JP2000511761A - クモ神経毒およびその生成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 無脊椎動物特異的神経毒δ−ラトロインセクトトキシン（δ−ＬＩＴ）の単離誘導体または類似体を含む毒素。該毒素を、細菌宿主中においてブラック・ウィドー・スパイダーのゲノムからの切断された形の遺伝子に対応するヌクレオチド配列を発現させることによって生成する。該遺伝子は無毒性前駆体タンパク質をコードしているが、切断された形は活性毒素をコードしている。

Description

【発明の詳細な説明】 クモ神経毒およびその生成法 本発明は、新規毒素、毒素の生成法、特に（しかし、それに限るわけではない が）、昆虫特異的神経毒δ−ラトロインセクトトキシン（δ−ＬＩＴ）およびそ の生成法に関する。 一連の高分子量神経毒は、ブラック・ウィドー・スパイダー（ｂｌａｃｋ ｗ ｉｄｏｗ ｓｐｉｄｅｒ）（ラトロデクタス・マクタンス・トレデシムグッタト ゥス（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｍａｃｔａｎｓ Ｔｒｅｄｅｃｉｍｇｕｔｔａ ｔｕｓ））の毒液中で発見された。これらの毒素の多くは、脊椎動物かまたは無 脊椎動物に特異的であると識別されている。α−ラトロトキシン（α−ＬＴ）お よびα−ラトロインセクトトキシン（α−ＬＩＴ）は、それぞれ脊椎動物および 無脊椎動物に特異的であると特徴付けられた２種類のこの種の神経毒である。こ れらのタンパク質の一次構造は決定されたが、クローン化された毒素の構造的特 徴の特性決定は、それらの遺伝子の機能的発現を達成することができないために 不可能であった。 本発明の目的は、新規毒素、および通常は前駆体タンパク質の翻訳後修飾によ って天然に生産される毒素を組換え技術を用いて生成する方法を提供することで ある。 本発明により、切断された形の遺伝子配列の発現によって生成される毒素など のポリペプチドまたはその類似体を提供する。 好ましくは、ポリペプチドは神経毒であり、好ましくは、遺伝子配列によって コードされた実質的に無毒性の前駆体ポリペプチドの毒性誘導体に対応する。ポ リペプチドは、実質的に無毒性の前駆体ポリペプチドの切断された形のアミノ酸 配列に対応するアミノ酸配列を含んでいてよい。好ましくは、ポリペプチドのア ミノ酸配列は、主としてカルボキシ（Ｃ）末端での、望ましくは約１５０個〜２ ００個までのアミノ酸の切断を有する前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列に対応 する。ポリペプチドアミノ酸配列は、更に、アミノ末端（Ｎ）で、好ましくは５ ０未満までのアミノ酸、望ましくは７個または２８個までのアミノ酸が切断され た前駆体ポリペプチドアミノ酸配列に対応しうる。 ポリペプチドのアミノ酸配列は、昆虫特異的神経毒δ−ラトロインセクトトキ シン（δ−ＬＩＴ）またはその活性誘導体のアミノ酸配列と相同であってよいし 、好ましくは、配列番号１および配列番号２で示されるアミノ酸配列またはその 活性誘導体を含む。好ましくは、毒素は、配列番号１で示される配列またはその 活性変異型を含む遺伝子配列のヌクレオチド構築物または切断された形から発現 される。好ましくは、毒素は、ナショナル・コレクションズ・オブ・インダスト リアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッド（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎ ｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｉｍｉｔｅｄ）に受託番号ＮＣＩＭＢ ４０６３２と して寄託された微生物中で実質的に提供される配列から発現される。 本発明は、更に、配列番号１および配列番号２で実質的に示されるアミノ酸配 列またはその活性誘導体を含む毒素として用いるためのタンパク質を提供する。 本発明のもう一つの態様により、毒素などのポリペプチドの発現において用い るための、切断された形の遺伝子配列またはその類似体を含むヌクレオチド配列 を提供する。 好ましくは、ヌクレオチド配列は、前駆体ポリペプチドをコードしている且つ その３’末端で切断されている遺伝子またはその活性誘導体に対応する。好まし くは、ヌクレオチド配列は、約４００個〜６５０個までのヌクレオチド塩基、望 ましくは５５０個〜６００個のヌクレオチド塩基が切断された遺伝子に対応する 。 ヌクレオチド配列は、更に、その５’末端で、好ましくは、１００個未満まで のヌクレオチド塩基、望ましくは８４個かまたは２１個までのヌクレオチド塩基 が切断されている遺伝子に対応しうる。 好ましくは、ヌクレオチド配列は、ブラック・ウィドー・スパイダー（Ｂｌａ ｃｋ Ｗｉｄｏｗ Ｓｐｉｄｅｒ）（ラトロデクタス・マクタンス・トレデシム グッタトゥス）の毒液中の神経毒をコードしている遺伝子の部分またはその活性 誘導体に対応する。 ヌクレオチド配列は、昆虫特異的毒素δ−ラトロインセクトトキシン（δ−Ｌ ＩＴ）の前駆体ポリペプチドをコードしている遺伝子の部分またはその活性誘導 体に対応しうる。ヌクレオチド配列は、好ましくは、９９１個のアミノ酸の配列 を含むポリペプチドをコードする。 好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号１で示される塩基配列またはその 活性誘導体、好ましくは、ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリア ル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッドに受託番号ＮＣＩＭＢ ４０６３ ２として寄託された微生物中に含まれる塩基配列を含む。 好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号１および配列番号２で示されるア ミノ酸配列またはその活性誘導体を有するポリペプチドをコードする。 ヌクレオチド配列は、逆転写酵素などの酵素の使用によってｍＲＮＡに由来す るｃＤＮＡでありうる。或いは、ヌクレオチド配列は、おそらくはポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて生成されたオリゴヌクレオチドＤＮＡ構築物であっ てよい。 本発明のもう一つの態様により、ポリペプチドを生成する方法であって、切断 された形の遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子を生成し、そして宿主発現系、例えば 、ウイルスまたは細菌発現系において該切断された形を発現させてポリペプチド を生成することを含む上記方法を提供する。 好ましくは、生成されたポリペプチドは活性毒素、望ましくは、実質的に上記 に定義の神経毒である。好ましくは、切断された形は、無毒性前駆体ポリペプチ ドをコードする遺伝子の部分を含む。 好ましくは、切断された形は、実質的に上記に定義の且つ配列番号１で示され るヌクレオチド配列またはその活性誘導体を含む。好ましくは、発現系は、望ま しくは、実質的にナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アン ド・マリン・バクテリア・リミテッドに受託番号ＮＣＩＭＢ ４０６３２として 寄託された、切断された形の配列を含むｐＴ７−７ベクターによって形質転換さ れた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌細胞を含む。発現系は、バ キュロウイルス系を含むことができる。 本発明のもう一つの態様において、概して上記に定義の毒素をコードしている 切断された形の遺伝子を含み且つ受託番号ＮＣＩＭＢ ４０６３２として寄託さ れた微生物中で実質的に提供される組換えＤＮＡ分子、例えば、ウイルス、特に 、バキュロウイルスを提供する。 本発明の更にもう一つの態様は、切断された形の遺伝子であって、概して上記 に定義の毒素をコードしている該切断された形を含む発現ベクターを提供する。 本発明は、更に、上記に定義の組換え体分子によって形質転換されたウイルス または細菌細胞などの細胞を提供する。 更に、上記に定義の毒素を含む殺虫剤を提供する。殺虫剤は、経口投与または 局所投与されるようにありうる。殺虫剤はスプレーを含んでいてよい。 本発明は、更に、昆虫を死滅させるまたは無能力にするための、上記に定義の 毒素を昆虫において生産する切断された形の遺伝子を発現させる手段を含む殺虫 剤系を提供する。殺虫剤系は、ウイルス発現系、望ましくは、バキュロウイルス 発現系を含むことができる。 もう一つの態様により、実質的に上記に定義の切断された形の遺伝子配列を有 する遺伝子修飾された細胞を含む植物を提供する。 また更に、本発明により、実質的に上記に定義の切断された形の遺伝子配列を 有する遺伝子修飾された細胞を含む非ヒト動物を提供する。 本発明のもう一つの態様により、実質的に単離された無毒性前駆体ポリペプチ ドを処理することによって生成される毒素を提供する。 毒素は、好ましくは神経毒であり、そして好ましくは、前駆体ポリペプチドの カルボキシ（Ｃ）末端方向への切断によって、好ましくは、部位特異的突然変異 誘発によって生成される。望ましくは、毒素アミノ酸配列は、概して、１５０個 〜２００個までのアミノ酸が切断された前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列に対 応する。毒素アミノ酸配列は、更に、前駆体ポリペプチドアミノ酸配列のアミノ （Ｎ）末端方向への切断によって生成されることができ、そこから切断されたフ ラグメントは、好ましくは、カルボキシ末端から切断されたフラグメントよりも 小さく、７個または２８個のアミノ酸を含んでいてよい。 好ましくは、毒素は、ブラック・ウィドー・スパイダー（ラトロデクタス・マ クタンス・トレデシムグッタトゥス）の遺伝子の部分によってコードされたポリ ペプチドに対応するアミノ酸配列を有する。毒素は、昆虫特異的神経毒δ−ラト ロインセクトトキシン（δ−ＬＩＴ）の類似体またはその活性誘導体を含んでい てよいしまたはであってよい。 好ましくは、毒素は、配列番号１および配列番号２で示されるアミノ酸配列ま たはその活性誘導体を含む。 本発明のもう一つの態様において、不活性前駆体ポリペプチドから活性ポリペ プチドを生成する方法であって、該単離された前駆体ポリペプチドを切断するこ とを含む上記方法を提供する。 好ましくは、単離された前駆体ポリペプチドはカルボキシ末端で、おそらくは タンパク質分解切断を用いて、好ましくは部位特異的突然変異誘発によって切断 される。Ｎ末端の切断もまた提供されうる。好ましくは、活性ポリペプチドは毒 素であり且つ実質的に上記に定義の通りである。 本発明のもう一つの態様により、上記に定義の、好ましくは、配列番号４で示 されるアミノ酸配列またはその誘導体を含む毒素前駆体ポリペプチドをコードし ている単離されたヌクレオチド塩基配列を提供する。塩基配列は、好ましくは、 配列番号３で示される配列またはその誘導体を含む。ヌクレオチド配列は、好ま しくは、神経毒δ−ラトロインセクトトキシン（δ−ＬＩＴ）の前駆体ポリペプ チドをコードする。好ましくは、塩基配列は、受託番号ＮＣＩＭＢ ４０６３３ として寄託された微生物中で実質的に提供される通りである。 もう一つの態様において、前の段落で定義の配列を含む組換えＤＮＡ分子、例 えば、ウイルス、そして更に詳しくは、バキュロウイルスを提供する。 更にもう一の態様において、本発明は、前の段落で記載の組換えＤＮＡ分子に よって形質転換された細菌細胞またはウイルス細胞などの細胞を提供する。 本発明は、更に、昆虫を死滅させるまたは無能力にするための、昆虫において 上記の遺伝子を発現させて上記の前駆体ポリペプチドを生産し且つ該前駆体ポリ ペプチドを処理して毒素を生産する手段を含む殺虫剤系を提供する。殺虫剤系は 、ウイルス発現系、望ましくはバキュロウイルス発現系を含むことができる。 もう一つの態様により、上記に定義の遺伝子を有する遺伝子修飾された細胞を 含む植物を提供する。 また更に、本発明により、上記に定義の遺伝子を有する遺伝子修飾された細胞 を含む非ヒト動物を提供する。 ここで、本発明の好ましい実施態様を、以下の配列に関して単に例として記載 するが、ここにおいて、 配列番号１は、本発明の一つの態様により、切断された形の遺伝子のヌクレオ チド塩基配列および対応するアミノ酸配列並びにそれによってコードされたポリ ペプチドを示す； 配列番号２は、配列番号１のポリペプチド配列を示す； 配列番号３は、本発明のもう一つの態様により、遺伝子のヌクレオチド塩基配 列および対応するアミノ酸配列並びにそれによってコードされたポリペプチドを 示す； 配列番号４は、配列番号３のポリペプチド配列を示す。 配列を論及すると、配列番号２の場合の毒素などのポリペプチドは、切断され た形の遺伝子配列（配列番号１）またはその類似体の発現によって生成される。 ブラック・ウィドー・スパイダー（ラトロデクタス・マクタンス・トレデシム グッタトゥス）毒液（ＢＷＳＶ）からの毒素、δ−ラトロインセクトトキシン（ δ−ＬＩＴ）が精製され、昆虫特異的毒性を有することが示された。δ−ＬＩＴ 構造遺伝子がクローン化され且つ配列決定され、天然の（前駆体）および機能性 タンパク質毒素のＮ−およびＣ末端は下記のように決定された。δ−ＬＩＴ ｃ ＤＮＡの部位特異的突然変異誘発は、細菌における成熟タンパク質生成物（毒素 ）の発現を可能にし、そしてこれはバッタに対して毒性であることが示された。 細菌発現系におけるこれおよび他のこのような毒素の発現および生産は、これ まで不可能であった。本発明は、毒素を生産する前駆体タンパク質の切断部位、 および細菌、実際には他の適当な宿主中で毒素を発現させることができる遺伝子 配列の正確な切断部位の識別を包含する。 微生物の寄託は、ブダペスト条約に基いて１９９４年５月３日にナショナル・ コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミ テッド、英国、スコットランド、アバディーン、マカー・ドライブ２３番街で行 われた。切断された形の遺伝子配列によってクローン化された大腸菌（Ｅｓｃｈ ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＸＬ−１ブルー（Ｂｌｕｅ）ｐＴ７．δＭ）は受 託番号４０６３２として寄託され、そして実質的に完全長さ配列によってクロー ン化された大腸菌（ＨＭＳ１７４ ｐＴ７．δＦＬ）は受託番号４０６３３とし て寄託されている。 更に詳細には、ｃＤＮＡクローニングおよび配列順序決定を以下のように行っ た。ポリ（Ａ＋）−ＲＮＡをブラック・ウィドー・スパイダー（ラトロデクタス ・マクタンス・トレデシムグッタトゥス）の毒腺から単離し、そしてｃＤＮＡラ イブラリーをプラスミドベクターｐＳＰ６５中に構築した（キャトキン（Ｋｉｊ ａｔｋｉｎ）ら、１９９３年による）。６ｘ１０⁴クローンのライブラリーを、 δ−ＬＩＴ（アミノ酸残基１〜８個）−５’ＧＡ（Ｃ／Ｔ）ＧＡ（Ａ／Ｇ）ＧＡ （Ａ／Ｇ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ）ＧＧ（Ａ／Ｔ）ＧＡＡＡＴＧＡＣ３’のＮ末端配列に 基く末端標識付き２３マーオリゴヌクレオチドプローブによってスクリーニング した。ハイブリダイゼーションを行った。正のクローンをコロニー精製し且つ制 限地図作成によって分析した。インサートを切除し、そして記載のように（サム ブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年）音波処理によってフラグメント 化した後、ｐＢＬｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋およびＳＫ−ベクター（スト ラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、米国）のＳｍａＩ部位中にクローンニン グした。配列順序決定用の一本鎖鋳型は、ヘルパーファージＶＣＳ（ストラタジ ーン）に感染後に得られた。ＤＮＡ配列は、鎖終結法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ ）ら、１９７７年）により、シークエナーゼ２．０バージョンキット（ＵＳＢコ ーポレーション）並びにＴ７およびＴ３ベクター特異的プライマー（ストラタジ ーン）を用いて決定された。それぞれの配列は、双方の鎖について少なくとも２ 回決定された。合成プライマーを用いて、単離されサブクローン化されたフラグ メントで包含されなかった部分を配列順序決定した。 ＤＮＡおよびタンパク質配列分析は、コンピューターソフトウェアＤＮＡＳＴ ＡＲ（ドナスター・インコーポレーテッド（Ｄｎａｓｔａｒ Ｉｎｃ）およびＰ ＣＧＥＮＥ（インテリジェネティクス・インコーポレーテッド（Ｉｎｔｅｌｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ））を用いて行われた。この作業は、ＳＥＲＣダレス バリー（Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ）ＳＥＱＮＥＴ装置に装備されたＧＣＧプログラム から恩恵を受けた（デバルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）、ヘベリー（Ｈａｅｂｅｒｌ ｉ）およびスミシス（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ）、（１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）；３８７〜３９５）。 完全長さｃＤＮＡ構築は以下のように行われた。二組のオリゴヌクレオチドプ ライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によってδ−ＬＩＴコーディング配列 のＮ−およびＣ−重複部分を製造した。発現ベクター中へのサブクローニングを 容易にするために、５’センスプライマー（Ｐ１）（ＴＴＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴ ＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＧＡＡ）および３’アンチセンスプライマー（Ｐ８） （ＣＡＡＴＧＧＴＣＧＡＣＡＣＡＧＡＡＧＧＡＡＴＧＧＴＡ）は、ＢａｍＨＩお よびＳａｌＩ制限酵素部位を含んでいた。二つの他のプライマー−Ｐ９、センス （ＧＴＣＴＧＡＡＣＣＡＴＴＴＡＣＴＧＴＣＣ）（１２８３〜１３０２位）およ びＰ３、アンチセンス（ＧＴＡＡＧＡＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣ）（２２５ ３〜２２７２位に対して相補的）は、内部ＮｃｏＩ（２０５６）制限部位を含む 重複フラグメントを製造するように選択された。オリゴヌクレオチドは、アミノ 酸９９１−５’ＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＴＴＣＣＧＧＴＡＡＡＧＴＡＣ ＧＡＣＧＡＡＡ３’後のタンパク質配列を終結するように設計された。ポリメラ ーゼ連鎖反応は、Ｔａｑ−ポリメラーゼ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））１単位 を用いて標準的な条件下（３０サイクル、５５℃で１分間、７２℃で３分間、９ ４℃で１分間、各プライマー１００ピコモルおよび第一鎖ｃＤＮＡ １〜１０ｎ ｇを用いる）で行われた。最初のサイクルでは、変性時間は５分間まで延長され た。増幅された材料の分子質量はアガロースゲル上で検査された。第一鎖ｃＤＮ Ａ合成は、第一鎖ｃＤＮＡシンセシスキット（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ）（ ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を用いて、製造者によって推薦されるラ ンダムおよび特異的プライマー両方によって行われた。ＰＣＲ産物をアガロース ゲルからジーンクリーンキット（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ Ｋｉｔ）（バイオ１０１ インコーポレーテッド（Ｂｉｏ １０１ Ｉｎｃ．）を用いて精製し、適当な組 合わせの酵素（Ｎ末端部分のためにＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩ並びにＣ末端部分 のためにＳａｌＩ／ＮｄｅＩ）によって消化し、そして同様の組合わせの酵素に よって制限されたｐＴ７−７ベクター中にクローン化した。完全長さｃＤＮＡを 、Ｎ末端のＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩ−フラグメント、Ｃ末端のＮｄｅＩ／Ｓａｌ Ｉ−フラグメントおよびｐＴ７−７ ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ消化ベターの間の三 方連結反応の結果として生成した。最終構築物は、アミノ末端に８個の追加のア ミノ酸残基を有した（ＭＡＲＩＲＡＲＧ）。プラスミド構築物はいずれも、両末 端からおよび連結部分を介して配列順序決定することによって実証された。完全 長さ構築物をｐＴ７δ．ＦＬと称し、その試料はＮＣＩＭＢに受託番号４０６３ ３として寄託されていて、そして切断されたクローン（１〜９９１アミノ酸）を ｐＴ７．δＭと称した（ＮＣＩＭＢ番号４０６３２）。 δ−ＬＩＴ ｃＤＮＡの同一性を実証するために、このクローンを大腸菌ＢＬ ２１（ＤＥ３）細胞中の細菌ｐＴ７−７ベクター中で発現させた。配列番号４の 完全長さ毒素ｃＤＮＡ（Ａｓｐ残基２９〜１１８６に対応する）１２１４を構築 し且つｐＴ７．δＦＬと称した。最初の２８アミノ酸は、クモ毒腺中の前駆体ポ リペプチド中に存在すると考えられるが、Ｎ末端プロセッシング中に切断される 。組換え体タンパク質は、全細菌溶解産物タンパク質の約１０％を構成している 。特異的な多クローン性抗体はクモ毒腺から精製されたδ−ＬＩＴに対して上昇 したが、δ毒素に特異的であることが実証された。このタンパク質は、具体的に は、細菌発現性組換え体完全長さδ−ＬＩＴ中の１３０Ｄａのタンパク質であっ た。細菌によって発現された完全長さδ−ＬＩＴと毒腺から精製された毒素との 分子質量の比較は、計算分子質量と一致して、約２３ｋＤａの寸法差を実証した 。完全長さδ−ＬＩＴは昆虫に対する毒性がなかったが、毒素の不活性前駆体の 形であると考えられる。 毒腺から精製されたδ−ＬＩＴを、質量分析法により（クラトス・コンパクト （Ｋｒａｔｏｓ Ｋｏｍｐａｃｔ）ＭＡＬＤＩ３マススペクトロメーターで）、 基質としてシナピン酸を用いて分析した。窒素レーザー励起は３３７ｎｍであり 、陽イオンは直線様式で検出されて）、ｍ／ｚ＋比１１０９１６の顕著な分子イ オンを生じた。これは、アミノ酸９９１で切断されているδ−ＬＩＴの予想の分 子質量に密接に対応する。比較により、細菌によって発現された完全長さδ−Ｌ ＩＴは、計算値１００Ｄａの範囲内のｍ／ｚ＋比１３３６３１の分子イオンを生 じた（ＶＫ，ＤＲＢ，ＰＮＲＵ，データは示されなかった）。部位特異的突然変 異誘発を用いて、新規のδ−ＬＩＴ ｃＤＮＡクローン（ｐＴ７δＭ）を生成し た が、それはδ−ＬＩＴ配列のアミノ酸９９１の後で切断された（配列番号２）。 このタンパク質を細菌中で発現させて、クモ毒液から単離された成熟毒素と同様 の分子質量のタンパク質を生成した。 ｐＴ７クローンによって形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、ア ンピシリン１００ｍｇ／ｍｌを含むＬＢ培地中において３０℃でＡ_6000nmが約０ ．５になるまで増殖させた。次に、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を培地に加えることによ って発現を誘導し、そしてインキュベーションを１時間続けた。機能研究のため に、細菌を５０ｍＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、 ０．４％トリトンＸ−１００、１２％（ｗ／ｖ）スクロース、５ｍＭ ＤＴＴ、 アプロトニン２μｇ／ｍｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８中で洗浄し且つ再懸濁さ せ、そして氷上で音波処理した。硫酸アンモニウムを透明な上澄み液に加えて最 終濃度を２０％飽和にし、そしてペレットをＤＴＴ不含緩衝液中に再懸濁させた 。これらの試料（５〜１５μｌ）を、バッタ（体重１００〜３００ｍｇ）の胸部 注射用に用い；それぞれの試験を４匹より多くのバッタで行い、そしてバッタの ２４時間の毒性を調べた。ｐＴ７−７およびｐＴ７．δＦＬからの抽出物はバッ タに対して影響を与えなかったが、ｐＴ７．δＭを有する細菌からの抽出物は急 速な致死を引き起こした。バッタの致死時間は、毒素のバッチの力価に応じて５ 分間〜４時間であった。 予備実験は、バッタ成体（雄および雌）の後肢から単離された神経によって興 奮したおよび休止している牽引爪神経−筋標本について試みられた（アシャウッ ド（Ｕｓｈｅｒｗｏｏｄ）およびマシリ（Ｍａｃｈｉｌｉ）、１９６８年）。δ −ＬＩＴを標準的なバッタ用食塩水（ｍＭ：ＮａＣｌ，１８０；ＫＣｌ，１０； ＣａＣｌ₂，２；ヘペス，１０（ｐＨ６．８））中に加えた。ＣａＣｌ₂が省略さ れた食塩水を用いる実験が何回か試みられた。機械的反応を、グラス（Ｇｒａｓ ｓ）ペンレコーダーに連結されたグラス歪ゲージを用いて記録した。小規模の刺 激性シナプス後電位の記録は、バッタ成体（両性）の後伸脛節筋の繊維から細胞 内微小電極（約１０ｍΩ抵抗）を用いて行われた。δ−ＬＩＴは、標準的なバッ タ用食塩水か、ＣａＣｌ₂が省略された食塩水かまたはＮａＣｌの代わりにＭｇ Ｃｌ₂を含んだ食塩水中に加えられた。小規模電位をビデオテープに記録し且 つインハウスソフトウェアを用いるマスコンプ（ＭａｓｓＣｏｍｐ）計算機で分 析した。膜二重層を、パッチピペット（直径１〜２μｍ；クラーク・エレクトロ メディカル（Ｃｌａｒｋ Ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｄｉｃａｌ）ガラスから二次加工 された）の先端に、ジフィタノイルホスファチジルコリンかまたはイソレクチン ９部およびコレステロール１部の混合物の単層からピペット浸漬成形技術（モン タル（Ｍｏｎｔａｌ）およびミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ）、１９８）を用いて成形 した。同様のパッチピペットを用いて、バッタ後伸脛節筋繊維から膜パッチを切 除した（ハディー（Ｈｕｄｄｉｅ）ら）。内因性カリウムチャンネルの活性を低 下させるために、ＫＣｌをピペットおよび浴食塩水から除去した。 バッタ牽引爪筋の神経によって引き起こされる単収縮は、１０^-11Ｍ δ−Ｌ ＩＴ（標準食塩水中に加えられた）によって約４０％減少し、そして１０^-10Ｍ 毒素の適用中になくなった。δ−ＬＩＴの適用中に、時々、小規模の自発的収縮 が生じた。単収縮振幅の変化は、不可逆的筋拘縮を伴った。δ−ＬＩＴの濃度が 低下した場合、拘縮の出現は遅れ、その振幅は減少した。筋拘縮はまた、筋が神 経によって刺激されなかった場合に毒素を加えた場合に生じた。単収縮はカルシ ウム不含食塩水中で生じることはなく、この食塩水中で平衡された標本に対して １０^-10Ｍの毒素を加えた場合、毒素を加えて３０分後でも拘縮は生じなかった 。 バッタ筋繊維から切除された裏返しのパッチをパッチピペット中で１０^-11Ｍ δ−ＬＩＴに対して暴露した場合、約４０ｐＳの最大電導度のチャンネルオープ ニングが観察された。この種類のチャンネルオープニングは、毒素不存在下では 決してみられなかった。パッチピペットおよび浴が同一食塩水（２ｍＭ ＣａＣ ｌ₂を含む）を含んでいた場合、チャンネル電流は体内整流を示し、チャンネル オープン時間は正のピペット電位においてよりも負において長かった。パッチを 越えて１０倍のＣａ²⁺勾配が存在した場合、チャンネル電流の逆転電位は＋／− １５ｍＶであり、その徴候はＣａ²⁺勾配に依存している。 １０^-11Ｍδ−ＬＩＴをパッチピペット中に入れた人工二重層実験において、 約３０ｐＳ電導度の単チャンネルオープニングが観察された。これらのチャンネ ルは、パッチピペットから毒素が省略された場合には見られなかった。パッチピ ペットおよび浴中で同一食塩水（２ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む）を用いると、α− ＬＩＴｘチャンネルの電流−電圧特性は、０ｍＶでの逆転電位によってＳ字形で あった。チャンネルは、パッチピペットおよび浴のイオン支配を操作することに よってＣａ選択的であることが分かった。 毒腺ｃＤＮＡからのｃＤＮＡライブラリーを、（上記の）δ−ＬＩＴのＮ末端 配列に対応する２３−ｂｐオリゴヌクレオチドプローブによってスクリーニング した。ヌクレオチドアンビギュイティーの数を減少させるために、α−ＬＴおよ びα−ＬＩＴ ｃＤＮＡ（キャトキンら、１９９０年、キャトキンら、１９９３ 年）のヌクレオチド配列から入手可能なコドン使用データを参照した。５種類の 正のｃＤＮＡクローンをコロニー精製し且つ配列順序決定した。最長クローン（ ｐＤＴ−１）は、２（ｋｂ）より大のδ−ＬＩＴコーディング領域を含んでいた 。ＰｓｔＩ−３’フラグメントを用いてｃＤＮＡライブラリーを再度スクリーニ ングして、毒素のＣ末端部分をコードしているクローンを探索した。更に別のｃ ＤＮＡクローン、ｐＤＴ−１７を単離したが、それはδ−ＬＩＴのＣ末端コーデ ィング領域を包含していた。読み取り枠全体を包含する二つの重複クローンは、 それら全体の配列順序が決定された。二つのクローンは、二つの異なる組のプラ イマーを用いて、重複部分を越えたポリメラーゼ連鎖反応による毒腺からの単一 の連続ＲＮＡの一部分であることが実証された。複合クローンは、最初のインフ レームメチオニンから出発し且つＴＡＡ停止コドンによって終結する３６４２ｂ ｐの枠によってｃＤＮＡをコードしている（配列番号３）。 Ｍｅｔ残基は、推定の配列の完全長さを確定するインフレーム停止コドンによ って先行される。 δ−ＬＩＴは、ブラック・ウィドー・スパイダー毒液から（クラスノペロヴ（ Ｋｒａｓｎｏｐｅｒｏｖ）ら、１９９２年）による３回のカラムクロマトグラフ ィーによって均一になるまで精製された。δ−ＬＩＴのＮ末端配列の２３アミノ 酸残基を配列順序決定した。純毒素をトリプシンによって消化し、そして７種類 の個々のペプチドを単離し且つ部分的に配列順序決定した。 直接的Ｎ末端配列決定は、成熟タンパク質が配列ＤＥＥＤＧＥＭ．．．から出 発するので、配列番号１および２の残基１がこの配列の最初のＡｓｐであること を実証する。Ａｓｐ（＋１）から開始する推定のポリペプチドは、予測分子質量 が１３２６７１ダルトンで且つｐＩが５．４の１１８６アミノ酸（配列番号３+4 で示される、Ａｓｐ残基２９〜残基１２１４）残基から成る。それは、アミノ酸 配列決定分析によって決定されたペプチド配列を全部含む。成熟タンパク質のＮ 末端（配列番号３で示される）の上流には二つのインフレームＭｅｔ残基（−７ および−２８）があり、これらは翻訳開始部位として役立ちうる。Ｍｅｔ（−７ ）のＡＴＧコドンを囲むヌクレオチド配列は、古典的コザク（Ｋｏｚａｋ）コン センサスにより十分に相関するが、Ｍｅｔ（−２８）のヌクレオチド配置は、ク モ形類から単離された少なくとも二つの他の既知のタンパク質、すなわち、主要 ハウスダストダニアレルゲン（ＡＡＡＡＴＧＡ）（ユウキ（Ｙｕｕｋｉ）ら、１ ９９１年）およびα−ラトロトキシンと一緒に共精製された低分子量タンパク質 （ＡＡＡＴＧＡ）（キャトキンら、１９９２年）の開始点に強く対応している。 どちらの場合も、成熟タンパク質のＮ末端に先行する推定の配列は、古典的シグ ナルペプチド構造に対応していない。本発明者は、δ−ＬＩＴ Ｎ末端の翻訳後 修飾が７または２８アミノ酸残基の除去を制限していると推定している。可能な エンドペプチダーゼ切断部位として役立ちうる明確なアミノ酸残基Ａｒｇ−Ｘ− Ｌｙｓ−Ａｒｇ（−１−４）のクラスターの存在は、翻訳後プロセッシングがＮ 末端で起こるという仮説を支持する。 δ−ＬＩＴの推定の構造のＰＥＳＴ（ロジャース（Ｒｏｇｅｒｓ）Ｓ．ら、１ ９８６年）による分析は、従来、細胞内タンパク質の急速分解に相関していたＰ 、Ｅ、ＳおよびＴに富むアミノ酸配列の存在を示す（ゴッテスマン（Ｇｏｔｔｅ ｓｍａｎ）およびマウリジ（Ｍａｕｒｉｚｉ）、１９９２年）。この部分は、配 列ＥＥＳＧＡＰＥＧＳＦＤＳＰＳＳを有し且つ残基９５６〜９７０間に位置して いる。δ−ＬＩＴのＣ末端部分におけるＰＥＳＴ領域の存在は、このタンパク質 のＣ末端プロセッシングと一致する。 δ−ＬＩＴの計算機分析は、三つの推定上の貫膜らせんを予測し、それらの内 の二つは末端部分に位置し（残基３９〜６７および２２１〜２４０）、そして最 小の長さの第三部分（残基５８０〜５９５）は中心部にあると予測している。第 二の推定上の貫膜らせん（残基２２１〜２４０）は、全てのクモの高分子量タン パク質神経毒の間で極めて保守的な部分に属する（キャトキンら、１９９３年） 。 予想のδ−ＬＩＴアミノ酸配列のドット−マトリックス分析は、タンパク質分 子の中心部における反復モチーフの存在を示した。δ−ＬＩＴ−次構造の４６０ アミノ酸残基は、アンキリン様反復体のタンデムに配列された不完全コピーを含 む（ミカエリー（Ｍｉｃｈａｅｌｙ）およびベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）、１９ ９２年）。α−ＬＴおよびα−ＬＩＴ（キャトキンら、１９９０年、キャトキン ら、１９９３年）は２０個以上の反復体を有するが、δ−ＬＩＴには、連続した 反復単位が１３個しかないことが分かった。それらの最適の配置は、（ルクス（ Ｌｕｘ）ら、１９９０年）で始めて示唆された様相にある。最初の反復体に先行 する１３アミノ酸配列は、共通配列とのその十分な相関により、減少した反復単 位と考えることができる。δ−ＬＩＴ反復単位の大部分は長さが３３〜３４アミ ノ酸であるが、二つの反復体は、それぞれ３５（Ｒ１）および３６（Ｒ６）残基 を有する。 ＰＣＯＭＰＡＲＥプログラムによる分析は、２種類の昆虫特異的毒素の反復単 位間の直線的相関を示した。強い直線的一致は、α−ＬＩＴの類似反復体と比較 してδ−ＬＩＴ反復体Ｒ２〜Ｒ９についてみられた（キャトキンら、１９９３年 ）。δ−ＬＩＴの最初の反復体は、α−ＬＩＴの最初の反復体に十分に対応して いないが、α−ＬＩＴからのＲ７に極めて類似している。δ−ＬＩＴ反復体Ｒ１ ０は、α−ＬＩＴからのＲ１９に最も似ていて；この反復体は、８位および３１ 位にそれぞれＳｅｒおよびＧｌｙ残基を有するという点で特異である。類似性の 次の範囲は、δ−ＬＩＴのＲ１１〜Ｒ１３とα−ＬＩＴのＲ１０〜Ｒ１２との間 で見られる。本発明者は、Ｒ７、Ｒ２およびＲ９反復体が昆虫毒素間に最も強く 保存されていることに注目し、昆虫毒性における機能的役割を示唆している。赤 血球アンキリン反復体は、種々のタンパク質を結合するそれらの機能的能力に関 して均等ではない（デービス（Ｄａｖｉｓ）ら、１９９１年）ので、毒素反復体 はまた、それらの機能に対して様々に寄与していると考えられる。 δ−およびα−ＬＩＴのドット−マトリックス比較は、いったん破壊され（δ −ＬＩＴの９００〜１１３０アミノ酸残基）且つ更に両方の毒素の最後の１６０ アミノ酸について修復される強い中心部の対角線によって、それらが類似した体 制全体を共有することを示す。中心部対角線の変位は毒素長さの差を反映し；δ −ＬＩＴはその昆虫特異的対応物よりも１９０アミノ酸短い。 成熟タンパク質は、いくつかの構造ドメイン、すなわち、約４７０アミノ酸残 基から成り且つα−ＬＩＴと強い直線的相同性を有するＮ末端；ほぼ完全にタン デムに配列されたアンキリン様反復単位から成る約４３０アミノ酸の中心ドメイ ン；および約１６０アミノ酸のＣ末端ドメインに分割することができる。 昆虫毒素タンパク質配列の配置は、Ｎ−およびＣ末端構造ドメイン両方が、高 い同一性を有し（Ｎ末端ドメインに対して４４．９％およびＣ末端に対して３７ ．１％）、より似ていない配列によって隔てられた同一性の高い部分の存在を実 証することを示す。二つの昆虫毒素の一次構造における最も劇的な変化は、反復 体含有ドメインのＣ末端部分に集中している。相同性の範囲は、δ−ＬＩＴの１ ３アンキリン様反復単位に局在している。この部分は、α−ＬＩＴともα−ＬＴ とも、ＮＢＲＦ−ＰＩＲデータベースからの他のいずれのタンパク質とも明らか な相同性を示さない約１１０アミノ酸残基の配列を伴う。興味深いことに、δ− ＬＩＴには存在しないこのドメインは、Ｃｙｓ残基の特異なクラスターを有し且 つ哺乳動物特異的α−ＬＴと相同であるα−ＬＩＴの一次構造において特異的な 部分を形成している（キャトキンら、１９９３年）。そのように、二つの昆虫特 異的神経毒間の顕著な構造的差異は、アンキリン様反復ドメインのＣ末端部分が 、それらの種々の機能特性のための構造的基礎を与える場合にある特別な役割を 果たしていることを示唆する。 ブラック・ウィドー・スパイダーの毒液からの高分子量タンパク質毒素は、強 力な且つ特異的種類の毒素である。これらの毒素は、神経タンパク質の機能を解 明するためのおよび昆虫特異的毒素を提供するための大きな可能性を与える。し かしながら、この可能性は、任意の機能を有するこれらのタンパク質毒素を発現 させることができないために、これまで実現されなかった。本発明は、新規の昆 虫特異的毒素をコードしている新規のＤＮＡ転写物のクローニングおよびこの毒 素の機能的発現並びに細菌中の他のポリペプチドを提供する。 δ−ＬＩＴ ｃＤＮＡを、毒素のアミノ酸１〜２３の配列に基くオリゴヌクレ オチドによってクローン化し、そしてその同一性を更に別のペプチド配列によっ て、および免疫化学的同一性をδ−ＬＩＴに特異的な抗体を用いて確証した。δ −ＬＩＴの推定の一次構造は、哺乳動物特異的αＬＴおよび昆虫特異的α−ＬＩ Ｔに対してかなり類似性があり、これらの毒素は同様の構造を有する系列の一部 分であることが示唆される。３種類のタンパク質は、δ−ＬＩＴ中に１３反復体 がある「アルキン様」反復体から成る中心部ドメインを有する。アルキン系列の タンパク質は、種々の内在性膜タンパク質に対してスペクトリンを結合させ（ベ ネット、１９９２年）、しかもアンキリンの「アンキリン反復体」ドメインはタ ンパク質に対する特異的結合に関与していると考えられる（デービスおよびベネ ット、１９９０年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５：１０５８９〜１０５９６ ；デービスら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６：１１１６３〜１１ １６９）。アンキリン系列とのこの構造類似性は、ラトロトキシンの既知の機能 特性に反映し；αＬＴは受容体に対して高親和性（Ｋ_d１０^-9Ｍ）で結合するこ とが知られている。αＬＴ受容体に対するこの特異的結合が毒素のアンキリン反 復部分によって媒介されているかどうかを確認しなければならない。 意外にも、δ−ＬＩＴは、哺乳動物特異的αＬＴに対する（３７％）よりも昆 虫特異的α−ＬＩＴに対して（３８％）類似性が顕著ではない。δ−ＬＩＴには １３個しか反復体がないが、αＬＴおよびα−ＬＩＴはそれぞれ１９個および２ ０個のアンキリン反復体を有する。後者の６／７個の反復体は、δ−ＬＩＴ中に 対応物がなく、α−毒素が両方ともこの部分に部分的に保存された間隔と共に６ 個のシステイン残基を有するように構造単位でありうる。しかしながら、αＬＴ およびα−ＬＩＴの標的毒性の差を考えると、昆虫特異的毒性を伴うこの構造的 特徴を確認することは不可能である。 δ−ＬＩＴは、ｃＤＮＡ配列から推定される毒素の分子量と、毒液から精製さ れた純毒素の相対移動度との間に顕著な不均衡を示す。タンパク質のＮ末端はタ ンパク質配列順序決定によって明確に識別されたが、Ｃ末端の正確な位置は実証 することが困難であった。細菌中での完全長さδ−ＬＩＴ ｃＤＮＡの発現は、 計算分子質量がＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のタンパク質の相対移動度に正確に反映して いること、および天然毒液が、完全にタンパク質分解的Ｃ末端プロセッシングに 由来しないとしても、支配的に由来することを実証した。完全長さ組換え体タン パク質は精製されたが、いずれの条件下においてもバッタに対して毒性ではなか った。完全長さタンパク質は機能性毒素の不活性前駆体である。 毒液から精製されたδ−ＬＩＴのＣ末端の正確な部位は、ＭＡＬＤＩ−質量分 析法によって評価され、切断部位はタンパク質のアミノ酸９９１に集中していた 。ｃＤＮＡを突然変異させて、配列番号２で示される配列を有する９９１個のア ミノ酸を有するタンパク質を生成し且つ細菌中で発現させた。成熟組換えタンパ ク質は可溶性であり且つバッタに対して致死性であった。タンパク質の部分精製 は、毒素が極めて毒性であることを示唆する。 上記の完全な遺伝子配列の切断された形を用いることによる成熟毒素の発現は かなりの利点を有する。第一に、細菌系における切断された形の機能的発現によ って毒素を比較的に容易に生成することができ、それによってクモの毒腺から毒 素を精製する必要がなくなる。これは毒素の工業生産を可能にし、したがって例 えば、殺虫剤系の主成分としての商業的開発を可能にする。 更に、それは、噴霧などの慣用法の他に、殺虫剤としての毒素の可能な投与系 を与える。例えば、切断された配列を包含した組換え体分子を含む改良された植 物細胞または植物、例えば、穀草植物を生産することは可能でありうる。このよ うな系は、切断された形を含む組換え体バキュロウイルスを含む。このようなウ イルスは、インビボで極めて感染性であり且つ宿主細胞中で耐失活性であり、し かも宿主昆虫細胞中において挿入されたヌクレオチド配列を高レベルで発現する ことができる。これは、植物に対して、そして実は脊椎動物に対して無害である と考えられる。植物組織の消化の際に、昆虫は組換え体分子および／または毒素 を取り込み、最終的には昆虫の死がもたらされる。毒素は昆虫特異的であるので 、消費の際にヒトまたは動物に対して有害な作用はないと考えらる。 これは、通常は生物系において前駆体タンパク質の翻訳後修飾によって生産さ れる毒素を細菌発現系において発現させるための本発明の一つの実施態様の一つ の使用の例である。他のタンパク質をコードしている他の遺伝子の切断された形 をこの方法で発現させることができることは理解されるはずであり、本発明の範 囲内である。 本発明は、更に、前駆体ポリペプチドを生じる完全な単離された遺伝子の発現 に続いて翻訳後修飾されることによって生成される毒素を提供する。前駆体ポリ ペプチドは、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有し、そして毒素は配列番号 ２で示される配列を有する。 毒素δ−ＬＩＴの前駆体ポリペプチドをコードしている単離された遺伝子（配 列番号３）（または類似体）は、前駆体ポリペプチドの発現のためのベクター中 にクローン化することができる。バキュロウイルス発現系を用いることができる 。次に、このように生成された前駆体ポリペプチドを、部位特異的突然変異誘発 によって上記に示された部位で切断して、活性毒素を生産することができる。こ れは、毒素δ−ＬＩＴまたはその活性誘導体をブラック・ウィドー・スパイダー とは無関係に、したがって、殺虫剤として指示される使用に対して産業用規模で 生産することを可能にする。 前述の説明において本発明のそれらの特徴に注目させる努力は特に重要である と考えられるが、本出願人が、特に強調されてもされなくても図面で論及された および／または示された本明細書中前記の特許を受けることができる特徴または 特徴組み合わせのいずれに関しても保護を請求するということは理解されるべき である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 7/00 7/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アシャウッド，ピーター・ノーマン・ラッ セル イギリス国ノッティンガム，エヌジー７・ ２アールディー，ユニバーシティ・パーク （番地なし），ザ・ユニバーシティ・オ ブ・ノッティンガム (72)発明者 デュルボヴァ，イリーナ アメリカ合衆国ニューヨーク州10021− 6399，ニューヨーク，ヨーク・アベニュー 1230，ザ・ロックフェラー・ユニバーシ ティ (72)発明者 ヴォルコヴァ，タチアナ ロシア共和国モスクワ ヴェー437, 117871 ジーエスペー，ウル・ミクルクロ −マクラヤ（番地なし），ロシアン・アカ デミー・オブ・サイエンシス (72)発明者 グリシン，ユージヌ ロシア共和国117871 モスクワ ヴェ437, ミクルクホ−マクラヤ・ストリート 16 ／10，ロシアン・アカデミー・オブ・サイ エンシス，シェムヤキン・アンド・オブチ ンニコフ・インスティチュート・オブ・バ イオオーガニック・ケミストリー (72)発明者 クラスノペロフ，ヴァレリ アメリカ合衆国ニューヨーク州10987，タ キシード，ロンドン・メドー・レイン（番 地なし），ネルソン・インスティチュー ト・オブ・エンヴァイランメンタル・メデ ィシン (72)発明者 ガルキナ，タチアナ・ゲンリクホフナ ロシア共和国117871 モスクワ ヴェ437, ミクルクホ−マクラヤ・ストリート 16 ／10，ロシアン・アカデミー・オブ・サイ エンシス，シェムヤキン・アンド・オブチ ンニコフ・インスティチュート・オブ・バ イオオーガニック・ケミストリー (72)発明者 フボトチェフ，ミカイル・ウラディミリヴ ィチ ロシア共和国117871 モスクワ ヴェ437, ミクルクホ−マクラヤ・ストリート 16 ／10，ロシアン・アカデミー・オブ・サイ エンシス，シェムヤキン・アンド・オブチ ンニコフ・インスティチュート・オブ・バ イオオーガニック・ケミストリー (72)発明者 プルジニコフ，キリル・アンドロエヴィチ ロシア共和国117871 モスクワ ヴェ437, ミクルクホ−マクラヤ・ストリート 16 ／10，ロシアン・アカデミー・オブ・サイ エンシス，シェムヤキン・アンド・オブチ ンニコフ・インスティチュート・オブ・バ イオオーガニック・ケミストリー (72)発明者 シャモティエンコ，オレグ・グリゴリエヴ ィチ イギリス国ロンドン シーダブリュー７・ ２エイワイ，インペリアル・カレッジ・オ ブ・サイエンス・テクノロジー・アンド・ メディシン，ウォルフソン・ラボラトリー ズ，デパートメント・オブ・バイオケミス トリー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 切断された形の遺伝子配列の発現によって生成される毒素などのポリペ プチドまたはその類似体。 ２． 前記ポリペプチドが神経毒である請求項１に記載のポリペプチド。 ３． 前記ポリペプチドが、前記遺伝子配列によってコードされた実質的に無 毒性の前駆体ポリペプチドの毒性誘導体に対応する請求項１または２のいずれか に記載のポリペプチド。 ４． 前記ポリペプチドが、実質的に無毒性の前駆体ポリペプチドの切断され た形のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含む請求項１〜３のいずれかに記 載のポリペプチド。 ５． 前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、主としてそのカルボキシ（Ｃ）末 端で切断されている前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する請求項４に記 載のポリペプチド。 ６． 切断が約１５０個〜２００個までのアミノ酸である請求項５に記載のポ リペプチド。 ７． 前記ポリペプチドアミノ酸配列が、更に、アミノ末端（Ｎ）で切断され た前駆体ポリペプチドアミノ酸配列に対応する請求項４〜６のいずれかれに記載 のポリペプチド。 ８． 切断が５０個未満までのアミノ酸、望ましくは７個または２８個までの アミノ酸である請求項７に記載のポリペプチド。 ９． 前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、昆虫特異的神経毒δ−ラトロイン セクトトキシン（δ−ＬＩＴ）のアミノ酸配列またはその活性誘導体と相同であ る請求項１〜８のいずれかに記載のポリペプチド。 １０．前記ポリペプチドが、配列番号１および配列番号２で示されるアミノ酸 配列またはその活性誘導体を含む請求項１〜９のいずれかに記載のポリペプチド 。 １１．前記毒素が、配列番号１で示される配列またはその活性変異型を含む遺 伝子配列のヌクレオチド構築物または切断された形から発現される請求項１〜１ ０のいずれかに記載のポリペプチド。 １２．前記ポリペプチドが、ナショナル・コレクションズ・オブ・インダスト リアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッドに受託番号ＮＣＩＭＢ ４０ ６３２として寄託された微生物で実質的に提供される配列から発現される請求項 １〜１１のいずれかに記載のポリペプチド。 １３．配列番号１および配列番号２で実質的に示されるアミノ酸配列またはそ の活性誘導体を含む毒素として用いるためのタンパク質。 １４．毒素などのポリペプチドの発現において用いるための、切断された形の 遺伝子配列またはその類似体を含むヌクレオチド配列。 １５．前記ヌクレオチド配列が、前駆体ポリペプチドをコードしている且つそ の３’末端で切断されている遺伝子またはその活性誘導体に対応する請求項１４ に記載のヌクレオチド配列。 １６．前記ヌクレオチド配列が、約４００個〜６５０個までのヌクレオチド塩 基、望ましくは５５０個〜６００個のヌクレオチド塩基が切断された遺伝子に対 応する請求項１５に記載のヌクレオチド配列。 １７．前記ヌクレオチド配列が、その５’末端で切断されている遺伝子に対応 する請求項１４〜１６のいずれかに記載のヌクレオチド配列。 １８．切断が１００個未満までのヌクレオチド塩基、望ましくは８４個かまた は２１個までのヌクレオチド塩基である請求項１７に記載のヌクレオチド配列。 １９．前記ヌクレオチド配列が、ブラック・ウィドー・スパイダー（ラトロデ クタス・マクタンス・トレデシムグッタトゥス（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｍａ ｃｔａｎｓ Ｔｒｅｄｅｃｉｍｇｕｔｔａｔｕｓ））の毒液中の神経毒をコード している遺伝子の部分またはその活性誘導体に対応する請求項１４〜１８のいず れかに記載のヌクレオチド配列。 ２０．前記ヌクレオチド配列が、昆虫特異的毒素δ−ラトロインセクトトキシ ン（δ−ＬＩＴ）の前駆体ポリペプチドをコードしている遺伝子の部分またはそ の活性誘導体に対応する請求項１９に記載のヌクレオチド配列。 ２１．前記ヌクレオチド配列が、９９１個のアミノ酸の配列を含むポリペプチ ドをコードする請求項１４〜２０のいずれかに記載のヌクレオチド配列。 ２２．前記ヌクレオチド配列が、配列番号１で示される塩基配列またはその活 性誘導体を含む請求項１４〜２１のいずれかに記載のヌクレオチド配列。 ２３．前記ヌクレオチド配列が、ナショナル・コレクションズ・オブ・インダ ストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッドに受託番号ＮＣＩＭＢ ４０６３２として寄託された微生物中に含まれる塩基配列を含む請求項１４〜２ ２のいずれかに記載のヌクレオチド配列。 ２４．前記ヌクレオチド配列が、配列番号１および配列番号２で示されるアミ ノ酸配列またはその活性誘導体を有するポリペプチドをコードする請求項１４〜 ２３のいずれかに記載のヌクレオチド配列。 ２５．前記ヌクレオチド配列が、逆転写酵素などの酵素の使用によってｍＲＮ Ａに由来するｃＤＮＡである請求項１４〜２４のいずれかに記載のヌクレオチド 配列。 ２６．前記ヌクレオチド配列が、おそらくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） を用いて生産されたオリゴヌクレオチドＤＮＡ構築物である請求項１４〜２５の いずれかに記載のヌクレオチド配列。 ２７．ポリペプチドを生成する方法であって、切断された形の遺伝子を含む組 換えＤＮＡ分子を生成し、そして宿主発現系、例えば、ウイルスまたは細菌発現 系において該切断された形を発現させてポリペプチドを生成することを含む上記 方法。 ２８．生成されたポリペプチドが、実質的に請求項１〜２７のいずれかに記載 の活性毒素である請求項２７に記載の方法。 ２９．切断された形が、無毒性前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子の部分 を含む請求項２７または請求項２８に記載の方法。 ３０．切断された形が、実質的に請求項１４〜２６のいずれかに記載のヌクレ オチド配列を含む請求項２７〜２９のいずれかに記載の方法。 ３１．発現系が、切断された形の配列を含むｐＴ７−７ベクターによって形質 転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌細胞を含む請求項２７〜３０のいずれ かに記載の方法。 ３２．発現系がバキュロウイルス系を含む請求項２７〜３１のいずれかに記載 の方法。 ３３．概して請求項１〜３２のいずれかに記載の毒素をコードしている切断さ れた形の遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子。 ３４．分子がウイルスを含む請求項３３に記載の組換えＤＮＡ分子。 ３５．分子がバキュロウイルスを含む請求項３４に記載の組換えＤＮＡ分子。 ３６．受託番号ＮＣＩＭＢ ４０６３２として寄託された微生物中に実質的に 与えられる組換えＤＮＡ分子。 ３７．概して請求項１４〜２６のいずれかに記載の切断された形の遺伝子を含 む発現ベクター。 ３８．実質的に請求項３３〜３７のいずれかに記載の組換え体分子によって形 質転換されたウイルスまたは細菌細胞などの細胞。 ３９．実質的に請求項１〜１３のいずれかに記載の毒素を含む殺虫剤。 ４０．殺虫剤が、経口投与または局所投与される、請求項３９に記載の殺虫剤 。 ４１．殺虫剤がスプレーを含む請求項３９または請求項４０に記載の殺虫剤。 ４２．昆虫を死滅させるまたは無能力にするための、実質的に請求項１〜４１ のいずれかに記載の毒素を昆虫において生産する切断された形の遺伝子を発現さ せる手段を含む殺虫剤系。 ４３．殺虫剤系がウイルス発現系を含む請求項４２に記載の殺虫剤系。 ４４．ウイルス発現系がバキュロウイルス発現系を含む請求項４３に記載の殺 虫剤系。 ４５．実質的に請求項１４〜２６のいずれかに記載の切断された形の遺伝子配 列を有する遺伝子修飾された細胞を含む植物。 ４６．実質的に請求項１４〜２６のいずれかに記載の切断された形の遺伝子配 列を有する遺伝子修飾された細胞を含む非ヒト動物。 ４７．実質的に単離された無毒性前駆体ポリペプチドを処理することによって 生成される毒素。 ４８．前記毒素が、前駆体ポリペプチドのカルボキシ（Ｃ）末端方向への切断 によって生成されている請求項４７に記載の毒素。 ４９．前記毒素アミノ酸配列が、概して、１５０個〜２００個までのアミノ酸 が切断された前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する請求項４８に記載の 毒素。 ５０．前記毒素アミノ酸配列が、前駆体ポリペプチドアミノ酸配列のアミノ（ Ｎ）末端方向への切断によって生成されている請求項４７〜４９のいずれかに記 載の毒素。 ５１．アミノ末端から切断されたフラグメントが、カルボキシ末端から切断さ れたフラグメントよりも小さい請求項５０に記載の毒素。 ５２．切断除去されたフラグメントが７個または２８個のアミノ酸を含む請求 項５０または請求項５１に記載の毒素。 ５３．前記毒素が、ブラック・ウィドー・スパイダー（ラトロデクタス・マク タンス・トレデシムグッタトゥス）の遺伝子の部分によってコードされたポリペ プチドに対応するアミノ酸配列を有する請求項４７〜５２のいずれかに記載の毒 素。 ５４．前記毒素が、昆虫特異的神経毒δ−ラトロインセクトトキシン（δ−Ｌ ＩＴ）の類似体若しくはその活性誘導体を含むまたはである請求項４７〜５３の いずれかに記載の毒素。 ５５．前記毒素が、配列番号１および配列番号２で示されるアミノ酸配列また はその活性誘導体を含む請求項４７〜５４のいずれかに記載の毒素。 ５６．単離された不活性前駆体ポリペプチドから活性ポリペプチドを生成する 方法であって、該単離された前駆体ポリペプチドを切断することを含む上記方法 。 ５７．単離された不活性前駆体ポリペプチドをカルボキシ末端で切断する請求 項５６に記載の方法。 ５８．前記切断を、タンパク質分解切断を用いて、好ましくは部位特異的突然 変異誘発によって行う請求項５６または請求項５７に記載の方法。 ５９．Ｎ末端の切断を提供しうる請求項５６〜５８のいずれかに記載の方法。 ６０．前記活性ポリペプチドが毒素であり且つ実質的に請求項１〜１３、４７ 〜５５のいずれかに記載されている通りである請求項５６〜５９のいずれかに記 載の方法。 ６１．配列番号４で示されるアミノ酸配列またはその誘導体を含む毒素前駆体 ポリペプチドをコードしている単離されたヌクレオチド塩基配列。 ６２．配列番号３で示される塩基配列またはその誘導体を含む単離された塩基 配列。 ６３．前記ヌクレオチド配列が、神経毒δ−ラトロインセクトトキシン（δ− ＬＩＴ）の前駆体ポリペプチドをコードしている請求項６１または６２のいずれ かに記載の単離された塩基配列。 ６４．受託番号ＮＣＩＭＢ ４０６３３として寄託された微生物中で実質的に 提供される単離された塩基配列。 ６５．実質的に請求項６１〜６４のいずれかに記載の配列を含む組換えＤＮＡ 分子。 ６６．前記分子がウイルスを含む請求項６５に記載の組換え体分子。 ６７．前記ウイルスがバキュロウイルスを含む請求項６６に記載の組換え体分 子。 ６８．実質的に請求項６５〜６７のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子によっ て形質転換された細菌またはウイルス細胞などの細胞。 ６９．昆虫を死滅させるまたは無能力にするための、昆虫において実質的に請 求項６１〜６４のいずれかに記載の塩基配列を発現させて前駆体ポリペプチドを 生産し且つ該前駆体ポリペプチドを処理して毒素を生産する手段を含む殺虫剤系 。 ７０．前記系がウイルス発現系を含む請求項６９に記載の殺虫剤系。 ７１．前記ウイルス発現系がバキュロウイルスを含む請求項６９に記載の殺虫 剤系。 ７２．実質的に請求項６１〜６４のいずれかに記載のヌクレオチド配列を有す る遺伝子修飾された細胞を含む植物。 ７３．実質的に請求項６１〜６４のいずれかに記載のヌクレオチド配列を有す る遺伝子修飾された細胞を含む非ヒト動物。 ７４．配列番号１および配列番号２に関して実質的に本明細書中前記に記載の 新規毒素。 ７５．配列番号１に関して実質的に本明細書中前記に記載のヌクレオチド配列 。 ７６．配列番号３および配列番号４に関して実質的に本明細書中前記に記載の 単離されたポリペプチド。 ７７．配列番号３に関して実質的に本明細書中前記に記載の単離されたヌクレ オチド。 ７８．請求項１〜７７のいずれかと同様の発明の範囲内にあるかどうかまたは それに関係しているかどうかを開示した任意の新規内容または新規内容を含む組 合せ。