JP2001002586A - 重粒子線療法用薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 重粒子線療法との併用療法において、併用さ
れて優れた効果を発揮する化学薬剤を求めること。 【解決手段】 ＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニスト、特に
抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗体からなる薬剤を
重粒子線療法用薬剤とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、重粒子線療法、す
なわち、重粒子線を腫瘍に照射して治療するという重粒
子線抗腫瘍治療方法において、該方法の長所を伸ばし、
短所を補うために行われる併用療法において用いられる
化学療法剤、すなわち重粒子線療法用薬剤に関するもの
であり、製薬技術の属するものである。

【０００２】

【従来の技術】腫瘍の治療方法として放射線療法は、手
術療法や化学療法とともに、重要な手段であり、特に重
粒子線療法は、体内で速度が小さくなり止まる寸前で最
大の電離を起すため病巣に高線量を集中させることがで
き、また、病巣が重要器官に接していても選択的照射が
可能で、比較的安全に治癒線量が照射できるという特長
を有している。さらに、照射をうけた細胞の放射線障害
は回復し難く、細胞周期の受け難いため、細胞致死効果
が大きく、放射線抵抗性といわれる難治性の腫瘍に対し
ても有効性が期待できるという優れた特長を有するもの
である。ちなみに、最近発表された臨床試験の例では、
頭頚部腫瘍で８０〜８５％、肺腫瘍で７６〜８０％、肝
腫瘍で８６〜９０％、子宮腫瘍で６５％、前立腺腫瘍で
１００％といわれている（1999-3-15 日本経済新聞）。
一方、放射線療法、手術療法および化学剤療法のいずれ
も、現在ある限界があり、また、いずれの療法の腫瘍に
対する攻略面に相違があるため、それらの療法の長所を
伸ばし、短所を補う意味で併用療法がおこなわれてい
る。放射線療法に併用される薬剤に求められる効果とし
ては、両者が別々の効果を示し、全体としては両方の効
果を加えたものとなる相加効果、それぞれの効果の和以
上の効果が得られる相乗効果および薬剤のみでは有効で
ないが放射線と併用すれば、放射線の効果を増す増感効
果である。これらの具体例としては、例えば、増感効果
を示すものとしては2-ニトロイミダゾール誘導体が挙げ
られ（特開平９−２５２６８）、相乗効果をしめすもの
としてアンギオスタチン(Nature, Vol. 394, p287-291,
1998)等が挙げられる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、上記の
様に優れた特長を有する重粒子線療法において、その長
所を伸ばし、短所を補うべく、化学剤療法との併用を検
討し、併用して優れた効果を発揮する薬剤を求めること
を目的として鋭意研究を行った結果、本発明を完成させ
たのである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、Ｖ
ＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニストからなる重粒子線療法用
薬剤、また、該ＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニストが抗Ｖ
ＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗体である前記重粒子線
療法用薬剤、さらには、抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクロー
ナル抗体がＶＥＧＦ／ＶＰＦのアミノ酸配列の一部であ
る下記配列１〜３の少なくとも１つと反応する抗体であ
る前記重粒子線療法用薬剤に関するものである。 １．ＫＰＳＣＶＰＬＭＲ ２．ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰ ３．ＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲ

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明におけるＶＥＧＦ／ＶＰＦ
アンタゴニストとは、血管透過性因子(VPF)［血管内皮
細胞増殖因子(VEGF)とも呼称されており、本明細書で
「ＶＥＧＦ／ＶＰＦ」と総称する]の作用を阻害する機
能を有するものを意味するものである。ＶＥＧＦ／ＶＰ
Ｆは、直接的に血管内皮細胞に作用し、血管新生すなわ
ち毛細血管内皮細胞の増殖、移動および組織への浸潤と
いう現象を誘発し、胎児の生長、創傷治癒、癌細胞の増
殖などの生理または病理的現象において重要な作用を果
たしているものである。また、ＶＥＧＦ／ＶＰＦは、マ
ウス、ラット、モルモット、ウシ及びヒトの正常又は腫
瘍細胞株で分泌されており、組織別では脳、下垂体、腎
臓、卵巣に存在することが明らかにされており[Ferrar
a, N.等、Endocrine Reviews 13: 18(1992)]、ヒトＶＥ
ＧＦ／ＶＰＦ遺伝子についてはそのcDNAがすでに単離さ
れて塩基配列が決定され、アミノ酸配列も推定されてい
る。この遺伝子からアミノ酸残基数の異なる４種類の蛋
白（アミノ酸残基数１２１個、１６５個、１８９個、２
０６個の４種類）が作られ、それらの中で１２１個のア
ミノ酸残基数のもの（ＶＥＧＦ121）と１６５個のアミ
ノ酸残基数のもの（ＶＥＧＦ165）が成熟蛋白であると
言われている[Ferrara, N.等、Endocrine Reviews 13:
18(1992)]。ＶＥＧＦ121はＶＥＧＦ165のカルボキシル
末端側の４４個のアミノ酸が欠失したものであるが、Ｖ
ＥＧＦ121とＶＥＧＦ165の間に、血管内皮細胞に対する
作用の違いがあるかどうかについては明らかにされてい
ない。

【０００６】血管新生阻害物質として知られているもの
としては、例えば、プロタミン（Taylor, S. et al., N
ature, 297, 307, 1982)、ヘパリンとコーチゾンの併用
剤（Folkman, J. et al., Science, 221, 71, 1983)、
プレドニゾロン・アセテート（Robin, J. B., Arch. Op
thalmol., 103, 284, 1985）、硫酸化多糖（特開昭63-1
19500号公報）、ハービマイシンＡ（特開平63-295509号
公報）、フマギリン（特開平1-279828号公報）、インタ
ーフェロンβ（国際公開第WO/29092号公報）等が知られ
ており、直接的にＶＥＧＦ／ＶＰＦについては、その血
管新生作用が抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦ抗体によって阻止され
ることが示唆されている（特表平８−５０２５１４号公
報）。さらにＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニストとして
は、ＶＥＧＦ／ＶＰＦの作用を阻害する機能を有するも
のであれば如何なる形態のものでもよく、ＶＥＧＦ／Ｖ
ＰＦに作用する抗体の一部分、ＶＥＧＦ／ＶＰＦの作用
を阻害する不活性なＶＥＧＦ／ＶＰＦ、またはその一部
分、ＶＥＧＦ／ＶＰＦの受容体の機能を損なう、例え
ば、血管透過性因子受容体に対する抗体またはその一部
分、さらには、ＶＥＧＦ／ＶＰＦの産生そのものを抑制
する薬剤等も挙げることができる。代表的なＶＥＧＦ／
ＶＰＦアンタゴニストとしては、抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモ
ノクローナル抗体が挙げられ、ＶＥＧＦ／ＶＰＦに作用
する抗体としては、アミノ酸残基数１２１個、１６５
個、１８９個又は２０６個の４種類のＶＥＧＦ／ＶＰＦ
サブタイプの何れに対する抗体であってもよい。特に、
該抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗体が、ＶＥＧＦ
／ＶＰＦのアミノ酸配列の一部である下記配列１〜３： １．ＫＰＳＣＶＰＬＭＲ ２．ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰ ３．ＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲ の少なくとも１つと反応する抗体がであることが好まし
い。

【０００７】上記の抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦ抗体としては、
マウス抗体等もあげられるが、ヒトへの投与において副
作用を軽減するための処理を行ったものも使用すること
ができる。例えば、マウスモノクローナル抗体をポリエ
チレングリコールのような物質で化学修飾を行い、抗原
性を軽減させたもの、また、マウスモノクローナル抗体
の可変領域を残して他の部分をヒトの抗体に変換させた
マウス・ヒトキメラ抗体や、マウスモノクローナル抗体
の抗原との結合領域であるＣＤＲ領域を残して他の領域
をヒト抗体に抗原との結合力を保持させたまま置き換え
たヒト化抗体も使用することができる。さらに、これら
を酵素的に切断して低分子化した抗体も使用することが
できる。該キメラ抗体またはヒト化抗体としては、Ｉg
Ｇタイプ又はＩgＡタイプ等があげられ、該ＩgＧのイソ
タイプとしては、ＩgＧ１、ＩgＧ２、ＩgＧ３又はＩgＧ
４があげられる。

【０００８】重粒子線療法は、炭素イオン等を高速に加
速し、腫瘍病巣に照射して治療する方法であり、従来の
ガンマ線やエックス線を利用した治療方法に比べ、腫瘍
細胞に対する殺傷が高く、病巣に的を絞って照射するこ
とができ、正常な細胞への影響力を最小に抑えることが
できる方法である。重粒子線療法は、局所進行性で、増
殖が遅く、放射線抵抗性の腫瘍、たとえば唾液腺腫瘍、
副鼻腔腫瘍、頭頚部腫瘍、前立腺癌、骨・軟部組織肉
腫、子宮肉腫、悪性黒色腫に対して最も効果的であり、
重要臓器に接する腫瘍、たとえばブドウ膜黒色腫、下垂
体腺腫、髄膜腫、動静脈奇形、聴神経鞘腫、軟骨肉腫、
脊索腫などに対しても有効なものである。重粒子線の照
射装置としては、体内深部に存在する腫瘍を治療するた
めには、体内飛程が３０cm程度必要であり、そのために
は約５,０００ＭeＶという高エネルギーの粒子線をつく
らなければならないため、サイクロトロンやシンクロト
ロンという高エネルギー粒子線加速器が用いられる。治
療のための重粒子線照射は、最大耐量と最大許容量に基
ずき、副作用と抗腫瘍効果を考慮して決められ、腫瘍の
位置の正確な把握、照射方向、治療門数、各門の線量等
を慎重に検討して行われる。因みに、頭頚部組織におけ
る耐容線量は、１回線量３.６〜４.０ＧyＥを４週間で
１６回照射したとき、総線量５７.６〜６２.０ＧyＥで
あり、速中子線治療で用いられている線量とほぼ等価で
ある(辻井、金井、Biotherapy 13(3):240-259, March,
1999)。

【０００９】本発明の重粒子線療法用薬剤を投与する場
合、投与する対象は特に限定されない。例えば、局所又
は全身投与することができ、投与する方法としては経口
又は非経口でもよく、経口投与には舌下投与を包含す
る。非経口投与には注射例えば皮下、筋肉、血管内、腹
腔内又は胸腔内などへの注射、点滴、座剤等を含む。
又、その投与量および有効成分の割合は動物か人間かに
よって、又年齢、投与経路、投与回数により異なり、広
範囲に変えることができる。この場合ＶＥＧＦ／ＶＰＦ
アンタゴニストの有効量と適切な希釈剤および薬学的に
使用し得る担体の組成物として投与される有効量は０.
１〜１００mg/kg体重/日であり１日１回から数回に分け
て毎日又は数日に１回又は１〜２週間に１回投与され
る。ＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニストは、一般に重粒子
線照射の後に投与されるが、照射前に投与してもよい。
本発明の重粒子線療法用薬剤を非経口投与する場合に
は、安定剤・緩衝剤・保存剤・膨張化剤等の添加剤を含
有し通常単位投与量アンプル若しくは多投与量容器又は
チューブの状態で提供される。たとえば、注射用製剤
は、精製されたＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニストを溶
剤、たとえば、生理食塩水、緩衝液などに溶解し、それ
に、吸着防止剤、たとえば、Ｔｗｅｅｎ８０、ゼラチ
ン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などを加えたもので
あり、または、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥
したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤とし
ては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコール
や糖類を使用することができる。同様に、点眼液、点眼
軟膏、乳化剤等の形態としたり、滞留を延長させるため
にリポソームやマイクロスフェアーにして使用すること
も出来る。また経口投与する場合はそれに適用される錠
剤・顆粒剤・細粒剤・散剤・カプセル剤等は通常それら
の組成物中に製剤上一般に使用される結合剤・包含剤・
賦形剤・滑沢剤・崩壊剤・湿潤剤のような添加剤を含有
する。又、経口用液体製剤としては内用水剤・懸濁剤・
乳剤・シロップ剤等いずれでの状態であってもよく、
又、使用する際に再溶解させる乾燥生成物であっても良
い。更にその組成物は添加剤・保存剤の何れを含有して
も良い。

【００１０】ＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニストとしての
抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗体の調製方法は以
下のとうりである。 〇 モノクローナル抗体の製造 各モノクローナル抗体は動物をＶＥＧＦ／ＶＰＦで免疫
し、その脾細胞を取り出しこれをミエローマ細胞と融合
して得たハイブリドーマ細胞を培養することにより製造
することができる。このハイブリドーマの製造は例えば
KohlerとMilsteinの方法[Nature,256:495(1975)]等によ
り行うことができる。 (1)抗体産生細胞の調製 免疫用動物にはマウス、ラット、ウサギ等の齧歯類が用
いられる。ミエローマ細胞としてはマウスまたはラット
由来の細胞が用いられる。そして免疫動物１匹に対して
ＶＥＧＦ／ＶＰＦ１０〜１００μｇの量を抗原として２
〜４週間の間隔で少なくとも計２〜３回の免疫を行う。
動物の飼育及び脾細胞の採取は常法に従って行われる。
尚、免疫の際には抗原に例えばグルタチオン-Ｓ-トラン
スフェラーゼ等を融合させて得られた蛋白質又はキーホ
ールリンペットヘモシアニン等を結合させて得られた複
合蛋白質を抗原として用いることもできる。 (2)ミエローマ細胞の調製 ミエローマ細胞としてはマウスミエローマSp2/O-Ag14(S
p2)、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)、P3×63-Ag.8.U・1(P3U1)等
が挙げられる。これらの細胞の継代培養は常法に従って
行われる。 (3)細胞融合 脾細胞とミエローマ細胞とを１：１〜１０：１の割合で
混合してポリエチレングリコールと混合するか電気パル
ス処理することにより細胞融合を行うことができる。 (4)ハイブリドーマの選択 融合細胞（ハイブリドーマ）の選択はヒポキサンチン
(１０-3〜１０-5Ｍ)、アミノプテリン(１０-6〜１０-7
Ｍ)、チミジン(１０-5〜１０-6Ｍ)を含む培地を用いて
培養して生育してくる細胞をハイブリドーマとすること
により行われる。 (5)ハイブリドーマの培養 ハイブリドーマのクローン化は限界希釈法により少なく
とも２回繰り返して行う。ハイブリドーマを通常の動物
細胞と同様にして培養すれば培地中に本発明のモノクロ
ーナル抗体が産生される。又、ハイブリドーマ細胞をマ
ウス腹腔内に移植して増殖させることにより腹水中に本
発明のモノクローナル抗体を蓄積させることもできる。 (6)モノクローナル抗体の採取及び精製 ハイブリドーマ細胞の培養液中又は腹水中に蓄積したモ
ノクローナル抗体は従来から用いられている硫安分画
法、ＰＥＧ分画法、イオン交換クロマトグラフィー及び
ゲル濾過クロマトグラフィーを用いる方法で精製され
る。又、プロテインＡやプロテインＧ等のアフィニティ
ークロマトグラフィーによる方法も利用できる。モノク
ローナル抗体の選別には酵素免疫測定法、ウエスタンブ
ロッティング法等が用いられる。又、モノクローナル抗
体のアイソタイプの決定はモノクローナル抗体の酵素免
疫測定法又はオクタロニー法等によって行うことができ
る。

【００１１】

【実施例】〇 抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗体
ＭＶ833の調製 （１）抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマの作製 単離したヒトＶＥＧＦ／ＶＰＦのcＤＮＡにて形質転換
した酵母の培養液よりヒトＶＥＧＦ／ＶＰＦを精製し
(特開平７−３１４９６号参照)、キーホールリンペット
ヘモシアニン(ＫＬＨ)とグルタルアルデヒドを用いて複
合体を作製し、得られた蛋白を抗原として常法に従って
マウスモノクローナル抗体を作製した。即ち、ＫＬＨ-
ＶＥＧＦ／ＶＰＦで免疫したマウスの脾細胞とマウスミ
エローマ細胞(Ｓp2)をポリエチレングリコール存在下で
細胞融合させた。得られたハイブリドーマは限界希釈法
によりクローニングした。ＶＥＧＦ／ＶＰＦとクローン
化したハイブリドーマの培養上清の反応性を酵素免疫測
定法により調べ、ＶＥＧＦ／ＶＰＦと反応するモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを選択した。又、
このハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体をＭ
Ｖ833と命名した。なお、得られたモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマは通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５６６９として
寄託されている。

【００１２】（２）抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル
抗体の調製 選択したハイブリドーマをヌードマウスの腹腔内に移植
し、モノクローナル抗体を大量に含む腹水を採取した。
この腹水中からプロテインＧアフィニティーカラム(Ｍ
ＡbＴrapＧII、ファルマシア社製）を用いてモノクロー
ナル抗体を精製した。又、抗体のクラスを抗マウス免疫
グロブリンサブクラス特異的抗体を用いた酵素免疫測定
法により調べた結果、ＭＶ833抗体のクラスはＩgＧ1で
あった。又、下記の方法で測定したＶＥＧＦ121及びＶ
ＥＧＦ165に対する解離定数は以下の通りであり本発明
のモノクローナル抗体はＶＥＧＦ／ＶＰＦに対して強い
親和性を有することがわかる。 ○ ５.７０×１０-11Ｍ±０.３５×１０-11Ｍ（ＶＥＧ
Ｆ121) ○ １.１０×１０-10Ｍ±０.１１×１０-10Ｍ（ＶＥＧ
Ｆ165) 解離定数の測定方法 モノクローナル抗体を０.１Ｍ塩化ナトリウムを含む２
５mＭ炭酸緩衝液(pＨ=９.０)で２μg/mlに調製し、取り
外し可能な有穴プレートに１００μlずつ添加し４℃で
一晩放置する。次に穴から溶液を除き１％ＢＳＡ-ＰＢ
Ｓを３００μlずつ添加し３７℃で４時間放置する。１
％ＢＳＡ-ＰＢＳを取り除いた後０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳ
で調製したＶＥＧＦと125Ｉ標識ＶＥＧＦ(125Ｉ標識Ｖ
ＥＧＦ121はＶＥＧＦ121をクロラミンＴ法により標識、
125Ｉ標識ＶＥＧＦ165はアマシャム社より購入)反応混
液を穴あたり２００μl添加して一晩放置する。この反
応混液中のＶＥＧＦ濃度はＶＥＧＦ121が０〜１ng/穴，
ＶＥＧＦ165が０〜１０ng/穴、125Ｉ標識ＶＥＧＦが１
×１０4cpm/穴(125Ｉ標識ＶＥＧＦ121;６６.７pg/穴、1
25Ｉ標識ＶＥＧＦ165；１１６pg/穴)とする。穴から反
応混液を取り除き０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳで６回洗浄した
後、穴を１個ずつ切り離して分析用チューブに入れガン
マーカウンターにてカウントし、その結果より作成した
散布図から解離定数を求める。又、下記の方法で測定し
た本発明のモノクローナル抗体の等電点はpＩ＝５.２〜
５.５であった。現時点で報告のある他のＩgＧ1タイプ
の抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗体の等電点は我
々の報告しているＭＶ101がpＩ＝７.０〜７.５でありジ
ェネンテック社のＡ４.６.１がpＩ＝４.２〜５.２[Kim,
K.J. et.al. Growth Factors,7:53(1992)]であり本発明
の物質はいずれの物質とも異なる物質である。 等電点の測定方法 モノクローナル抗体の等電点電気泳動は市販の等電点電
気泳動用アガロースゲル(和科盛社)を使用し同社の等電
点電気泳動層にて泳動した。泳動は等電力出力可能なパ
ワーサプライ(バイオラド社)により３Ｗで３０分間泳動
した。泳動後ゲルは銀染色キット(バイオラド社)にて蛋
白染色した。モノクローナル抗体の等電点は同時に泳動
した等電点マーカー蛋白の泳動度より抗体の等電点を求
めた。

【００１３】（３）ＶＥＧＦ／ＶＰＦ中のモノクローナ
ル抗体の反応部位の同定 (3-1) ＶＥＧＦ／ＶＰＦのアミノ酸配列の一部分に相当
するペプチドの作製 ヒトＶＥＧＦ121のアミノ配列の連続した１２個のアミ
ノ酸を１つのペプチドとして全配列を網羅する６７種の
ペプチドを考案し、各ペプチドをマルチピンペプチド合
成法[Maeji,N,J, et.al. J.Immunol.method,134:23(199
0)]により合成した。まず９６穴アッセイプレート用ピ
ンブロックのピンの先端に導入された9-フルオレニルメ
トキシカルボニル(Ｆmoc)-β-アラニンからピペリジン
によりＦmoc基を除去した後、ジシクロヘキシカルボジ
イミドとヒドロキシベンゾトリアゾール存在下でＦmoc-
アミノ酸を縮合させた。N,N-ジメチルホルムアミドで洗
浄後、再びジシクロヘキシカルボジイミドとヒドロキシ
ベンゾトリアゾール存在下でＦmoc-アミノ酸を縮合さ
せ、この操作を繰り返すことにより目的のペプチドを合
成した。縮合反応終了後、無水酢酸でアセチル化を行
い、さらにトリフルオロ酢酸で側鎖保護基を除去した。
ピン上で合成したペプチドはピンを中性溶液中に浸すこ
とにより切り出した。合成したペプチドの定量はオルト
フタルアルデヒドを用いてアミノ基を定量することによ
り行った。合成した６７種のペプチドのアミノ酸配列を
表１に示した。数字はペプチド識別番号を示す。

【００１４】

【表１】

【００１５】(3-2) ＭＶ833抗体と反応するペプチドの
同定 以上のようにして合成した６７種のペプチドはヒトＶＥ
ＧＦ121の全領域に対応するものである。したがって６
７種のペプチドとＭＶ833抗体との反応性を調べること
によりＭＶ833抗体がＶＥＧＦ／ＶＰＦのどの部位に反
応しているかを明らかにすることができる。そこで酵素
免疫測定法により６７種のペプチドとＭＶ833抗体との
反応性を調べた。９６穴ＮＯＳプレート(コースター社
製)に６７種の２０μＭペプチド溶液を入れ室温で２時
間放置した。０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳでプレートの穴を３
回洗浄した後、２％ＢＳＡ-ＰＢＳを入れ室温で１時間
放置した。２％ＢＳＡ-ＰＢＳを除いた後、ＭＶ833(１
％ＢＳＡ-ＰＢＳ溶液)を入れ室温で１時間放置した。
０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳで６回洗浄後ペルオキシダーゼ標
識したヒツジ抗マウスＩgＧ(アマシャム社)(０.１％Ｂ
ＳＡ-ＰＢＳ溶液)を入れ室温で１時間放置した。０.１
％ＢＳＡ-ＰＢＳで６回洗浄後８.３mg/mlオルトフェニ
レンジアミン２塩酸塩および０.０１％過酸化水素を含
む０.２Ｍトリス−クエン酸緩衝液(pＨ=５.２)を入れて
発色させた。反応は２規定硫酸を加えて停止させた後、
吸光度(ＯＤ４９０／６５０)を測定した。なお、反応性
の測定には、上記のような酵素免疫測定法の他、オクタ
ロニー法、ウエスタンブロッティング法等を用いてもよ
い。ＭＶ833抗体は６７種類のペプチドの中でペプチド
識別番号３１、３２、３３、６０、６３の５つのペプチ
ドに強く反応した。ペプチド識別番号３１〜３３のペプ
チドにはＫＰＳＣＶＰＬＭＲという配列が共通に含まれ
ていることより、この領域ではＭＶ833抗体はＫＰＳＣ
ＶＰＬＭＲというアミノ酸配列部分と反応していると考
えられる。したがって、ＭＶ833抗体はＶＥＧＦ／ＶＰ
ＦのＫＰＳＣＶＰＬＭＲ配列とＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲ
Ｐ配列とＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲ配列とに反応してい
ることが予想される。抗体はタンパク質の表面に露出し
ている部分を認識すると考えられるため、この２種類の
アミノ酸配列部分はＶＥＧＦ／ＶＰＦの表面に露出して
いる部分であると言える。又、モノクローナル抗体は抗
原決定基が単一であると言われているが、高次構造をと
っている蛋白質などの高分子物質が抗原の場合は抗体が
立体的に抗原を認識し、蛋白質の一次構造レベルで抗体
の反応性を調べた時に二箇所以上の不連続なアミノ酸配
列に反応することがある。ＭＶ833抗体がＶＥＧＦ／Ｖ
ＰＦ中の二箇所のアミノ酸配列部分に反応したことよ
り、本抗体は二箇所のアミノ酸配列部分を立体的に同時
に認識していると考えられる。微量タンパク質やウイル
スの研究を行う場合現在ではその遺伝子のクローニング
を行い、その塩基配列よりタンパク質のアミノ酸配列が
予想できる。このアミノ酸配列をもとにして親水性の高
い部位を探索し、その部位の合成ペプチドに対するポリ
クローナル抗体やモノクローナル抗体を作製して免疫学
的解析に用いている。親水性の高い部位の探索にはHoop
＆Woodsらの方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824
(1981)]などを用いて解析しているが、あらゆるタンパ
ク質にあてはまるとは限らない。したがって本発明によ
りＶＥＧＦ／ＶＰＦの表面に露出している部位の中で血
管新生等の阻害に重要である部分が明らかにされたこと
により強い抗癌活性を有したＶＥＧＦ／ＶＰＦ抗体を容
易に作製できるようになり、また、本発明に採用された
方法は蛋白質の表面に露出している部位を明らかにする
方法としても適用できる。

【００１６】（４） 抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナ
ル抗体ＭＶ８３３と重粒子線療法の併用試験 ヌードラット(Fisher 344/Jcl-r-nu、５週齢、雄)をネ
ンブタール麻酔し、定位脳手術装置に頭部を固定後、デ
ンタルドリルで右前頭部に小孔を開け、ヒト悪性グリオ
ーマ細胞株Ｕ−２５１ＭＧを５×１０⁵個(５μl)をマイ
クロシリンジで定位的に右前頭葉内３.５〜４.０mmの深
さに移植した。創部を縫合して無菌動物室にて飼育し、
移植後１〜２週の間にＭＲＩを撮影した。ＭＲＩは、
１.５Ｔの超伝導ＭＲＩ装置で、ネンブタール麻酔後、
ラットを固定台に固定し、尾静脈から０.２mlのガドリ
ニウムを静注し、直径１５cmの表面コイルを用いてＴ１
強調画像を冠状断で撮影した。ＭＲＩで腫瘍の着床を確
認した後、対象群はそのまま経過を観察し、治療群は移
植１４〜２０日の間に放射線医学研究所(千葉)の重粒子
線治療センター生物照射室で照射した。照射は、１３５
ＭeＶまたは２９０ＭeＶの炭素イオンで１００ＫeＶの
線源を用い、Spread Out Bragg Peakは６cmとした。ラ
ットは、ネンブタール麻酔し、照射部位がＭＲＩで確認
した位置になるように直径１cmの穴のあいた４cmの厚さ
の真鍮のコリメーターまたは厚さ５mmのタングステン製
multileafコリメーターに固定して、照射台に取り付
け、照射の深さは脳表から６mmを後端として１回照射線
量は２０Ｇyまたは３０Ｇyとした。抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦ
モノクローナル抗体ＭＶ８３３は、照射後に５００μg
を週２回、計６回腹腔内投与した。対照群、重粒子線照
射群および重粒子線照射と抗体併用群のそれぞれにおけ
る平均生存期間を表２に示す。

【００１７】

【表２】

【００１８】表２から、本発明に従って重粒子線照射と
抗体の投与を併用した群では、その他の群よりも平均生
存期間が有意に延長され、重粒子線照射療法と抗VEGF/V
PF抗体の投与の併用は、腫瘍治療に極めて有効であるこ
とが示された。

【００１９】

【発明の効果】本発明によれば、すなわち、重粒子線照
射療法とＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニストの投与を併用
することにより、平均生存期間を有意に延長することが
できる。したがって、本発明は、各種の癌の治療に有効
に利用され得るものである。

【００２０】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン：

【００２１】配列番号：２ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン：

【００２２】配列番号：３ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン：

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニストからな
   る重粒子線療法用薬剤。
2. 【請求項２】 ＶＥＧＦ／ＶＰＦアンタゴニストが抗Ｖ
   ＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗体であることを特徴と
   する請求項１の重粒子線療法用薬剤。
3. 【請求項３】 抗ＶＥＧＦ／ＶＰＦモノクローナル抗体
   がＶＥＧＦ／ＶＰＦのアミノ酸配列の一部である下記配
   列１〜３の少なくとも１つと反応する抗体であることを
   特徴とする請求項２の重粒子線療法用薬剤。 １．ＫＰＳＣＶＰＬＭＲ ２．ＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰ ３．ＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲ