JP2000513585A - 逆転写方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｍｎ⁺⁺依存性逆転写酵素、好ましくはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、ｃＤＮＡ転写物を全長で合成することを改良する方法が開示されている。前記改良は、ベタイン存在下での重合にある。

Description

【発明の詳細な説明】 逆転写方法 関連出願の相互参照 該当せず。 連邦により援助された研究開発に関する陳述 該当せず。 発明の背景cDNA の合成 Mn⁺⁺の存在下で、種々のDNA依存性DNAポリメラーゼは、テンプレートとしてRN Aを利用し、かつオリゴヌクレオチドプライマーから開始された相補的ｃDNAを合 成することで逆転写酵素として作用することができる〔カルカス(Karkas、J．D. )，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 70:3834-3838、1973〕。この反応は、合成速度 、cDNAの合計収率、および鳥類骨髄芽球症ウィルス(AMV)またはマウスモロニー 白血病ウィルス(MMLV)逆転写酵素などの真正逆転写酵素によって産生される完全 長転写物の存在量に比べると非効率的であると見なされる〔パウエル(Powell，L ．M．)ら，Cell.50:831-840、1987〕。 逆転写酵素として働く熱安定性のDNA依存性DNAポリメラーゼはcDNAの合成に利 用されてきた。昇温下（50℃より高い）で行われる反応は、中温性の酵素反応に 比べ、初回免疫特異性およびRNAの 二次構造領域を経由する逆転写能力の増加を示すことが期待される。逆転写酵素 として利用される熱安定性DNAポリメラーゼは、RNA標的で開始するDNAコピー（ アンプリコン）を創生するRT-PCR法にも利用されてきた〔マイヤース(Myers，T ．W．)およびゲルファンド(Gelfand，D.H.)，Biochemistry 30:7661-7666，1991 および米国特許第5,322,770号、同第5,310,652号および同第5,407,800号〕。ベタイン ベタイン（N,N,N-トリメチルグリシン）はPCRの効率を改善することが判明し ている。米国特許第5,545,539号〔ミラー(Miller),1994年10月18日出願〕はグリ シンベースのオスモライトの有効量を用いて標的ヌクレオチド配列のPCR増幅を 改善する方法を記述している。オスモライトは増幅生成物中の「スタッターバン ド」の出現を減少させるので、標的ヌクレオチド配列の検出を容易にする。 リース(Rees)らはベタインがDNA熱溶融転移の塩基対組成依存性を減少または 排除する能力を有することを実証した(Biochemistry 32:137-144，1993)。 DE4411588C1は、ベタインを含むRNAおよびDNAポリメラーゼ反応の緩衝液、並 びにPCR反応、MMLV逆転写酵素を用いるRNAのcDNAへの逆転写における緩衝液の利 用を開示している。 当該技術で必要とされているのは、RT-PCRプロセスの全体の感度および定量面 を改善するためにcDNAの全体収率および完全長転写物存在量を増加させる方法で ある。 発明の簡単な要約 我々は、ベタインがMn⁺⁺の存在下で逆転写酵素として作用する熱安定性DNAポ リメラーゼによって完全長cDNAの合成収率を改善することを発見した。 本発明は、逆転写を増加させるのに有効な量のベタインの存在下にRNAテンプ レートを熱安定性のDNA依存DNAポリメラーゼにさらす工程を含むDNAの合成方法 である。ポリメラーゼはRNAテンプレートを逆転写し、テンプレートのDNAコピー を創生する。ベタインの濃度は、好ましくは、0.5〜3.0Mであり、最も好ましく は2.0M(±.0.5M)である。 本発明はまた、逆転写反応用のキットである。好ましい実施態様では、キット はベタイン含有溶液、ヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびDNA依存 性DNAポリメラーゼを含む。キットは逆転写反応におけるベタイン含有溶液中の 熱安定性のDNA依存DNAポリメラーゼの利用に関するインストラクションシートを 含むことが好ましい。 本発明の別の実施態様では、前記方法は増幅方法、最も好ましくはポリメラー ゼ連鎖反応に結びつけられる。 本発明の目的は改良された逆転写反応を提供することにある。 本発明の別の目的はcDNA合成反応における完全長転写物の収率および存在量を 増加させる方法を提供することである。 本発明の別の目的はRT-PCRプロセスの合計の定量面を改善することである。 本発明のほかの目的、特徴および利点は本明細書および請求の範囲を考察した 後に明らかになると思われる。 図面のいくつかの図の簡単な説明 該当せず。 発明の詳細な説明 本発明は逆転写を増加させるための有効量のベタインの存在下にRNAテンプレ ートを熱安定性DNA依存DNAポリメラーゼにさらすステップを含むDNAの合成方法 である。この方法は当業者に公知な逆転写酵素としてDNA依存DNAポリメラーゼを 用いる方法に適用することができる。 本発明を以下に説明する特殊なDNAポリメラーゼによって例示するが、本発明 はこれらの例に限定されるものではない。文献に発表されているその他の熱安定 性ポリメラーゼは本明細書に記載した方法の実施に有用である。これらの例には 、好熱性細菌であるバシラス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermo philus )、テルモシフォ・アフリカヌス(Thermosipho africanus)、テルモトガ・ マリチマ(Thermotoga maritima)、テルムスSPS17種、T.ブロキアヌス(T ．brokia nus )、T.フラブス(T ．flavus)、T.ラクツエス(T ．lactues)、T.ルベンス(T ．rub ens )、T.ルバー(T ．ruber)およびT．Z05種から抽出されるポリメラーゼが含まれ る。さらに好熱性アーケオ細菌から単離された熱安定ポリメラーゼには、たとえ ばデスルフロコッカス・モビリス(Desulfurococcus mobilis)、メタノバクテリ ウム・テルモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)、メ タノテルムス・フェルビダス(Methanothermus fervidus)、ピリコッカス・フリ オウス (Pyrococcus furious)、ピロヂクチウム・オクルツルム(Pyrodictium occulturn )、スルホロブス・アシドカリダリウス(Sulfolobus acidocaldariu)、S.ソルフ アタリクス(S ．solfataricus)、テルモコッカス・リトラリス(Thermococcus lit oralis )およびテルモプラズマ・アシドフィラム(Thermoplasma acidophilulm)が 含まれる。 改質された熱安定性ポリメラーゼは、タンパク質分解から得ることができ、ま たは切断遺伝子から産生しうる。これらのタンパク質も、ＲＮＡテンプレートを 用いたデオキシリボヌクレオシド三リン酸を重合する機能がある限り本発明の実 施に有用である。 本発明の方法は、逆転写酵素または逆転写酵素として作用するＤＮＡポリメラ ーゼのいずれかによって逆転写のための基質でありうるあらゆるＲＮＡテンプレ ートに作用すると思われる。 以下の例には、典型的な逆転写反応混合物について記述されている。好ましい 反応混合物としては、ＲＮＡテンプレート分子、オリゴヌクレオチドプライマー 、４つのｄＮＴＰ全ての混合物、および適切な緩衝液が挙げられる。以下の例に は、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８．３)、０．０５Ｍ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂および０．７５ｍＭ ＭｎＣｌ₂を含む緩衝液の使用について記述さ れている。米国特許第５，３２２，７７０号、同第５，３１０，６５２号および 同第５，４０７，８００号には、Ｍｎ依存性逆転写反応が記述されている。 次いで、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを、反応混合物に加える。好ましくは、 熱安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを、テルモス・テルモフィラス（Ｔ ｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ ｓ ）またはバシルス・ステアロテルモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒ ｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）のいずれかから単離する。しかし、上述のとおり 様々な他の熱安定性生物から由来するポリメラーゼも、適切であると思われる。 反応物を、ベタイン１水和物として好ましくはミズーリー州セントルイス（Ｓ ｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅ ｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）から得たベタイン、カタログ番号第Ｂ２７５４号 の存在下でインキュベートする。最適には、ベタインを、０．５から２．５Ｍで 使用する。２Ｍ（±０．５Ｍ）の濃度が好ましい。我々の実験は、３Ｍのベタイ ン濃度が、少なくとも限度ぎりぎりに効果があることを示す。 本発明では、テンプレートのＤＮＡコピーでＲＮＡテンプレートが作製される ポリメラーゼ逆転写が必要とされる。電気泳動ゲル上での逆転写物質の可視化に よってこのＤＮＡコピーの存在または不在を検出できる。 以下の例では、我々は、観察できない量から観察できる量までｃＤＮＡの合成 量増加させることができた。しかし、我々は、本発明の方法が、ｃＤＮＡ合成が 単に効果のない、そして不必要に全体的に抑制されている状況にも適用可能であ ることを予見する。放射性標識ｄＮＴＰを全長産物に組込むことによって測定さ れるときに、少なくとも産物の１０％増加によって規定されるとおり、ｃＤＮＡ 合成のあらゆる改善は、本発明と一致する。 本発明は、本発明の方法によって逆転写反応を行うためのキットでもある。そ のほとんどの基本形態で、キットは、ベタイン含有溶液または緩衝液のバイアル または容器、および反応のためのインス トラクションを含む。好ましくは、キットは、デオキシリボヌクレオチドおよび 熱安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをも含む。 例 Ａ．実験 大腸菌（Ｅ ｃｏｌｉ）リボソームＲＮＡを、テルモス・テルモフィラスおよ びバシラス・ステアロテルモフィラスから単離されたＤＮＡポリメラーゼによる ｃＤＮＡ合成用の混合物中の標的テンプレートＲＮＡとして使用した。１ｕｇの リボソームＲＮＡ調製品を含む反応混合物は、２３Ｓ、１６Ｓおよび５Ｓ ｒＲ ＮＡ種；１６ＳのｒＲＮＡ種の３’末端付近にアニールするオリゴヌクレオチド プライマー；４つのデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、 ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）全ての混合物；適切な反応緩衝液（０．０１Ｍトリス −ＨＣｌ、ｐＨ８．３、０．０５Ｍ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂および０ ．７５ｍＭ ＭｎＣｌ₂）；および５単位のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼまたは Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを含有した。混合物を、種々の濃度のベタイン（３ ．０Ｍまで）の不在または存在下で、６０℃で２０分間インキュベートした。反 応混合物を、ＤＮＡサイズ標準とともに１％アガロースゲル電気泳動によって分 析した。核酸バンドを、臭化エチジウム染色および紫外線（３１２ｎｍ）透照に よって可視化させた。 Ｂ．結果 電気泳動ゲルでのバンドのパターンは、２Ｍの付近の濃度の反応混合物中での ベタインの存在が、約１．４ｋｂに強力なバンド移動 の現れることによって示されるとおりｃＤＮＡの合成を改善することを示した。 このサイズは、全長のｃＤＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡハイブリッドについて予測さ れるサイズと一致する。ベタインの不在下では、そのようなバンドは見られず、 そして反応混合物ではより小さな産物が優勢であった。 反応サンプルを、全てのＲＮＡの崩壊を生じるアルカリ性ゲルアガロース電気 泳動によって分析した場合、１．４ｋｂで移動するｃＤＮＡの単一バンドを観察 し、これはまた全長のｃＤＮＡの合成と一致した。ベタインの不在下で、より小 さい産物がまたもやゲル上に見られた。 ベタインがＴＴｈおよびＢｓｔＤＮＡポリメラーゼによるｃＤＮＡの合成を増 強する機構は不明である。Ｍｎ⁺⁺の存在下で温度が上昇しているときＲＮＡ安定 性を改善し、ＲＮＡコンホメーションを改変するので、それはＤＮＡポリメラー ゼによるテンプレートとしてよりよく活用され、そして改善プライミングが可能 な因子である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 逆転写を増加するための有効量のベタインの存在下、熱安定性のＤＮＡ依 存性ＤＮＡポリメラーゼにＲＮＡテンプレートをさらす工程を含んでなり、前記 ポリメラーゼが前記ＲＮＡテンプレートを逆転写し、そして、前記テンプレート のＤＮＡコピーが創生される、ＤＮＡ合成方法。 ２． ベタインの濃度が０．５〜３．０Ｍである請求項１記載の方法。 ３． 濃度が２．０Ｍ（±０．５Ｍ）である請求項２記載の方法。 ４． 熱安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが、テルマス・テルモフィラ ス及びバシラス・ステアロサーモフィラスから単離されるポリメラーゼ類からな る群から選ばれる請求項１記載の方法。 ５． ＤＮＡコピーを増幅する工程をさらに含む請求項１記載の方法。 ６． 増幅がポリメラーゼ連鎖反応である請求項５記載の方法。 ７． ベタイン含有溶液の容器及び逆転写法のためのインストラクションを含ん でなる逆転写反応用キット。 ８． デオキシリボヌクレオチドをさらに含む請求項７記載のキット。 ９． 熱安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのアリコートをさらに含む請 求項７記載のキット。