JP2001226290A - 心筋保護剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒト由来アンチトロンビン−ＩＩ
Ｉの新規医薬用途を提供すること。 【解決手段】 ヒト由来アンチトロンビン−ＩＩ
Ｉを有効成分とする心筋保護剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト由来アンチト
ロンビン−ＩＩＩ（以下、単にＡＴ−ＩＩＩという）を
有効成分とする心筋保護剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＡＴ−ＩＩＩは血漿中に存在するα２グ
ロブリンに属する糖蛋白質の一種で、その分子量は６５
０００〜６８０００であり、プロテアーゼ阻害活性を有
し、トロンビンの凝固活性を強く阻害する。また、トロ
ンビンに対する阻害作用のみならず、その他の凝固因
子、例えば、活性化Ｘ因子、活性化ＩＸ因子などに対す
る阻害作用をも有している。その他、プラスミンやトリ
プシンに対する阻害作用があることも報告されている。
これらの阻害作用は、一般にヘパリンの共存下でより速
やかに進行することが知られている。このような薬理作
用を有するＡＴ−ＩＩＩは、血液凝固阻止、凝固異常亢
進の補正、具体的には血栓形成傾向、汎発性血管内凝固
症候群（ＤＩＣ）の治療を目的として臨床上用いられて
いる。

【０００３】ＡＴ−ＩＩＩの医薬用途としては、抗炎症
（特開昭６３−１３２８４３号公報）、ＰＧＩ₂産生促
進（特開平３−１４５４３１号公報）、成人呼吸促迫症
候群治療・微少循環改善（特開平６−２５６２１３号公
報）、妊娠中毒症治療（特開平７−３１６０７２号公
報）、高血圧症予防治療（特開平８−１０９１４０号公
報）、運動機能障害・組織障害・脊髄障害・脊髄損傷・
脊髄虚血の予防治療（特開平８−１６９８４５号公
報）、ショック起因の胃粘膜障害予防治療（特開平８−
２４５４１９号公報）、胎盤血流量改善（特開平８−２
９５６３５号公報）、虚血再潅流肝障害治療（特開平９
−１１０７１８号公報）、血圧低下抑制（特開平１１−
１２４３４０号公報）等が公開になっている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＡＴ−ＩＩ
Ｉの従来知られていなかった作用を利用した製剤を提供
することを目的とする。すなわち、当該ＡＴ−ＩＩＩを
他の医薬用途に使用することを意図するものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＡＴ−ＩＩＩが心
筋壊死を抑制し、心筋保護剤として有用であることを見
出して、本発明を完成した。

【０００６】即ち、本発明はＡＴ−ＩＩＩを有効成分と
する心筋保護剤に関する。以下に詳細を説明する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明で使用されるＡＴ−ＩＩＩ
は、ヒト由来のもので、医薬として使用できる程度に精
製されたものであれば特に制限されるものではなく、例
えば、ヒトの全血、血漿、血清または凝固した血液から
圧搾された血清等から精製することができる。使用され
る血液としては、特にＨＢｓ抗原、抗ＨＣＶ抗体、抗Ｈ
ＩＶ抗体、抗ＨＴＬＶ−１抗体に関して陰性であり、か
つ／または、ＡＴＬ（ＧＰＴ）値でスクリーニングした
健康人のものが好ましい。

【０００８】ＡＴ−ＩＩＩを調製するための出発原料と
しては、例えばコーンの冷エタノール法で得られる画分
ＩＶ−１、画分ＩＶ、上清Ｉ、上清ＩＩ＋ＩＩＩ（ＥＰ
公開５５１０８４号公報）等が使用される。ＡＴ−ＩＩ
Ｉの精製法としては、例えば、特開昭４８−３５０１７
号公報、特公昭５９−７６９３号公報に開示された方
法、疎水性クロマト（特開平１−２７５６００号公
報）、陰イオン交換体処理（特開平２−４７１７号公
報）、固定化ヘパリン処理（特開平７−２６８００３号
公報）、有機酸塩・糖類・塩化ナトリウム存在下での加
熱処理（特開平１０−１４７５３８号公報）、金属キレ
ート処理（特開平１１−４９７９９号公報）等が例示さ
れる。また、ＡＴ−ＩＩＩは細胞培養法（例えば、特表
昭５７−５００７６８号公報）、遺伝子工学法（例え
ば、特開昭５８−１６２５２９号公報）等により調製さ
れるものであってもよい。さらに、市販のＡＴ−ＩＩＩ
製剤［例えば、商品名：ノイアート（登録商標）、吉富
製薬社製］等を用いることもできる。

【０００９】本発明の有効成分であるＡＴ−ＩＩＩは、
心筋壊死抑制作用、特に虚血再潅流による心筋壊死抑制
作用を有しており、また、これらの作用に基づく心機能
低下抑制作用を有することから、心筋保護剤として虚血
再潅流心障害の予防治療、特に虚血性心疾患に対する虚
血再潅流障害の予防治療、すなわち、虚血性心疾患にお
いて血流再開後に生じる新たな心筋組織障害の予防治療
等に有用である。

【００１０】本発明の心筋保護剤においては、薬効成分
としてＡＴ−ＩＩＩ単独で効果を発揮し得る。また、必
要に応じてヘパリンと併用してもよい。

【００１１】また、本発明の心筋保護剤は、本発明の目
的に反しない限り通常医薬品に用いられる薬理的に許容
される添加剤（例えば、担体、賦形剤、希釈剤等）、安
定化剤または製薬上必要な成分を配合していてもよい。
添加剤・安定化剤としては、糖類，すなわちブドウ糖、
果糖等の単糖類、ショ糖、乳糖、麦芽糖等の二糖類、マ
ンニトール、ソルビトール等の糖アルコール；クエン
酸、リンゴ酸，酒石酸等の有機酸またはその塩（例え
ば、ナトリウム塩等）；グリシン、アスパラギン酸、グ
ルタミン酸等のアミノ酸またはその塩（例えば、ナトリ
ウム塩等）；ポリエチレングリコール、ポリオキシエチ
レン・ポリオキシプロピレン共重合体（プルロニック
系）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル
（トウィーン系）等の界面活性剤；ヘパリン、ヒト血清
アルブミン等が挙げられる。また、グルコン酸またはそ
の塩を配合した液状製剤（特開平９−１３２５３４号公
報）等も例示される。

【００１２】本発明製剤は、ＡＴ−ＩＩＩと上記成分と
を適宜混合し、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロッ
プ剤、注射剤等の剤型に調製される。本製剤は、液状製
剤の態様でもよいが、とりわけＡＴ−ＩＩＩを薬理的に
許容される添加剤とともに凍結乾燥品として調製してお
き、用時溶解して使用する態様の製剤とすることが好ま
しい。かかる製剤は、使用時に注射用蒸留水や滅菌精製
水等によって約１〜１００単位／ｍＬ溶液として、より
好ましくは生理的に等張な塩濃度および生理的に好まし
いｐＨ値（ｐＨ６〜８）に調整される。

【００１３】本発明の製剤の投与量は症状、体重、性
別、年齢、動物種等によって適宜選択すればよく、一般
的にヒトの成人に対しては、通常１〜１０００単位／ｋ
ｇ体重／日、好ましくは１０〜５００単位／ｋｇ体重／
日を１日１〜数回に分けて投与する。投与経路としては
経口、非経口のいずれでもよいが、好ましいのは非経口
投与である。このうち、より好ましいのは静脈内投与で
あり、静脈内への注射、持続注入、持続点滴等が例示さ
れる。本明細書において、ＡＴ−ＩＩＩの力価は、１単
位が正常人血漿１ｍＬ中に含まれるＡＴ−ＩＩＩ量に相
当する。

【００１４】

【実施例】以下、本発明を詳細に説明するため実験例お
よび実施例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限
定されるものではない。

【００１５】実験例１ 方法：心筋虚血再潅流モデルの作製 ウイスター系雄性ラット（体重２５５〜３２７ｇ、各群
とも例数６）にペントバルビタール・ナトリウム塩５０
ｍｇ／ｋｇ体重を静脈内投与により麻酔した後、保温マ
ット（３８℃に設定）上に背位固定し、気管にカニュー
レを挿入して人工呼吸器（ＭＯＤＥＬ６８３、Ｈａｒｖ
ａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ社製）による調節呼吸（１
０ｍＬ／ｋｇ体重、７０ｃｐｍ）を行った。左側肋間に
て開胸後、胸腔内より心臓を露出させ左冠動脈結紮用に
左冠動脈周囲心筋に縫合糸を掛け、胸腔内に心臓を戻し
た。状態が安定してからＡＴ−ＩＩＩ（比活性７単位／
ｍｇ。１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０に溶解したも
の。濃度は４．８３ｍｇ／ｍＬ。投与量は２５０単位／
ｋｇ体重）を右側大腿静脈より投与し、投与５分後に冠
動脈結紮により心筋虚血状態とし、虚血２０分後に結紮
を解除して再潅流を行った。対照として溶媒投与群（ベ
ヒクル群）をおいた。

【００１６】各種パラメーターの測定 心電図は心電図用アンプ（ＡＣ−６０１Ｇ、日本光電社
製）を用いて標準四肢第ＩＩ誘導法にて計測し、再潅流
後１分間における不整脈の発現を観察した。循環動態で
は平均血圧（ＭＢＰ）を右側大腿動脈に挿入したポリエ
チレンカテーテルより圧トランスデューサー（Ｓｔａｔ
ｈａｍ Ｐ−５０、Ｇｏｕｌｄ社製）を介し、血圧測定
用アンプ（ＡＰ−６４１Ｇ、日本光電社製）にて測定し
た。心拍数（ＨＲ）は血圧波をトリガーとして心拍計ユ
ニット（ＡＴ−６０１Ｇ、日本光電社製）で計測した。
また、右側頸動脈を介して左心室内にミラーマイクロチ
ップ圧力トランスデューサー（ＳＰＣ−３２０、ＭＩＬ
ＬＡＲ ＩＮＳＴＲＵＣＴＩＯＮＳ社製）を挿入し、血
圧・心内心音用アンプ（ＡＰ−６３０Ｇ、日本光電社
製）にて左心室圧を測定した。各測定項目は、ポリグラ
フ（ＲＭ−６０００、日本光電社製）に入力し、熱ペン
式レコーダー上に連続記録し、同時に循環動態解析シス
テム（ＭＰ１００ＷＳ、ＢＩＯＰＡＣ Ｓｙｓｔｅｍ社
製）を介して、循環動態解析ソフト（ＭＰ／ＶＡＳ、フ
ィジオテック社製）によりコンピュータ（Ｐｏｗｅｒ
Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ Ｇ３ＤＴ３００、Ａｐｐｌｅ社
製）の外部記憶装置（ハードディスク）に記録採取し
た。採取された心電図および左室圧データは循環動態解
析ソフトを用いて、心筋虚血の指標としてＳＴ偏位, Ｔ
波電位および左室に対する前負荷の指標である左心室拡
張終期圧（ＬＤＥＤＰ）をそれぞれ算出した。また左室
圧データより心機能解析ソフト（Ｖｍａｘ ＴＣ Ａｎ
ａｌｉｚｅ ｖｅｒ．１．１．０、フィジオテック社
製）を用いて、収縮機能の指標として、ＬＶｄＰ／ｄｔ
ｍａｘ（左室圧一次微分最大値）、ＬＶｄＰ／ｄｔ／
Ｐ ｍａｘ（左室圧一次微分左室圧補正値最大値）、Ｖ
ｍａｘ（無負荷最大短縮速度）、拡張機能の指標として
−ＬＶｄＰ／ｄｔ ｍｉｎ（左室圧一次微分最小値）お
よび時定数Ｔをそれぞれ求めた。

【００１７】また、試験終了後に再度、冠動脈を結紮し
て、２ｍｇ／ｍＬエバンスブルー溶液２ｍＬを尾静脈よ
りボーラス投与した後に心臓を採取し、左心室重量およ
びエバンスブルー染色されない左心室心筋虚血部重量を
測定した。さらに虚血部心筋をＴＴＣ染色（２，３，５
−トリフェニルテトラゾリウム。染色条件は３７℃で２
０分間とする）し、染色されない左心室心筋壊死部重量
を測定した。

【００１８】測定ポイント 冠動脈結紮前（被験物質投与前後）、結紮（虚血）２０
分後、再潅流２時間後に循環動態および心電図の変化を
測定した。

【００１９】評価項目は、平均血圧、心拍数、ＳＴ偏
位,、Ｔ波電位、左心室拡張終期圧、ＬＶｄＰ／ｄｔ
ｍａｘ、ＬＶｄｔ／ｄｔ／Ｐ ｍａｘ、Ｖｍａｘ、−Ｌ
ＶｄＰ／ｄｔ ｍｉｎ、時定数、不整脈の発生頻度、心
筋虚血部と左心室の重量比、心筋壊死部と心筋虚血部の
重量比とした。

【００２０】データ処理：得られた値は平均値±標準誤
差で表わした。評価項目における影響は、ベヒクル群と
の差について虚血時と再潅流時それぞれで反復測定分散
分析を行い、ｔ−検定による解析を行った（ベヒクル群
に関しては、モデル確立確認のため、前値との差につい
てＤｕｎｎｅｔｔ法による解析を行った）。また各重量
比についてはベヒクル群との差についてｔ−検定による
解析を行った。それぞれ危険率が５％未満の場合を有意
差ありとした。なお、データ処理は非臨床解析システム
により行った。結果を表１〜４に示す。

【００２１】

【表１】

【００２２】

【表２】

【００２３】表中、各数値は実験直前の値を０として算
出したものである。^*はベヒクル群との間に危険率５％
未満で有意差があることを示す。

【００２４】

【表３】

【００２５】表中、各数値は実験直前の値を０として算
出したものである。^**はベヒクル群との間に危険率１％
未満で有意差があることを示す。

【００２６】

【表４】

【００２７】表中、^**はベヒクル群との間に危険率１％
未満で有意差があることを示す。

【００２８】結果：ベヒクル群において前値との差の検
定で、Ｔ波電位では虚血時に、また、平均血圧、心拍
数、時定数では再潅流後に、そして、ＬＶｄＰ／ｄｔ
ｍａｘ、−ＬＶｄＰ／ｄｔ ｍｉｎ、ＬＶｄＰ／ｄｔ／
Ｐ ｍａｘ、左心室拡張終期圧では、虚血時および再潅
流後に有意差が認められたことから、今回の虚血再潅流
モデルは成立しているものと考えられた。また、心筋虚
血部／左心室重量比においては、ベヒクル群とＡＴ−Ｉ
ＩＩ投与群の間に有意差は認められず、両群とも同程度
の心筋虚血を生じさせたことが示唆された。

【００２９】ＡＴ−ＩＩＩの影響について反復測定分散
分析を行った結果、心拍数と−ＬＶｄＰ／ｄｔ ｍｉｎ
にのみ有意差［群（Ｇｒｏｕｐ）あるいは群×時間（Ｇ
ｒｏｕｐ×Ｔｉｍｅ）］が認められた。このうち、−Ｌ
ＶｄＰ／ｄｔ ｍｉｎにおいて、虚血２０分後および再
潅流２時間後にベヒクル群に対して有意な改善作用を認
めた（表２および表３）。なお、ＬＶｄＰ／ｄｔ ｍａ
ｘにおいても−ＬＶｄＰ／ｄｔ ｍｉｎと同様の傾向が
認められたが、測定値の欠損値を考慮した反復測定分散
分析の結果では有意差が認められなかった。ただし、Ｔ
ｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法では再潅流２時間後にベヒク
ル群に対して有意な改善作用を認めた。

【００３０】心筋壊死部／心筋虚血部重量比に関して、
ＡＴ−ＩＩＩ投与群はベヒクル群に対して有意な心筋壊
死抑制作用を認めた（表４）。

【００３１】考察：ＬＶｄＰ／ｄｔ ｍａｘ、平均血
圧、心拍数などにおいてベヒクル群のみ再潅流２時間後
において低下を認めたことから、−ＬＶｄＰ／ｄｔ ｍ
ｉｎの結果とも併せるとＡＴ−ＩＩＩ投与により心機能
低下が抑制されていることが考えられた。また、ベヒク
ル群に関しては再潅流後に死亡例があり、ＡＴ−ＩＩＩ
投与群にはそのような例が認められなかったことからも
ＡＴ−ＩＩＩの心機能低下抑制が示唆された。この心機
能低下抑制作用は、心筋壊死部／心筋虚血部重量比がＡ
Ｔ−ＩＩＩ投与群で著明に抑制されていたことから、虚
血再潅流による心筋壊死をＡＴ−ＩＩＩが抑制したこと
によるものと考えられた。

【００３２】実験例２（急性毒性） 急性毒性ＬＤ₅₀はマウス・ラットで雌雄に差はなく、静
脈内・経口とも１５０００単位／ｋｇ体重以上、皮下で
は２万単位／ｋｇ体重以上であった。また、サル（雄）
では静脈内投与で６０００単位／ｋｇ体重以上であっ
た。

【００３３】実施例１ コーンの冷アルコール分画法で得られた画分ＩＶ−１の
ペースト１０ｋｇを生理食塩水１００Ｌに懸濁し、硫酸
バリウムを５（ｗ／ｖ）％になるように加え、室温で３
０分間撹拌し、微量に存在するプロトロンビンを硫酸バ
リウムに吸着させて除去した。この上清液をｐＨ６．５
に調整し、ポリエチレングリコール＃４０００を１３
（ｗ／ｖ）％になるように加え、生じた沈澱を遠心分離
して除き、さらにポリエチレングリコール＃４０００を
３０（ｗ／ｖ）％になるように加え、さらに生じた沈澱
を遠心分離して回収した。この沈澱を冷生理食塩水約２
０Ｌに溶解し、予め生理食塩水で調製されたヘパリンセ
ファロースを充填したカラムへ注入し、ＡＴ−ＩＩＩを
カラムに吸着させた。このカラムを０．４Ｍの塩化ナト
リウム溶液で洗浄して夾雑蛋白を除去した後、２Ｍの塩
化ナトリウム溶液をカラムに流して溶出画分を回収し
た。この画分（ＡＴ−ＩＩＩの水溶液）にクエン酸ナト
リウムを０．６Ｍの濃度に加え、ｐＨ７．８に調整した
後、６０℃で１０時間の加熱処理を施し、続いて０．９
（ｗ／ｖ）％塩化ナトリウム溶液に対し一晩透析を行い
つつ濃縮してＡＴ−ＩＩＩの１（ｗ／ｖ）％水溶液を
得、必要に応じて濾過または遠心分離を行って透明な溶
液とした。このＡＴ−ＩＩＩの１（ｗ／ｖ）％水溶液に
マンニトールを２（ｗ／ｖ）％、クエン酸ナトリウムを
０．２（ｗ／ｖ）％となるように加え、また塩化ナトリ
ウムが０．５（ｗ／ｖ）％になるように少量の冷蒸留水
で希釈し、１Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨ７．６に調整
した後、滅菌したミリポアフィルターで除菌濾過し、５
００単位づつ分注し、凍結乾燥を行って乾燥製剤とし
た。

【００３４】実施例２ １バイアル中、ＡＴ−ＩＩＩ ５００単位、マンニトー
ル２００ｍｇ、塩化ナトリウム５０ｍｇおよびクエン酸
ナトリウム５２ｍｇからなる凍結乾燥品を調製し、静注
用製剤とした。これを用時、２０ｍｌの注射用蒸留水に
溶解して患者に投与する。

【００３５】

【発明の効果】本発明によれば、ＡＴ−ＩＩＩは、心筋
壊死を抑制する、特に虚血再潅流による心筋壊死を抑制
する作用を有する。また、当該作用により心機能低下を
抑制する作用をも併せ持つものである。よって、ＡＴ−
ＩＩＩは心筋保護剤として臨床上、極めて有用である。

フロントページの続き Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA03 CA18 CA26 CA36 DC35 MA44 MA66 NA04 NA14 ZA362 ZC412

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト由来アンチトロンビン−ＩＩＩを
   有効成分とする心筋保護剤。