JP2001245678A - ナチュラルキラー細胞刺激因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）においてイン
ビトロでγ−インターフェロンの生産を誘発することが
出来るナチュラルキラー細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）タン
パク質またはそのサブユニットに対する抗体の提供。 【解決手段】 当該タンパク質をコードするＤＮＡを遺
伝子組換え技術により発現させることにより、当該タン
パク質またはサブユニットに対する抗体を得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】この発明は、係属中の米国特許出願第０７
／２６９９４５号（１９８８年１１月１０日出願）の一
部継続出願である。

【０００２】

【発明の属する技術分野】この発明は、ナチュラルキラ
ー細胞およびその他の免疫系細胞の機能を刺激する新規
サイトカイン、および該因子を均質な形で入手する方
法、ならびに組換え遺伝子工学手法によってこれを生産
する方法に関するものである。

【０００３】

【従来の技術】ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は免疫系
で活性なリンパ球のサブセットであり、ヒト末梢血単核
細胞の平均１５％を占める〔Ｇ.トリンキエリ、Ｂ.ペル
ッシア、ラボラトリー・インベスティゲーション、５０
巻、４８９頁（１９８４年）〕。ヒトＮＫ細胞の同定に
使用される表面マーカーは、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片へ低
親和性で結合するＦｃ−γ−レセプターIIIまたはＣＤ
１６抗原のようなレセプターである〔Ｂ.ペルッシア
ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、１３３巻、１８
０頁（１９８４年）〕。ＮＫ細胞は、生体内で腫瘍、腫
瘍転移、ウイルス感染等の防御に重要な役割を演じ、ま
た正常および悪性造血を調節していることが証明されて
いる。

【０００４】免疫系細胞間のシグナルを伝達する調節タ
ンパク質の系統群が多数確認されてきた。これらの調節
分子はサイトカインとして知られている。多くのサイト
カイン類は、造血系および免疫系細胞の増殖、発育、お
よび生物学的活性を調節することが判明した。これらの
調節分子は、コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−Ｃ
ＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよび多能性ＣＳＦ、またはインター
ロイキン−３）、インターロイキン類（ＩＬ−１〜ＩＬ
−７）、インターフェロン類（α、βおよびγ）、腫瘍
壊死因子（αおよびβ）、および白血球遊走阻止因子
（ＬＩＦ）等のすべてを含む。これらのサイトカイン類
は、骨髄、末梢血、胎児性肝臓、およびその他のリンパ
系または造血系器官由来の標的細胞で広汎な生物活性を
示す〔例えばＧ.ウォング、Ｓ.クラーク、イムノロジー
・トゥデイ、９巻（５）、１３７頁（１９８８年）、参
照〕。

【０００５】ある種のサイトカイン類の生化学的ならび
に生物学的同定、およびその特性決定は、天然供給源、
例えば血液および尿から入手し得る天然に存在する少量
の因子によって妨害される。最近、多数のサイトカイン
類が、分子クローニングされ、異種的に発現され、均質
に精製されるようになった〔Ｄ.メトカーフ、「ザ・モ
レキュラー・バイオロジー・アンド・ファンクションズ
・オブ・ザ・グラニュロサイト・マクロファージ・コロ
ニー・スティミュレーティング・ファクターズ」、ブラ
ッド、６７巻、（２）、２５７〜２６７頁（１９８６
年）〕。これらのサイトカイン類は、γ−インターフェ
ロン、ヒトおよびマウスのＧＭ−ＣＳＦ、ヒトのＧ−Ｃ
ＳＦ、ヒトのＣＳＦ−１、およびヒトおよびマウスのＩ
Ｌ−３である。ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、
およびＩＬ−２等、精製したこれらの因子の幾つかは、
生体内で、造血系および免疫系に調節的作用を表すこと
が判明した。

【０００６】その他のタンパク質についても、天然供給
源またはその他の入手源から精製することによって、免
疫応答を刺激し、または増強することができる医薬用と
して好適な均質な形で生産する技術上の必要性がなお存
在する。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】この発明は、一態様と
して、他の哺乳動物のタンパク質を実質上含有していな
いＮＫＳＦと呼ばれる新規ヒト・ナチュラルキラー細胞
刺激因子を提供する。

【０００８】

【課題を解決するための手段】活性なＮＫＳＦは約７０
ｋｄの見掛けの分子量を有する。ＮＫＳＦの精製標品に
は２つのポリペプチドの存在が認められ、これらは、結
合すると活性なＮＫＳＦを生成するサブユニットである
と予測される。現在のところ、ＮＫＳＦは、大きいサブ
ユニットと小さいサブユニットが１またはそれ以上のジ
スルフィド結合を介して互いに結合することによって生
成したヘテロ２量体であると推定される。この見掛けの
ヘテロ２量体構造は、２つの個々のサブユニットの結合
により、あるいは例えばインスリンの場合のように、単
一の前駆体ポリペプチドのタンパク質分解による切断に
よって生じるのであろう。あるいはＮＫＳＦの活性型
は、大きい方のサブユニットのホモ２量体、または小さ
い方のサブユニットのホモ２量体である可能性もある。

【０００９】活性な約７０〜８０ｋｄのＮＫＳＦは、さ
らに後記の第Ｉ表に示したアミノ酸配列の全部または一
部を含んでいることを特徴とする。またＮＫＳＦサブユ
ニットの大きい方または小さい方のいずれかの一次配列
には、下記のアミノ酸配列（１文字略記法）の１または
それ以上が存在する。カッコ内は確実に同定できなかっ
たアミノ酸を示す。 Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｑ−Ｖ Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｎ−Ｙ−Ｔ Ｉ−Ｗ−Ｅ−Ｌ−Ｋ Ｌ−Ｍ−Ｄ−Ｐ−Ｋ Ｖ−Ｍ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ｎ−Ａ (Ａ)−Ｖ−Ｓ−Ｎ−Ｍ−Ｌ−Ｑ−Ｋ Ｎ−Ａ−Ｓ−Ｉ−Ｓ−Ｖ Ｔ−Ｆ−Ｌ−Ｒ Ｄ−Ｉ−Ｉ−Ｋ−Ｐ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｋ

【００１０】ＮＫＳＦの大きい方のサブユニットポリペ
プチドは４０ｋｄの見掛けの分子量を有することを特徴
とする。このサブユニットは、さらに下記の配列と同一
または実質上同一のアミノ末端配列を有することを特徴
とする。 Ｉ−Ｗ−Ｅ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｄ−Ｖ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｅ−Ｌ
−Ｄ−Ｗ−Ｙ−Ｐ−Ｄ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｅ−Ｍ

【００１１】この大きい方のポリペプチドは、さらに後
記の第Ｉ表に示した長いクローン化配列の全部または一
部を含んでいる特徴を有する。

【００１２】ＮＫＳＦの小さい方のポリペプチドサブユ
ニットは、約３０〜３５ｋｄの見掛けの分子量を有し、
さらに下記の配列と同一または実質上同一のアミノ末端
配列を有することを特徴とする。

【００１３】Ｘ−Ｎ−Ｌ−Ｐ−Ｖ−Ａ−(ＰまたはＸ)−
Ｐ−Ｄ−Ｐ−(ＳまたはＸ)−Ｍ−Ｆ−Ｐ ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。

【００１４】ＮＫＳＦは、試験管内で、ヒト末梢血リン
パ球（ＰＢＬｓ）によるγ−インターフェロン生産を誘
発する生物学的活性を示す。ＮＫＳＦは均質な形で、後
に詳述するようなγ−インターフェロン誘発検定で、１
mg当たり１×１０⁷希釈単位より大きい比活性を示す特
徴を有する。

【００１５】ＰＢＬｓにおけるγ−インターフェロン誘
発活性以外にも、ＮＫＳＦは、下記のように （１）ＰＢＬｓによる顆粒球−マクロファージコロニー
刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）誘発検定における生物学的活
性、（２）白血病細胞および腫瘍由来細胞を致死させる
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化する生物学的活
性、（３）フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）活性化Ｔリ
ンパ球による腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）誘発検定における
生物学的活性、（４）末梢血Ｔリンパ球のマイトジェン
誘起作用等の生物学的活性を示す。

【００１６】この発明はもう一つの態様として、ヒトＮ
ＫＳＦポリペプチド、およびヒトＮＫＳＦの大きい方の
サブユニットポリペプチドおよびヒトＮＫＳＦの小さい
方のサブユニットポリペプチド発現を暗号化しているｃ
ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を提供する。そのような配
列は、上記の１またはそれ以上のサブユニットおよびペ
プチド配列を暗号化しているヌクレオチド配列を含んで
いる。

【００１７】この発明はまた、発現調節配列と機能的に
結合させたＮＫＳＦまたはＮＫＳＦサブユニットを暗号
化しているＤＮＡ配列を含んでいるベクターを提供す
る。またこの発明は、組換え体ＮＫＳＦまたはその組換
え体サブユニットの生産に使用するため、そのようなベ
クターで形質転換した宿主細胞を提供する。

【００１８】またこの発明は、組換え体ＮＫＳＦタンパ
ク質を提供する。このタンパク質は他の哺乳動物のタン
パク質様物質を含有せず、上記の物理的、生化学的、ま
たは生物学的な活性または形質の１またはそれ以上を含
有する、１またはそれ以上の上記のサブユニットまたは
ペプチド断片を暗号化しているＤＮＡ配列の存在によっ
て特徴付けられる。

【００１９】この発明のもう一つの態様は、均質または
組換え体ＮＫＳＦの治療的有効量、またはＮＫＳＦサブ
ユニットの一方または双方、またはそのペプチド断片の
１またはそれ以上の有効量を含有してなる医薬組成物を
提供する。これらの医薬組成物は、γ−インターフェロ
ンおよびＧＭ−ＣＳＦ産生が昂進している状態が存在す
ることに起因するガンおよびその他の疾患状態の処置方
法に使用される。すなわちこの因子は、一般に造血細胞
数またはその活性水準の欠乏を特徴とする疾患の処置に
使用される。

【００２０】したがってこの発明は、もう一つの態様と
して、好適な医薬担体とともに、ＮＫＳＦ、またはその
サブユニットの一方または双方、またはそのペプチド断
片の治療的有効量を患者に投与することにより、ナチュ
ラルキラー細胞機能の増強によって効果が期待できるガ
ンおよび／またはその他の病的状態を処置する方法を提
供する。これらの治療方法は、ＮＫＳＦ、またはそのサ
ブユニット、またはそのペプチド断片の１またはそれ以
上とともに、少なくとも１種類のその他のサイトカイ
ン、造血促進因子、インターロイキン、成長因子、また
は抗体の有効量を、同時または順次に投与することを包
含し得る。

【００２１】この発明はまた、ＮＫＳＦ、またはそのサ
ブユニットを産生するヒト細胞系を他のタンパク質およ
びポリペプチドと混合することによって、それらの細胞
系から均質なＮＫＳＦ、またはそのサブユニットを生産
する方法を提供する。この発明が提供するこの生産方法
は、ＮＫＳＦ、そのサブユニット、またはそのペプチド
断片産生能を有する選ばれた細胞を培養して、ならし培
地を得、５段階の基本的な精製段階を経てこのならし培
地を精製することからなる。

【００２２】この発明は、もう一つの態様として、組換
え体ヒトＮＫＳＦタンパク質、そのサブユニット、また
はそのペプチド断片を生産する新規プロセスにベクター
および形質転換細胞を使用する。このプロセスでは、発
現ＮＫＳＦタンパク質、そのサブユニット、またはその
ペプチド断片を暗号化しているＤＮＡ配列で形質転換し
た細胞系をその発現調節配列と機能可能に組合わせて培
養する。上記のプロセスでは、ポリペプチド発現のため
の宿主細胞として、多数の既知細胞を使用し得る。現
在、好ましい細胞系は、哺乳動物細胞系および細菌細胞
である。

【００２３】この発明のその他の態様および有利性は、
以下の好ましい実施態様に関する詳細な説明を見れば明
らかである。

【００２４】

【発明の実施の形態】この発明が提供する新規ヒトナチ
ュラルキラー細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）は、他の哺乳動
物のタンパク質様物質を実質上伴っていない均質なタン
パク質またはタンパク質様組成物である。

【００２５】ナチュラルキラー細胞刺激因子は、ドデシ
ル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）で非還元条件下に測定した約７０〜８
０ｋｄの見掛けの分子量を有する。この７０〜８０ｋｄ
のペプチドは、γ−インターフェロン誘発検定で有効で
ある。

【００２６】この７０〜８０ｋｄバンドは、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで還元条件下に４０ｋｄ（大きい方のサブユニッ
ト）および約３０〜３５ｋｄ（小さい方のサブユニッ
ト）の見掛けの分子量を有する２つの小サブユニットを
生じる。どちらのサブユニットとも、同一のγ−インタ
ーフェロン誘発検定による生物学的活性で、天然の７０
〜８０ｋｄ種の活性に比較して実質的に低下する。４０
ｋｄに低下した種および３０〜３５ｋｄに低下した種か
ら、上述のように同定したアミノ末端配列が測定され、
したがって、これらは前記のＮＫＳＦヘテロ２量体のサ
ブユニットであると考えられる。現在、ＮＫＳＦは、大
きい方のサブユニットと小さい方のサブユニットがジス
ルフィド結合したヘテロ２量体であると考えられる。

【００２７】ＮＫＳＦは、少なくとも一部、陰イオン性
の糖タンパク質である。等電点電気泳動により、ＮＫＳ
Ｆの２つの種は４.３および４.８の等電点を有すること
が認められる。現在、２つの種は糖鎖形成パターンを異
にしているものと推測される。

【００２８】ＮＫＳＦは、まず実施例８で詳細に説明す
るγ−インターフェロン誘発検定で生物学的活性を有す
る特徴を有する。その他の活性としては、ヒト末梢血リ
ンパ球によるＧＭ−ＣＳＦ産生誘発能が挙げられる（Ｇ
Ｍ−ＣＳＦに関する追加的な情報は、例えば公開された
ＰＣＴ出願ＷＯ８６／００６３９参照）。またＮＫＳＦ
は、末梢血Ｔリンパ球に対するレクチンおよびホルボー
ルジエステルのような各種マイトジェンの分裂促進活性
に対して増強効果を有し、また活性化されたヒト扁桃Ｂ
細胞に対する増殖促進効果を有する。

【００２９】またＮＫＳＦは、自然細胞障害検定および
抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）検定により、試験管内
で白血病細胞および腫瘍由来細胞を致死させるＮＫ細胞
の機能を増強することが認められた。

【００３０】自然細胞障害検定について簡単に付言すれ
ば、ＮＫＳＦの存在でヒト末梢血リンパ球または精製し
たＮＫ細胞を８〜１８時間インキュベートする。ついで
標準的な⁵¹Ｃｒ−放出検定を用いて、リンパ球およびＮ
Ｋ細胞を、白血病細胞系、腫瘍由来細胞系またはウイル
ス感染繊維芽細胞のような標的細胞を溶解する細胞溶解
能について検定する。ＮＫＳＦは、ＮＫ細胞細胞障害活
性の既知の活性化因子であるインターフェロンαおよび
ＩＬ−２で得られた成績に匹敵する水準で、そのような
標的細胞を溶解するＮＫ細胞の溶解能を劇的に増強する
〔例えばＧ.トリンキエリら、ジャーナル・オブ・エキ
スペリメンタル・メディシン、１４７巻、１３１４頁
（１９７８年）、およびＧ.トリンキエリら、ジャーナ
ル・オブ・エキスペリメンタル・メディシン、１６０
巻、１１４６頁（１９８４年）、参照〕。

【００３１】ＡＤＣＣ検定では、ＮＫ細胞のＦｃレセプ
ターに対して結合能を有する抗体（例えばＩｇＧ_2a、Ｉ
ｇＧ₃等）で標的ガン細胞を被覆する。予備的なＡＤＣ
Ｃ検定で、ＮＫＳＦの存在は、被覆した腫瘍細胞に対す
るＮＫ細胞の細胞致死活性を増強するようである〔例え
ば、Ｌ.Ｍ.ワイナーら、キャンサー・リサーチ、４８
巻、２５６８〜２５７３頁（１９８８年）、Ｐ.ハーゼ
イら、キャンサー・リサーチ、４６巻、６０８３〜６０
９０頁（１９８８年）、ＡＤＣＣに関する追加的な情報
は、Ｃ.Ｊ.ハンシクら、プロシーディングズ・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ
・ザ・ＵＳＡ、８３巻、７８９３〜９７頁（１９８６
年）参照〕。

【００３２】ビーズ結合したヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体（抗
−μ）で刺激した正常なヒトＢ細胞を使用するＢ細胞増
殖因子検定におけるＮＫＳＦの予備的な分析で、ＮＫＳ
Ｆは、Ｂ細胞増殖因子活性を示す特徴を有する。この検
定で、Ｂ細胞表面上のＩｇＭ免疫グロブリンに対する抗
体は、Ｂ細胞を活性化してＢ細胞増殖因子と反応を起こ
させる〔Ｃ−ＴＫ.ツェングら、ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー、１４０巻、２３０５〜２３１１頁（１９８
８年）〕。そのような抗体は商業的に入手し得る。

【００３３】ＮＫＳＦは、リンホカイン混合物を産生す
る商業的に入手可能な細胞系であるヒト細胞系ＲＰＭＩ
８８６６（ユニバーシティー・オブ・ペンシルバニア・
セル・センター）のならし培地で最初に検出された。ま
たこの因子は、他のエプスタイン−バーウイルスで形質
転換したリンパ芽球様細胞系、またはその他のヒト細胞
系からも生産され得る。天然にＮＫＳＦを産生する細胞
からこれを得るために採用する精製技術では、下記の段
階を用いる。これらの段階は、例えばＱＡＥゼータ調製
用カートリッジ（ＬＫＢファルマケア社）のようなイオ
ン交換カラムによる精製を含み、これによってＮＫＳＦ
タンパク質が陰イオン性であることが分かる。第２の精
製段階は、レンチル−レクチンカラムであり、このこと
は、ＮＫＳＦが少なくとも一部糖タンパク質であること
を示している。レンチル−レクチンカラムからの溶出物
を、さらにヒドロキシルアパタイトカラムへ通し、つづ
いてヘパリン−セファロースカラムおよび高速タンパク
質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）モノＱカラムで
精製する。ＲＰＭＩ８８６６から得られたＮＫＳＦは、
後段の３つのカラムからそれぞれ単一のピークとして溶
出した。残存する約３７ｋｄのタンパク質混入物を、ゲ
ル濾過クロマトグラフィー単独または逆層ＨＰＬＣおよ
びゲル濾過クロマトグラフィーによって除去する。精製
して得られた均質なＮＫＳＦを、実施例８に示したγ−
インターフェロン誘発検定によって生物学的活性を検定
し、１mg当たり１×１０⁷希釈単位より大きい比活性を
証明した。

【００３４】すなわち実施例２で詳細に説明するが、Ｒ
ＰＭＩ８８６６のならし培地、またはその他のヒトＮＫ
ＳＦ供給源へ、上記の精製手段を適用することによって
均質なＮＫＳＦを入手し得る。ＲＰＭＩ８８６６細胞系
は該因子を自然に産生し得るが、細胞系をホルボールジ
ブチレートのようなホルボールエステル類で処理するこ
とによって生産水準を増強することができる。細胞は４
８時間血清が存在しなくても、なおＮＫＳＦを他のリン
ホカインと一緒に産生する。ＲＰＭＩ８８６６（実施例
１参照）またはその他のＮＫＳＦ供給源細胞の培養方法
は、当業界で既知の方法である。

【００３５】ＮＫＳＦ、またはそのサブユニットの一方
または双方、またはそのペプチドは、組換え技術によっ
ても生産し得る。クローン化したＮＫＳＦ、またはその
サブユニットの一方または双方のためのＤＮＡ配列を得
るため、均質なポリペプチドのトリプシン消化物を調製
する。例えばＮＫＳＦのサブユニットで認められた９種
類のトリプシン消化物では、下記の Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｑ−Ｖ Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｎ−Ｙ−Ｔ Ｌ−Ｍ−Ｄ−Ｐ−Ｋ Ｉ−Ｗ−Ｅ−Ｌ−Ｋ Ｖ−Ｍ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ｎ−Ａ (Ａ)−Ｖ−Ｓ−Ｎ−Ｍ−Ｌ−Ｑ−Ｋ Ｎ−Ａ−Ｓ−Ｉ−Ｓ−Ｖ Ｔ−Ｆ−Ｌ−Ｒ Ｄ−Ｉ−Ｉ−Ｋ−Ｐ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｋ が同定される。またＮＫＳＦの大きい方のサブユニット
および小さい方のサブユニットのアミノ末端配列は前述
のように同定した。

【００３６】ＮＫＳＦのこれらのトリプシン消化生産物
のアミノ酸配列を暗号化している可能性のあるすべての
配列を予測した遺伝暗号を用いて、オリゴヌクレオチド
プローブを合成する。さらにこれと同じ方法を用いて、
上述のように同定したＮＫＳＦの２つのサブユニットの
アミノ末端配列からプローブを組立て得る。これらのプ
ローブを使用してＮＫＳＦ遺伝子またはサブユニット遺
伝子を同定し、ヒトゲノムライブラリーを選別すること
ができる。別法として、ＲＰＭＩ８８６６またはＮＫＳ
Ｆのその他の細胞供給源からのｍＲＮＡを使用してｃＤ
ＮＡライブラリーを作成し、これをプローブで選別し
て、ＮＫＳＦポリペプチド、または大きいサブユニット
および小さいサブユニットのポリペプチドを暗号化して
いるｃＤＮＡを同定することができる。ｃＤＮＡを同定
したら、それらを各種の発現ベクターの任意の一つへ同
時導入し、ＮＫＳＦ、または一方または双方のサブユニ
ットの発現系を作成することができる。

【００３７】そのような組換え技術を用いることによっ
て、ＮＫＳＦポリペプチド、またはその大きいおよび／
または小さいサブユニットのポリペプチドを暗号化して
いるＤＮＡ配列を得る。これらの配列はトリプシン消化
断片、または前述のようにして同定したアミノ末端配列
の１またはそれ以上を暗号化したＤＮＡ配列を含んでい
る。

【００３８】ｐＮＫ−６と命名したそのようなＮＫＳＦ
クローンの一つは、少なくとも下記のＤＮＡおよびアミ
ノ酸配列を有し、大きい方のＮＫＳＦサブユニットの全
部または一部を暗号化している。

【００３９】

【表１】

【表２】

【００４０】プラスミドｐＮＫ−６でクローン化したこ
の配列は、ブダペスト条約に基づく国際寄託の寄託番号
４０５４５のもとに、ジ・アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（１２３０１、パークローン・ドラ
イブ、ロックビル、マリーランド）へ１９８９年２月３
日に寄託した。追加的なクローン体が得られ、これらが
配列決定されれば、ＮＫＳＦの大きい方のサブユニット
および／または小さい方のサブユニットの配列のカルボ
キシ末端配列を提供することが期待される。

【００４１】また前記のペプチド配列および大きい方の
サブユニットを暗号化しているＤＮＡ配列の対立遺伝的
変異体、およびその類似体または誘導体もこの発明に包
含される。

【００４２】すなわち、この発明は、他の霊長類タンパ
ク質を暗号化しているＤＮＡ配列を全く伴わず、ＮＫＳ
Ｆの大きいサブユニットおよび小さいサブユニットを含
め、ＮＫＳＦポリペプチドの発現を暗号化している新規
ＤＮＡ配列を包含する。これらのＤＮＡ配列は、上記の
同定されたＤＮＡ、およびペプチド配列、およびそれら
の配列を緊縮ハイブリッド形成条件下に〔Ｔ.マニアテ
ィスら、モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリ
ー・マニュアル）、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー（１９８２年）、３８７〜３８９頁参
照〕、ＤＮＡ配列へハイブリッド形成した１またはそれ
以上を含んでいるＤＮＡ配列である。そのような緊縮ハ
イブリッド形成条件の１例を示せば、４×ＳＳＣで６５
℃でハイブリッド形成し、ついでこれを０.１×ＳＳＣ
で６５℃で１時間洗浄する。別の緊縮ハイブリッド形成
条件を例示すれば、５０％ホルムアミド中、４×ＳＳＣ
で４２℃で行う。

【００４３】また緩和条件下に、その配列へＮＫＳＦま
たはそのサブユニットをハイブリッド形成し、ＮＫＳＦ
生物学的特性を有するＮＫＳＦペプチドの発現を暗号化
しているＤＮＡ配列も、新規ＮＫＳＦポリペプチドを暗
号化している。そのような非緊縮ハイブリッド形成条件
の例は、４×ＳＳＣで５０℃、または３０〜４０％ホル
ムアミドで４２℃でハイブリッド形成する。例えばＮＫ
ＳＦの配列と有意な相同領域（例えば、グリコシル化部
位またはジスルフィド結合）を共有し、１またはそれ以
上のＮＫＳＦ生物学的特性を有するタンパク質を暗号化
しているＤＮＡ配列は、たとえそのようなＤＮＡ配列が
ＮＫＳＦ配列へ緊縮ハイブリッド形成しないとしても、
明らかにＮＫＳＦポリペプチドを暗号化している。

【００４４】同様にＮＫＳＦ配列によって暗号化された
ＮＫＳＦポリペプチドを暗号化し、ただし遺伝暗号の縮
重または対立遺伝的変異体のために、コドン配列を異に
するＤＮＡ配列（アミノ酸変化をもたらし、またはもた
らし得ない種集団に天然に存在する塩基変化）もまたこ
の発明に包含される。点突然変異により、あるいは活
性、半減期、または暗号化されたポリペプチドの生産を
増強するために誘導された修飾によって生じたＮＫＳＦ
のＤＮＡ配列における変異体もまたこの発明に包含され
る。

【００４５】またＮＫＳＦポリペプチドは、既知の通常
の化学合成によっても生産し得る。合成手段によるこの
発明のポリペプチドの組立て方法は、当業界で既知の技
術である。合成的に組立てられたＮＫＳＦポリペプチド
配列は、１次、２次、もしくは３次構造およびコンホー
メーション上の特徴をＮＫＳＦポリペプチドと共有して
いるから、ＮＫＳＦと共通の生物学的特性を有し得る。
すなわち、これらは生物学的有効物質として、または免
疫学的代替物として天然の精製したＮＫＳＦポリペプチ
ドの代わりに治療的および免疫学的処理に使用し得る。

【００４６】また本明細書で提供するＮＫＳＦは、精製
した均質な組換え体ＮＫＳＦタンパク質、またはサブユ
ニットポリペプチドの配列と類似し、ただし天然に修飾
され、または意図的に操作して修飾を加えた配列によっ
て暗号化された因子を含む。

【００４７】ペプチドまたはＤＮＡ配列における修飾は
当業界で既知の技術により実施できる。ＮＫＳＦ配列に
おける重要な修飾は、暗号配列中の選ばれたアミノ酸残
基の置換、挿入または欠失を含み得る。そのような置
換、挿入または欠失のための突然変異手法は当業界で既
知のものである（例えば、米国特許第４５１８５８４
号、参照）。

【００４８】本明細書で報告するＮＫＳＦポリペプチド
またはサブユニットポリペプチド配列のその他の特殊な
突然変異は、糖鎖結合部位の修飾を含み得る。グリコシ
ル化が存在せず、または一部だけがグリコシル化された
状態は、アスパラギン連鎖した任意のグリコシル化認識
部位またはＯ−連鎖した炭化水素の付加によって修飾さ
れた任意の分子部位のアミノ酸置換または欠失によりも
たらされる。アスパラギン連鎖したグリコシル化認識部
位は、好適な細胞性グリコシル化酵素によって特異的に
認識されるトリペプチド配列からなる。これらのトリペ
プチド配列は、アスパラギン−Ｘ−スレオニンまたはア
スパラギン−Ｘ−セリン（ここでＸは通常任意のアミノ
酸である）のいずれかである。グリコシル化認識部位の
１番目または３番目のアミノ酸位置の一方または双方に
おけるさまざまなアミノ酸置換または欠失（そして／ま
たは２番目の位置のアミノ酸欠失）は、修飾されたトリ
ペプチド配列に非グリコシル化をもたらす。

【００４９】そのように変化したヌクレオチド配列を発
現すると、その位置でグリコシル化されていない変異体
が生産される。

【００５０】ＮＫＳＦ活性の全部または一部を保有して
いると期待され得るＮＫＳＦまたはそのサブユニットの
配列のその他の類似体または誘導体も、当業者であれば
この発明の報告によって容易に作成し得る。そのような
修飾の１つは、存在するリシン残基へのポリエチレング
リコールの付着、または付着を可能にするリシン残基の
通常の技術による配列への挿入であり得る。そのような
修飾もこの発明の範囲に包含される。

【００５１】この発明はまた、ＮＫＳＦポリペプチドの
生産方法を提供する。この発明の方法は、既知の調節配
列の制御下に、サブユニットポリペプチドを含め、ＮＫ
ＳＦポリペプチドの発現を暗号化しているＤＮＡ配列で
形質転換した、好適な細胞または細胞系の培養を含む。
好適な細胞または細胞系は、チャイニーズハムスター卵
巣細胞（ＣＨＯ）または３Ｔ３細胞のような哺乳動物細
胞であり得る。好適な哺乳動物宿主細胞の選択、および
形質転換、培養、増強、選別、および生産物の生産なら
びに精製方法は、当業界で既知のものである〔例えば、
ゲッシングおよびサムブルック、ネーチャー、２９３
巻、６２０〜６２５頁（１９８１年）、または別法とし
てカウフマンら、モレキュラー・アンド・セルラー・バ
イオロジー、５巻（７）、１７５０〜１７５９頁（１９
８５年）、またはハウレイら、米国特許第４４１９４４
６号、参照〕。２つの異なったｃＤＮＡをＣＨＯ細胞で
同時発現する方法は、例えば公開されたＰＣＴ国際特許
出願ＷＯ８８／０８０３５に報告されている。その他の
好適な哺乳動物細胞系は、サルＣＯＳ−１細胞系、およ
びウイスター・インスティチュート（フィラデルフィ
ア、ペンシルバニア）で最初に開発されたＣＶ−１細胞
系である。

【００５２】同様にこの発明に好適な宿主細胞系として
有用なものは、細菌性細胞である。例えばエシェリキア
・コリの多数の株（例えばＨＢ１０１、ＭＣ１０６１、
および後述の実施例に使用した株）はバイオテクノロジ
ーの分野で宿主として既知のものである。バシラス・サ
ブチリス、シュードモナス、およびその他の桿菌類等の
多数の株もこの発明に使用し得る。

【００５３】当業界で既知である酵母細胞の多数の株も
この発明のポリペプチド発現のための宿主細胞として入
手可能である。また所望により、昆虫細胞もこの発明の
方法の宿主細胞として利用し得る〔例えば、ミラーら、
ジェネティック・エンジニアリング、８巻、２７７〜２
９８頁（プレナム・プレス社、１９８６年）、参照〕。

【００５４】この発明はまた、新規ＮＫＳＦポリペプチ
ドを発現する方法に使用するベクター類を提供する。こ
れらのベクターは、サブユニットポリペプチドを含め、
ＮＫＳＦポリペプチドを暗号化している新規ＮＫＳＦの
ＤＮＡ配列を含んでいる。別法として、前述のように修
飾した配列を挿入したベクターもまたこの発明の実施態
様であり、ＮＫＳＦポリペプチドの生産に有用である。
この方法に使用するベクター類も、この発明のＤＮＡ暗
号配列と機能的に組合わせて、選ばれた宿主細胞での複
製および発現を指令し得る選ばれた調節配列を含んでい
る。

【００５５】このように細胞供給源から均質に精製さ
れ、あるいは組換え技術または合成的に生産されたＮＫ
ＳＦは、ＮＫ細胞活性の増強またはγ−インターフェロ
ンまたはＧＭ−ＣＳＦの生体内生産の増大に反応するガ
ンまたはその他の疾患状態を処置する医療用調製品また
は医薬製剤として使用し得る。そのような病的状態は、
疾病、放射線照射または薬物投与によって発生し、例え
ば、白血球減少、細菌またはウイルスによる感染、貧
血、骨髄移植に伴う免疫細胞または造血細胞欠乏を含む
Ｂ細胞またはＴ細胞欠乏等が挙げられる。これらのＮＫ
ＳＦポリペプチド組成物によるガンおよびその他の疾患
の治療的処置は、今日入手可能な薬物処置によって起こ
る不快な副作用を回避し得る。

【００５６】またＮＫＳＦのサブユニットポリペプチド
の一方または双方、またはそのペプチド断片をそのよう
な医薬製剤に使用することも可能であり得る。

【００５７】またこの発明のポリペプチド類は、単独ま
たは他のサイトカイン類、造血促進因子類、インターロ
イキン類、成長因子類、または抗体と組合わせてガンま
たはその他の疾患状態の処置に使用し得る。これらの新
規ポリペプチド類のその他の用途は、診断または治療的
用途のため、標準的な方法によって生じるモノクローナ
ル抗体およびポリクローナル抗体の開発である。

【００５８】したがってこの発明のもう一つの態様とし
て、上述の状態を処置するための方法および治療的組成
物を提供する。そのような組成物は、この発明のＮＫＳ
Ｆタンパク質またはサブユニットポリペプチドの治療的
有効量、またはその断片の治療的有効量を製薬上許容し
得る担体と混合して含有する。この組成物は非経口的に
全身投与することができる。別法として、組成物を静脈
内に投与し得る。また所望により、組成物を皮下投与し
得る。全身投与する場合、この発明に使用する治療的組
成物は、発熱物質を含有しない非経口的に許容し得る水
溶液形態をとる。ｐＨ、等張性、安定性等の点を十分考
慮したそのような製薬上許容し得るタンパク質の溶液製
剤は当業界で周知のものである。

【００５９】上述の状態を処置する方法に組込まれる投
与計画は、薬物の作用を修飾する各種の要素、例えば病
状、体重、患者の性別および規定食、感染の重篤度、投
与時間、その他、臨床的な要素を考慮して、主治医によ
り決定される。１日の投与計画は、一般にＮＫＳＦタン
パク質またはそのサブユニット１〜１０００μg、また
は体重１kg当たりタンパク質５０〜５０００単位（１単
位／mlはγ−インターフェロン誘発検定で５０％最大刺
激をもたらすタンパク質濃度を表す）であるべきであ
る。

【００６０】またこの発明の治療方法および組成物は、
その他のヒトの因子との併用を含み得る。そのような用
途のための代表的なサイトカイン類および造血促進因子
類は、特にＩＬ−１、ＩＬ−２、およびＩＬ−６等であ
る（例えばＰＣＴ公開ＷＯ８５／０５１２４、ＷＯ８８
／００２０６、およびヨーロッパ特許出願第０１８８８
６４号、参照）。ＮＫＳＦ治療に加え得るその他の可能
性ある候補は、ＩＬ−４、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、またはエリスロポエチンであ
る。またＢ細胞増殖因子、Ｂ細胞分化因子、または好酸
球分化因子のような増殖因子類も、ＮＫＳＦと併用する
のに有用であり得る。

【００６１】これと同様に、ＮＫ細胞のＦｃレセプター
への結合能を有する抗体の投与と一緒にまたはその前
に、ＮＫＳＦまたはそのサブユニットまたはその断片を
投与することは、腫瘍に対するＡＤＣＣ療法を増強し得
る。その場合の投与量は、治療用組成物中のそのような
追加成分の量を考慮して調節すべきである。処置患者の
経過は通常の方法によって監視することができる。

【００６２】以下に実施例を挙げて、この発明の均質な
ヒトＮＫＳＦの精製および特性決定、およびその他の方
法および生産物について例示的に説明する。これらの実
施例は発明を説明するためのものであって、発明の範囲
を限定する目的をもつものではない。

【００６３】

【実施例】実施例１ 無血清ＲＰＭＩ８８６６細胞のならし培地の調製 加熱失活させた５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する
ＲＰＭＩ１６４０培地で、ヒトＢリンパ芽球様細胞系Ｒ
ＰＭＩ８８６６を維持した。無血清ならし培地を調製す
るには、細胞を洗浄し、これを１０^-7Ｍホルボール−１
２−１３−ジブチレート（ＰｄＢＵ）を含有する無血清
ＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊し（１０⁶細胞／ml）、５
％ＣＯ₂気流中で３７℃で４８時間培養した。０.２μm
フィルター〔デュラポア（商標）親水性カートリッジ型
フィルター、ミリポアー社、ベッドフォード、ＭＡ〕濾
過によって無細胞上清を回収し、ツイーン−２０および
フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を、
それぞれ０.０２％および０.１ｍＭずつ添加した。つい
で細胞ならし培地を、限外濾過カートリッジ（スパイラ
ル−ウーンド、Ｓ１、アミコン社、ダンバーズ、ＭＡ）
を使用して減圧下に５０倍濃縮した。

【００６４】実施例２ ＮＫＳＦのならし培地からの精製 下記の方法は、実施例１で報告したＲＰＭＩ８８６６な
らし培地から均質なＮＫＳＦタンパク質を得るため、現
在使用されているものである。

【００６５】ａ.アニオン交換カートリッジ−クロマト
グラフィー 粗製の濃縮ならし培地２リットルを、伝導率が６m Os／
cmとなるまで蒸留水で希釈して、１Ｍトリス−ＨＣl緩
衝液（ｐＨ８）でｐＨ８に調節した。ついで並列に連結
し、０.１Ｍトリス−ＨＣl緩衝液（ｐＨ８）で流速１５
０ml／分で予め平衡化したＱＡＥゼータプレプ２５０型
カートリッジ（ファルマシア社）５個へ、濃縮物を適用
した。特に説明しない場合、精製に使用したすべての緩
衝液は０.０２％ツイーン−２０および０.１ｍＭ ＰＭ
ＳＦを含有している。カートリッジを０.１Ｍトリス−
ＨＣl緩衝液（ｐＨ６.８）３リットルで洗浄し、ついで
０.５Ｍ ＮａＣlを含有する０.１Ｍトリス−ＨＣl緩衝
液（ｐＨ６.８）１.５リットルで洗浄して、画分３００
mlを採取した。ＮＫＳＦ活性を０.５Ｍ ＮａＣlを含有
する洗浄液で溶出した。

【００６６】ｂ. レンチル−レクチンセファロース−ク
ロマトグラフィー ２回分のＱＡＥゼータプレプ溶出液から得たＮＫＳＦ含
有画分を合わせて、２０ｍＭトリス−ＨＣl緩衝液（ｐ
Ｈ７.２）で平衡化したレンチル−レクチンセファロー
ス４Ｂ（ファルマシア社）のカラム（２.５×１５cm）
へ直接適用した。平衡化緩衝液５カラム容量で洗浄した
のち、０.２Ｍ α−メチル−Ｄ−マンノピラノシド（シ
グマ社）および０.５Ｍ ＮａＣlを含有する２０ｍＭト
リス−ＨＣl緩衝液（ｐＨ７.２）３カラム容量でカラム
を溶出した。ＮＫＳＦ活性の約１／２がカラムに結合
し、α−メチル−Ｄ−マンノピラノシドで溶出した画分
に回収された。

【００６７】ｃ. ヒドロキシルアパタイト−クロマトグ
ラフィー レンチル−レクチンセファロースカラムへ結合したＮＫ
ＳＦ活性プールから濃縮した物質を、０.１ｍＭ ＣａＣ
l₂および０.１５ＭＮａＣlを含有する１ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ６.８）に対して透析し、０.１ｍＭ
ＣａＣl₂を含有する１ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
６.８）で予め平衡化したバイオゲルＨＴ（バイオラド
社）カラム（２×５cm）へ適用した。平衡化緩衝液５カ
ラム容量でカラムを洗浄し、０.１５Ｍ ＮａＣlを含有
するリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６.８）の１ｍＭ−４
００ｍＭ直線濃度勾配１００mlで溶出した。画分４mlを
採取し、ＮＫＳＦ活性を試験した。リン酸カリウム約２
００ｍＭ−３００ｍＭの画分で、カラムから単一の活性
ピークとして得られた。

【００６８】ｄ. ヘパリン−セファロース−クロマトグ
ラフィー バイオゲルＨＴカラムから溶出したＮＫＳＦ含有画分を
合わせて２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.
２）に対して透析し、ヘパリン−セファロース（ピアス
社、ロックフォード、ＩＬ）カラム（１×１０cm）へ適
用した。２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.
２）５カラム容量でカラムを洗浄し、１Ｍ ＮａＣlを含
有するこれと同じ緩衝液で溶出した。画分３mlを採取
し、ＮＫＳＦ活性を測定した。本質的にすべての活性を
ヘパリンカラムで結合して、１Ｍ ＮａＣl洗浄で回収さ
れた。

【００６９】ｅ. モノＱ−クロマトグラフィー ヘパリンセファロースカラムからプールした画分を、１
％エチレングリコールおよび０.１ｍＭ ＰＭＳＦを含有
する（ただしツイーン−２０を含有せず）２０ｍＭトリ
ス−ＨＣl緩衝液（ｐＨ６.８）（バッファーＡ）に対し
て透析し、ＹＭ１０メンブランを備えた撹拌セル（アミ
コン社）で２mlに濃縮した。試料をモノＱ（５／５）カ
ラム（ファルマシア社−ＦＰＬＣアパラタス部門）へ適
用し、バッファーＡ（ｐＨ６.８）の０Ｍ−１Ｍ ＮａＣ
l直線濃度勾配溶液で溶出した。画分０.５mlを採取しＮ
ＫＳＦ活性を試験した。活性は約２２０ｍＭ−２７０ｍ
Ｍ ＮａＣlの画分で単一のピークとして認められた。

【００７０】ｆ. ゲル濾過クロマトグラフィー モノＱカラムからプールしＮＫＳＦ活性を含有する画分
をスピードバック・コンセントレーター（サバント社、
ファーミングデール、ＮＹ）で１００μlに濃縮し、こ
れをＦＰＬＣスーパーローズ１２カラムへ適用した。
０.１５Ｍ ＮａＣl、１％エチレングリコール、０.１ｍ
Ｍ ＰＭＳＦを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７.２）でクロマトグラフィーを実施した。流
速を０.６ml／分とし、画分０.５mlを採取した。約３７
ｋｄのタンパク質混入物からＮＫＳＦタンパク質（７０
ｋｄ）を分離した。

【００７１】別法として、プールしたモノＱ画分を、上
記の（ｆ）段階の前に逆層ＨＰＬＣ（ｃ８カラム）へ掛
けて、活性な７０ｋｄタンパク質からタンパク質混入物
を分離し得る。

【００７２】実施例３ ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動 ラエムリの方法〔Ｕ.Ｋ.ラエムリ、ネーチチャー、２２
７巻、６８０〜６８５頁（１９７０年）〕にしたがい、
１０％アクリルアミド板状ゲル（厚さ０.７５mm）を使
用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。電気泳動ののち、
銀染色試薬（バイオラド）を使用する銀−硝酸塩法によ
ってゲルを染色するか、あるいは２mmのスライスとして
これを切り出し、ＲＰＭＩ培地０.５mlで２４℃で４時
間溶出して、ＮＫＳＦ活性について検定した。標準タン
パク質、ホスホリパーゼｂ（９４ｋｄ）、ウシ血清アル
ブミン（６７ｋｄ）、オボアルブミン（４３ｋｄ）、カ
ルボニックアンヒドラーゼ（３０ｋｄ）、大豆トリプシ
ンインヒビター（２０ｋｄ）、およびラクトアルブミン
（１４.４ｋｄ）によって見掛けの分子量を測定した。

【００７３】ＮＫＳＦ活性の前に溶出する数種の画分で
開始し、活性画分を通じてずっと連続し、ＮＫＳＦ活性
ピークの後に溶出する画分で終了するモノＱカラム画分
（実施例２、(ｅ)段階）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還
元条件）から、２つのタンパク質（７０ｋｄおよび３７
ｋｄ）の存在が、各種のモノＱ画分におけるＮＫＳＦ活
性の存在と相関していることが判明した。別の非還元ゲ
ルで活性画分を泳動させ、７０ｋｄおよび３７ｋｄバン
ドに対応する領域からタンパク質を溶出して、ＮＫＳＦ
活性を試験した。活性はすべて７０ｋｄ種と対応してお
り、このタンパク質がＮＫＳＦであることが明らかにな
った。

【００７４】７０ｋｄ種をゲルから溶出し、クロラミン
Ｔ（シグマ社、セントルイス、ＭＯ）を使用してこれを
ヨウ素化し、還元剤β−メルカプトエタノールの存在
（１０％）で２分間沸騰させたのち、別のＳＤＳゲルで
再び泳動を行った。これらの条件下で、７０ｋｄ種は分
子量４０ｋｄおよび３０ｋｄの２つの明瞭なサブユニッ
トに分解し、この事実は、天然のＮＫＳＦがこれらのサ
ブユニットポリペプチドのジスルフィド結合したヘテロ
２量体であり得ることを示している。あるいはＮＫＳＦ
は、大きい方のサブユニットまたは小さい方のサブユニ
ットの集合体によって生成された２量体であり得る。天
然の７０ｋｄ ＮＫＳＦの還元は、γ−インターフェロ
ンの末梢血リンパ球産生を誘発するＮＫＳＦの誘発能を
すべて破壊するようである。

【００７５】実施例４ タンパク質の回収 ＲＰＭＩ８８６６の無細胞ならし培地５００リットルか
ら出発して、モノＱカラムからプールした目的の活性画
分は、同一ゲルで並行して分析した対照タンパク質の銀
染色強度から算定して、タンパク質約１０μgを含有し
ていた。この約６μgが７０ｋｄ ＮＫＳＦタンパク質に
対応した。算定された７０ｋｄ ＮＫＳＦの比活性は１
×１０⁷単位／mgであった。標品中のＮＫＳＦ活性の通
算回収率は２％であった。

【００７６】実施例５ ＮＫＳＦタンパク質組成 上記のＳＤＳ−ＰＡＧＥ実施例で報告したように、均質
なＮＫＳＦを還元し、トリプシンで消化した。別法とし
て非還元ＮＫＳＦを逆層ＨＰＬＣカラムから得て、トリ
プシンで消化し得る。下記のアミノ酸配列を有する９種
類のトリプシン消化断片を単離した（カッコ内は仮に同
定したアミノ酸）。 断片１ − Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｑ−Ｖ 断片２ − Ｌ−Ｍ−Ｄ−Ｐ−Ｋ 断片３ − Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｎ−Ｙ−Ｔ 断片４ − Ｉ−Ｗ−Ｅ−Ｌ−Ｋ 断片５ − Ｖ−Ｍ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ｎ−Ａ 断片６ − (Ａ)−Ｖ−Ｓ−Ｎ−Ｍ−Ｌ−Ｑ−Ｋ 断片７ − Ｎ−Ａ−Ｓ−Ｉ−Ｓ−Ｖ 断片８ − Ｔ−Ｆ−Ｌ−Ｒ 断片９ − Ｄ−Ｉ−Ｉ−Ｋ−Ｐ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｋ

【００７７】また実施例３で報告したように、還元後、
単離したＮＫＳＦの４０ｋｄ種および３０ｋｄ種から、
ＮＫＳＦの各サブユニットのアミノ末端のアミノ酸配列
を決定した。４０ｋｄのサブユニットからのアミノ末端
配列は、Ｉ−Ｗ−Ｅ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｄ−Ｖ−Ｙ−Ｖ−Ｖ
−Ｅ−Ｌ−Ｄ−Ｗ−Ｙ−Ｐ−Ｄ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｅ−Ｍで
あった。このアミノ末端配列、および断片１、３、４、
８、および９は、前記の第Ｉ表で同定した大きい方のサ
ブユニットのクローンのアミノ酸配列から誘導されたも
のであることが分かった。

【００７８】３０ｋｄの小さい方のサブユニットからの
アミノ末端配列は、下記のように、カッコ内のアミノ酸
の同定が確定していない、(Ｘ)−Ｎ−Ｌ−Ｐ−Ｖ−Ａ−
(Ｐ)−Ｐ−Ｄ−Ｐ−(Ｓ)−Ｍ−Ｆ−Ｐであった。（Ｘ）
は、この配列の最初の残基が決定できなかったことを表
す。

【００７９】オリゴヌクレオチドのプール、または独特
のオリゴヌクレオチドからなるプローブを、レーズの方
法〔Ｒ.レーズ、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー、１８３巻（１）、１〜１２頁（１９８５
年）〕により設計した。オリゴヌクレオチドプローブ
は、自動ＤＮＡ合成装置で合成した。

【００８０】遺伝暗号は縮重するので（１個以上のコド
ンが同一のアミノ酸を暗号化できる）、トリプシン処理
した断片のアミノ酸配列を暗号化している可能性のすべ
てのあるヌクレオチド配列を含んでいるオリゴヌクレオ
チドの混合物を合成しなければならない。ある種のコド
ンは、真核遺伝子では希にしか利用されず、またジヌク
レオチドＣｐＧの相対頻度は真核性暗号配列では希であ
る理由から〔Ｊ.Ｊ.ツールら、ネーチャー、３１２巻、
３４２〜３４７頁（１９８４年）参照〕、ある場合に
は、コドン利用に基づいたプローブ混合物のオリゴヌク
レオチド数を減らすことが可能である。プローブ設計に
利用するアミノ酸配列の領域は、できれば高度に縮重し
たコドンを避けることによって選ばれる。オリゴヌクレ
オチドを自動ＤＮＡ合成装置で合成し、ついでプローブ
をポリヌクレオチドキナーゼおよび ³²Ｐ−ＡＴＰで放射
能標識する。

【００８１】ついでｃＤＮＡを、ＲＰＭＩ８８６６細胞
系からポリアデニル化したＲＮＡから合成し、これをラ
ムダＺＡＰ（ストラタジーン・クローニング・システム
ズ社、ラ・ジョラ、ＣＡ）またはその他、好適なベクタ
ーへ確立された手法を用いて（ツールら、前掲）クロー
ン化した。このライブラリーからの組換え体を平板接種
し、複製ニトロセルロース・レプリカをプレートから作
成した。³²Ｐ−γ−ＡＴＰでオリゴヌクレオチドをリン
酸化し、プローブの鎖長および塩基組成から予測した温
度で、標準的なハイブリッダイゼーション溶液中で１
夜、レプリカへハイブリッド形成した〔Ｊ.シンガー−
サムら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、
８０巻、８０２〜８０６頁（１９８３年）、およびＳ.
Ｖ.サグズら、「デベロップメンタル・バイオロジー・
ユージング・ピュアリファイド・ジーンズ」、ＩＣＮ−
ＵＣＬＡ・シンポジウム・オン・モレキュラー・アンド
・セルラー・バイオロジー、Ｄ.Ｄ.ブラウンおよびＣ.
Ｆ.フォックス編、（アカデミック社、ＮＹ）、２３
巻、６８３〜６９３頁（１９８１年）参照〕。ついでオ
ートラジオグラフィーに掛けることができる許容し得る
水準にバックグラウンド放射能が低下するまで、フィル
ターを０.５×ＳＳＣで同じ温度で洗浄した。別法とし
て、ハイブリッド形成および洗浄をテトラアルキルアン
モニウム塩溶液の存在で実施し得る〔Ｋ.Ａ.ヤコブス
ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、１６巻、４６
３７〜４６５０頁（１９８８年）参照〕。複製陽性物を
プラーク精製した。ヒトＮＫＳＦを暗号化するのに必要
なヌクレオチド配列の一部または全部を含んでいるクロ
ーンが得られた。この方法によって得られたクローンの
１つは、前述のようにＡＴＣＣ４０５４５として寄託し
た。

【００８２】実施例６ 組換え体ヒトＮＫＳＦの発現 ＮＫＳＦを生産するため、そのサブユニットを暗号化し
ているｃＤＮＡを標準的な分子生物学的な手法により好
適な発現ベクターへ移入した。これらの発現ベクターに
関しては、哺乳動物、昆虫、酵母、真菌および細菌発現
のための多数の種類が当業界で既知である。哺乳動物細
胞のそのようなベクターの１つはｐＸＭである〔Ｙ.Ｃ.
ヤングら、セル、４７巻、３〜１０頁（１９８６
年）〕。このベクターは、ＳＶ４０複製開始点およびエ
ンハンサー、アデノウイルス主後期プロモーター、アデ
ノウイルス３分節系先導配列のｃＤＮＡコピー、短いハ
イブリッド介在配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル
およびアデノウイルスＶＡＩ遺伝子を、所望のｃＤＮＡ
の高水準発現を哺乳動物細胞で指令する好適な関係で含
んでいる〔例えばカウフマン、プロシーディングズ・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
・オブ・ザ・ＵＳＡ、８２巻、６８９〜６９３頁（１９
８５年）〕。このｐＸＭベクターをエンドヌクレアーゼ
酵素ＸｈｏＩで直線化し、続いてＮＫＳＦの各サブユニ
ット発現の組立て体を生じ得るＸｈｏＩ相補的末端を作
り出す合成オリゴヌクレオチド（コラボレーティブ・リ
サーチ、レキシントン、ＭＡ〕を付加することによっ
て、予め修飾したＮＫＳＦサブユニットを暗号化してい
るｃＤＮＡへ、当モル量ずつ別々にライゲーションし
た。２つのポリペプチドが２つの異なったｍＲＮＡから
誘導されたのであれば、２つの異なったｃＤＮＡを同一
宿主で同時に発現するか、あるいは異なった宿主でそれ
ぞれ独立して発現させ、サブユニットを別々に精製しな
ければならない。目的の活性ＮＫＳＦは、個々のサブユ
ニットを再生することによって組立てられる。

【００８３】もし２つのＮＫＳＦのサブユニットが単一
のｍＲＮＡから誘導されたのであれば（すなわち、それ
らが単一の前駆体ポリペプチドのタンパク質酵素分解切
断によって生じたのであれば）、前述と類似の態様で、
ベクターを個々のｃＤＮＡへ等モル量でライゲーション
する。対応するｃＤＮＡは、好適なベクターにより種々
の宿主で発現することができる。

【００８４】ａ. 哺乳動物細胞発現 以下に説明する検定に使用するＮＫＳＦタンパク質の発
現を得るため、個々のサブユニットのためのｃＤＮＡ
（それらが単一の前駆体から誘導されたものであれば、
両方のサブユニットを暗号化している単一のｃＤＮＡ）
を含んでいるｐＸＭ組立て体を混合し、例えばこれをＣ
ＯＳ細胞へトランスフェクトする。トランスフェクトし
たＣＯＳ細胞からのならし培地は、γ−インターフェロ
ン誘発検定で測定されるＮＫＳＦ生物学的活性を含有し
ている。

【００８５】本明細書で報告する哺乳動物細胞発現ベク
ターは、当業界で既知の技術によって合成し得る。この
ベクターの構成（例えばレプリコン、選択遺伝子、エン
ハンサー、プロモーター等）は、既知の方法によって天
然供給源からまたは合成によって入手し得る〔カウフマ
ンら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー、１５９巻、５１１〜５２１頁（１９８２年）、およ
びカウフマン、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・Ｕ
ＳＡ、８２巻、６８９〜６９３頁（１９８５年）参
照〕。代表的な哺乳動物宿主細胞は、形質転換細胞系を
も含め、特に霊長類細胞系およびゲッ歯類細胞系であ
る。また正常な２倍体細胞、一次組織および初代外植片
の試験管内培養から誘導された細胞株も好適である。候
補となる細胞は、選択遺伝子が優性に作用する限り、選
択遺伝子で遺伝子型的に欠損している必要はない。ベク
ターＤＮＡの安定な組込み、および組込んだベクターＤ
ＮＡのその後の増幅には、いずれも通常の方法により、
ＣＨＯ細胞を使用し得る。別法として、ベクターＤＮＡ
はウシ乳頭腫ウイルスゲノム〔ラスキーら、セル、３６
巻、３９１〜４０１頁（１９８４年）参照〕の全部また
は一部を含み、安定なエピソーム要素としてＣ１２７マ
ウス細胞のような細胞系で実施し得る。その他の好適な
哺乳動物細胞系としては、ヒーラ細胞、ＣＯＳ−１サル
細胞、マウスＬ−９２９細胞、スイス、Ｂａｌｂ−ｃま
たはＮＩＨマウスから誘導された３Ｔ３系、ＢＨＫまた
はＨＡＫハムスター細胞系等が挙げられるが、これに限
定されるものではない。

【００８６】ＮＫＳＦタンパク質は２量体であるから、
２つのサブユニットが異なっている場合は（例えば大き
いサブユニットと小さいサブユニット）、これらを同一
宿主で同時に発現するか、または別々に発現させて、互
いに再生し、活性なＮＫＳＦを生産しなければならな
い。然し、もしＮＫＳＦサブユニットが単一のｃＤＮＡ
によって暗号化されている前駆体の切断によって生じる
のであれば、少なくとも好適なプロテアーゼを含んでい
る哺乳動物細胞で、単一のｃＤＮＡを発現させて機能的
なＮＫＳＦを生産することができる。

【００８７】２つのサブユニットを哺乳動物細胞で同時
に発現することが必要である場合は、２つの異なった選
別可能な遺伝子またはマーカーを用いて、２つのｃＤＮ
Ａを細胞へ導入しなければならない。実施例７で報告す
るように、これは、一方のマーカーとしてジヒドロ葉酸
還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を、他方のマーカーとして
アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を使用して、ＣＨＯ
細胞で容易に達成できる。任意の哺乳動物細胞系で独立
的に選別できる２つの遺伝子の任意の組合わせがこの目
的に有用である。例えばＣＨＯ細胞系でＡＤＡの選別下
に、一方のサブユニットの発現を独立的に生じさせ、別
の細胞系でＤＨＦＲの選別下に、他方のサブユニットの
発現を生じさせる。２重選別のもとに、細胞系をポリエ
チレングリコール中で融合して、両方のサブユニットを
発現する安定な系を生産する。別法として、２つのＤＮ
Ａを同一の細胞へ同時にまたは順次導入し、それによっ
て活性なＮＫＳＦを発現する系を生産する。

【００８８】ついで標準的な免疫学的、生物学的、また
は酵素的な検定によって、生産物の発現について安定な
形質転換体を選別する。ＮＫＳＦポリペプチドを暗号化
しているＤＮＡおよびｍＲＮＡの存在は、サザンブロッ
ティングおよびＲＮＡブロッティングのような標準的な
方法によって検出し得る。ＣＯＳ−１サル細胞のような
好適な宿主細胞へ発現ベクターＤＮＡを導入したのちの
数日間、ポリペプチドを暗号化しているＤＮＡの一過性
の発現が、培地中のタンパク質活性または免疫検定によ
って無選別に測定される。

【００８９】また当業者であれば、例えば好適な酵素
で、対応するプラスミドからＮＫＳＦサブユニットのＤ
ＮＡ配列を挿入し、周知の組換え遺伝子工学技術を用い
て、ｐＪＬ３およびｐＪＬ４〔ゴーら、ＥＭＢＯ・ジャ
ーナル、４巻、６４５〜６５３頁（１９８５年）〕、お
よびｐＭＴ２（ｐＭＴ２−ＶＷＦで始まる、ＡＴＣＣ＃
６７１２２、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／０００３３
参照）〕のようなその他の既知のベクターを使用するこ
とにより、ｐＸＭベクターに匹敵し得るその他の哺乳動
物の発現ベクターを組立てることができる。両方のＮＫ
ＳＦサブユニットとともにこれらのベクターを好適な宿
主細胞へ形質転換することによって、ＮＫＳＦポリペプ
チドの発現を生じることができる。

【００９０】ｂ. 細菌発現系 同様に当業者であれば、暗号配列を挟んで隣接する任意
の哺乳動物性調節配列を除去し、細菌性調節配列を挿入
して、細菌細胞により、この発明のＮＫＳＦサブユニッ
トを細胞内または細胞外に発現する細菌性ベクターを作
り出すことによって、ＮＫＳＦサブユニットを暗号化し
ている配列を操作することができる。当業界で既知のよ
うに、ＮＫＳＦポリペプチドを暗号化しているＤＮＡを
さらに修飾して、細菌性発現を最適化するさまざまなコ
ドンを含有させ得る。当業界で既知の方法により、好ま
しくは成熟ＮＫＳＦサブユニットを暗号化している配列
を、成熟ＮＫＳＦポリペプチドの細菌発現、分泌および
プロセッシングを可能にする分泌先導ポリペプチドが暗
号化されているヌクレオチドへ、枠組みのまま機能的に
結合する。そのような分泌系を使用して、ＮＫＳＦの両
方のサブユニットをエシェリキア・コリで同時発現し、
活性なヘテロ２量体の分泌を生じることが期待される。
この方法によって活性なキメラ抗体断片が得られた〔例
えばビッターら、サイエンス、２４０巻、１０４１〜１
０４３頁（１９８８年）参照〕。

【００９１】別法として、細胞内に発現するベクターを
使用して、エシェリキア・コリで２つの異なったｃＤＮ
Ａから個々のサブユニットを別々に成熟した形で発現
し、既知の方法によりサブユニットを別々に単離し、こ
れを混合して再生する（例えば米国特許第４５１２９２
２号参照）。

【００９２】どちらの経路を介しても、細菌宿主細胞で
発現させた化合物を、ついで回収し、精製し、そして／
または物理化学的、生化学的および／または臨床的な指
標について、すべて既知の方法により特性を決定する。

【００９３】ｃ. 昆虫または酵母細胞発現 同様の操作によって昆虫細胞でＮＫＳＦポリペプチを発
現するための昆虫ベクターの組立てが実施できる（例え
ば公開されたヨーロッパ特許出願第１５５４７６号に報
告された方法、参照）。ＮＫＳＦサブユニットを単一の
ｃＤＮＡから誘導したのであれば、このｃＤＮＡは昆虫
細胞で発現され得る。もしそうではなく、ＮＫＳＦサブ
ユニットが２つの異なったｃＤＮＡから誘導したのであ
れば、各サブユニットを昆虫細胞ベクターへ別々に挿入
し、得られた２つのベクターを昆虫細胞へ同時導入し
て、生物学的に活性なＮＫＳＦを発現する。

【００９４】同様に酵母調節配列を使用して酵母ベクタ
ーを組立て、酵母細胞で個々のＮＫＳＦサブユニットを
同時発現するか、あるいはもし、タンパク質が単一の前
駆体から誘導されたのであれば、その前駆体を暗号化し
ているｃＤＮＡを酵母細胞で発現して、細胞外に分泌さ
れる活性なＮＫＳＦヘテロ２量体を生産する。別法とし
て、個々のサブユニットを酵母で細胞内に発現し、個々
のポリペプチドを単離し、最後に互いに再生して活性な
ＮＫＳＦを得る（例えば、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ８
６／００６３９、およびヨーロッパ特許出願ＥＰ１２３
２８９に報告された方法を参照）。

【００９５】実施例７ 高水準のＮＫＳＦを発現するＣＨＯ細胞系の組立て この発明のＮＫＳＦタンパク質を哺乳動物細胞から高水
準で生産する１つの方法は、個々のＮＫＳＦサブユニッ
トを暗号化している２つのｃＤＮＡの多重コピーを含ん
だ細胞を組立てるか、または、もしサブユニットが単一
ポリペプチドから誘導されるのであれば、ＮＫＳＦ前駆
体を暗号化しているｃＤＮＡのコピーを含んだ細胞を組
立てることを含む。

【００９６】後者の場合、細胞が濃度増大するメトトレ
キセート（ＭＴＸ）を含有するように、例えばカウフマ
ンおよびシャープの方法により、単一のｃＤＮＡを増幅
可能なマーカー（例えばＤＨＦＲ遺伝子）と同時トラン
スフェクトする〔カウフマンおよびシャープ、ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（１９８２
年）、前掲〕。この方法は多数の異なった細胞型に使用
できる。

【００９７】例えばＮＫＳＦ前駆体遺伝子を含んでいる
ｐＭＸベクター（実施例６）を、この前駆体遺伝子の発
現を可能にする他のプラスミド配列と機能的に組合わせ
て、ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ３のようなＤＨＦＲ発現プラ
スミド〔カウフマン、プロシーディングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・
ザ・ＵＳＡ、８２巻、６８９〜６９３頁（１９８５
年）〕と一緒に、リン酸カルシウム共沈およびトランス
フェクションによって、ＤＨＦＲ欠乏ＣＨＯ細胞ＤＵＫ
Ｘ−ＢIIへ導入する。透析したウシ胎児血清によるα培
地における増殖によって、ＤＨＦＲ発現形質転換体を選
別する。生物検定、免疫検定、またはＲＮＡブロッティ
ングにより、形質転換体をＮＫＳＦ発現について検査
し、つぎに陽性プールを、ＭＴＸの濃度増大（０.０
２、０.２、１.０、５μＭの段階系列）による増殖の増
幅について選別する〔カウフマンら、モレキュラー・セ
ル・バイオロジー、５巻、１７５０頁（１９８３
年）〕。増幅された系をクローン化し、ＮＫＳＦタンパ
ク質発現をγ−インターフェロン誘発検定によってモニ
ターする。ＭＴＸ耐性水準の増大とともにＮＫＳＦ発現
が増大することが期待される。

【００９８】もし２つのＮＫＳＦポリペプチドがそれぞ
れ別のｍＲＮＡから誘導されるのであれば、それぞれ対
応するｃＤＮＡをＣＨＯ細胞で同時発現する。例えばＤ
ＨＦＲおよびＡＤＡのような２種の異なった選別可能な
マーカーを使用し得る。ｃＤＮＡの一つは、ＮＫＳＦサ
ブユニットの１つを発現するＤＨＦＲ系（例えばベクタ
ーｐＸＭ）を使用して発現し、また単一前駆体ＮＫＳＦ
タンパク質の際に報告したように、ｐＡｄＤ２６ＳＶｐ
Ａ３を使用してＤＨＦＲを発現する。第２のサブユニッ
トもベクターｐＸＭを使用して発現されるが、このマー
カーはプラスミドｐＳＶ２ＡＤＡとの同時トランスフェ
クトを介して得られ〔カウフマンら、プロシーディング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８３巻、３１３６頁（１９
８６年）〕、哺乳動物細胞でＡＤＡの発現を指令する。
第２のサブユニットを含んだｐＸＭベクター組立て体
を、ｐＳＶ２ＡＤＡと一緒にＤＨＦＲ欠乏ＣＨＯ ＤＵ
ＫＸ−ＢII 細胞へトランスフェクトする。トランスフ
ェクトされた細胞を２'−デオキシコフォルマイシン
（ｄＣＦ）の０.０１μg〜４０μgの段階的に増大する
濃度で、増殖について選別する。個々のｃＤＮＡの発現
（一方のサブユニットは１細胞系でＤＨＦＲ選別下に、
他方のサブユニットは別の細胞系でＡＤＡ選別下に）
を、転写を試験するｍＲＮＡブロッティングおよびタン
パク質生産を試験する免疫検定の組合わせによって実施
する。最後に、ＡＤＡ選別下にサブユニットの１つを発
現する細胞とＤＨＦＲ選別下に他方のサブユニットを発
現する細胞とを、当業界で十分確立された方法を用いて
ポリエチレングリコール中で融合し、ｄＣＦおよびＭＴ
Ｘのいずれにも耐性で、両方のサブユニットを発現する
単一細胞系を生産し、生物学的に活性なＮＫＳＦを生産
する。

【００９９】どちらかの薬物の選別下に、どちらかのサ
ブユニットを発現する細胞系を生成することもできる。
つぎに他方のサブユニットを発現するｃＤＮＡを第２の
薬物の選別下に導入し、両方のサブユニットを同時に発
現する細胞を生産し得る（例えば公開されたＰＣＴ国際
出願ＷＯ８８／０８０３５の、ＤＨＦＲへ結合した第１
の遺伝子とＡＤＡ遺伝子へ結合した第２の遺伝子を別個
に増幅する例示的な報告を参照）。

【０１００】また両方のＮＫＳＦサブユニットを発現す
る２つのｐＭＸ組立て体を、ＤＨＦＲを発現するプラス
ミドおよびＡＤＡを発現するプラスミドと混合し得る。
両方の薬物を組合わせた選別を使用して、形質転換体を
ＮＫＳＦ活性について直接試験し、ヘテロ２量体を発現
する細胞系を得ることができる。

【０１０１】上述の発現系のいずれの場合でも、得られ
た細胞系を好適な薬物選別によってさらに増幅し、得ら
れた細胞系を再クローン化して、本明細書で報告するγ
−インターフェロン誘発検定を使用して発現水準を評価
することができる。

【０１０２】実施例８ ヒトＮＫＳＦの生物学的活性 下記の検定は、実施例２で報告した均質なＮＫＳＦ、ま
たは部分的に精製したＮＫＳＦ変異体のいずれかを使用
して実施した。分子の組換え変異体は、これらの同一の
検定またはその他の検定でＮＫＳＦの生物学的特性を有
することが期待される。

【０１０３】新たに調製したヒト末梢血の単核球細胞
（ＰＢＭＣ）、またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）
で誘発した芽球をＮＫＳＦとともに培養すると、上清中
に有意なγ−インターフェロン量が検出される。さらに
ＮＫＳＦは、γ−インターフェロン生産誘発においてＩ
Ｌ−２、ホルボールジブチレート（ＰｄＢｕ）、および
ＰＨＡと相乗的に作用する。ノーザンブロット分析で、
ＮＫＳＦは単独または他の因子と組合わせて、γ−イン
ターフェロンｍＲＮＡの蓄積を誘発することが分かっ
た。γ−インターフェロン伝達情報は、精製したＴ細胞
集団およびＮＫ細胞集団のどちらでも見いだされた。タ
ンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）ととも
に前温置したのち、ＮＫＳＦで刺激するとγ−インター
フェロンｍＲＮＡの超誘発を生じる。ＨＬＡ−ＤＲ
（＋）補助細胞はＴ細胞およびＮＫ細胞によるγ−イン
ターフェロン産生に必要である。γ−インターフェロン
ｍＲＮＡの誘発は、ＰＨＡ芽球のＮＫＳＦ処理後１時間
以内に検出できる。以下にこの検定の詳細を報告する。

【０１０４】ａ. γ−インターフェロン誘発検定 ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）培養におけるγ−イン
ターフェロン（γ−ＩＦＮ）発現誘発によって、ＮＫＳ
Ｆ活性を測定した。この検定では、１０％加熱失活させ
たＦＣＳを加えたＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊したヒト
ＰＢＬｓ（１０ ⁷細胞／ml）１００μlを微量検定プレー
ト（Ｕ−ボトム、９６−ウエル、コスター社、ケンブリ
ッジ、ＭＡ）で試験試料１００μlへ添加し、５％ＣＯ₂
気流から無細胞上清１００μlを棄て、産生されたγ−
ＩＦＮ量を放射線免疫検定（セントコール・γ−インタ
ーフェロン・ラジオイムノアッセイ、セントコール社、
マルバーン、ＰＡ）により測定した。１ml当たりのＮＫ
ＳＦ１単位は、ＮＫＳＦの至適濃度の存在で生産される
最大γ−ＩＦＮ量の１／２を生産するのに必要な濃度で
ある。

【０１０５】各ウエルで生産されるγ−ＩＦＮ量と培養
内のＮＫＳＦ量との間にはプラスの相関がある。

【０１０６】γ−ＩＦＮ以外にも、ＮＫＳＦは、Ｔ細胞
およびＮＫ細胞のＧＭ−ＣＳＦおよび腫瘍壊死因子生産
を誘発する。上述のようにこれらのサイトカイン生産の
検定を実施し、上清をサイトカイン類の存在について特
異的な生物学的検定または放射線免疫検定によって検定
した〔カチュリら、ジャーナル・オブ・エキスペリメン
タル・メジシン、１６５巻、１５８１〜１５９４頁（１
９８７年）〕。別法として、サイトカイン遺伝子の誘発
はＮＫＳＦ処理したリンパ球内の３種のサイトカインの
ｍＲＮＡ転写物の蓄積を評価することによって測定す
る。リンパ球をＮＫＳＦと４〜１８時間培養し、確立さ
れた方法によってＲＮＡを抽出し、アガロースゲル電気
泳動によって分画し、ニトロセルロースでブロットし、
³²Ｐ−標識ｃＤＮＡプローブで、γ−ＩＦＮ、ＧＭ−Ｃ
ＳＦ、または腫瘍壊死因子遺伝子に対して形質転換する
（ノーザンブロッティング）。形質転換の程度はオート
ラジオグラフィーおよびデンシトメトリーによって測定
する。

【０１０７】ＮＫＳＦは、精製したヒトＮＫ細胞からの
γ−ＩＦＮおよびＴＮＦ生産を誘発する。（ａ）のγ−
インターフェロン誘発検定で報告した検定では、ＮＫ細
胞は２つの作用機構によって各種の標的細胞を溶解する
ことができる。１つの作用機構は、特異的な感作なしに
白血病細胞系および固形腫瘍由来細胞系、ウイルス感染
細胞、およびある場合には、正常細胞を含む各種の標的
細胞を一過性に溶解する。第２の作用機構はＡＤＣＣで
ある。予備的な根拠から、ＮＫＳＦは、ＮＫ細胞のＦｃ
レセプターへ結合可能なＦｃ部分をＩｇＧ抗体で被覆し
た標的細胞を、一層効率的に溶解するＮＫ細胞の細胞溶
解能を増強し得ることが判明した。

【０１０８】ｂ. ＮＫ検定 ＮＫＳＦによるＮＫ細胞の一過性細胞障害性の増強を検
定するため、ＰＢＬｓまたは精製したＮＫ細胞（５×１
０⁶細胞／ml）を１０％加熱失活させたＦＣＳを加えた
ＲＰＭＩ１６４０培地で、ＮＫＳＦの各種希釈度の存在
で１８時間インキュベートする。ついでＰＢＬｓを洗浄
し、Ｕ−ボトム微量滴定板の１０^{4 51}Ｃｒ−標識した標
的細胞へ、ＰＢＬｓを、１：１〜１００：１のＰＢＬ−
標的細胞比で添加する（最終容量２００μl）。４時間
後、プレートを遠心し、無細胞上清を採取して、細胞か
らの⁵¹Ｃｒ−標識の放出によって標的細胞の溶解を評価
する。標的細胞として悪性造血細胞系（即ち、Ｋ５６
２、ダウディ、Ｕ９３７、ＨＬ−６０、ＭＬ３、モルト
４、ジャーカット、ＴＨＰ−１）、固形腫瘍由来細胞系
（横紋筋肉腫、黒色腫）、および正常な包皮由来繊維芽
細胞株について検定を行うと、ＮＫＳＦはＮＫ細胞の細
胞障害性を数倍増大する。ＮＫＳＦによるＮＫ細胞性細
胞障害性の増強は、γ−ＩＦＮ、腫瘍壊死因子またはＩ
Ｌ−２の産生による２次的なものではなく、ＮＫＳＦで
処理したＰＢＬによって生じたものである。細胞障害性
検定、ＮＫ細胞の精製方法、およびサイトカインによっ
て増強されたＮＫ細胞を介する増強の定量的な評価につ
いては、Ｇ.トリンキエリら、ジャーナル・オブ・エキ
スペリメンタル・メジシン、１４７巻、１３１４頁（１
９７８年）、Ｇ.トリンキエリら、ジャーナル・オブ・
エキスペリメンタル・メジシン、１６０巻、１１４７頁
（１９８４年）、およびＢ.ペルッシアら、ナチュラル
・イミュニティー・アンド・セル・グロウス・レギュレ
ーション、６巻、１７１〜１８８頁（１９８７年）〕に
詳細に報告されている。

【０１０９】ｃ. ＡＤＣＣ検定 標準的な抗体依存性細胞障害性の検定における予備的な
成績で、この発明の部分的に精製したＮＫＳＦは、抗体
被覆した腫瘍標的細胞のＮＫ細胞致死作用を投与量に比
例した形で増強することが判明した。ＮＫ細胞のＦｃレ
セプターへ結合し得る抗体に対するＮＫ細胞のＡＤＣＣ
反応は、ＮＫＳＦの添加によって増強される。

【０１１０】ｄ. ＮＫＳＦの助マイトジェン効果 １０％加熱失活させたヒトＡＢ血清を加えたＲＰＭＩ１
６４０培地２００μlでＰＢＬｓ（０.５×１０⁶／ml）
を培養する。３日後および６日後に、ＰＢＬｓを³Ｈ−
チミジンで６時間パルスし、スカトロン・セル・ハーベ
スターを使用してガラスフィルターに細胞を採取し、パ
ッカード・トリカーブ・ベータ・カウンターを使用する
液体シンチレーションにより細胞内の³Ｈ−チミジンを
計数することにより、ＤＮＡ合成（増殖）を評価する。
ＮＫＳＦは、それ自身によるＰＢＬ増殖効果はごく僅か
であるが、フィトヘマグルチニンとの培養６日目および
ホルボールジエステル（ＴＰＡ１０^-8またはＰＤＢｕ１
０^-7）との培養３日目および６日目でいずれも強いマイ
トジェン誘起効果を示す。細胞周期分析は、ロンドンら
による免疫蛍光染色〔ロンドンら、ジャーナル・オブ・
イムノロジー、１３７巻、３８４５頁（１９８６年）〕
をＤＮＡ染色と組合わせた手技を使用するフローサイト
メトリー（サイトフルオログラフ５０Ｈ、オルト・ダイ
アグノスティックス社）によって実施する。この分析か
ら、ＮＫＳＦのマイトジェン誘起効果によって影響され
たＰＢＬｓはＴ細胞のＣＤ４またはＣＤ８でいずれも陽
性であることが判明した。

【０１１１】ｅ.ＧＭ−ＣＳＦ誘発検定 ヒトＰＢＬｓの培養でＧＭ−ＣＳＦ発現の誘発を測定し
た。この検定で、１０％加熱失活させたＦＣＳを加えた
ＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊したヒトＰＢＬｓ（１０^-7
細胞／ml）１００μlを、微量滴定板（Ｕ−ボトム、９
６−ウエル、コスター社、ケンブリッジ、ＭＡ）で試験
試料１００μlへ添加し、５％ＣＯ₂気流中で３７℃で１
８時間インキュベートした。インキュベーション後、各
ウエルから無細胞上清１００μlを棄て、異なったエピ
トープを認識するヒトＧＭ−ＣＳＦに対する２種のマウ
スモノクローナル抗体（３／８.２０.５および２／３.
１、ジェネティックス・インスチチュート社より提供）
を使用する酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によ
り、産生されたＧＭ−ＣＳＦ量を測定した。組換え体ヒ
トＧＭ−ＣＳＦ（ジェネティックス・インスチチュート
社）を標準として使用して、この検定の検出限界は５０
pg／mlであった。

【０１１２】この発明を実施することによって、多数の
修飾および変更を当業者へもたらすことが期待される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/04 Ｃ０７Ｋ 16/24 43/00 １１１ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ０７Ｋ 16/24 Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ０７Ｋ 14/52 Ａ６１Ｋ 37/02 (71)出願人 594096852 ザ・ウイスター・インスティテュート ＴＨＥ ＷＩＳＴＡＲ ＩＮＳＴＩＴＵＴ Ｅ アメリカ合衆国ペンシルベニア19104、フ ィラデルフィア、スプルース、サーティ・ シックス・ストリート（番地の表示なし) (72)発明者 ジョルジオ・トリンチェリ アメリカ合衆国19104ペンシルベニア、ウ ィンウッド、ウィスター・ロード355番 (72)発明者 バイス・ペルシア アメリカ合衆国19146ペンシルベニア、フ ィラデルフィア、ウェイバリー・ストリー ト2302番 (72)発明者 ミチコ・コバヤシ 神奈川県横浜市港北区大豆戸町931−１ 大倉山Ｂ−513番 (72)発明者 スティーブン・シー・クラーク アメリカ合衆国01890マサチューセッツ、 ウィンチェスター、ジョンソン・ロード 122番 (72)発明者 ゴードン・ジー・ウォング アメリカ合衆国02130マサチューセッツ、 ジャマイカ・プレイン、アパートメント 10、ジャマイカ・ウェイ40番 (72)発明者 ロッドニー・エム・ヒューウィック アメリカ合衆国02173マサチューセッツ、 レキシントン、ウッドクリフ・ロード16番

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）において
   インビトロでγ−インターフェロンの生産を誘発するこ
   とが出来、ＳＤＳ ＰＡＧＥ非還元性条件下で見掛け分
   子量約７０〜８０ｋＤを有し、かつ（ａ）ＳＤＳ ＰＡ
   ＧＥ還元性条件下で見掛け分子量約４０ｋＤであって、
   Ｉ−Ｗ−Ｅ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｄ−Ｖ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｅ−Ｌ
   −Ｄ−Ｗ−Ｙ−Ｐ−Ｄ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｅ−Ｍを含むＮ末
   端アミノ酸配列を有する第１サブユニットと（ｂ）ＳＤ
   Ｓ ＰＡＧＥ還元性条件下で見掛け分子量約３０〜３５
   ｋＤであって、Ｘ−Ｎ−Ｌ−Ｐ−Ｖ−Ａ−Ｘ−Ｐ−Ｄ−
   Ｐ−Ｘ−Ｍ−Ｆ−Ｐ（ここで、Ｘは任意アミノ酸であ
   る。）を含むＮ末端アミノ酸配列を有する第２サブユニ
   ットを含んでなるナチュラルキラー細胞刺激因子（ＮＫ
   ＳＦ）タンパク質またはそのサブユニットに対する抗
   体。
2. 【請求項２】 化学的に Ｌ−Ｔ−Ｉ−Ｑ−Ｖ Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｎ−Ｙ−Ｔ Ｌ−Ｍ−Ｄ−Ｐ−Ｋ Ｉ−Ｗ−Ｅ−Ｌ−Ｋ Ｖ−Ｍ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ｎ−Ａ (Ａ)−Ｖ−Ｓ−Ｎ−Ｍ−Ｌ−Ｑ−Ｋ Ｎ−Ａ−Ｓ−Ｉ−Ｓ−Ｖ Ｔ−Ｆ−Ｌ−Ｒ Ｄ−Ｉ−Ｉ−Ｋ−Ｐ−Ｄ−Ｐ−Ｐ−Ｋ Ｉ−Ｗ−Ｅ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｄ−Ｖ−Ｙ−Ｖ−Ｖ−Ｅ−Ｌ
   −Ｄ−Ｗ−Ｙ−Ｐ−Ｄ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｅ−Ｍ および Ｘ−Ｎ−Ｌ−Ｐ−Ｖ−Ａ−(ＰまたはＸ)−Ｐ−Ｄ−Ｐ−
   (ＳまたはＸ)−Ｍ−Ｆ−Ｐ（ここで、Ｘは任意アミノ酸
   である。）からなるアミノ酸配列の１またはそれ以上を
   含んでいる請求項１に記載のタンパク質に対する抗体。
3. 【請求項３】 生物学的にγ−インターフェロン誘発検
   定で１mg当たり１×１０⁷希釈単位より大きい比活性を
   有する請求項１に記載のタンパク質に対する抗体。
4. 【請求項４】 次の特性の一つまたはそれ以上を有する
   請求項１に記載のタンパク質に対する抗体: (１)等電点ゲル電気泳動で４.３の等電点、 (２)等電点ゲル電気泳動で４.８の等電点、 (３)ヒドロキシルアパタイトカラムから単一のピークと
   して溶出、 (４)ヘパリン−セファロースカラムから単一のピークと
   して溶出、 (５)ＦＰＬＣモノＱカラムから単一のピークとして溶
   出、 (６)ＰＢＬによるＧＭ−ＣＳＦ誘発検定における生物学
   的活性、 (７)白血病細胞および腫瘍由来細胞を致死させる活性化
   ＮＫ細胞における生物学的活性、 (８)フィトヘマグルチニン活性化Ｔリンパ球を使用する
   腫瘍壊死因子誘発検定における生物学的活性、 (９)末梢血Ｔリンパ球に対する共分裂促進活性。