASTユニットは牛乳タ
ンパク質のうち主にカゼインに対する特異性を示してい
る値であることが分かる。これは、CAP-RASTシステムで
用いられている牛乳アレルゲンキャップは脱脂乳（その
タンパク質の約80% がカゼイン、約20% がαラクトアル
ブミンおよびβラクトグロブリン等のホエータンパク
質）が固定化されているためと考えられる。さらに、こ
のことは実際の臨床検査における牛乳RASTユニットの解
釈を行う場合に特に留意しておかなければならない重要
な点であると考えられる。このように、ここでは代表的
な牛乳タンパク質を用いた結果を示したが、これは一例
に過ぎない。他にも酵素処理、加熱処理、あるいは化学
修飾されたアレルゲン等を用いた検討が可能であり、よ
り詳細なアレルゲン解析に応用することが可能である。
ンパク質のうち主にカゼインに対する特異性を示してい
る値であることが分かる。これは、CAP-RASTシステムで
用いられている牛乳アレルゲンキャップは脱脂乳（その
タンパク質の約80% がカゼイン、約20% がαラクトアル
ブミンおよびβラクトグロブリン等のホエータンパク
質）が固定化されているためと考えられる。さらに、こ
のことは実際の臨床検査における牛乳RASTユニットの解
釈を行う場合に特に留意しておかなければならない重要
な点であると考えられる。このように、ここでは代表的
な牛乳タンパク質を用いた結果を示したが、これは一例
に過ぎない。他にも酵素処理、加熱処理、あるいは化学
修飾されたアレルゲン等を用いた検討が可能であり、よ
り詳細なアレルゲン解析に応用することが可能である。
【００３０】
【実施例３】実施例１および２において検討したアレル
ギー患者血清のうち、固定化プロテインＧ処理によって
IgE 抗体の減少が大きかった血清、すなわち、抗IgE 自
己抗体の存在量が多いと考えられるいくつかの血清に関
して以下の検討を行った。未処理の血清と実施例１に示
した方法で処理した血清について、CAP-RASTシステム
(ファルマシア社製) を用いて牛乳特異的IgE 抗体を測
定した。その結果、未処理の場合を100 として表すと、
表2 に示すように固定化プロテインＧ処理と酸処理を行
った方が特異的IgE 抗体の検出性が上昇した。なお、血
清No.1〜3は、それぞれ別々のアレルギー患者に由来す
る血清で、これらの血清は、それぞれ固定化プロテイン
Ｇ処理によるIgE抗体の減少量が異なるものである。
ギー患者血清のうち、固定化プロテインＧ処理によって
IgE 抗体の減少が大きかった血清、すなわち、抗IgE 自
己抗体の存在量が多いと考えられるいくつかの血清に関
して以下の検討を行った。未処理の血清と実施例１に示
した方法で処理した血清について、CAP-RASTシステム
(ファルマシア社製) を用いて牛乳特異的IgE 抗体を測
定した。その結果、未処理の場合を100 として表すと、
表2 に示すように固定化プロテインＧ処理と酸処理を行
った方が特異的IgE 抗体の検出性が上昇した。なお、血
清No.1〜3は、それぞれ別々のアレルギー患者に由来す
る血清で、これらの血清は、それぞれ固定化プロテイン
Ｇ処理によるIgE抗体の減少量が異なるものである。
【００３１】
【表２】 ───────────────────────────────── 血清 No. 未処理 固定化プロテインＧ処理および酸処理 ───────────────────────────────── 1 100 120 2 100 115 3 100 130 ─────────────────────────────────
【００３２】IgE に対する自己抗体は、IgE 産生の調
節、アレルギー反応の促進あるいは抑制作用、および生
体防御への関与等さまざまな生理機能を果している可能
性が考えられている。また、実際のIgE 抗体検査におい
てもIgE に対する自己抗体がIgE 抗体の検出を妨害して
いる可能性も指摘されている。しかし、臨床検査で広く
用いられているCAP-RASTシステムにおいてIgE 抗体の検
出がどの程度妨害されているかは不明である。すなわ
ち、抗IgE 自己抗体が生体において実際にどのような働
きをしているか、また、IgE 抗体検査において抗IgE 自
己抗体をどのように取り扱うべきか等の問題はこれから
の検討課題と言える。したがって、通常のIgE 抗体検査
法に加えて本発明のような固定化プロテインＧ処理およ
び酸処理を応用した検査法を併用することで、より詳細
なIgE 抗体検査が可能になると考えられる。以下の試験
例１〜４では、本発明において予め特異的IgG抗体を固
定化プロテインＧにより除去する工程の処理条件を検討
した結果を示す。
節、アレルギー反応の促進あるいは抑制作用、および生
体防御への関与等さまざまな生理機能を果している可能
性が考えられている。また、実際のIgE 抗体検査におい
てもIgE に対する自己抗体がIgE 抗体の検出を妨害して
いる可能性も指摘されている。しかし、臨床検査で広く
用いられているCAP-RASTシステムにおいてIgE 抗体の検
出がどの程度妨害されているかは不明である。すなわ
ち、抗IgE 自己抗体が生体において実際にどのような働
きをしているか、また、IgE 抗体検査において抗IgE 自
己抗体をどのように取り扱うべきか等の問題はこれから
の検討課題と言える。したがって、通常のIgE 抗体検査
法に加えて本発明のような固定化プロテインＧ処理およ
び酸処理を応用した検査法を併用することで、より詳細
なIgE 抗体検査が可能になると考えられる。以下の試験
例１〜４では、本発明において予め特異的IgG抗体を固
定化プロテインＧにより除去する工程の処理条件を検討
した結果を示す。
【００３３】
【試験例１】通常はIgG 抗体のみを結合すると言われて
いるプロテインＧが、低pHではIgE抗体も結合するよう
になることを表３に示す。低pHにおいて固定化プロテイ
ンＧとIgG 抗体、あるいはIgE 抗体を反応させ、遠心分
離によって固定化プロテインＧを除いた後の上清に残る
抗体量を測定した。表３には初めに加えた抗体量を100
として、それからどれだけ減少したかを計算し、抗体結
合率として表した。抗体量の測定にはELISA を用い、96
ウェルマイクロプレートには初めに抗IgG 抗体あるいは
抗IgE 抗体を固定化した。その他の操作は実施例１と同
様に行った。
いるプロテインＧが、低pHではIgE抗体も結合するよう
になることを表３に示す。低pHにおいて固定化プロテイ
ンＧとIgG 抗体、あるいはIgE 抗体を反応させ、遠心分
離によって固定化プロテインＧを除いた後の上清に残る
抗体量を測定した。表３には初めに加えた抗体量を100
として、それからどれだけ減少したかを計算し、抗体結
合率として表した。抗体量の測定にはELISA を用い、96
ウェルマイクロプレートには初めに抗IgG 抗体あるいは
抗IgE 抗体を固定化した。その他の操作は実施例１と同
様に行った。
【００３４】
【表３】 ─────────────────────────────── ｐＨ IgG抗体結合率 IgE抗体結合率 ─────────────────────────────── 7.0 91 0 4.0 100 95 3.5 92 93 3.0 90 98 ───────────────────────────
【００３５】
【試験例２】試験例１に示すように低pHではプロテイン
ＧはIgE 抗体も結合するようになる。このことは、酸処
理によって遊離させたIgE 抗体が酸性の状態では再びブ
ロテインＧに結合することを意味する。そこで、その再
結合を防ぐために、IgG 抗体によってプロテインＧのIg
G 抗体結合部位を飽和させる処理（IgG 抗体ブロッキン
グ）を実施例１の中で述べた手順にしたがって行った。
その後、pH3.0 においてIgE 抗体を添加し固定化プロテ
インＧと反応させ、上清に残存するIgE 抗体を測定し
た。抗体量の測定は試験例1 と同様に行い、測定結果は
抗体結合率として表した。表４に示すように、IgG 抗体
ブロッキングを行った場合、固定化プロテインＧは低pH
においてもIgE 抗体を結合しなくなった。
ＧはIgE 抗体も結合するようになる。このことは、酸処
理によって遊離させたIgE 抗体が酸性の状態では再びブ
ロテインＧに結合することを意味する。そこで、その再
結合を防ぐために、IgG 抗体によってプロテインＧのIg
G 抗体結合部位を飽和させる処理（IgG 抗体ブロッキン
グ）を実施例１の中で述べた手順にしたがって行った。
その後、pH3.0 においてIgE 抗体を添加し固定化プロテ
インＧと反応させ、上清に残存するIgE 抗体を測定し
た。抗体量の測定は試験例1 と同様に行い、測定結果は
抗体結合率として表した。表４に示すように、IgG 抗体
ブロッキングを行った場合、固定化プロテインＧは低pH
においてもIgE 抗体を結合しなくなった。
【００３６】
【表４】 ────────────────────────────── IgG 抗体ブロッキング pH3.0 におけるIgE 抗体結合率 ────────────────────────────── 有り 0 無し 97 ──────────────────────────────
【００３７】
【試験例３】表５は、実施例１において行ったpH3.0 で
５分間という酸処理の条件が最適条件であることを示
す。IgE-IgG 複合体を含んでいる血清を用いて、表５に
示した条件で固定化プロテインＧに対する酸処理を行っ
た。IgG 抗体ブロッキングを含むその他の条件は実施例
１と同様であり、抗体量の測定は試験例１と同様であ
る。表５に示した値は、固定化ブロテインＧ処理を行わ
なかった時に測定されるIgE 抗体量を100 とした時に酸
処理によってIgE 抗体の検出がどの程度回復したかを示
す。
５分間という酸処理の条件が最適条件であることを示
す。IgE-IgG 複合体を含んでいる血清を用いて、表５に
示した条件で固定化プロテインＧに対する酸処理を行っ
た。IgG 抗体ブロッキングを含むその他の条件は実施例
１と同様であり、抗体量の測定は試験例１と同様であ
る。表５に示した値は、固定化ブロテインＧ処理を行わ
なかった時に測定されるIgE 抗体量を100 とした時に酸
処理によってIgE 抗体の検出がどの程度回復したかを示
す。
【００３８】
【表５】 ────────────────────────────── 酸処理の時間（分） 酸処理のpH 5 10 20 ────────────────────────────── pH4.0 70 70 70 pH3.5 87 87 88 pH3.0 101 92 87 ──────────────────────────────
【００３９】
【試験例４】表６は、実施例１において行ったpH3.0 で
5 分間という酸処理の条件が、固定化プロテインＧに一
旦結合したIgG 抗体には実質的な影響を及ぼさないこと
を示す。0.1 mg/ml の濃度のヒトIgG 抗体をpH7.0 にお
いて固定化プロテインＧに結合させた後、pH3.0 で5 分
間の酸処理を行い上清に遊離されたIgG 抗体を試験例１
と同様に測定した。表６の値は、最初に添加した抗体濃
度を100 としたときの相対値で表した。表６に示すよう
に、pH3.0 で5 分間の酸処理によって、固定化プロテイ
ンＧに一旦結合したIgG 抗体の遊離率は増加するもの
の、約2%にとどまり、大きな影響は及ぼさなかった。
5 分間という酸処理の条件が、固定化プロテインＧに一
旦結合したIgG 抗体には実質的な影響を及ぼさないこと
を示す。0.1 mg/ml の濃度のヒトIgG 抗体をpH7.0 にお
いて固定化プロテインＧに結合させた後、pH3.0 で5 分
間の酸処理を行い上清に遊離されたIgG 抗体を試験例１
と同様に測定した。表６の値は、最初に添加した抗体濃
度を100 としたときの相対値で表した。表６に示すよう
に、pH3.0 で5 分間の酸処理によって、固定化プロテイ
ンＧに一旦結合したIgG 抗体の遊離率は増加するもの
の、約2%にとどまり、大きな影響は及ぼさなかった。
【００４０】
【表６】 ─────────────────────── 酸処理 上清に遊離されたIgG 抗体 ─────────────────────── 無し 0.2 有り 2.3 ───────────────────────
【００４１】
【発明の効果】本発明の方法によれば、通常のELISA 用
マイクロプレートを用いて競合する特異的IgG 抗体およ
び抗IgE 自己抗体の影響をほとんど受けずに任意のアレ
ルゲンに対する血清中の特異的IgE抗体 の反応性を簡便
に解析することができる。また、この方法を応用するこ
とによって、通常のIgE 抗体検査法では知ることのでき
ない抗IgE 自己抗体の存在程度も測定可能であり、さら
に、CAP-RASTシステムのような既存の測定法に本発明の
方法を応用することでより詳細なIgE抗体 検査を行うこ
とも可能である。
マイクロプレートを用いて競合する特異的IgG 抗体およ
び抗IgE 自己抗体の影響をほとんど受けずに任意のアレ
ルゲンに対する血清中の特異的IgE抗体 の反応性を簡便
に解析することができる。また、この方法を応用するこ
とによって、通常のIgE 抗体検査法では知ることのでき
ない抗IgE 自己抗体の存在程度も測定可能であり、さら
に、CAP-RASTシステムのような既存の測定法に本発明の
方法を応用することでより詳細なIgE抗体 検査を行うこ
とも可能である。
【図１】実施例２における牛乳アレルギー患者血清の脱
脂乳、カゼイン、αラクトアルブミン、およびβラクト
グロブリンに対する特異的IgE 抗体量（縦軸）と、臨床
検査の値である牛乳RASTユニット（横軸）との相関性を
示す図である。
脂乳、カゼイン、αラクトアルブミン、およびβラクト
グロブリンに対する特異的IgE 抗体量（縦軸）と、臨床
検査の値である牛乳RASTユニット（横軸）との相関性を
示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｑ
Claims (4)
- 【請求項１】 IgG 抗体を特異的に吸着するリガンドを
用いて、特異的IgE抗体と特異性を同じくする特異的IgG
抗体を、特異的IgE 抗体との競合が起きない程度まで
予め除去した後に、特異的IgE 抗体を測定することより
なる血清中の特異的IgE 抗体測定方法において、特異的
IgG抗体を予め除去する工程が、(1)血清とIgG 抗体を特
異的に吸着するリガンドとをpH6.0〜7.5 にて反応させ
た後、(2)そのIgG 抗体を特異的に吸着するリガンドのI
gG 抗体結合部位をIgG 抗体によって飽和させ、(3)さら
に、そのIgG 抗体を特異的に吸着するリガンドを酸処理
することを特徴とする方法。 - 【請求項２】 工程(3)の酸処理条件が、pH2.7〜3.3 で
５分間である請求項１記載の特異的IgE 抗体の測定方
法。 - 【請求項３】 IgG 抗体を特異的に吸着するリガンド
が、プロテインＧである請求項１又は２記載の特異的Ig
E 抗体の測定方法。 - 【請求項４】 IgG 抗体を特異的に吸着するリガンド
が、不溶化担体に固定化されたリガンドである請求項１
〜３のいずれかに記載の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000099666A JP4363740B2 (ja) | 2000-03-31 | 2000-03-31 | 特異的ＩｇＥ抗体測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000099666A JP4363740B2 (ja) | 2000-03-31 | 2000-03-31 | 特異的ＩｇＥ抗体測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001281249A true JP2001281249A (ja) | 2001-10-10 |
| JP4363740B2 JP4363740B2 (ja) | 2009-11-11 |
Family
ID=18613989
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000099666A Expired - Fee Related JP4363740B2 (ja) | 2000-03-31 | 2000-03-31 | 特異的ＩｇＥ抗体測定方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4363740B2 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006267063A (ja) * | 2005-03-25 | 2006-10-05 | Univ Of Tokushima | アレルギー疾患の判定方法及びアレルギー疾患の判定キット |
| JP2006267058A (ja) * | 2005-03-25 | 2006-10-05 | Univ Of Tokushima | ダイヤモンドチップへの蛋白質／ペプチドの固定化方法 |
| JP2010508516A (ja) * | 2006-10-26 | 2010-03-18 | アボット・ラボラトリーズ | 内在性の抗分析物抗体を含有する試料中の分析物の免疫アッセイ |
| JP2011133285A (ja) * | 2009-12-24 | 2011-07-07 | Toyobo Co Ltd | アレルギー検査方法 |
| WO2021187398A1 (ja) * | 2020-03-16 | 2021-09-23 | 東レ株式会社 | 体液検体中のスギアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の検出方法および検出用キット |
| WO2022158509A1 (ja) * | 2021-01-21 | 2022-07-28 | 東レ株式会社 | アレルゲン固定化担体およびアレルゲン特異的抗体の検出方法 |
| JP7338527B2 (ja) | 2020-03-19 | 2023-09-05 | 東レ株式会社 | 体液検体中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の検出方法 |
-
2000
- 2000-03-31 JP JP2000099666A patent/JP4363740B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006267063A (ja) * | 2005-03-25 | 2006-10-05 | Univ Of Tokushima | アレルギー疾患の判定方法及びアレルギー疾患の判定キット |
| JP2006267058A (ja) * | 2005-03-25 | 2006-10-05 | Univ Of Tokushima | ダイヤモンドチップへの蛋白質／ペプチドの固定化方法 |
| JP4568841B2 (ja) * | 2005-03-25 | 2010-10-27 | 国立大学法人徳島大学 | アレルギー疾患の判定方法及びアレルギー疾患の判定キット |
| JP4660756B2 (ja) * | 2005-03-25 | 2011-03-30 | 国立大学法人徳島大学 | ダイヤモンドチップへの蛋白質／ペプチドの固定化方法 |
| JP2010508516A (ja) * | 2006-10-26 | 2010-03-18 | アボット・ラボラトリーズ | 内在性の抗分析物抗体を含有する試料中の分析物の免疫アッセイ |
| JP2011133285A (ja) * | 2009-12-24 | 2011-07-07 | Toyobo Co Ltd | アレルギー検査方法 |
| WO2021187398A1 (ja) * | 2020-03-16 | 2021-09-23 | 東レ株式会社 | 体液検体中のスギアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の検出方法および検出用キット |
| JP7338527B2 (ja) | 2020-03-19 | 2023-09-05 | 東レ株式会社 | 体液検体中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の検出方法 |
| WO2022158509A1 (ja) * | 2021-01-21 | 2022-07-28 | 東レ株式会社 | アレルゲン固定化担体およびアレルゲン特異的抗体の検出方法 |
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|---|---|
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