JP2000510584A - 血小板の機能性評価のための試験用カートリッジ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 血液試料の血小板機能性評価のための装置と方法。カートリッジが複数の試験セルを含む。各セルは血液試料の一部分を収容する。凝固剤の測量された量が各セルに供給される。血小板活性化剤の計量された量が各セルに供給され、各セルにおけるかかる薬剤の量は各他のセルにおけるかかる薬剤の量と異なる。セル中における試料部分の相対凝固時間は血液試料の血小板機能性を決定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 血小板の機能性評価のための試験用カートリッジ技術分野 本発明は血小板機能性評価のための装置に関する。より詳細には、本発明は血 小板の機能性評価に使用するための改善された多槽カートリッジおよびそれを使 用する方法に関する。技術的背景 全血の凝血または凝固において、血小板が重要な役割を演ずることが観察され ている。血小板が活性化されると、血液の凝固時間を短縮する。この短縮化は血 小板のはじめの状態に関係し、血小板機能不全は心肺バイパス手術後の術後出血 の主要な原因と考えられる。 血小板の機能性は血液および緩衝液中のカオリン（kaolin）のような凝血促進 剤を混合することによって便宜的に決定される。これは試験用カートリッジ中に 組み込まれた一連の試験用のセル中で行なわれる。凝血剤を加えた後に、各セル 中の血液／カオリン溶液は烈しくかきまぜられて凝血促進のために血小板が活性 化される。各セル中の血液試料のかきまぜの程度は夫々異なる。米国特許第５, ３１４,８２６号に述べたように、凝固時間は、かきまぜ程度に比例する。かき まぜ程度の函数としての血液の一部分の凝固時間の比較によって、血小板の機能 性を決定することができる。それを実施するための方法と装置は米国特許第４, ５９９,２１９号および第５,３１４,８２６号に詳細に開示されている。本発明 の更なる理解のための必要性から、これら二つの米国特許における開示を参考と して、ここに組み入れた。 血小板の化学的活性化剤または薬剤は従来から良く知られている。かかる活性 化剤の一つである１−Ｏ−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−ホ スホリルコリン、すなわち生物学的活性リン脂質がデモプ一ロス（Demopoulos） らによってJ．Biol．Chem.，(1979)，245，9355〜8に開示されている。この血小 板活性化剤または活性化薬剤は、しばしば血小板活性化因子と呼ばれ、活性血小 板の能力を高めて効果的に血液凝固反応に関与し、その結果、血液の凝固時間 を短縮する。もしも血小板が不活性であるか、または正常に機能しないと、活性 化剤は凝固時間に僅かに影響するか、または影響を与えないであろう。 本発明の主要な目的は、血液試料中の機能性血小板の評価を容易にする、改善 された血小板機能性試験用カートリッジを提供することにある。 本発明の他の目的は、血液試料部分をその中に受け入れて、血小板活性に予言 的な凝固結果を与える試験カートリッジを提供することにある。発明の開示 上述した目的に従い、本発明は複数の試験セルを有するカートリッジによって 具現化される。夫々のセルは血液試料の一部分を収容できるようになっている。 凝固剤の計測された量が夫々のセルの反応室に乾燥した充填物として塗られる。 夫々のセルにおける凝固剤の量は夫々の他のセルにおいて凝固剤の量と異なり、 少なくとも一つのセルが血小板活性化剤を含まない。加えて、ヘパリンまたはプ ロタミンの量が夫々のセルに液体または乾燥物で加えられる。セルはまた、カオ リンのような凝固剤を含み、この剤はカートリッジ使用の際に反応室中に挿入さ れて血液および血小板活性化剤と混合される。各セル内の試料の相対凝固時間が 測定され、標準とおよび相互に比較したときに血液試料の血小板機能性が決定さ れる。 カートリッジおよび血小板機能性決定の方法は患者の血液条件が厳密にモニタ ーされねばならない心臓切開や心肺手術に関連して有用である。図面の簡単な説明 図１は本発明を具体化した多槽カートリッジの前正面図である。 図２は実質的に図１の線２−２の面における断面図である。 図３は血小板活性化因子濃度と凝固時間の関係を示すグラフである。本発明実施のための最上の方法 本発明は前部下垂スカートまたは下垂板１４を有するカートリッジ板１２から たれ下がり、かつ一体化した複数の試験セル１１、好ましくはかかるセルの６箇 を有する試験カートリッジ１０において具体化される。カートリッジは、米国特 許第４,５９９,２１９号に詳述したように、夫々のセル１１中に挿入された血液 試料の一部分の凝固時間の決定のために上記特許に詳細に述べたような試験装置 中に挿入できるようになっている。各セル１１は下方向に先細の管１５によって 形成され、この先細管１５には、その端部からの中程に内側に突出する環状座１ ６が画定され、また上部密封面１８および下部密封面１９も画定される。管１５ の下端に弾性可撓性滑動プラグ２０が位置し、プランジャー・シャフト２２によ って画定されたプランジャー２１および密封ワッシャーまたは円板２４が管の上 方部分に位置する。密封ワッシャー２４は環状座１６の上部密封面１８に当接し 、プラグ２０と共に下部凝固剤室２５を画定する。管１５はワッシャー２４の上 方にプラグ２８を画定し、試験機（示されていない）と連動されている。 緩衝、静菌溶液中のカオリンのような凝固剤２９がプラグ２０上、かつ密封ワ ッシャー２４下の凝固剤室２５中に含まれる。カートリッジが使用されるとき、 各セルのプランジャー２１は引き上げられ、プラグ２０は上方に押され、この結 果、上部セル反応室２６中に含まれた血液試料中に凝固剤が押しやられて凝固が 始まる。 本発明によれば、化学的血小板活性化因子または薬剤３０の計測された量が頂 部または上部反応室２６中に乾燥充填物として供給される。この血小板活性化因 子組成物は、血液試料が凝固室２６中に導入され、凝固剤２９が添加され混合さ れたときに、血液試料中に溶解する。加えて用いられるべき化学的操作に応じて 、ヘパリンまたはプロタミンの選択された量が反応室２６における乾燥充填物と して用いられる。 一連の異なる凝固時間を与えるために、各セルにおける血小板活性化因子の量 が各他のセルにおける量と異なる。最初の二つの小槽１１Ａおよび１１Ｂ（図１ 参照）においては血小板活性化因子が用いられていない。連続する夫々のセル１ １Ｃ、１１Ｄ、１１Ｅおよび１１Ｆにおいては、次第に増加する量の血小板活性 化因子または血小板活性化薬剤が用いられた。 好ましい血小板活性化因子は化合物１−Ｏ−アルキル−２−アセチル−ｓｎ− グリセリン−３−ホスホリルコリン、すなわち生物学的活性リン脂質である。使 用されうる他の因子または化合物は、コラーゲン、エピネフリン、リストセチン およびアラキドン酸である。好ましい血小板活性化因子、１−Ｏ−アルキル−２ −アセチル−ｓｎ−グリセリル−３−ホスホリルコリンの充填物は、この因子を ０．２５％のウシ血清アルブミンを含む食塩（ＮａＣｌ）と混合し、脱イオン水 で望ましい因子濃度にうすめることにより合成される。望ましい因子濃度の夫々 の溶液の量がセル中に入れられ蒸発されると、血小板活性化因子の望ましい量の 固体または乾燥充填残渣が残される。望ましい量のヘパリンおよびプロタミンを 添加し、充填物として乾燥することもできる。 カオリンのような凝固剤は、０．５ｍの塩化カルシウムおよび静菌剤としての ナトリウムアシドのヒドロキシエチルピペラジン・エタンスルホン酸の緩衝液へ の４％ｗ／ｖ懸濁として合成される。この凝固剤の０．０８８mlの量をカートリ ッジ１０の各小槽１１の薬剤室２５中に仕込む。 使用にあたっては、血液試料のセル当り０．３５mlの量が各セル中に分配され る。この結果、下記の表１に異例として示した血小板活性因子（ＰＡＦ）血中濃 度が得られる。 各セルの反応室へ血液試料を導入した後に、凝固剤を各反応室へ挿入し、各セ ルにおける血液の凝固時間を決定した。各セルの凝固時間から、凝固比を計算し た。凝固比は、セル１１Ａおよび１１Ｂのコントロール凝固時間の平均値と比較 したセルＣ、Ｄ、ＥおよびＦの凝固時間の比である。血小板機能は正常な母集団 において観察された最高凝固比反応の％として表わされる。正常母集団反応のこ の値は知られており、一方では血小板の機能性も示す凝固比％の計算のために使 用することができる。各セルにおける相対凝固時間から、いずれかの適切な望ま しい計算をすることができる。血小板機能は、また手術中における血液損失およ び血液輸血の必要の決定にも用いることができる。血小板機能性は更に心臓手術 中のヘパリン治療管理を助ける。 実施例１ 血小板活性化因子溶液およびセルの製造 １．ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）〔シグマ・プロダクト（Sigma Product） 社＃Ａ−３８０８〕の６２．５mgを計量する。 ２．ＮａＣｌの２１９mgを計量する。 ３．脱イオン水で２５mlに調合する。これにより、０．２５％ＢＳＡ／０．１ ５Ｍ ＮａＣｌが与えられる。ＢＳＡが完全に溶解するまで放置する。 ４．ハミルトン（Hamilton）シリンジを用いて血小板活性化因子１−Ｏ−アル キル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリン−３−ホスホリルコリンの５０μl を清潔な栓つきガラス瓶中に採取し、蒸発フード中で蒸発させる。２mlのＢ ＳＡ／ＮａＣｌ溶液を加え、少なくとも１時間放置する。この作業用蓄積物 質は１００μＭである。 ５．作業用蓄積血小板活性化因子（ＰＡＦ）を脱イオン水で連続的に１／１０ に０．１μＭまでうすめる。これら溶液の各５μｌは、０．４ml血液中に １．２５μＭ、１２．５μＭ、１２５μＭおよび１２５０μＭを夫々与える 。 ６．下記の量をセルに加え、指示された血液中濃度が得られる。 小 槽 添加薬剤 ＰＡＦ濃度 Ａ ５μｌ ＢＳＡ／ＮａＣｌ ０nM Ｂ ０．１μM ＰＡＦの５μl １．２５nM Ｃ １μM ＰＡＦの５μl １２．５nM Ｄ １０μM ＰＡＦの５μl １２５nM Ｅ １００μM ＰＡＦの２μｌ ５００nM Ｆ １００μM ＰＡＦの５μl １２５０nM ７．水を蒸発させて各セルに乾燥充填物を残す。 ８．自発的提供者からの正常血液の試料を用い、実施例１に従って製造したカ ートリッジに血液の０．４ml部分を各セルに加え、各セルにおける血液の凝 固時間を測定し、図３のようにプロットした。 上述したように、凝固時間を比に変換することによって滴定曲線が標準化され た。 血小板活性化因子が存在しない、セルＡの凝固時間は、これに対して全ての他 のセル凝固時間が比較されたセル凝固時間である。秒で表わした夫々の他のセル 凝固時間により秒で表わしたセルＡの凝固時間を割ることによって比を計算した 。次いで１引くセルＡの凝固時間対他のセルの凝固時間の比により凝固比を計算 した（１−小槽Ａの時間／小槽Ｘの時間）。正常値の百分率としての血小板機能 によってデータを表わすこともできる。これは凝固比を１００倍し、次いで２２ の正常なドナーにおける最高血小板活性化因子応答を測定することによって決定 されたファクター１．９７を乗ずることによって凝固比から計算される。これら のドナーは血小板の機能不全を知っておらず、薬剤摂取についても知っていない 。 以上述べた試験用カートリッジと方法は、単純にして迅速な、血小板機能試験 管理の応答点の提供に有用である。この検定は更なる血液治療と管理から利益を 受けることができる、心肺バイパス後の過剰な血液損失の患者を確認することが できる。 本発明のいくつかの説明のための態様を図示し、上記に詳述したが、開示され た特定の形状に本発明を限定する意図は存在しないことが理解されるべきである 。これに反して、本発明は、付記する請求の範囲で表わした本発明の精神と範囲 内の全ての修正、二者択一的構造および組成、同等物および用途を包含する。

【手続補正書】 【提出日】平成１０年１２月１１日（１９９８．１２．１１） 【補正内容】 請求の範囲 １．複数の試験用セルを有するカートリッジからなる、血液試料の血小板機能性 評価のための装置であって、試験用セルのそれぞれに凝固剤と所定量の血小板 活性化剤とが入れてあり、またそれらセルの少なくもふたつのものの血小板活 性化剤の量を異ならせてあることを特徴とする装置。 ２．前記血小板活性化剤が１−Ｏ−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル −３−ホスホリルコリンである請求の範囲１記載の装置。 ３．前記血小板活性化剤が１−Ｏ−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−１−グリセ リル−３−ホスホリルコリン、コラーゲン、エピネフリン、リストセチン及び アラキドン酸からなる群から選ばれる請求の範囲１記載の装置。 ４．血液試料を複数部分の試料に分割し、選択された量の血小板活性化剤の存在 下に夫々の試料部分について凝固試験を行ない、夫々の部分試料当りの血小板 活性化剤の選択された量は相互に異なり、夫々の前記試料部分当りの凝固時間 の差にもとづいて血小板機能性を決定することからなる血液試料における血小 板機能性を決定するための方法。 ５．前記血小板活性化剤が１−Ｏ−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル −３−ホスホリルコリンである請求の範囲４記載の装置。 ６．前記血小板活性化剤が１−Ｏ−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル −３−ホスホリルコリン、コラーゲン、エピネフリン、リストセチンからなる 群から選ばれる請求の範囲４記載の装置。 ７．複数の試験用セルを有するカートリッジからなる、血液試料の血小板機能性 評価のための装置であって、試験用セルのそれぞれに凝固剤と所定量の凝固影 響剤とが入れてあり、またそれらセルの少なくもふたつのものの凝固影響剤の 量を異ならせてあることを特徴とする装置。 ８．血液試料を複数部分の試料に分割し、凝固影響剤の選択された量の存在下に 夫々の試料部分の凝固試験を行ない、夫々の部分試料当りの薬剤の選択された 量は相互に異なり、夫々の部分試料当りの凝固時間の差にもとづいて凝固特性 を決定することからなる血液試料の凝固特性を決定するための方法。 ９．前記凝固影響剤が血小板活性化剤である請求の範囲７記載の装置。 10．前記凝固影響剤が血小板活性化剤である請求の範囲８記載の方法。 11．複数の試験用セルを備えた、血液試料の血小板機能性試験を行うための装置 であって、試験用セルが血液試料の等分された分量を入れられるようになって おり、試験用セルのそれぞれに凝固剤と所定量の血小板活性化剤とが入れてあ り、またそれらセルの少なくもふたつのものの血小板活性化剤の量を異ならせ てあり、この構成により血液試料の各等分分量につき凝固時間が決定され、そ れら等分分量の相対凝固時間により血液試料の血小板機能性が決定されること を特徴とする装置。 12．血小板活性化剤が１−Ｏ−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３ −ホスホリルコリン、コラーゲン、エピネフリン、リストセチン及びアラキド ン酸からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求の範囲11記載 の装置。 13．血小板活性化剤が１−Ｏ−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３ −ホスホリルコリンである請求の範囲11記載の装置。 14．試験用セル中の血小板活性化剤の量が約０ないし約２．７６マイクログラム である請求の範囲11記載の装置。 15．血液試料の等分分量中の血小板活性化剤の濃度が約０と約１５０ｎＭである 請求の範囲11記載の装置。 16．試験用セルの少なくもひとつが血小板活性化剤を全く含まずまた残りのセル がそれぞれ異なる量の血小板活性化剤を含んでいる請求の範囲11記載の装置。 17．凝固剤がカオリンである請求の範囲11記載の装置。 18．血小板機能性試験がプランジャー感知装置技術により行われる請求の範囲11 記載の装置。 19．複数の試験用セルを備えた、血液試料の凝固特性評価のための装置であって 、試験用セルが血液試料の等分された分量を入れられるようになっており、試験 用セルのそれぞれに凝固剤と所定量の凝固影響剤とが入れてあり、それらセルの 少なくもふたつのものの凝固影響剤の量が異ならせてあり、この構成により血液 試料の各等分分量につき凝固時間が決定され、それら等分分量の相対凝固 時間により血液試料の凝固特性が決定されることを特徴とする装置。 20．凝固影響剤が血小板活性化剤である請求の範囲19記載の装置。 21．血小板活性化剤が１−Ｏ−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３ −ホスホリルコリン、コラーゲン、エピネフリン、リストセチン及びアラキド ン酸からなる群から選ばれたものである請求の範囲20記載の装置。 22．血小板活性化剤が１−Ｏ−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル−３ −ホスホリルコリンである請求の範囲20記載の装置。 23．凝固剤がオリンである請求の範囲19記載の装置。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 レイン，カロル，イー. アメリカ合衆国、コロラド 80111、グリ ーンウッド ビレッジ、イースト スタン フォド プレイス、9155

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．複数の試験用セルを有するカートリッジからなり、夫々の該セルは血液試料 の一部分、夫々の該セルにおける凝固剤の計測された量、および夫々の該セル における血小板活性化剤の計測された量を収容するために設けられた、夫々の 該セルにおけるかかる薬剤の量は夫々の他のセルにおけるかかる量と異なり、 ここで該セルにおける該血液試料の相対凝固時間から該血液試料の血小板機能 性が決定される、血液試料の血小板機能性評価のための装置。 ２．前記血小板活性化剤が１−Ｏ−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル −３−ホスホリルコリンである請求の範囲１記載の装置。 ３．前記血小板活性化剤が１−Ｏ−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−１−グリセ リル−３−ホスホリルコリン、コラーゲン、エピネフリン、リフトセチンから なる群から選ばれる請求の範囲１記載の装置。 ４．血液試料を複数部分の試料に分割し、選択された量の血小板活性化剤の存在 下に夫々の試料部分について凝固試験を行ない、夫々の部分試料当りの血小板 活性化剤の選択された量は相互に異なり、夫々の前記試料部分当りの凝固時間 の差にもとづいて血小板機能性を決定することからなる血液試料における血小 板機能性を決定するための方法。 ５．前記血小板活性化剤が１−Ｏ−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル −３−ホスホリルコリンである請求の範囲４記載の装置。 ６．前記血小板活性化剤が１−Ｏ−アルキル−２−アセチル−ｓｎ−グリセリル −３−ホスホリルコリン、コラーゲン、エピネフリン、リフトセチンからなる 群から選ばれる請求の範囲４記載の装置。 ７．複数の試験用セルを有するカートリッジからなり、夫々の該セルは血液試料 の一部分、夫々の該セルにおける凝固剤の計測された量、および夫々の該セル における凝固に影響する薬剤の計測された量を収容するために設けられた、夫 々の該セルにおけるかかる薬剤の量は夫々の他のセルにおけるかかる量と異な り、ここで該セルにおける該血液試料の相対凝固時間から該血液試料の凝固特 性が決定される、血液試料の凝固特性を評価するための装置。 ８．血液試料を複数部分の試料に分割し、凝固影響剤の選択された量の存在下に 夫々の試料部分の凝固試験を行ない、夫々の部分試料当りの薬剤の選択された 量は相互に異なり、夫々の部分試料当りの凝固時間の差にもとづいて凝固特性 性を決定することからなる血液試料の凝固特性を決定するための方法。 ９．前記凝固影響剤が血小板活性化剤である請求の範囲７記載の装置。 １０．前記凝固影響剤が血小板活性化剤である請求の範囲８記載の方法。