JP2000515020A

JP2000515020A - 植物の成長および収穫量を増大させる方法

Info

Publication number: JP2000515020A
Application number: JP10507124A
Authority: JP
Inventors: ドエルナー，ピーター，ダブリュ．; ラム，クリストファー，ジェイ．
Original assignee: ザソークインスティチュートフォーバイオロジカルスタディーズ
Priority date: 1996-07-18
Filing date: 1997-07-17
Publication date: 2000-11-14
Also published as: NZ333767A; US6696623B1; EP0929663A4; WO1998003631A1; BR9710872A; AU742968B2; CA2260287A1; IL128104A0; EP0929663A1; US6252139B1; AU3960597A; KR20000067901A; ZA976381B

Abstract

(57)【要約】本発明は、植物におけるサイクリン発現のレベルを上昇させることを含む、対応する野生型植物と比べて成長および収穫量が増大していることを特徴とする遺伝子改変された植物を産生する方法を提供する。成長および収穫量が増大していることを特徴とする遺伝子改変された植物も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】植物の成長および収穫量を増大させる方法発明の分野本発明は一般的に植物遺伝子操作に関し、具体的には成長および収穫量が増大していることを特徴とする遺伝子操作された植物の産生方法に関する。発明の背景各植物種に関して、自然環境条件によって植物成長に幅広い差異が存在する。大部分の条件下では、植物の最大成長潜在力は発揮されていない。植物育種(bre eding)は、植物の資源が個々の器官に転送されることにより成長が高められ得るということを証明している。植物の遺伝子操作は、遺伝物質、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを単離および操作し、その後その物質を植物または植物細胞に導入することを必然的に伴うものであり、近年、植物育種および農業をかなり変化させた。農作物の価値の増大、収穫量の増大、生産コストの低減、病害虫抵抗性、ストレス耐性、耐乾燥性、医薬、化学薬品および生物学的分子の生産、ならびにその他の有益な特性がすべて、遺伝子操作技術によって得られる可能性がある。遺伝子発現を操作する能力は、形質転換植物に新規特性をもたらす手段を提供する。例えば、植物の根系の大きさを増大させる能力は、土壌からの栄養素の吸収を増大させることができるであろう。さらに、葉の成長を増大させる能力は、太陽エネルギーを吸収する植物の能力を増大させるであろう。明らかに、植物全体またはその特定の標的器官の成長を制御する能力が非常に所望されている。発明の概要本発明は、サイクリン発現のレベルを高めることによって植物の成長および収穫量を増大させることができるという発見に基づくものである。第１の実施態様においては、本発明は、対応する野生型植物と比べて成長および収穫量が増大していることを特徴とする遺伝子改変された植物を産生する方法を提供する。この方法は、植物細胞をサイクリンタンパク質をコードする核酸（ここで、核酸は調節配列に作動可能なように(operably)結合されている）と接触させて形質転換された植物細胞を得て、その形質転換植物細胞から植物を産生させ、そして収穫量の増大を示す植物を選択することを含む。サイクリンをコードする核酸は、好ましくは、サイクリンcyc1aAtをコードする。別の実施態様においては、本発明は、植物を、その作用物質に接触させていない植物におけるサイクリン発現よりもサイクリン発現を高める作用物質と接触させることを含む、収穫量が増大していることを特徴とする植物を産生する方法を提供する。この作用物質は、転写因子、またはサイクリン導入遺伝子としての発現を誘導する内因性サイクリンプロモーターもしくはその他の化学的に誘導可能なプロモーターを誘導する化学物質であり得る。また、本発明は、本発明の方法によって産生された植物、植物組織および種子も提供する。図面の簡単な説明図１は、定常状態レベルのcdc2aAt ｍＲＮＡおよびｐ34タンパク質を示すものであり、パネルａは側根分裂組織のＩＡＡ誘導中のcyc1aAt ｍＲＮＡを示し、パネルｂは選択された非誘導トランスジェニック系におけるcyc1aAt ｍＲＮＡを示し、パネルｃは野生型に対して標準化した転写物レベルを示す。Col-O：野生型；1A2、2A5、4A3、11A1：T2ホモ接合性トランスジェニック系；6A、7A、8 A：T1ヘテロ接合性トランスジェニック系。図２は、根端および発達中の側根におけるcdc2aAtおよびcyc1aAt転写物のin s ituハイブリダイゼーション分析を示すものである。パネルａ〜ｄは、cdc2aAt（ａ）またはcyc1aAt（b〜d）アンチセンスプローブにハイブリダイズした静止根（パネルａ、ｂ）または原基における増殖細胞（パネルｃ、ｄ）の横断面を示すものである。パネルｅ、ｆは、根端における隣接する分裂組織細胞列(cell file s)中のcyc1aAt ｍＲＮＡ発生量を示す。転写物蓄積は、銀粒子付着によって示され、間接赤色照明によって視覚化した。目盛リバーはａ〜ｄでは10μｍであり、ｅでは５μｍである。fc：cyc1aAt転写物を蓄積している創始細胞；ｐ：内鞘細胞層；ｒ：根端方向；ｓ：シュート方向。図３は、cyclaAtサイクリンを異所的に発現しているシロイヌナズナタリアナ(Arabidoopsis thaliana)(A.タリアナ)における根の成長速度の増大を示すものである。パネルａ：野生型（左）またはcdc2aAt::cyc1aAt遺伝子融合物を含むトランスジェニック系6A（T1世代）（右）。シロイヌナズナ種子をＭＳ（３％スクロース）寒天上に播いて、７日間垂直方向に成長させた。ベクター単独もしくは無関係のプロモーター::uidA構築物またはcdc2aAt5’非翻訳リーダーがＤＳトランスポゾン挿入によって分断されているcdc2aAt::cyc1aAt融合物で形質転換した植物はこの表現型示さなかった。パネルｂ：野生型（左）または側根のＩＡＡ誘導の６日後のトランスジェニック系6A（T1世代）（右）。水耕法で成長させた１週齢の苗を10μＭのＩＡＡ_effで処理することにより側根発達を刺激した。好ましい実施態様の説明本発明は、農作物などの植物の収穫量を、植物におけるサイクリン発現レベルを高めることによって増大させる方法を提供する。分裂に対して反応能のある植物細胞におけるサイクリン発現の増大によって植物の成長の増大が生じる。好ましい実施態様においては、本発明は、遺伝子改変されていない植物（すなわち野生型植物）と比べて収穫量が増大していることを特徴とする、遺伝子改変された植物を産生する方法を提供する。この方法は、植物細胞をサイクリンタンパク質をコードする核酸(ここで、核酸は調節配列と作動可能なように結合されている)と接触させて形質転換された植物細胞を得て、その形質転換植物細胞から植物を産生させ、そしてその後成長および収穫量の増大を示す植物を選択することを含む。本明細書で用いられる場合、「収穫量」または「植物の収穫量」という用語は、作物の成長の増大および／または生物量の増大を意味する。一つの実施態様においては、収穫量の増大は成長速度の増大および根の大きさの増大から生じる。別の実施態様においては、収穫量の増大は、シュートの成長から誘導される。さらに別の実施態様においては、収穫量の増大は果実の成長から誘導される。「遺伝子改変」という用語は、本明細書で用いられる場合、１以上の外因性核酸配列、例えばサイクリンをコードする配列、ならびに調節配列を１以上の植物細胞に導入することを意味し、全体的な(whole)、性的に反応能のある(sexually competent)、生存能力のある植物を作製することができる。「遺伝子改変された」という用語は、本明細書で用いられる場合、上記のプロセスによって作製された植物をいう。本発明の遺伝子改変された植物は、生殖細胞系列内に保持された外来遺伝子を挿入するか農業的に有用な植物変種に改良することができるような自家受粉能または同種のその他の植物との他家受粉能を有する。「植物細胞」という用語は、本明細書で用いられる場合、プロトプラスト、配偶子産生細胞、および全植物に再生される細胞を意味する。本明細書で用いられる場合、「植物」という用語は、全植物、植物部分、植物細胞、または植物組織もしくは植物種子のような植物細胞の１群のいずれかを意味する。苗木も「植物」の意味に含まれる。本発明に含まれる植物は、形質転換技術に適合可能な任意の植物であり、裸子植物ならびに単子葉類と双子葉類の両方の被子植物が挙げられる。単子葉類被子植物の例としては、限定するものではないが、アスパラガス、トウモロコシ(field corn)、スイートコーン、大麦、小麦、米、モロコシ、タマネギ、パールミレット、ライ麦、カラスムギ、およびその他の穀類(cereal grains )が挙げられる。双子葉類被子植物の例としては、限定するものではないが、トマト、タバコ、綿、菜種、圃場豆(field beans)、大豆、コショウ、レタス、エンドウ、アルファルファ、クローバー、アブラナ属作物もしくはアブラナオレラセア(Brassica oleracea)（例えば、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ）、ラディッシュ、ニンジン、ビート(beets)、ナス、ホウレンソウ、キュウリ、カボチャ、メロン、カンタロープ、ヒマワリ、および種々の鑑賞植物が挙げられる。木種の例としては、ポプラ、マツ、セコイア、ヒマラヤスギ、オークなどが挙げられる。「外因性核酸配列」という用語は、本明細書で用いられる場合、受容植物宿主とは関係ない核酸、または固有の(native)核酸がその原形から実質的に改変されている場合にはその宿主固有の核酸を意昧する。例えば、この用語は、宿主種に源を発する核酸を含み、そのような配列は、天然または野生型プロモーターとは異なるプロモーターに作動可能なように連結されている。本発明の一般的な方法においては、サイクリンをコードする少なくとも１種の核酸配列がプロモーターに作動可能なように連結されている。サイクリン発現を高めるためには、サイクリンポリヌクレオチドの１以上のコピーを植物に導入するのが望ましくあり得る。例えば、サイクリンポリヌクレオチドの多数のコピーは植物におけるサイクリンの産生をさらにいっそう高める効果を有するであろう。「調節配列」という用語は、本明細書で用いられる場合、作動可能なように結合された遺伝子の転写を制御することが可能な核酸配列を意味する。したがって、プロモーターまたは調節エレメントの調節支配下に遺伝子を配置するということは、遺伝子の発現が調節配列によって制御されるように遺伝子を配置するということを意味する。一般に、プロモーターは、それらが制御する遺伝子の5'側（上流）に位置している。したがって、プロモーター遺伝子の組み合わせの構築においては、プロモーターは、好ましくは、遺伝子の上流の、プロモーターとプロモーターが自然環境において制御する遺伝子の間の距離に近い転写開始部位からの距離のところに配置されている。当技術分野で公知のように、この距離の多少の変動はプロモーターの機能を損なうことなく許容され得る。同様に、エンハンサーなどの調節エレメントの、その支配下に置かれた異種遺伝子に対する好ましい位置は、そのエレメントが天然で調節する構造遺伝子に対する天然の位置を反映する。本発明で利用されるサイクリンをコードする核酸としては、例えばサイクリンＢなどの分裂サイクリンをコードする核酸、例えばサイクリンＡなどのＳ期サイクリンをコードする核酸、ならびにＧ１期サイクリンをコードする核酸が挙げられる。本明細書で利用することができる具体的なサイクリンとしては、cyc1aAt 、cyc3aAt、cyc3bAt、cycd1、cycd2などが挙げられる。好ましくは、本発明の方法で用いられる核酸はcyc1aAtタンパク質をコードするものである（遺伝子バンク受託No.X62279)。本発明の遺伝子改変された植物は、植物細胞を所望のサイクリンをコードする核酸配列と接触させることによって産生される。植物細胞に導入された場合に有効であるためには、サイクリンをコードする核酸は、植物細胞においてサイクリン導入遺伝子の転写を誘導するのに有効なプロモーターと作動可能なように結合されなければならない。さらに、植物細胞において認識されるポリアデニル化配列または転写制御配列も使用され得る。本明細書に記載されているように、核酸はベクターによって導入されるのが好ましく、そしてその核酸配列を有するベクターは、培養物中で形質転換細胞を非形質転換細胞から選択することができるように１以上の選択マーカー遺伝子をも含むのが好ましい。「作動可能なように結合された」という用語は、調節配列、好ましくはプロモーター配列と、プロモーターによって調節されるサイクリンをコードする核酸配列との機能的な連結を意味する。作動可能なように連結されたプロモーターは、サイクリン核酸配列の発現を制御する。本発明において用いられるサイクリン遺伝子の発現は、いくつかのプロモーターによって誘導され得る。内因性、または目的の構造遺伝子の天然プロモーターが遺伝子の転写調節に利用され得るが、好ましくは、プロモーターは外来の調節配列である。全植物の成長および収穫量を増大させることが望ましい場合、サイクリン発現は、植物における分裂可能な全ての細胞に誘導されるべきである。これは、全ての分裂組織において活性なプロモーターを用いることによって達成することができる。そのようなプロモーターとしては、例えば、cdc2aプロモーターおよびcyc 07プロモーターが挙げられる（例えば、Itoら，Plant Mol．Biol．24:863，1994 ;Martinezら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:7360，1992;Medfordら，Plant C ell，3:359，1991;Teradaら，Plant Journal，3:241，1993;Wissenbachら，Plan t Journal，4:411，1993を参照されたい）。特定の器官の成長および収穫量を増大させることが望ましい場合、サイクリン発現は、適当な分裂組織、例えばシュート分裂組織、花分裂組織、根分裂組織などを標的とするべきである。これは、組織特異的プロモーターを用いることによって達成することができる。シュート分裂組織において活性な組織特異的プロモーターの例は、Atanassovaら，Plant Journal，2:291，1992およびModfordら，P lant Cell，3:359,1991に記載されている。花分裂組織において活性な組織特異的プロモーター例には、Bowmanら，Plant Cell，3:749，1991およびMandelら，N ature，360:273，1992に記載されているagamousおよびapetala l遺伝子のプロモーターがある。選択された特定のプロモーターは、収穫量の増大および／または生物量の増大をもたらすのに十分なサイクリン発現を引き起こすことが可能であるべきである。サイクリン発現は分裂に反応能のある細胞において変更することができるということが理解されるべきである。本発明のベクター構築物に用いられるプロモーターは、所望により改変することによってその制御特性に影響を及ぼし得るものである。任意に、選択マーカーをサイクリンをコードする核酸に結合してもよい。本明細書において用いられる場合、「マーカー」という用語は、マーカーを含む植物または植物細胞の選択またはスクリーニングを可能にするトレイトまたは表現型をコードする遺伝子を意味する。好ましくは、マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子であり、それによって適当な抗生物質を用いることにより形質転換されていない細胞から形質転換された細胞を選択することができる。適当な選択マーカーの例としては、アデノシンデアミナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、キサンチンーグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびアミノグリコシド3'-0-ホスホトランスフェラーゼIIが挙げられる。その他の適当なマーカーは当業者には公知であろう。本発明にしたがって形質転換プロセスを開始するために、まず、適当なベクターを構築し、それを植物細胞に適正に導入することが必要である。本発明において植物細胞の形質転換に用いられるベクターは、プロモーターと作動可能なように結合されたサイクリンをコードする核酸配列を含む。本明細書で利用されるベクターの構築の詳細は、植物遺伝子工学の分野の当業者には公知である。本発明で利用されるサイクリンをコードする核酸配列は、アグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)(A.ツメファシエンス)のTiプラスミド、アグロバクテリウムリゾジーンズ(Agrobacterium rhizogenes)(A. リゾジーンズ)の根誘導（Ri）プラスミドおよび植物ウイルスベクターを用いることにより植物細胞に導入することができる（かかる技術の概略については、例えば、Weissbach & Weissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology,A cademic Press，ニューヨーク，第VIII節，第421-463頁；およびGrierson & Cor ey，1988，Plant Molecular Biology，第２版，Blackie，ロンドン，第7-9章、およびHorschら，Science，227:1229，1985を参照されたい。これらはいずれも参照により本明細書に含まれるものである）。アグロバクテリウア菌のTiまたは Riプラスミドから誘導された植物形質転換ベクター以外にも、別法としては、例えば、リポソームの使用、エレクトロポレーション、遊離のＤＮＡ取込みを増大させる化学薬品、ウイルスまたは花粉を用いる形質転換、ならびにマイクロプロジェクション(microprojection)の使用が含まれ得る。当業者は比較的無傷の状態のサイクリンをコードする核酸配列を導入するのに適したベクターを選択することができるであろう。したがって、導入されたサイクリンをコードする核酸を有する植物を産生するベクターは、いずれも十分なはずである。裸の(naked)ＤＮＡの断片を使用した場合でも低効率ではあるが本発明の特性が得られるものと予想される。ベクターの選択、またはベクターを使用するかどうかは、典型的には、選択される形質転換方法によって導き出される。本発明による植物の形質転換は、本質的に、植物分子生物学の分野の当業者に公知の種々の方法のいずれかにおいて行い得る（例えば、Methods of Enzymolog y，第153巻，1987，WuおよびGrossman編，Academic Pressを参照されたい。これは参照により本明細書に含まれるものである）。本明細書で用いられる場合、「形質転換」という用語は、サイクリン−核酸配列の導入による宿主植物の遺伝子型の変更を意味する。例えば、サイクリンをコードする核酸は、上記で簡単に述べたように、Tiプラスミドを含むA．ツメファシエンスを利用することによって植物細胞に導入することができる。形質転換媒体(vehicle)としてA.ツメファシエンス培養液を用いる場合、形質転換された組織の正常な非がん遺伝子分化が可能であるようにアグロバクテリウムの非がん遺伝子株をベクター担体として用いることが最も有利である。また、アグロバクテリウムは、バイナリー(binary)Tiプラスミド系を有することも好ましい。そのようなバイナリー系は、１）転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）の植物への導入に必須の毒性(virulence)領域を有する第１のTiプラスミド、および２）キメラプラスミドを含む。このキメラプラスミドは移入される核酸に隣接する野生型TiプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の少なくとも１個のボーダー(borde r)領域を含む。バイナリーTiプラスミド系は、植物細胞の形質転換において有効であることが示されている（De Framond，Biotechnology，1:262，1983;Hoekema ら，Nature，303:179，1983)。そのようなバイナリー系は、A.ツメファシエンスのTiプラスミドへの組込み（これは古い方法論である）を必要としないので、好ましい。本発明による形質転換においてアグロバクテリウムの使用を含む方法は、限定するものではないが、１）アグロバクテリウムと培養され、単離されたプロトプラストとの共培養；２）アグロバクテリウムを用いた植物細胞または組織の形質転換；または３）アグロバクテリウムを用いた種子、頂部または分裂組織の形質転換を含む。さらに、遺伝子導入は、Bechtoldら(C.R．Acad．Sci．Paris，316: 1194，1993)によって記載され、本明細書の実施例において説明されているように、アグロバクテリウムによるin planta形質転換によって行うことができる。このアプローチはアグロバクテリウム細胞の懸濁液の減圧浸潤に基づくものである。サイクリンをコードする核酸を植物細胞に導入する好ましい方法は、そのような植物細胞、外植体、分裂組織または種子に上記のように形質転換されたA.ツメファシエンスを感染させることである。当技術分野で公知の適当な条件下で、形質転換された植物細胞を成長させてシュート、根を形成させ、さらに植物に発達させる。一方、サイクリンをコードする核酸を機械的または化学的手段を用いて植物細胞に導入することができる。例えば、マイクロピペットを用いてマイクロインジェクトすることによって核酸を植物細胞に機械的に導入することができる。また、核酸は、細胞に取り込まれる遺伝物質と沈降複合体を形成するポリエチレングリコールを用いることによって植物細胞に導入することが可能である。また、サイクリンをコードする核酸は、エレクトロポレーションによって植物細胞に導入することもできる（Frommら，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，82:5 824，1985、これは参照により本明細書に含まれるものである）。この技術において、植物プロトプラストは、関連核酸配列を含むベクターまたは核酸の存在下でエレクトロポレートされる。高電圧の電気インパルスを可逆的に膜に透過させて核酸を導入する。エレクトロポレートされた植物プロトプラストは細胞壁を改修し、分裂し、植物カルスを形成する。形質転換された遺伝子で形質転換された植物細胞の選択は、本明細書に記載したように表現型マーカーを用いて行うことができる。サイクリンをコードする核酸を植物細胞に導入するための別の方法は、導入される核酸を内部または表面のどちらかに含んだ小粒子による高速弾道透過(hlghv elocity ballistic penetration)である(Kleinら，Nature 327:70，1987)。また、衝撃(bonbardment)形質転換法もSanfordら（Techniques 3:3-16，1991）およびKleinら(Bio/Techniques 10:286，1992)に記載されている。典型的には、新規核酸配列の１個のみの導入が要求されるが、この方法は、特に多数導入を与えるものである。カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）も核酸を植物細胞に導入するためのベクターとして使用し得る（米国特許第4,407,956号）。ＣａＭＶウイルスＤＮＡゲノムを、細菌中で増殖することができる組換えＤＮＡ分子を作り出す親細菌プラスミドに挿入する。クローニング後、組換えプラスミドを再度クローニングして所望の核酸配列の導入によってさらに改変し得る。次いで、組換えプラスミドの改変されたウイルス部分を親細菌プラスミドから切り出して、植物細胞または植物の接種に用いる。本明細書で用いられる場合、「接触させる」という用語は、上記のような化学的および物理的手段などの、サイクリンをコードする核酸を植物細胞に導入するあらゆる手段を意味する。好ましくは、接触させるとは、核酸または核酸を含むベクターを上記のようなサイクリンをコードする核酸で形質転換されたA.ツメファシエンスによって植物細胞（外植体、分裂組織、種子など）に導入することをいう。通常、形質転換プロセスから植物細胞は再生されて完全な植物が得られる。形質転換の即時産物は「トランスジノート(transgenote)」と称する。「成長」または「再生」という用語は、本明細書で用いられる場合、植物細胞、植物細胞の１群、植物部分（種子など）または植物断片（例えばプロトプラスト、カルスまたは組織の一部）から完全な植物に成長させることを意味する。プロトプラストからの再生は植物の種間で変化するが、一般的には、まずプロトプラストの懸濁液が製造される。ある一定の種においては、次いでプロトプラスト懸濁液から胚形成を誘導することができる。培養培地には、一般的に、成長および再生に必要な種々のアミノ酸およびホルモンが含まれる。利用されるホルモンの例としては、オーキシンおよびサイトカイニンが挙げられる。効率的な再生は培地、遺伝子型、および培養の履歴に依存する。これらの変数を制御した場合、再生が再現可能である。また、再生は、植物カルス、外植体、器官または部分からも生じる。形質転換は、器官または植物部分の再生に関連して行うことができる（Methods in Enzym ology，第118巻およびKleeら，Annual Review of Plant Physiology，38:467，1 987を参照されたい）。Horschら，Science，227:1229，1985の葉ディスク(disk) −形質転換−再生法を利用することによってディスクを選択培地で培養すると、その後約２〜４週間のうちにシュートが形成される。発達したシュートをカルスから切り出し、適当な根誘導選択培地に移植する。根が伸びた苗木を、根が現れたらできるだけはやく土壌に移植する。苗木は、必要に応じて成熟するまで別の大きな鉢に植え替えることができる。栄養繁殖した作物においては、成熟トランスジェニック植物を、挿木または同一植物を産生させるための多数の組織培養技術を利用することによって繁殖させる。所望のトランスジノートの選択が行われ、新しい品種を得て、商業用途のために栄養繁殖する。種子繁殖作物においては、成熟トランスジェニック植物は自己交配してホモ接合性近交植物を産生することができる。得られた近交植物は、新たに導入された外来遺伝子を含む種子を産生する。これらの種子は、成長し、選択された表現型、例えば収穫量の増大をもたらす植物を産生することができる。花、種子、葉、枝、根、果実などの再生された植物から得られる部分は、これらの部分が記載したような形質転換された植物細胞を含む場合、本発明に含まれるものである。再生された植物の後代および変種、ならびに突然変異体も、これらの部分が導入された核酸配列を含む場合、本発明の範囲に含まれるものである。野生型植物と比べて成長および／または収穫量の増大を示す植物は、視覚的な観察によって選択することができる。本発明は、本発明の方法によって産生された植物ならびに植物組織および種子を含むものである。別の実施態様においては、本発明は、収穫量の増大が可能な植物を、サイクリンプロモーターを誘導する量のサイクリン遺伝子発現を誘導する作用物質と接触させることによって、成長および収穫量が増大していることを特徴とする植物を産生する方法を提供する。サイクリン遺伝子発現の誘導によって、その作用物質と接触させていない植物と比べて収穫量が増大した植物が産生される。「収穫量の増大が可能な植物」とは、その内因性サイクリン遺伝子の発現を誘導して収穫量を増大させることができる植物をいう。「プロモーターを誘導する量」という用語は、内因性サイクリンプロモーターを刺激することによって作用物質と接触させていない植物細胞におけるサイクリン発現よりもサイクリン遺伝子発現を高めるのに必要な作用物質の量を意味する。例えば、転写因子または化学物質を用いることにより天然サイクリンプロモーターからの遺伝子発現を高め得るものであり、これによってプロモータおよびサイクリン遺伝子発現が誘導され得る。また、本発明は、選択された組織における核酸配列の転写の増大させる方法も提供する。この方法は、サイクリンタンパク質をコードする外因性遺伝子を含む核酸構築物がゲノム内に組み込まれている植物を成長させることを含み、ここで、該遺伝子は組織特異的プロモーターと作動可能なように結合されており、それによって該遺伝子の転写が該選択組織中で増大するものである。植物発達は、分裂組織によって媒介される後胚器官形成により行われる(Steev esおよびSussex，Patterns in Plant Development，1-388(Press Syndicate of the University of Cambridge，ケンブリッジ，1989))。細胞分裂は分裂組織の形成(initiation)、維持および貫性(proliferative)成長に固有のものであるが、成長および発達の調節における細胞周期の役割は不明確である。この問題に取リ組むために、cdc2およびサイクリン遺伝子（それぞれ、細胞周期進行を制御するサイクリン依存タンパク質キナーゼの触媒および調節サブユニットをコードする）(MurrayおよびHunt，The Cell Cycle(ニューヨーク)，1993)の発現を調べた。頂端分裂組織だけでなく静止分裂組織においても発現するcdc2とは異なり（Ma rtinezら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:7360，1992）、cyc1aAtの転写物は活性分裂組織に特異的に蓄積され、細胞質分裂前に即座に細胞を分裂させる。シロイヌナズナ(Arabidopsis)植物は、発達のパターンが変更されたり腫瘍形成が誘導されることなく成長が著しく増進された。したがって、サイクリン発現は成長の制限要因である。上記の開示は、本発明を一般的に説明するものである。より完全な理解は、下記の具体例を参照することによって得られ得る。この具体例は単に説明の目的のために本明細書に記載されているものであり、本発明の範囲を限定するものではない。実施例１全長cyc1aAtサイクリンｃＤＮＡをシロイヌナズナcdc2aAtプロモーター（Heme rlyら，1992，前出）の支配下に配置した。キメラ遺伝子を、選択マーカーであるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(Hyg)を有するＴ−ＤＮＡ形質転換ベクターにクローニングし、減圧浸潤法(BechtoldおよびPelletier，Acad．Sc i．Paris，Life Sci.，316:1194，1993)を用いてシロイヌナズナ中に形質転換してアグロバクテリウムツメファシエンスを導入した。cyclaAt ｍＲＮＡの定常状態レベルが上昇したいくつかの独立トランスジェニック系は、主根および側根の両方の成長速度の劇的な増大を示し、これは生(fresh)重量、乾燥重量およびＤＮＡ含量の増大と比例関係にあったが、細胞の大きさとは相関していなかった。成長の増大は規則的であり、形態学には相違が観察されず、明らかに腫瘍形成性ではなかった。シロイヌナズナ苗（生態型(ectotype)コロンビア）を20mlのＭＳ培地（Murash igeおよびSkoog，Physiol．Plant.，15:473，1962）中で成長させた。８日齢〜1 0日齢の植物を、50mMリン酸カリウム、pH5.5で緩衝化したＭＳ培地に移し、ＩＡＡを10μＭ_effまで加えることによって（非解離ＩＡＡ）側根の形成を刺激した。示した時点で根を回収し、全ＲＮＡおよびタンパク質を単離した。500ngのポリ(A)＋ＲＮＡを１％ホルムアルデヒドゲル上で分離して（Ausubelら，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates and Wiley−I nterscience，ニューヨーク，1987）、Nytran膜に移し（SchleicherおよびSchul l）、cyc1aAt(Hemerlyら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:3259，1992)のヌクレオチド(nt)674〜1004またはシロイヌナズナcdc2aAt(Hirayamaら，Gene，105:1 59,1991)のnt 661〜1386に対応する³²Ｐ標識プローブとハイブリダイズさせ、その後標準化(normalization)のためにシロイヌナズナUBQ3(Norrisら，PlantMol．Bi ol.，21:895，1993)のnt 2576〜2824とハイブリダイズさせた。分子動力学ホスホイメージャー(Molecular Dynamics Phosphorimager)を用いてブロットを定量した。cyc1aAtはシロイヌナズナにおけるシングルコピー遺伝子である。全タンパク質を12％SDS-PAGEにて分離し、PVDF膜に移した。ｐ34^cdc2aAtを、ウサギ中でアミノ酸286〜294に対応するペプチドYFKDLGGMP（配列番号１）に対して生じさせた血清を用いて検出し、化学発光増幅アッセイ(Enhanced Chemiluminescenc e Assay)(Amersham)によって視覚化した。図１は、定常状態レベルのcdc2aAt ｍＲＮＡおよびｐ34タンパク質を示すものであり、パネルａは側根分裂組織のＩＡＡ誘導中のcdc1aAt ｍＲＮＡを示し、パネルｂは選択された非誘導トランスジェニック系におけるcdc1aAt ｍＲＮＡを示し、パネルｃは野生型に対して標準化した転写物レベルを示す。Co1-O；野生型；1A2、2A5、4A3、11A1：T2ホモ接合性トランスジェニック系；6A、7A、8 A：T1ヘテロ接合性トランスジェニック系。4A3、6A、7A、8A、および3A系のcdc1 aAt ｍＲＮＡレベルはＩＡＡ誘導野生型根のものより高かった。細胞当たりのcdc2 ｍＲＮＡとｐ34^cdc2タンパク質のレベルは、オーキシンインドール酢酸（ＩＡＡ）による側根形成の刺激の後それほど変化しなかった（図１、パネルａ）。したがって、cdc2発現が分裂に対する反応能と相関する一方、根成長および側根の形成はサイクリン依存性タンパク質キナーゼｐ34触媒サブユニットの発生量によって限定されるようには見えず、さらに、トランスジェニックシロイヌナズナにおけるcdc2の異所性発現によって成長または発達を混乱させることはできなかった(Hemerlyら，EMBO J.，14:3925，1995)。それとは対照的に、シロイヌナズナ根のＩＡＡ処理によって低い基底レベルからいくつかのcyc遺伝子の発現が誘導され、特にcdc1aAt ｍＲＮＡ（これは分裂サイクリンをコードする（Hemerlyら，前出））は15〜20倍の急速な増大を示した（図１、パネルＢ）。図２は、根端および発達中の側根におけるcdc2aAtおよびcyc1aAt転写物のin s ituハイブリダイゼーション分析を示すものである。パネルａ〜ｄは、cdc2aAt（ａ）またはcyc1aAt（b〜d）アンチセンスプローブにハイブリダイズした静止根（パネルａ、ｂ）または原基における増殖細胞（パネルｃ、ｄ）の横断面を示すものである。パネルｅ、ｆは、根端における隣接分裂組織細胞ファイル中の cyc1aAt ｍＲＮＡ発生量を示す。転写物蓄積は、銀粒子付着によって示され、間接赤色照明によって視覚化した。目盛りはａ〜ｄでは10μｍであり、ｅでは５ μｍである。fc：cyc1aAt転写物を蓄積している創始細胞；ｐ：内鞘細胞層；ｒ：根端方向；ｓ：シュート方向。組織試料を、サイクリン転写物の発現を調べるためにin situハイブリダイゼーション用に加工した。試料を、10μＭのＩＡＡで処理した。８時間または24時間インキュベートした後、ラディッシュ（Raphanus sativavar Scarlet Globe）根をDrewsら，Cell，65:991，1991に記載されたとおりに加工した。断片（８μ ｍ）をcyc1aAt（Hemerlyら、前出）（図２、パネルｂ〜e）のnt 674〜1004に対応する³³Ｐ標識ＲＮＡプローブまたはcdc2aAt（Hirayamaら、前出）のnt 661〜1 386に対応する³⁵Ｓ標識プローブと、50％ホルムアミド中で48℃にて14時間ハイブリダイゼズさせた。ハイブリダイゼーション後、0.015MのNaCl中、58℃で１時間最終洗浄を行い、次いでスライドを３週間（cyc1aAt）または５日間（cdc2aAt ）暴露した。発達後、銀粒子を赤色光で横方向から照らし、切片を相コントラストによって視覚化してFUJI Velviaフィルムに二重写しで記録した。画像をADOBE フォトショップで処理した。図２、パネルｆに要約されている分析のために、銀粒子を計数し、細胞の大きさを図２、パネルｅに示した細胞列(file)において測定した。 in situハイブリダイゼーションの場合、cdc2とは異なり、cyc1aAt転写物が静止内鞘細胞内で検出されなかったが、発端側根原基の単一細胞質濃密細胞(singl e cytoplasmically dense cells)に蓄積されており、創発性(emergent)器官では cyc1aAtが分裂組織中で独占的に発現しているということがわかった（図２、パネルａ〜d)。さらに、アブラナ科草本(crucifer)の根は、横方向への分裂後の縦方向への伸張によって生じる長い細胞列からなり(Dolanら，Development，119:7 1，1993)、連続細胞分裂期におけるそのような隣接する空間的なディスプレイ内でcyc1aAt転写物は細胞質分裂直前に大きい細胞内でのみ蓄積し、隣接する小さい娘細胞ではバックグラウンドレベルまで低下していた（図２、パネルｅ、ｆ）。サイクリン発現と有糸分裂とにおける同様の厳重な空間−時間関係が、キンギョソウ属草本(Antirrhinum)の茎頂分裂組織において観察された（Fobertら，EMBO．J.，13:616，1994）。根端分裂組織の成長および側根の形成中におけるcyc1aAt発現と細胞分裂との密接な相関関係は、トランスジェニックシロイヌナズナにおけるcyc1aAt::uidA 遺伝子融合物の発現から導きだされたcyc1aAtプロモーター活性のパターン（Fer reiraら，Plant Cell，6:1763，1994）とともに、サイクリン発生量が根の成長および発達を調節する主要な要因であるということを示唆するものであった。この仮説を試験するために、cdc2aAtプロモーターの制御下でcyc1aAtを含むトランスジェニックシロイヌナズナを作製した（BechtoldおよびPelletier，Acad．Sci ．Paris，Life Sci.，316:1194，1993）。非処理根におけるcyc1aAt ｍＲＮＡのレベルが野生型植物のＩＡＡで刺激した根において観察されたものよりも高い５種の形質転換体が得られ（図１、パネルｃ）、これらの系をさらなる研究のために選択した。 in vitro突然変異誘発によってcyc1aAt ｃＤＮＡの３番目のコドンにNheI部位を導入し、その後、このオープンリーディングフレームを、コドン３のところでin vitro作製したXbaI部位を有するcdc2aAtプロモーターに連結した。この断片をpBiB-Hyg内に連結し（Beckerら，Pl．Mol．Biol.，20:1195，1992）、アグロバクテリウムツメファシエンスGV3101内にトランスフェクトした（KonczおよびSchell，Mol．Gen．Genet.，204:383，1986）。シロイヌナズナタリアナ( Arabidopsis thaliana)（A.タリアナ）（生態型コロンビア）を減圧浸潤によって形質転換し（Bechtoldら，前出）、トランスジェニック苗（TO世代）を30μｇ /mlハイグロマイシンを含むＭＳプレート上で選択した。52個の独立トランスジェニック系が得られ、cyc1aAt ｍＲＮＡのレベルの上昇が、詳細に分析した11 系の中の９系で検出された。成長アッセイを、示したようにヘテロ接合性T1後代およびホモ接合性T2後代において行った。図３は、cyc1aAtサイクリンを異所的に発現しているシロイヌナズナにおける根の成長速度の上昇を示すものである。パネルａ：野生型（左）またはcdc2aAt: :cyc1aAt遺伝子融合物を含むトランスジェニック系6A（Tl世代）（右）。シロイヌナズナ種子をＭＳ（３％スクロース）寒天上に播いて、７日間垂直方向に成長させた。ベクター単独で、または無関係のプロモーター::uidA構築物を用いて、またはcdc2aAt5’非翻訳リーダーがＤＳトランスポゾン挿入によって分断されているcdc2aAt::cyc1aAt融合物を用いて形質転換した植物は、この表現型示さなかった。パネルｂ：野生型（左）または側根のＩＡＡ誘導の６日後のトランスジェニック系6A（T1世代）（右）。水耕法で成長させた１週齢の苗を10μＭのＩＡＡ_effで処理することにより側根発達を刺激した。 cdc2aAt::cyc1aAt導入遺伝子の強い発現によって組織化(organaized)根の成長速度の著しい増大が生じた（図３、パネルａ）。ホモ接合性またはヘテロ接合性種をＭＳ寒天上に播き、植物を７日間、昼16時間／夜８時間のスケジュールで２ 2℃にて垂直方向に成長させた。スピードライトプラチナフレームグラバー(Ligh ttools Research)を用いて24時間間隔で各プレートの４つの画像を得て、NIH-Im ageを用いて根端の変位を測定することによって根の成長を分析した。成長分析後、各クラスの10植物由来の根を集めて、ＲＮＡを分析した。細胞の大きさを測定するために、根を飽和抱水クロラール中で一晩中インキュベートすることによって清浄にし、Normarski光学素子を用いて視覚化し、写真を撮ってNIH-Imageを用いて分析した。統計的分析（不対分散(unpaired variances)によるt-検定）をＭＳエクセルを用いて行った。ＩＡＡ処理植物における根の成長を、誘導の３日後および６日後に、液中で成長させた植物から切り取った根の生(fresh)重量を測定し、次いで24時間凍結乾燥した後の乾燥重量を測定することによって評価した。全ＤＮＡを乾燥物から抽出した（Ausubelら，前出）。ヘテロ接合性T2後代において、微速度写真撮影法において主根の頂部の変位によって測定された成長速度の上昇は、導入遺伝子発現により厳密に共分離されており(co-segregated)、導入遺伝子が無い個体は野生型植物と同じ速度で成長した（表１）。cdc2aAt::cyc1aAt形質転換体における表皮細胞、皮質細胞、内皮細胞および内鞘細胞の平均の大きさは、野生型章物と同等であるか、わずかに小さかった（表２）。したがって、成長の増大は細胞の大きさよりもむしろ細胞の数の増大を反映していた。自然発生的な側根形成のパターンおよび根全体の形態学は、野生型植物とトランスジェニック植物とでは区別がつかなかった（図３、パネルａ）。１μＭのＩＡＡ（ＩＡＡは非常によく分離された側根原基を誘導する）で処理した場合、主根の単位長さ当たりの原基の形成の頻度は変化しなかった（野生型では標準偏差0.09で平均1.08initials／mm、調べた２種のトランスジェニック系では1.14±0.07と1.09±0.13）。しかしながら、10μＭのＩＡＡによる誘導後の側根の成長および発達は、cdc2aAt::cyc1aAt形質転換体においては著しく促進され、非常に大きな根系が生じた（図３、パネルｂ）。ＩＡＡ処理後のcd c2aAt::cyc1aAt植物における根成長の増大は、見かけ上、alfl表現型に似ており（Celenzaら，Genes&Development，9:2131，1995）、これらの植物はcyc1aAt転写物のレベルが上昇していたが、cdc2aAt::cyc1aAt形質転換体とは対照的に、al fl植物は、余分の側根を形成する。ＩＡＡ処理cdc2aAt::cyc1aAt植物の生重量の、同等の野生型対照に対する数倍の増加は、ＤＮＡ含量および乾燥重量における著しい増大を伴っていた（表３）。共焦顕微鏡検査によって、ＩＡＡに応答する成長の増大（弱いcdc2aAt::cyc1aAt発現を示すいくつかの系でも観察された）は、細胞空胞形成または伸張の導入遺伝子刺激を反映していないということが確認された。したがって、異所性サイクリン発現は、分裂組織において細胞分裂活性を刺激することによって根の成長を増大させ、それによって分裂組織の組織化を変化させずに細胞の産生速度を増大させる。上記のデータから、cdc2aAt::cyc1aAt発現が既成の頂端分裂組織からの成長を増大させるのに十分であることがわかり、これは細胞周期活性が分裂組織活性を調節するということを示唆するものである。しかしながら、cdc2aAtプロモーターの制御下におけるcyc1aAtの異所性発現による余分の器官原基の誘導の失敗は、サイクリン依存性タンパク質キナーゼ活性の翻訳後調節または平行調節経路の操作のいずれかによる新たな頂端分裂組織の発生におけるさらなる制御ポイントを意味する。大部分の動物細胞においては、細胞分裂への関与はG1の後期に生じ（Pardee.A.B.，Science，246:603，1989）、サイクリンD1およびサイクリンＥは培養細胞におけるG1進行の速度を制限する（OhtsuboおよびRoberts，Science, 259:1908,1993；Quelleら，GenesDev.，7:1559，1993；ResnitzkyおよびReed,Mo l．Cell Biol.，15:3463，1995)。サイクリンD1のレベルの上昇がいくつかの腫瘍において観察され（Motokuraら，Nature，350:512，1991;Rosenbergら， Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88:9638，1991；Withersら，Mol．CellBiol.，１ 1:4864，1991）、トランスジエニックマウスにおける異所性発現は過形成および腺癌を促進する（Wangら，Nature，369:669，1994）。それとは対照的に、cyclaAtの異所性発現では腫瘍形成が生じなかったが、共焦顕微鏡検査によってモニターしたところ、分裂組織の組織化または大きさを変化させることなく組織化された成長が刺激された。さらに、トランスジエニック植物の形態学は変化せず、成長の増大は器官発達の促進を伴っていた。したがって、サイクリン発現は、分裂組織活性、組織化された成長および不確定な植物発達を決定する内因性調節階層における重大な制限上流要因である。この調節階層は、動物のものとは明らかに異なっており、決定的発達が、筋肉分化中の細胞分裂の厳格な形態形成調節によって説明される貫生性成長を制限しており（Halevy ら，Science，267:1018，1995;Skapekら，Science，267:1022，1995)、植物の成長および発達の印象的な適応性を強調するものであり得る（Drew，M.C.，NewPhy tol.，75:479，1975）。サイクリン発生量は、加減抵抗器（rheostat）として機能することによって栄養素利用能などの自然環境における変化に応答して柔軟な成長の調節を可能にし得るものである。表１は根端成長速度の比較を示す。植物系＝独立形質転換体（Col-0を除く）。（＋）＝十分なレベルのサイクリンをコードする核酸の存在により成長表現型の増大を示す植物。（−）＝導入されたサイクリンをコードする核酸を喪失したか、成長の増大に十分なサイクリン発現を示さない植物。速度＝単位時間当たりの根端の変位の速度（＊は野生型の成長速度と有意に異なる値を示す）。ｎ＝分析した各植物の数。表２は細胞の大きさの比較を示すものであり、表３は野生型およびcdc2aAt::cyc 1aAt遺伝子融合物を含むトランスジエニックシロイヌナズナ系におけるＩＡＡ処理後の根成長の比較を示すものである。系３Ａ、６Ａ、７Ａ、８Ａは、導入遺伝子が１以上導入されたヘテロ接合性T1集団である。（＋）はcyclaAt転写物レベルが増大した植物を示す。（−）は野生型cyclaAt転写物レベルを有する植物である。下記のT2系はcdc2aAt::cyclaAtに対してホモ接合性である：２Ａ５、４Ａ３および１１Ａ１；４Ａ３における構成cyc1aAt発現はＩＡＡ誘導野生型レベルよりも高いが、２Ａ５および１１Ａ１においてはそうではなかった（図１）。ｎは分析した植物の数である。＊は野生型とは有意に異なることを意昧する：ａ、Ｐ＜0.001、ｂ、Ｐ＜0.01。生重量＝新たに切り取った根系の重量。乾燥重量＝２４時間乾燥後の重量。本発明についての上記の記載は、例証および説明を目的とした例示的なものである。本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の変更がなされ得ることが理解されるべきである。したがって、下記の特許請求の範囲は、そのような変更を包含するものと解釈されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ラム，クリストファー，ジェイ. アメリカ合衆国 92122 カリフォルニア州，サンディエゴ，ファーレイドライブ 6444

Claims

【特許請求の範囲】１．対応する野生型植物と比べて成長および収穫量が増大していることを特徴とする遺伝子改変された植物を産生する方法であって、植物細胞をサイクリンタンパク質をコードする核酸と接触させることにより（ここで該核酸は調節配列と作動可能なように結合されている）、形質転換された植物細胞を取得し、前記の形質転換された細胞から植物を産生させ、そして前記の収穫量の増大を示す植物を選択することを含む前記方法。２．遺伝子改変された植物が根の成長の増大を示す、請求項１に記載の方法。３．遺伝子改変された植物がシュートの成長の増大を示す、請求項１に記載の方法。４．サイクリンがcyclaAtである、請求項１に記載の方法。５．調節配列がプロモーターである、請求項１に記載の方法。６．プロモーターが構成プロモーターおよび誘導プロモーターからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。７．接触が物理的手段によるものである、請求項１に記載の方法。８．接触が化学的手段によるものである、請求項１に記載の方法。９．植物細胞が、プロトプラスト、配偶子産生細胞、および全植物に再生される細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。１０．前記核酸がＴ−ＤＮＡ誘導ベクターに含まれている、請求項１に記載の方法。１１．請求項１に記載の方法によって産生された植物。１２．請求項１に記載の方法によって産生された植物から誘導された植物組織。１３．請求項１に記載の方法によって産生された植物から誘導された種子。１４．成長および収穫量が増大していることを特徴とする植物を産生する方法であって、植物を、その作用物質に接触させていない植物におけるサイクリン発現よりもサイクリン発現を高める作用物質と接触させることを含む、前記方法。１５．成長および収穫量の増大が根の成長の増大から生じるものである、請求項１４に記載の方法。１６．成長および収穫量の増大がシュートの成長の増大から生じるものである、請求項１４に記載の方法。１７．サイクリンがcyclaAtである、請求項１４に記載の方法。１８．作用物質が転写因子である、請求項１４に記載の方法。１９．作用物質が化学物質である、請求項１４に記載の方法。２０．植物組織における核酸配列の転写を増大させる方法であって、サイクリンタンパク質をコードする核酸を含む核酸構築物がゲノム内に組み込まれている植物を成長させることを含み、ここで、該核酸は組織特異的プロモーターに作動可能なように結合されており、それによってそのサイクリンをコードする核酸の発現が該植物組織中で増大するものである、前記方法。