JP2000509998A

JP2000509998A - 安定化一過性遺伝子発現

Info

Publication number: JP2000509998A
Application number: JP10521611A
Authority: JP
Inventors: エイ．ゴッフィ，ランダル; エス．ゴッフィ，アディーリア
Original assignee: ジーンスパンコーポレイション
Priority date: 1996-11-01
Filing date: 1997-10-31
Publication date: 2000-08-08
Also published as: AU732445B2; WO1998020146A2; CN1238807A; EP0941356A2; WO1998020146A3; CA2270137A1; AU5160198A

Abstract

(57)【要約】本発明は、真核生物細胞中での一過性の発現を増幅するための方法および物質を提供する。固形腫瘍において延長された一過性発現を達成するためのモデル系、フィーダー細胞または下層に結合した細胞外マトリックスを使用せずに肝細胞を培養する手段、および細胞のグルコース消費を低減するために細胞の代謝を操作するための方法もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】安定化一過性遺伝子発現本出願は、1997年４月11日に出願された米国特許出願第08/833,747号（これは 1996年11月１日に出願された米国仮出願第60/030,109号に基づく一部継続出願である）に基づく一部継続出願である。発明の分野本発明は、培養された真核生物細胞に導入された外来遺伝子の一過性発現を増強する方法および物質に関する。発明の背景外来DNAの真核生物宿主細胞への導入は、多くの目的を果たし得る。例えば、この技術は、特定の遺伝子を同定するための遺伝的補完の手段を提供し得、例えば、代謝経路に重要な酵素を発現する遺伝子は、その経路における欠損細胞をレスキューするその能力によって同定され得る。外因性遺伝子もまた、レシピエント細胞を、そのような細胞に正常にはネイティブではない高用量のタンパク質（例えば、それを殺傷する目的のために悪性細胞に導入される細胞傷害性タンパク質のような）に曝露する目的のために導入され得る。あるいは、外来遺伝子は、十分多量で外来遺伝子のタンパク質産物を得るために、宿主細胞に導入され得、その結果、タンパク質は、さらなる研究のために回収されるか、または医薬として使用され得る。さらに、外来遺伝子の導入は、体細胞遺伝子治療の有望な手段としてみなされる。遺伝子治療のゴールは、損失または欠損遺伝子の作動コピーを患者に提供することによって先天性遺伝子欠損を治療すること、あるいは治療目的のための一時的に外来遺伝子産物を提供することである。体細胞遺伝子治療に対する１つのアプローチは、エキソビボストラテジーであり、ここで、細胞は体から取り出され、トランスジェニックDNAが細胞に挿入され、次いで細胞が体に戻される。別のアプローチにおいて、インビボでの細胞は、患者に直接導入される外来DNAによって標的化される。外来遺伝子は、種々の方法によって生存真核生物細胞に導入され得る。これらは、例えば、外来遺伝子が連結されているウイルスベクターの使用を含む。代表的には、ウイルスベクターは、活発に分裂している細胞（例えば、造血幹細胞）のみを標的化する。外来DNAの導入に有用な別の方法は、エレクトロポレーションであり、ここで、細胞は、DNA溶液の存在下で細胞に与えられる、簡単な高電圧電気パルスに応じてDNAを取り込む。細胞に外来DNAを導入するための方法に頻繁に使用される他の方法は、リポフェクションを含み、ここでDNAはリポソーム（これは凝集して膜構造を形成する脂質分子によって形成される液体充填嚢である）に会合される。DNA分子はリポソームに包膜化されるようになり得るか、またはリポソーム膜に会合され得る。リポソームは、外来遺伝子を細胞に導入する手段として、レシピエント細胞と融合される。広範に使用されるが、リポフェクションの１つの制限は、リポソームが、生存真核生物細胞にいくらか毒性であることである。他の一般的に使用される方法において、DNAは、細胞に適用される前にCaPO₄と共沈されるか、または外来DNAの侵入は、DEAEデキストラン（DNAとの静電的複合体を形成するポリマー）によって媒介され得、複合体はエンドサイトーシスによって細胞に内部移行される（KormisおよびWu，Seminars Llv.Dis., 15:257-267(1995)）。例示的なトランスフェクションプロトコルは、幅広く入手可能である（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning,第２版（1989）、これは本明細書中で参考として援用される；Gorman,C.，「High Efficiency Gene Tran sfer into Mammalian Cells」,第６章、143-190頁、DNA Cloning II-A Practica l Approach,IRL Press,Oxford(1985),Glover,D.M.編;Wynshaw-Borisら、BioTech niques，4:104-119(1986)；Chang,P.L．（編）、Somatic Gene Therapy，CRC Pr ess，1995；ならびにGuide to Euckaryotic Transfection with Cationic Lipid Reagents，Life Technologies（Gibco-BRL）を参照のこと）。「トランスフェクション」は、しばしば、それによって外来遺伝子（「導入遺伝子」）が生存宿主細胞に導入されるプロセスを説明するのに使用される一般的な用語である。このプロセスについての別の用語は、「形質導入」であり、この後者の用語は、ウイルス性ベクター媒介遺伝子移入をいう場合に最も一般的に使用される。外来DNAを発現するかまたは取り込む宿主細胞は、「形質転換細胞」として公知であり、そしてそれによって形質転換されるプロセスは、「形質転換」または「形質導入」と称される。異なる型の細胞はそれらの形質転換に対する感受性において変化し、そして外来DNAを導入するためのプロトコルは、代表的には、種々のパラメーター（例えば、pH、培養培地の型、DNA量、CO₂濃度、またはDNA導入の方法）の調整によって至適化される（例えば、ChenおよびOkayama， Mol.Cell.Biol.，7:2745-2752(1987)を参照のこと）。外来DNAがCaPO₄またはDEAEデキストラン法によって細胞に導入される場合、ほとんどの細胞が最初にDNAを取り込むが、それらの画分のみが、導入された後の最初の数日間DNAを発現することが観察されている（例えば、Gorman(1985)を参照のこと）。トランスフェクトDNAの初期の発現は、代表的には、短命であり、そして「一過性発現」といわれる。レシピエント細胞のさらに小さい画分（0.1 〜0.001％）は、宿主ゲノムにそれを共有結合することによって、トランスフェクトDNAを安定に取り込む（例えば、Wynshaw-Borisら、(1986)を参照のこと）。トランスフェクト外来DNAが、外来遺伝子の発現を支持する様式において、宿主D NAに共有結合的に挿入される場合、得られる細胞は、「安定に形質転換されている」といわれる。観察された低レベルの共有結合性組込みについての可能な理由は、活性なDNA合成が、外来DNAの取り込みを開始するために生じなければならないことである。従って、細胞は、細胞周期のＳ期の間のみの安定な形質転換に感受性であることが意図される。安定な形質転換細胞において、外来遺伝子は、各時点の細胞分裂を再生し、そして、外来遺伝子によってコードされるタンパク質は、外因性細胞染色体遺伝子を転写する同じ酵素機構によって発現される。しかし、一過性発現の最初の合図の後、トランスフェクト培養物における細胞のごく小さな画分のみが、代表的には、トランスフェクト遺伝子の取り込まれたコピーを含む。従って、このような培養物において発現される外来タンパク質の量は少量であり、そして検出不可能でさえあり得る。従って、安定な形質転換プロトコルは、一般的には、トランスフェクション後の選択工程に頼って、外来DNAの添加後に存在する少しの安定な形質転換細胞に対する選択的増殖利点を提供する。安定な形質転換細胞の同種培養は、外来遺伝子が取り込まれており、そしてそれを発現し続ける細胞の株を得るために、種々の実験条件下で選択的に単離され得る。これを達成するために、選択可能な遺伝子（通常は、薬物耐性を付与するか、または色素生産性タンパク質をコードするもの）は、所望のタンパク質をコードするDNAの導入と同時に宿主細胞に取り込まれなければならない。この目的に適切なレポーター遺伝子の例としては、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、細菌βガラクトシダーゼなどが挙げられる（例えば、AlamおよびCook，Anal.Biochem.，188:245 -254(1990)を参照のこと）。薬物耐性マーカーが使用される場合、薬物耐性細胞は、安定な形質転換細胞が培養において優性になり得るように、関連薬物に長期間曝露することによって選択されなければならない。あるいは、取り込まれたDN Aを含む細胞は、色素生産性基質を色の付いた基質（これは、個々の安定な形質転換細胞の同定および手動クローニングを可能にする）に変換し得る同時トランスフェクト遺伝子の発現によって同定され得る。いくつかの例において、所望の遺伝子自身は、安定な形質転換細胞において選択可能な特色を付与し得るが、この環境は希である。いずれにしろ、安定な形質転換細胞株の作製および単離は、達成までに１〜３カ月かかり得る（Wynshaw-Borisら、(1986)）。安定な形質転換とは対照的に、トランスフェクトDNAの一過性発現は、外来DNA の宿主細胞染色体への取り込みに依存しない。細胞に適用されるDNAの大部分は、核に迅速に輸送されると考えられるが、いくつかの系において、発現は、任意の検出可能な取り込みの非存在下で、トランスフェクション後80時間まで検出され得る（例えば、Gorman(1985);Wynshaw-Borisら(1986)を参照のこと）。一過性発現が検出され得る前に、選択工程は必要ではない。しかし、外来遺伝子を取り込む細胞の約１〜10％のみが、代表的には、トランスフェクト外来遺伝子からmR NAを転写する（例えば、Gormanら、Nucl.Ac.Res.，11:7631-7648(1983)を参照のこと）。一過性トランスフェクト細胞におけるトランスフェクトDNAのほとんど大部分は、宿主DNAに取り込まれないが、これらの細胞の約0.001〜１％において取り込まれる（AlamおよびCook(1990)）。細胞のこの小さい安定なトランスフェクト画分は、トランスフェクション後すぐに観察される外来遺伝子発現プロフィールにおける重要または有用な役割を果たさないと考えられる。選択工程を伴わずに、外来遺伝子の発現は、トランスフェクト細胞の培養物からすぐに消滅する。代表的には、培養細胞における一過性発現が、約48時間においてピークに達し、そして24〜80時間のみ検出可能である（Gorman(1985);Wynsh aw-Borisら(1986)）。トランスフェクト細胞によって取り込まれるDNAのほとんどは、ヌクレアーゼによって迅速に代謝されるか、または細胞分裂によって希釈される（例えば、Gorman(1985)；Guide to Eukaryotic Transfection with Cati onic Lipid Reagents Life Technologiesを参照のこと）。一過性発現は、標的細胞が活性に分裂されることを要求しないので、トランスフェクションに対する感受性は、このような細胞間で劇的に変化するが、通常は分割しない最終分化細胞において達成され得る。例えば、裸のDNAは、マウス骨格筋に直接注射した場合に発現され得る（Wolffら、Science，247,1465-1468(19 90)）。他の研究において、裸のDNAは、ワクチンとして使用された（Cohen,J.， Science，259,1691-1692(1993)）。多くの研究は、インビボでの外来DNAの幹細胞へのリポソーム送達に集中している（例えば、WuおよびWu，J.Biol.Chem．263:14621-14624(1988)；Chowら、J ．Pharmacol.Exp.Ther.，248:506-13(1989);Wuら、J.Blol.Chem.，264:16985-16 987(1989);Kanedaら、J.Biol.Chem.，264:12126-12129(l989a);Kanedaら、Scien ce，243:375-378(1989b)；Wilsonら、J.Biol.Chem.，267:963-967(1992);Wilson ら、J.Biol.Chem.，267:11483-11489(1992b)；Chowdhuryら、J.Biol.Chem.，268 :11265-11271(1993)；Peralesら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91:4086-4090(1994 ）；KormisおよびWu,(1995)を参照のこと）。外来DNAをインビボで特異的な組織に標的するための１つのアプローチは、レセプター媒介性リポソーム送達である (KormisおよびWu(1995)に概説される)。このストラテジーの肝臓への適用において、Wuおよび彼の共同研究者は、幹細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質レセプターの存在を活用して、肝臓に注射リポソームを標的した。この送達系は、一連の刊行物において特徴づけられる（WuおよびWu(1988)；Wuら(1989)；Wilsaon ら（1992a)；Wllsonら(1992b)；Chowdhuryら(1993)；Peralesら(1994)）。アシアロ糖タンパク質は、ポリリジンとの静電的複合体を形成しているDNAとともに、リポソームに封入された。最初の努力が成功した場合、このグループは、レシピエントラットにおいて部分的な肝切除を行うことによって、外来DNAの安定な取り込みを最大化することを試みた。肝臓細胞の再生は、正常な肝臓に存在するものよりＳ期における細胞の高い比率を提供するので、この順序は、外来DNA が取り込み得る肝臓細胞の比率を増加させることが予測された。部分的肝切除の後、トランスジェニックタンパク質は、トランスフェクション後11週間の間、血液において検出可能であった（Wuら(1989)）。初めに、これらの研究者は、注射したDNAが取り込まれていると考えたが、後の実験は、検出可能な取り込まれたD NAが存在しないことを明らかにし、かわりに保存された外来DNAが、血漿膜／エンドソーム画分に存在することを示した（Wilsonら(1992b)；Chowdhuryら(1993) ）。この驚くべき観察は、部分的肝切除が、DNA合成自体の非依存性である機構によってトランスジェニックDNAの持続性を導くことを示した。別のグループもまた、注射したDNAを肝臓に指向させるための標的ストラテジーを使用している（Kanedaら(1989a)；Kanedaら(1989b)）。ここで、トランスジェニックDNAは、リポソームにおいて、核に通常見いだされるタンパク質（すなわち、非ヒストン染色体タンパク質）とともに封入された。彼らは、注射したベシクルの肝臓細胞の核への送達を観察し、そして注射後７または８日までの間の測定可能な導入遺伝子発現を検出した。しかし、このDNAは、幹細胞染色体に取り込まれなかった。他は、CaPO₄-DNA沈殿物の肝臓、脾臓、または腹膜への直接注射に続く、外来DNAの首尾良いインビボでの発現を報告している（Kanedaら(19 89a)を参照のこと）。多数の試薬は、安定な形質転換のインビボでの効率を増大することが示されている。あるグループは、CaPO₄媒介性トランスフェクションの間の培養培地におけるpHを制御することによって、50％の安定な形質転換効率が達成され得ることを報告している（Chenおよび0kayama(1987)）。トランスフェクトDNAの発現を増強すると報告される別の試薬は、酪酸またはそのナトリウム塩である（Gormanら(1983)）。クロマチン構造を改変するその公知の能力のために、Gormanら(1983)は、トランスフェクションによって細胞に導入される外来遺伝子の発現に対する酪酸の効果を試験した。これらの研究において、細胞はトランスフェクトされ、次いで、１回の12時間の用量の酪酸ナトリウムに曝露された。一過性発現が次の５日にわたってモニターされた場合、彼らは、トランスフェクト遺伝子を発現したレシピエント細胞の割合において、２〜４倍の増加を観察した。彼らはまた、トランスフェクト構築物が、SV40エンハンサーエレメントを含む場合、外来遺伝子発現レベルにおける25〜100倍の増加を記載した。酪酸塩の存在下でトランスフェクトした他の培養物が、安定な形質転換体について選択された場合、彼らは、安定な形質転換体に対する増加を与えるトランスフェクト細胞の割合において、コントロールを超える有意な増加を観察した。しかし、Palermoら（J.Biothech.，19:35-48(1991)）は、酪酸塩がトランスフェクション工程の間に存在していてもそうでなくても、安定な形質転換体における増加した導入遺伝子発現を誘導し得ることを見いだした。実際に、多くの報告が、特定のタンパク質の合成を誘導するか、またはインビトロでの細胞分化を増加する酪酸の能力を証明している。(Boffaら、J.Biol.Chem.，256:9612-962 1(1981)；Kruh，Mol.Cell.Biochem．42:65-82(1982)；Chabanasら、J.Mol.Biol. ，183:141-151(1985)；Parker，J.Biol.Chem.，261:2786-2790(1986)；Kooistra ら、Biochem.J.，247:605-612(1987)；Kanekoら、Canc.Res.，50:3101-3105(199 0)；Nathanら、Exp.Cell Res.，190:76-84(1990)；Palermo，J.Biotech.，16:35 -48(1991)；Kosakaら、Exp.Cell Res.，192:46-51(1991)；ならびにOhら、Biote chnol.Bioeng.，42:601-610(1993)）。遺伝子導入のための酪酸塩の至適濃度は、細胞型から細胞型へと変化し、そしてその細胞毒性効果を最小化する適切な濃度範囲は、標的細胞の各型について経験的に決定されなければならない（例えば、Gorman(1985)；Parkerら(1986)；Ohら(1993)を参照のこと）。生細胞における酪酸（または酪酸塩）の効果は、染色体タンパク質の改変に限定されない。この化合物の最も著しい徴候のうちの１つは、培養した細胞の増殖を可逆的に抑制するその能力である（例えば、Boffaら(1981)を参照のこと、これは、酪酸塩に曝露したほとんどの細胞が、G1/S境界で阻止されることを報告する）。さらに、酪酸塩は、インターフェロンの抗腫瘍作用を増強する（Kruh(198 2)）。この抗腫瘍活性は、特に興味深い。なぜなら、生マウスへの0.5mlの50mM 酪酸塩溶液の直接注射によって達成されたからである。外来遺伝子の発現のための適切な形質転換ではなく、一過性発現を用いる多くの利点が存在する。第１に、一過性発現を用いることによって、当業者は、比較的多数の構築物を迅速に分析し得る。また、体におけるその存在が疾患の持続期間のみ所望される、治療用タンパク質を送達するための選択の方法でもあり得る。さらに、一過性発現は、重大な細胞遺伝子に挿入される外来DNAの結果として生じ得る変異誘発または細胞死の危険を回避する。さらに、一過性発現は、不死化されていない一次細胞株において達成され得るが、安定な形質転換体は、長期間の培養において生存および分割し得る細胞からのみ確立され得る。しかし、肝臓肝切除モデルの例外を除いて、現在公知の一過性発現方法の主な弱点は、外来遺伝子の比較的短命の発現、および生細胞に毒性であるトランスフェクション試薬（精製DNA自身を含む）の傾向であることが続く。肝切除または他の外科切除は、ほとんどの実施目的のためのアプローチに強烈すぎる。従って、一過性発現を安定化する他の手段の可能性は、この技術の適用の潜在的な範囲を広げる。発明の要旨本発明は、宿主真核生物細胞に導入されている外来DNAの発現を有意に増強する方法および物質を提供する。本明細書中に記載される物質は、一過性発現の量および持続性の両方を増加する。これらの物質を含む化学化合物は、増殖細胞および非分割細胞の安定な培養物の両方において効果的であることが実証される。この環境は、これらの化合物で観察される増強された一過性発現が、レシピエント宿主細胞のゲノムへの外来DNAの取り込みに関与しないことを示す。さらに、本発明の化合物は、培養培地に存在するグルコースの培養細胞による消費を抑制し、従って別の炭素源（例えば、脂質またはタンパク質）におけるエネルギーに頼ることを細胞に強制することが示される。これらの同じ細胞は、アンモニウムの増加した産生を示し、従ってタンパク質がエネルギー源として使用されることを示唆する。グルコース消費におけるそれらの効果は、これらの化合物の作用の主要な部位がミトコンドリアであることを示唆する。この観察は、ミトコンドリアを、インビトロおよびインビボの両方での非取り込み外来DNAの持続性発現における重要な役割を果たすことと結びつける。さらに、これらの化合物の存在下における細胞増殖が、内因性アルカリホスファターゼ活性を発現および分泌することを誘導する。本発明はさらに、種々の送達系によって標的細胞に導入されている外来遺伝子の長期一過性発現を提供する。この送達系としては、カチオン脂質（すなわち、リポソーム）およびデンドリマー（dendrlmer）（「星形」ポリマーとしてもまた知られる）のような種々の合成ポリマーが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の化学化合物の多くは、外来DNAが細胞に導入された後の、十分な外来遺伝子の運命に影響し、従って、それによってDNAが導入される方法に非依存的に作用する。本発明の化学化合物のいくつかは、外来DNAの導入に続く最初の４日間の間の発現の程度を増加するのに特に影響し、従って細胞に取り込まれるDN Aの最初の量を増強するか、またはDNAを発現する細胞の割合を増加するか、またはその両方であるようである。本発明の化合物は、疎水性部分および酸性部分を有し、そして後者は塩またはエステルの形態をとり得る。さらに、それらは生体適合性、すなわち、適切な濃度で細胞に適用される場合、50％を超える細胞が生存したままである。本発明の方法は、化合物を「Ａ型」処方物（これは、外来遺伝子が細胞に添加された後の初めの４日間、一過性発現が主に増加する）および「Ｂ型」処方物（これは、外来DNAが細胞を侵入した後に、一過性発現を主に安定化する）に分類することに関する。従って、名称「Ａ型」および「Ｂ型」は、化合物が培養物に添加される時を反映する。至適発現は、細胞を、トランスフェクション工程（一過性発現の第一相）の前、間、および／または後に、Ａ型化合物で処理することによって、そして数時間または数日以内（例えば、12〜60時間以内に、外来DNA を誘導するＢ型化合物をさらに添加し、そしてその後（一過性発現の第２相）の細胞との接触においてそれを放置することによって得られる。最適には、Ａ型化合物は、一過性発現の両方の相を通じて培地中で維持される。本発明はさらに、一過性発現の両方の期におけるそれらの使用のための、個々の化学物質および２つ以上の化合物の処方物の効力を決定するためのアッセイを提供する。本発明の化学物質は、生細胞における著しい代謝変化を起こし、これは、以前に観察されたよりも長い期間、外来DNAの一過性発現を持続し得る。さらに、これらの化学物質の添加に続いて、培養細胞は、それらのグルコースの消費を驚くほど減少し、そしてそれらの別のエネルギー源（例えば、タンパク質およびおそらく脂質）の使用を著しく増加した。１つの実施態様において、本発明は、支持細胞の非存在下、およびタンパク質分解酵素または他の接着促進分子を有するプレコート細胞下層の必要性を伴わずに、肝細胞を培養するための方法を提供する。図面の簡単な説明本発明の前述の局面および多くの付随する利点は、添付の図面と組み合わせた場合、以下の詳細な説明を参照することによってより良好に理解されるのと同じように、より容易に理解される。ここで：図１は、本発明のいくつかの異なる化合物に曝露した細胞についての細胞増殖曲線を示す。図１は、実施例４および表７に示されるプレートのいくつかについての細胞増殖の量を示すグラフである。図１の差し込み欄における数字は、表７に列挙されたプレートの数字に対応する；図２は、化合物のいくつかの細胞傷害性を示すグラフである。この化合物の試験結果は表７に示されている。図２の差し込み欄における数字は、表７に列挙されたプレートの数字に対応する；そして図３は、実施例６の実験の結果を示すグラフである。これらの実験は、一過性発現の持続時間を延長する種々の化学物質の存在下で、分化したブタPICM-19 3B T細胞における一過性発現を含む。図４は、実施例８に記載される実験の間に毎日回収したサンプルにおいて測定した、βガラクトシダーゼの量のグラフである。そして、一過性発現安定化化合物の存在下で、バイオリアクターデバイスにおいて培養したトランスフェクト細胞における導入遺伝子発現の長期安定化（すなわち、32日）を示す。図５Ａ〜５Ｃは、実施例８に記載される実験の間に毎日サンプリングされた培養培地における、アンモニア、グルコース、および乳酸の濃度を示すグラフである。図５Ａは、各サンプルにおいて測定したアンモニアの濃度を示す。図５Ｂは、各サンプルにおいて測定したグルコースの濃度を示す。そして、図５Ｃは、各サンプルにおいて測定した乳酸の濃度を示す。好ましい実施態様の詳細な説明定義：トランスフェクション：以下の開示の目的のために、「トランスフェクション」とは、外来DNAをレシピエント細胞に導入する任意の手段をいう。これは、リポソーム媒介法、ウイルスベクター、CaPO₄-DNA共沈物、DEADデキストラン、裸のDNA、星形ポリマーの存在下におけるタンパク質と複合体化したDNAトランスフェクション、またはDNAをレシピエント細胞に導入する他の手段を含む。外来DNA／トランスジェニックDNA：レシピエント真核生物細胞における発現のために適切に改変されている遺伝物質である。代表的には、レシピエント細胞と異なる生物起源である必要はない。トランスジェニックDNAは、生物学的に活性なタンパク質またはタンパク質ドメインについてのコード領域を含む。「適切な改変」によって、トランスジェニックDNAは、真核生物プロモーターおよび、宿主細胞における外来遺伝子の機能的転写を確実にすることが要求される任意の他の調節配列に作動可能に連結されることが意味される。DNAは通常、環状形態であり、そして得られるmRNAの転写および続く翻訳に必要な調節配列に作動可能に連結されるポリペプチドについてのコード領域を含む。このようなシグナルは、 RNAポリメラーゼ、エンハンサー、転写終結シグナル、リボソーム結合部位、転写開始および停止シグナル、ポリ(A)添加シグナルなどを含み得る。エンハンサーは、組織特異的であり得る。 βガラクトシダーゼ（β-gal）：無色の基質を容易に検出可能な着色産物に変換し得る細菌酵素。この遺伝子は、以下の実施例において、本発明の効力を実証する目的のための代表的な外来遺伝子として使用される。本発明は、真核生物細胞における外来遺伝子の一過性発現を増強するための、方法および物質を提供する。方法は、ヒト大腸ガン細胞、マウスメラノーマ細胞、ブタ原発生肝細胞において、および分化した肝細胞に共通するブタ細胞株において有効であることが示されている。この方法は、最初に、細胞において発現され得る形態におけるタンパク質をコードする外来DNAの分子を細胞に導入することを含む。外来DNAは、任意の従来の方法によって細胞に導入され得、この方法としては、リポフェクション、エレクトロポレーション、CaPO₄-DNA共沈物とのインキュベーション、DEAEデキストランとのインキュベーション、DNAのウイルスベクターへの連結などが挙げられるが、これらに限定されない。レトロウイルスまたはアデノウイルスに由来するベクターは、外来遺伝子を真核生物宿主細胞に導入するのに有用である。所望される場合、外来DNAを含むプラスミドまたはウイルスベクターは、プロモーターと挿入部位との間に位置するか、あるいは挿入部位に続いて位置するヌクレオチド配列を提供し得、その結果、ベクターに提供されたヌクレオチド配列によってコードされる１つ以上のアミノ酸は、外来DNAによってコードされるタンパク質に融合する。このような融合タンパク質は、所望の転写後改変（例えば、分泌のためのシグナルペプチド）を指向するペプチドまたは炭水化物部分の接合部についての部位を提供し得る。本発明は、細胞において外来遺伝子の一過性発現を増強するための、方法および物質を提供する。外来遺伝子の細胞への導入の前、間、または後に、細胞は以下に記載の１つ以上の化合物と接触され、その後、外来DNAの発現は、これらの化合物の非存在下でトランスフェクトした細胞と比較して、実質的に増強される。「一過性発現を増強する」ことによって、本明細書では、本発明の方法が使用される場合、トランスフェクション後の最初の数日の間の導入遺伝子発現の量が、コントロールと比較して増大されること、または一過性発現の間の期間が、コントロールと比較して延長されること、またはその両方が意味される。本発明の方法において、外来DNAが導入される細胞は、最初のDNA取り込みまたは発現の効率を増大するか、あるいは細胞を侵入した後の外来DNAの有効半減期を延長する化学物質と接触される。個々の化合物は、最初の発現の効率を増加し得、そしてまた、一過性発現の期間を延長し得る。用語「外来DNAの有効半減期」は、本明細書で、外来遺伝子によってコードされるタンパク質が細胞において検出され得る間の期間の長さをいうための経時的意味において使用される。従来のトランスフェクションプロトコルが使用される（すなわち、トランスフェクションが、開示された方法に従って以下に記載の化学物質を用いずに行われる）場合、一過性発現は、代表的には、外来遺伝子が細胞に導入された後３〜４日以内に検出不可能なレベルに減衰する。しかし、本発明の方法を用いると、発現の容易に検出可能なレベルは、代表的には、トランスフェクション工程後14日間までも観察され、そしてトランスフェクション後32日まで観察されている。トランスフェクトされた外来DNAに相同なDNAおよびRNAは、本発明の方法に従って処理されたトランスフェクト細胞において、転写の32日後、検出されている。本発明の方法を用いると、一過性発現は、代表的には、約２〜３日間以内がピークであり、次いで開始レベルの約３分の１のレベルにまで減少し、その後数日〜数週間安定なままである。本発明の方法に有用な物質は、以下により完全に記載される多数の化学物質を含む。「物質」は、単一の化学物質、または２つ以上の化合物の組合せからなり得る。さらに、物質は、トランスフェクションプロトコルの初期の間に投与される１つ以上の化合物、および外来DNAを細胞に入れた後に添加されるさらなる化合物（単数または複数）を含む。これらの一過性発現増強剤は、外来DNAの導入の前、間、および後に存在し得る。DNAを導入した後に細胞に添加される場合、物質は、代表的には、少なくとも２４時間以上細胞と接触したままである。一般的には、本発明の方法における物質として有用な化学物質は、少なくとも１つの疎水性部分および少なくとも１つの酸性部分を含む。酸性部分はまた、疎水性および有機性であり得る。特定のこれらの化学物質について、酸性部分は、塩またはエステルとして改変されている。１つの実施態様において、化学物質は、一般式R₁-C(=)OR₂によって表されるカルボン酸誘導体であり、別の実施態様において、化学物質は、一般式R₇-SO₂-OR₈によって表されるスルホン酸誘導体である。適切なカルボン酸誘導体（すなわち、（R₁-C(=O)-OR₂）としては、天然に存在するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、セリン、スレオニン、メチオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン）、それらの非天然光学異性体、および特定のアミノ酸誘導体（例えば、3-メチル-L-ヒスチジン、α−ケトグルタール酸、β−アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチン、葉酸、グルタチオン、馬尿酸、ホモセリン、N- カルバミルアスパラギン酸、Ｎ−ホルミル−Ｌ−メチオニンおよびオルニチン）が挙げられる。アミノ酸についての一般的なカルボン酸誘導体式（R₁-C(=O)-OR₂）を参照して、R₁は、CHNH₂R₃であり、ここでR₃は、天然に存在するアミノ酸の側鎖である。本発明の方法において有用な他のアミノ酸誘導体は、アルキル置換体およびさらなる官能基を有するアルキル置換体をさらに含むアミノ酸を含む。これらのアミノ酸誘導体は、上記のカルボン酸誘導体式によって示される（ここでR₁は、CHNH₂ (CH₂)_nR₅であり、ここでn=１〜７、およびR₅は、CH₃、OH、CONH₂、C₆H₄OH、およびCONHNH₂から選択される）。あるいは、R₁は、-(CH₂)_nCHNH₂CO₂Hであり、ここでn=１〜８；-CH(CO₂H)NHCONH₂、またはR₁は-C₅H₄N（すなわちニコチン酸および誘導体）である。アミノ酸に加えて、本発明の方法において有用なカルボン酸誘導体は、アルキル、アリール、ならびに置換アルキルおよびアリールカルボン酸誘導体を含む。好ましいアルキルおよび置換アルキルカルボン酸誘導体は、上記の一般式で示され、ここでR₁は、-(CH₂)nR₆であり、ここでn=１〜９であり、そしてR₆は、インドール基、NCH₃C(=NH)NH₂、SCH₃、NH₂、CH₃、CO₂H、CONH₂、およびNHC(=NH)NH₂ から選択される。好ましいアリールカルボン酸誘導体は、安息香酸およびその誘導体を含む。安息香酸誘導体は、上記の式によって示され、ここでR₁は-C₆H₄R₄ であり、ここでR₄は、H、CH₃、(CH₂)_nCH₃、NH₂、COCH₃、CO(CH₂)_nCH₃、C(CH₃)₃ 、CH(CH₃)₂、(CH₂)_nCO(CH₃)₂、(CH₂)_nCOCH₃、OCH₃、およびO(CH₂)_nCH₃から選択され、ここでn=１〜３である。側鎖はしばしば、線状ドレーン（drain）より有効であることが見いだされている。本発明において有用なカルボン酸誘導体は、カルボン酸（すなわち、R₂がHである）；エーテル基およびケトン基のようなさらなる官能基を有するエステル（例えば、R₂が、(CH₂)_xO(CH₂)_yCH₃および(CH₂)_xCO(CH₂)_yCH₃であり、ここでx+y= ２〜７である）を含むカルボン酸エステル（例えば、R₂がCH₃および(CH₂)_nCH₃であり、ここでn=１〜８である）；ならびに金属塩（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、およびマグネシウム）ならびに比較的低分子量のカチオン（例えば、アンモニウム）を含むカルボン酸塩を含む。適切なスルホン酸誘導体（一般式R₇-SO₂-OR₈によって示される）は、アルキル、アリール、置換アルキル、およびアリールスルホン酸誘導体（すなわち、R₇が、アルキル、アリール、または置換アルキルもしくはアリール基である）を含む。好ましくは、スルホン酸誘導体は、低級アルキル（すなわち、直鎖または分岐 C₁-C₅アルキル基）スルホネート、およびより好ましくは、アミノ置換低級アルキルスルホネート（例えば、タウリン）である。好ましくは、アリールスルホン酸誘導体は、ベンゼンスルホン酸誘導体、およびより好ましくは、アミノ置換ベンゼンスルホン酸塩（例えば、3-アミノベンゼンスルホン酸塩）である。本発明において有用なスルホン酸誘導体は、スルホン酸（すなわち、R₈がHである）、および金属塩（例えば、R₈が、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、およびマグネシウムである）ならびに比較的低分子量の有機カチオン（例えば、 R₈がアンモニウムイオンである）を含むスルホン酸塩を含む。別の実施態様において、本発明の方法における物質として有用な化学物質は、スルホン化アミノポリサッカライドを含む。好ましくは、ポリサッカライドは、スルホン化N-アセチル化アミノポリサッカライドである。適切なポリサッカライドは、代表的には、約４〜約200の糖残基を含む。好ましいスルホン化N-アセチル化アミノポリサッカライドは、コンドロイチン -6-硫酸およびスルホネートグアラン（guaran）を含む。グアランは、Cyamopsis tetragonolobus種子の胚乳から単離され、そしてマンナン骨格に結合するα-1,6 -結合D-ガラクトースを有する高分子量のβ-1,4-D-ガラクトマンナン（例えば、約1,200,000ダルトンまで）である。適切なグアランは、一般的にはヒドロキシプロピルグアランといわれる、2-ヒドロキシプロピルエーテル誘導体を含む。本発明の方法において有用な他の化学物質は、アドレナリン（エピネフリン）、補酵素B12、およびメチルコバラミンを含む。従って、同定されたスルホン化アミノポリサッカライドの特に有効な例は、コンドロイチン-6-硫酸（Ｃ型コンドロイチン硫酸）（ポリアニオン性グリコサミノグリカン）である。コンドロイチン硫酸は、体にわたる軟骨および結合組織において見いだされる、天然に存在するムコ多糖類である。Ｃ型コンドロイチン硫酸は、分子量（反復ジサッカライドのN-アセチルガラクトサミン残基での硫酸化の程度）において、および未硫酸化反復単位への硫酸化の相対分布において変化するポリマー性分子である。約4000ダルトンの分子量を有するコンドロイチン-6 -硫酸は、特に有効である。Ｃ型コンドロイチン-6-硫酸の市販調製物は、代表的には、種々の割合のＡ型コンドロイチン硫酸（これは、コンドロイチン-4-硫酸である）を含む。Ｃ型コンドロイチン硫酸を主に含む調製物は、一過性発現を安定化するのに非常に効果的である一方、このポリマーのＡ型形態を優性に含む調製物は無効である。従って、所定のポリマー調製物における反復ジサッカライドのN-アセチルガラクトサミン残基を占有する6-硫酸置換部位に対する4-硫酸の相対量は、本発明の方法におけるポリマーの活性に重要である。なぜなら、6-硫酸形態のみが、一過性発現を増強するのに活性であるようであるからである。一過性発現を増強するのに有効な化学物質は、共通して以下の所望の特徴を有する：１．一過性発現を増強するのに有効な濃度範囲内で、培養中の細胞に添加される場合、わずかに細胞傷害性あるかまたは非細胞傷害性。スルホン化アミノポリサッカライドについては、この範囲は、約0.01〜0.5mMである。一過性発現を増強するのに有効な残留化合物については、この範囲は、約１〜15mMである。これらの至適量は、細胞培養培地成分（例えば、特定のアミノ酸）として既に存在し得るこれらの物質の量に加わる。このアッセイに従って細胞傷害性ではない化合物は、本明細書で、「生体適合性」として定義される。本発明の目的のために、細胞傷害性物質は、所定の濃度で、SW480細胞の８日安定培養（物質への連続曝露を伴う）におけるトランスフェクション後４日以内の生存細胞の数において、＞50％の減少を生じるものとして規定され、そしてここで、細胞の正味の拡大は、８日間の最後に生じる。しかし、種々の型の細胞は、異なる化学物質に対するそれらの感受性において変化することが理解されるべきである。従って、SW480 細胞は、化学物質の生体適合性濃度を決定するための簡便なツールとして使用され得る一方、他の型の細胞との生体適合性を至適化するために、SW480細胞で決定される濃度を経験的に調整することが必要であり得る。細胞傷害性についてのアッセイは、実施例４においてより詳細に記載される。２．酸性官能基（例えば、カルボン酸基、スルホン酸基など）は常に存在し、そして細胞傷害性を減少するように改変され得る。好ましい改変は、エステル形成および塩形成である（有機カチオンに基づく塩を含む）。なぜなら、塩およびエステル結合は、化合物が標的細胞に侵入した後の代謝プロセスによって、容易に切断されるからである。好ましい実施態様において、水溶液における化学物質は、4.5〜9.0のpHを有する。３．酸性基は、比較的疎水性の有機基を連結する。スルホン化ポリサッカライドとは異なる化合物について、分子のこの部分は、好ましくは、非極性または疎水性である。同様に、スルホン化ポリサッカライドは、比較的疎水性の官能基（例えば、2-置換位置におけるコンドロイチン-6-硫酸におけるN-アセチル基）の存在によって改変されるそれらの天然の親水性特徴を有する。本発明のための効果が改良されている多くの化合物は、有機性および疎水性である酸性基を含む。４．最も有効な物質のいくつか（例えは、安息香酸と安息香酸ナトリウムの50 /50混合物（安息香酸緩衝液）、およびコンドロイチン-6-硫酸）は、抗酸化および遊離ラジカル捕捉特徴を有する（例えば、Merck Indexを参照のこと）。便宜上、スルホン化アミノポリサッカライドとは異なる化合物は、本明細書で以後「グループI」といわれ、一方、スルホン化アミノポリサッカライドは、本明細書で以後「グループII」と称される。本発明の好ましい実施態様において、細胞は、外来DNAへの細胞への導入の前および間に、グループIから選択される化学物質と接触され、そして外来DNAの導入の後に、グループIIから選択される化学物質とさらに接触される。本発明の化学物質は、トランスフェクション工程の前、間、または後のいずれに細胞に添加されても有効である。本発明は、培養細胞における一過性発現を延長するために有用な方法を提供し、培養細胞としては、一次培養物、樹立した細胞株、分化した細胞の安定培養物、増殖物質への曝露によって維持された正常細胞株、および形質転換細胞（例えば、ハイブリドーマ細胞およびSW480 P3ヒト結腸ガン細胞株（ATCC#CCL228；本明細書で以後「SW480細胞」という）を含む種々の腫瘍から確立された培養物）が挙げられる。本発明の方法はまた、外来DNAを細胞にインビボで導入するのにも有用である。化合物は、任意の従来の手段（経口的、局所的、灌流、または注射を含む）によって投与され得る。外来DNAを受ける組織への化学化合物への宿主の曝露を確認することが所望される場合、化学化合物は、局所的注射（例えば、固体腫瘍塊への直接注射）によって、またはそれらを特異的組織に標的化するタンパク質をリポソームに取り込むことによって導入され得る。化学物質または化学物質の組合せの注射は、外来DNAを送達するためのビヒクルの同じ部位での注射と同時にか、または注射の前であり得る。あるいは、化合物は、標的部位での化合物の遅い放出を提供するビヒクルで、例えば、不活性固体キャリアの溶解によって適用され得る。本発明の方法は、上記の化合物の存在下で、細胞に導入されるトランスジェニックDNAによって発現されるタンパク質の回収を意図する。タンパク質は、任意の従来の手段、例えば、トランスフェクト細胞を抽出することによって、または細胞が増殖する培養培地を抽出することによって回収され得る。所望される場合、トランスジェニックタンパク質は、トランスジェニックタンパク質の培養培地への分泌を指向するシグナルペプチドを提供するベクターを用いて発現され得る。分泌されるタンパク質はまた、数日にわたってアッセイされて、産生されたタンパク質の相対または絶対量を決定され得、従って、トランスフェクションプロトコルにおける改変の効率を評価するための手段を提供する。粗細胞抽出物は、回収したタンパク質の酵素的または他の生物学的活性についてアッセイされ得るか、またはタンパク質は、タンパク質の活性についての機能的アッセイを行う前に、標準的な手順を用いてさらに精製され得る。導入遺伝子がインビボで発現される場合、タンパク質は、宿主の体液（例えば、ミルク）または他の身体組織から回収され得る。所定のタンパク質に使用される精製手順は、タンパク質の物理的特徴（例えば、そのサイズ、形状、疎水性、安定性など）に依存する。また、回収されたタンパク質は、物理的手段（例えば、ゲル電気泳動、等電点電気泳動）によって、またはクロマトグラフィー法（例えば、高速液体クロマトグラフィーなど）によって検出または定量され得る。本発明の方法は、培養真核生物細胞における、または発現したトランスフェクト遺伝子のタンパク質産物のミリグラム量の一過性発現哺乳動物宿主における迅速な産生を生じる。トランスフェクト真核生物細胞におけるタンパク質産生は、真核生物細胞における発現が、多くのタンパク質の生物学的活性に必要とされ得る翻訳後の改変を支持し得る点において、細菌発現系を超える利点を提供する。さらに、原核生物宿主細胞のかわりに真核生物を用いることによって、潜在的に毒性の細菌タンパク質を、トランスジェニックタンパク質の最終調製物から排除する必要性を回避する。本発明の方法は、真核生物宿主細胞を用いて、安定に取り込まれた外来DNAを含む永久細胞株を樹立する必要性を伴わずに、真核生物宿主細胞において、商業的に有用な量の生物学的に活性なタンパク質（例えば、増殖因子、ホルモン、抗生物質など）を得るための手段を提供する。これらの方法は、それらの薬学的特性について試験される生物学的物質を迅速に得るために使用され得る。細胞を、本発明のグループIIから選択される化学化合物と接触させることによって、増加した細胞接着ならびに細胞-細胞接触および伝達を生じ、従ってこれらの化合物の投与は、これらの細胞-細胞相互作用を増強するための手段を提供する。従って、本発明は、培養培地に添加されているスルホン化アミノポリサッカライドの存在下で細胞を増殖させることによって、細胞の培養下層への接着を増強し、従って培養における細胞の寿命を促進するための方法を提供する。例えば、コンドロイチン-6-硫酸は、分化した肝細胞の特徴を有する細胞株の培養における長期増殖を促進するのに有効である。通常は、肝細胞は、支持細胞が提供されるか、または培養下層が、肝細胞接着を促進する物質で最初にコートされない限りは、培養において生存しない（例えば、SidhuおよびOmiecinski，Pharmac ogenetics，5:24-36(1995)を参照のこと）。本発明の物質が、培養細胞と接触された場合、細胞は改変された代謝プロセス（減少したグルコース消費および乳酸産生、ならびに増加したアンモニア産生を含む）を示した。従って、本発明の方法は、細胞がタンパク質または脂質のような代替の炭素源を利用するように、細胞の代謝を操作するのに有効である。さらに、物質は、細胞が、上昇したレベルの内因性アルカリホスファターゼ活性を発現するのを誘導する。グループIおよびIIの両方の化合物は、この目的に有用である。エネルギー供給源の細胞の利用を操作するのに特に有用な物質は、安息香酸、4-エチル安息香酸、コンドロイチン-6-硫酸、および安息香酸緩衝液であり、ここで安息香酸緩衝液は、安息香酸および安息香酸ナトリウムの等モル混合物である。本発明の方法は、インビトロまたはインビボのいずれかにおける細胞代謝を操作する（例えば、肥満について哺乳動物を処置する）のに有用である。それらの疎水性性質のために、記載される方法の化学化合物は、非常に疎水性のミトコンドリア外膜を架橋し得る。これらの物質は、ミトコンドリアベースの代謝プロセス（すなわち、グルコース代謝系）に影響するので、観察された増強された発現は、ミトコンドリアの内側の外来DNAの転写から生じることが可能なようである。外来DNAは環状であるので、外来DNAは、環状ミトコンドリアDNAを複製するために正常に使用される機構によって複製さえされ得、従って、導入遺伝子を発現するために利用可能なテンプレートの量を増加する。本発明は、インビトロおよびインビボの両方における一過性発現を増強するための物質として、これらの化学化合物の使用を提供する。インビトロまたはインビボのいずれかで使用される場合、化合物は、外来DNAの導入の前、間、および後に最適に使用される。化学化合物の細胞培養培地からの除去において、長期発現に対するそれらの効果は徐々に減少し、そして細胞の以前の振る舞いが回復する。インビボで使用される場合、化合物は、プライマーとしてレシピエント組織に注射されるか、またはトランスジェニックDNA溶液と静脈内混合され、そして注射による外来遺伝子の導入後に投与されるか、または栄養補助食品として投与され得る。例えば、腫瘍は、化学化合物の直接注射、続くDNAのその後の注射、さらに後に続く同じまたは異なる化合物の経口補充物によってプライム化され得る。他の実施態様において、本発明は、固体腫瘍を刺激する半固体塊における細胞を不死化する細胞培養の系（すなわちバイオリアクターにおいて増殖する細胞）における外来遺伝子の安定化一過性発現を得るための方法を提供する。このモデル腫瘍系において開発されたプロトコルは、抗腫瘍化合物（例えば、IL-2）を発現する遺伝子を固体腫瘍に直接トランスフェクトするのに使用され得る。本発明の物質がトランスジェニック発現を増強する機構は決定されていない。それらは、トランスフェクトDNAまたはその転写物を直接安定化し得るか、または発現されるタンパク質を安定化さえし得る（この後者の可能性は見込みがないが）。さらに、グループIおよびグループII化合物は、異なる機構を介して作用して、一過性発現を増強するようである。なぜなら、２つのグループからの化合物の組合せは、しばしば、化合物が別々に使用される場合より有効であるからである（例えば、実施例６を参照のこと）。本発明の好ましい実施態様において、細胞は、トランスフェクションの前、間、および後に、グループIからの１つ以上の化合物と接触され、そしてトランスフェクション工程の後に、グループIIの化合物（すなわち、スルホン化ポリサッカライド）と接触される。以下のパラメーターは、一過性発現の持続時間を延長するための物質として有用な化学化合物を促進および特徴づけるために規定されている。これらのパラメーターは、「Ｘ」因子、「Ｇ」因子、および「Ｋ」因子と称される。１．Ｘ因子：ここで、「Ａ」は、選択された時間の間のコントロールトランスフェクト細胞において発現されるタンパク質の量であり、「Ｃ」は、化学化合物が添加されている細胞において作製されるタンパク質の量である。この因子は、トランスフェクト細胞に添加される化学化合物が、トランスフェクション後の最初の４日間の一過性発現の安定化を増強する程度を反映する。一過性発現の安定化において活性な化学化合物について、Ｘについての値は＞1である。例えば、発現が、化合物の存在下で倍になる場合、Ｘ＝50である。好ましい化合物は、Ｘ＞10を有し、そして最も好ましい化合物は、Ｘ＞25を有する。この因子は、本発明の化学化合物がトランスフェクション後の最初の４日間に培養培地に存在する場合に観察される外来遺伝子発現の量を、その化合物を欠くコントロール培養で観察される発現の量に対して、比較する方法を提供する。従って、Ｘ因子は、その化合物の存在または非存在下において観察される発現の量の間の比に関連する。Ｘは、問題の物質が、１つより多い化学化合物の混合物である場合、同様に計算され得る。累積的タンパク質発現（すなわち、「Ａ」および「Ｃ」の値）は、培養細胞のアリコートにおいて毎日測定した値を合計することによって測定される。２．Ｇ因子。Ｇ因子は、評価された時間に関してのみ、Ｘ因子と異なる。Ｇ因子を計算するために、発現されたタンパク質の量は、４日目〜７日目または４日目〜14日目に測定され、ここで０日目は、外来DNAが細胞に添加された日である。下付文字は、２つの時間のうちどちらが測定の基準を提供したかを示す。従って「Ｇ₇」は、測定が、４日目〜７日目の間行われたことを示し、そして「Ｇ₁₄ 」は測定が４日目〜14日目の間行われたことを示す。Ｘ因子についてと同様に、ここで、「Ａ」および「Ｃ」は、Ｘ因子についてと同様に規定される。ＸおよびＧ因子の両方に従って化合物を特徴づけることは有用である。なぜなら、Ｘについての低いかまたはネガティブな値を有するいくつかの化合物は、Ｇ因子について高いかまたはポジティブな値を有し得る。Ｇ₇およびＧ₁₄についての高い値を有する化合物は、１つ以上の化合物が、DNAが既に細胞に侵入した後（すなわち、一過性発現の第２期の間）の培養物に添加される一過性発現に特に有用である。好ましい化合物は、Ｇ＞０の値を有する。より好ましくは、Ｇ＞10 、および最も好ましくは、Ｇ＞25である。３．Ｋ因子。Ｋ因子は、コントロールトランスフェクト細胞および本発明の化学化合物に暴露した細胞における外来DNA発現の減衰についての速度定数の比である。Ｋは、以下の方程式に従って決定される：ここで、「κ_(DNA)」は、タンパク質を発現するトランスジェニックDNAの発現の減衰についての時間関数としての一次速度定数である、すなわちそれがトランスフェクトDNAの有効濃度の変化を反映するかのように使用されるが、観察される発現の変化が、単に細胞における外来DNAの濃度以外のいくつかのパラメーターの関数である事は依然可能である。従って、コントロールトランスフェクト培養物における一次反応速度は、κ_(DNA)＝d_(DNA)/dt＝またはlog_(DN _A) =kt/2.303＋log_(DNA)0として表現され得る。従って、log_(DNA)が時間に対してプロットされる場合、Ｙ軸またはlog_(DNA)0との交点は、発現されるトランスフェクトDNAの最初の濃度を反映する。さらに、この線の傾きは、-κ_(DNA)/2.303 に等しい。 κ_(DNA)の値は、時間に対して外来タンパク質濃度の対数をプロットするコンピュータープログラムを用いることに由来する。プログラムは、タンパク質産生が減少している間の期間に対応する、得られる線のその部分の傾きを決定する。代表的には、タンパク質合成の至適量は、トランスフェクションに続く48時間の期間の間に生じる。その後、発現の速度は、本発明の種々の化学化合物でトランスフェクションする前、間、および／または後に細胞を接触させることによる操作に供した速度で減衰する。従って、傾きは減衰のこの期間の間計算され、異なる化学化合物の効率を比較する目的について比較され得るκ_(DNA)およびＫについての値を提供する。本発明の化学化合物の特に有効な処方物については、発現の速度の最初の減衰の後に、速度の増加が続き得る。従って、Ｋ因子は、既に細胞の内側に存在した後の、外来遺伝子発現の安定性に対する化学化合物の効果を反映し、そして最初のDNAの取り込みにおけるこれらの化合物の効果を反映しない。Ｋ因子は重要である。なぜなら、本発明の利点は、一過性発現を改良するための他の報告された方法とは対照的に、DNA取り込みの効率を改良することを試みる従来のアプローチにではなく、トランスフェクション工程後の一過性発現を安定化するための手段を提供することに主に由来するからである。しかし、本発明の化学化合物のいくつかは、トランスフェクション後最初の４日間にそれらの最大有効性を有し、従って、それらは、トランスフェクトDNAの増加した量を取り込む細胞を誘導することによって作用し得ることを示唆する。このような化合物は、一旦外来DNAが細胞の内側に存在すると、遺伝子発現の有効半減期を十分に延長するように作用し得る。Ｋについてのポジティブな値は、化合物または化合物の組合せが、外来DNAトランスフェクション後発現を安定化するのに有効であり、従って、本発明の好ましい化学化合物および処方物は、Ｋ＞０の値を有することを示す。本発明の化学化合物の非存在下で、遺伝子導入したDNAの発現（すなわち、κ₍ _DNA) ）の減衰は、一次の反応である。本発明の化学化合物が培養物に添加される場合、外来DNAの発現についての速度論は、コントロール培養物と比較して、劇的に変化する。これらの化合物の存在下で、κ_(DNA)は、外来タンパク質の産生が、長時間延長されるにつて、ますますよりポジティブになる。実際は、変化は、最も好ましい処方物のいくつか（すなわち、Ｋ＞40のもの）についてあまりにも劇的であるので、従来の一次速度論は、結果を適切に表し得ない。従って、好ましい化合物／処方物は、偽一次または二次反応のいずれかに対する速度論を変化するようである。この結果は、従来の知識によって予測されない。本発明の方法において有用な多くの化合物および処方物は、実施例において議論され、そしてＸ、Ｇ、およびＫの値が示される表１、８、９、および10に列挙されるものに含まれる。本発明は、さらに、一過性発現を安定化し得るかどうか決定するための化学物質をスクリーニングするための、SW480細胞株に基づく方法を提供する。この方法のための、スクリーニングのための候補化学化合物は、生体適合性であり、そして少なくとも１つの疎水性部分および少なくとも１つの酸性部分を含むものである。試験化合物または化合物の群は、細胞において発現される場合に検出され得るタンパク質をコードする外来DNAの、０日目の導入の前、間、および／または後に、SW480細胞の培養に導入される。トランスフェクション工程に続く数日の期間、培養物のサンプルは回収され、そしてその中の外来タンパク質の量が決定される。培養物において累積的に発現されるタンパク質の量は、毎日のサンプルにおいて測定される量を合計することによって決定される。そしてこれらの合計は、試験培養物（すなわち、試験化合物と接触されたもの）と、化合物と接触されない平行コントロール培養物との間で比較される。タンパク質測定についてのアリコートは、０日目と４日目との間、または４日目と７日目との間、または４日目と14日目の間、毎日回収され得、そして測定されるタンパク質の量は、上記の式にしたがって、Ｘ、またはＧ₇もしくはG₁₄についての値をそれぞれ決定するのに使用される。このようにして決定された値が、Ｘ、Ｇ₇、またはＧ₁₄について＞０の場合、その物質は、一過性発現を増強し得ると結論され得る。好ましくは、Ｘ、Ｇ₇、またはＧ₁₄は、＞10であり、そして最も好ましくはＸ、Ｇ₇、またはＧ₁₄は、＞25である。このように同定される化学化合物は、上記の手順における外来遺伝子の一過性発現を増強するのに使用され得る。他の細胞株は、このスクリーニングアッセイにおいてSW480細胞と置換され得る。好ましい産物処方物は、Ｘ、Ｇ、およびＫ因子について最も高い（または最もポジティブな）値を示すこれらの化合物および化合物の組合せから選択される。さらに、本発明の種々の化学化合物は、トランスジーン発現の増強を最大にするために一緒に使用され得る。例えば、種々の化合物は、手順の間の異なる時間で同じ培養物を処理するのに使用され得る。異なる処方物は、特性の異なる組合せを必要とする。好ましい処方物の２つの別々の異なる型は以下である：Ａ型処方物：これらは、Ｘの高い値を有する化合物である。これらの化合物は、トランスフェクション工程のすぐ後で非常に活性であり、従って、DNA取り込みの効率を増強することによって一過性発現の第１期の間に作用し得る。それゆえ、上記のような片対数プロットからのlog_(DNA)0またはＹ交点は、これらの化合物を含まないコントロール培養についてより、Ａ型化合物または処方物の場合において高い。このような化合物は、DNA取り込みの効率に影響すると仮定される。なぜなら、Ｙ交点は、その細胞への導入のすぐ後の細胞の内側の活性な外来 DNAの濃度の大まかな測定であるからである。試験された化合物の多くは、Ｘ因子についてのポジティブな値を有する（例えば、表１を参照のこと）。従って、本発明は、トランスフェクトしたDNAを安定化する化学化合物を提供するだけでなく、細胞への最初のDNA取り込みを増強するようである化合物をも提供する。多くの処理化合物は、Ｇ₇もしくはＧ₁₄、またはＫについての高い値、ならびにＸについての高い値を有し、従って、一過性発現の両方の期の間効果的である（例えば、表１、３、８、および９を参照のこと）。Ｂ型処方物：この分類において有用な化合物は、高いＧおよびＫ因子の両方を必要とする。Ｘについての高い値が所望されるが、必要とはされない。０以上のＫについての値は、トランスフェクトDNAを安定化し得る化合物の特徴である。最も高度に好ましいＢ型安定化剤は、Ｋ＞１、またはより好ましくはＫ＞10、そしてＧ₇またはＧ₁₄＞25の値を有する。さらに、Ｘおよび／またはＧ因子＞25を示す複製実験は、特定の物質が、Ａ型およびＢ型処方物のいずれかにおいて高度に好ましい化合物が考慮される前に要求される。インビトロおよびインビボでの適用のために、一過性発現は、Ａ型およびＢ型処方物の両方の使用によって最も最大化される。例えば、好ましい方法は、トランスフェクションする前に、Ｘ＞25の値を有する１つ以上のＡ型化合物にそれらを暴露することによって細胞を最初にプライムすることを含む。Ａ型化合物はまた、トランスフェクションの間に存在し、そして一過性発現の期間を通じて最適に存在したままである。トランスフェクション工程の後、細胞は、その各々が好ましくはＧ₇またはＧ₁₄＞25の値を有する１つ以上のＢ型化合物との一過性発現の期間の残りの間接触される。好ましい実施態様において、Ａ型化合物は、安息香酸緩衝液であり、そしてＢ型化合物は、コンドロイチン-6-硫酸である。別の好ましい実施態様において、Ａ型化合物は、安息香酸および4-エチル安息香酸であり、そしてＢ型化合物は、安息香酸緩衝液およびコンドロイチン-6-硫酸である。なお別の好ましい実施態様において、Ａ型化合物は、安息香酸緩衝液およびグルタミン酸であり、そしてＢ型化合物は、コンドロイチン-6-硫酸である。インビトロでの適用のために、最良の結果は、細胞がＡ型処方物の存在下で、トランスフェクション工程の前に数時間（例えば、約20〜24時間）培養された場合に達成される。食餌性（すなわち経口適用）の形態におけるＡ型処方物でのプライミングは、インビボでの現実的な選択肢であることに留意のこと。一過性感染を増強するのに有効な多くの化合物は、非毒性であることが公知である（以下の表１を参照のこと）。培養細胞は、Ａ型処方物の存在下で、少なくともトランスフェクション後48時間至適に維持される。所望される場合、Ａ型処方物は、細胞の約＞90％が外来DNAに取り込まれた後（すなわち、DNAが培養物に添加される後の数日）に除去され得るか、またはこの処方物は、一過性発現の第２期の間、細胞と接触させたままにし得る。Ｂ型処方物は、導入遺伝子発現のピーク（これは、代表的には、トランスフェクション後24〜48時間で生じる）で、細胞に至適に添加される。至適には、Ｂ型処方物を含む培地での食餌は、実験の持続期間の間、定期的に繰り返される。本発明の方法は、インビボで使用され得ること（すなわち、動物研究および臨床手順）が明らかになるはずである。特に、固形腫瘍に関する遺伝子治療の場合、Ａ型処方物は、DNA送達ビヒクルと同時投与され得、ここでレシピエント組織は、DNAを投与する前に、Ａ型処方物の注射によって「プライム」される。その後、Ｂ型処方物が投与される。個々の化合物に有用な濃度範囲は変化し得、そして有用な範囲の上限は、細胞傷害性効果によって制限され得る。DNA／Ａ型処方物の腫瘍への直接注射は、日常的な手順のみを含む。なぜなら、種々の薬学的キャリアは、当該分野で公知であるからである。直接注入は、非標的組織をトランスフェクション試薬に暴露することを回避する。コリン、リポソーム処方物、または徐放処方物は、Ｂ型処方物と組み合わされて、トランスフェクト腫瘍細胞における局所作用を延長し得る。さらに、Ｂ型処方物は、食物補充剤（または添加剤）として、延長された期間、患者に摂食され得る。注射および食餌性摂食の両方は、毒性のような要因等に従って至適有効性に組み合わされ得る。このアプローチは、他の体組織を損傷せずに、腫瘍に高用量の細胞傷害性タンパク質を送達する利点を提供する。このストラテジーを用いることによって、腫瘍細胞自身は導入され、数日間にわたって細胞傷害性タンパク質を連続的に産生し、従って、タンパク質自身の用量を腫瘍に単純に注射するより、さらに有効な送達手段を提供する。このアプローチは、問題のタンパク質が、外部的に適用される場合に原形質膜を容易に通過し得ないものである場合、または治療用タンパク質が、一旦標的細胞内にあると短い半減期を有する場合、特に有用である。本発明の他の表明において、グループIから選択される化合物は、グループII から選択される化合物（例えば、コンドロイチン-6-硫酸）に共有結合的または非共有結合的に結合され得る。実施例１一過性発現の増強についてのスクリーニングアッセイコントロールトランスフェクションのためのプロトコル：以下の手順を使用して、一過性発現を提供する： SW480 P3（ATCC#CCL228）ヒト大腸ガン細胞（代表的には、１×10⁶細胞）を、６ウェル組織培養プレートのウェルにプレートした。プレートしたしウェルの数は、実験を進行する間の、トランスフェクション後の日数を反映した。各ウェルは、以下を含む30mlのストック溶液からの１mlの完全培地を含んだ：26.4ml RPM I組織培養培地、４mM L-グルタミン、3.0mlウシ胎児血清、および10μg/mlゲンタマイシン。細胞を37℃にて、CO₂インキュベーター中で、10％CO₂で、プレート後24時間培養した。その時間の間、細胞はプレートに接着した。インキュベーション工程前の24時間後、トランスフェクション工程を、RPMIを除去し、そして２μgのVR1412 DNA（Vical，Inc.，San Diego，CA）（これは、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下で、細菌性βガラクトシダーゼ遺伝子を発現する）、および８μｇのカチオン性脂質の混合物（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンと等モル割合で混合した1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（例えば、「DMRIE/ 0.99:1の脂質：DNAモル比を得た。代表的な一過性トランスフェクションプロトコルは、10⁶細胞あたり10μｇのDNAを使用するが、本明細書に記載されるプロトコルは、細胞への毒性を低減するために、より少ないDNAを使用することに留意されるべきである。次いで、プレートを、４時間37℃にてインキュベートした。４時間のインキュベーション工程の後、100μｌの熱非活性化ウシ胎児血清（トランスフェクションを停止するため）および12.0μｌの50mg/mlゲンタマイシンを、各ウェルに添加した。外来DNAをウェルに添加した後24時間後、１つのウェルからの細胞の全てを、トリプシン処理して計数し、次いで各ウェルからの２ ×10⁴細胞を溶解し、そして後にβガラクトシダーゼ濃度を測定するのに使用するまで、液体N₂中に保存した。この時間で、各々の未回収ウェルは、以前に規定したOPTI-MEM培地（L-グルタミンを添加しない）の１ｍｌを受けた。実験の残りについて、１つのさらなるウェルを24時間間隔で回収し、そして未回収のウェルを、48時間毎に、1mlのOPTI-MEM（L-グルタミンを含まず、そして試験化合物を含む）を摂取した。試験化合物についてのプロトコル：一過性発現を増強する効率について種々の化合物を試験するために、コントロール培養物についての上記のプロトコルを、培養培地に候補化学化合物（単数または複数）を取り込むことによって改変した。手順の残りの部分は、コントロール培養物についてのプロトコルに関して未変更のままであった。２×10⁴細胞の溶解サンプルを、各βガラクトシダーゼアッセイについて維持し、そして各ウェルからの残留細胞を毎日犠牲にした。溶解物を凍結し、そして βガラクトシダーゼアッセイを行い得るまで、液体窒素中で維持した。解凍したサンプルを、クロロフェノールレッドに基づくクロロフェノールレッドベースの手順を用いて、βガラクトシダーゼについてアッセイした。ここで、着色産物を、紫外／可視光分光光度計を用いて、580nmにて定量した。多数の化学化合物についてのこのアッセイからの結果を、以下の表１に示す。表１は、実験において決定したＸの値を示す。この実験において、実施例に記載の方法を用いて、培養SW480ヒト大腸ガン細胞を培養し、そして細菌性βガラクトシダーゼ遺伝子でトランスフェクトした。比較の目的のために、表１は、アッセイにおいてネガティブと試験された化合物、ならびにポジティブと試験された多数の化合物を含む。表１に示すpH値を、培養培地において調製したストック溶液を脱イオン水で希釈することによって作製した水溶液において測定した。約pH３（メラニン）〜pH10（アドレナリン）の範囲にある化合物は、一過性発現の持続期間を延長するのに有効であることが観察された。好ましいpH範囲は、約pH4.5〜9.0である。試験結果を、Ｘ、Ｇ、またはＫのいずれか１つについて計算した値が０を超える場合、陽性であるとみなした。 ^*星印によって示したＧの値はＧ₇の値を示すが、星印なしのＧ値は、Ｇ₁₄の値を示す。Ｘ＞１である表１におけるこれらの化合物は、トランスフェクション後最初の２〜３日間、一過性発現の程度を増加する化合物である。このような化合物は、他で発現されているより１細胞あたり大量のDNAを取り込むように細胞を影響し得るか、あるいは、他で発現されているより、高い割合の外来DNAを発現するトランスフェクト細胞を生じ得る。これらの化合物は、初期転写または発現を増強することもまた可能なままである。これらの化合物は、トランスフェクションに対してこの効果を有することを以前に報告されていない。興味深いことに、メラニンは、一過性発現を顕著に抑制することを記録した。表１に列挙した化合物に加えて、一過性発現を延長し得ることが試験および見いだされているさらなる化合物は、t-ブチル安息香酸、エトキシ安息香酸、イソプロピル安息香酸、メトキシ安息香酸、イソブチル安息香酸、コンドロイチン-6 -硫酸（Ｃ型）、およびグアラン（特に、ヒドロキシグアラン）を含む。実施例２一過性発現を増強しそしてグルコース消費を減少する化学化合物さらなる実験を行い、増強された一過性発現方法をさらに特徴づけた。これらの実験のために、表２に記載の５つの培養条件を、実施例１に記載の一過性発現プロトコルを用いて試験した。６ウェルプレートを用いて、そして個々のウェルからの細胞を、以下に記載のように回収し得るように、十分な数のウェルをSW48 0細胞で播種した。各々の日に、１つのウェルを細胞数計算のために採取して、各採取ウェルからの2×10⁴細胞を溶解して、そしてその溶解物をβ-ガラクトシダーゼアッセイのために保持した。これらの同じウェルからの上清を凍結して保持し、そしてその後にpH、グルコース消費、および乳酸塩およびアンモニアの産生の評価に用いた。以下の表３で見られるように、プレート２、３および４で使用された化学化合物の様々な組み合わせは、遺伝子発現を増強および維持するそれらの能力において違いをみせた。プレート４は、本実験において最も優れた全体的性能を有し、高いＸおよびＧ因子を伴った。本実験において唯一グループII化合物を含んだプレート３は、トランスフェクション効率の減少（すなわち、低いＸ因子）の兆候を明らかに示したが、発現の維持（すなわち、比較的高いＧ因子）の所見を示した。表３プレート番号 1A 1B 2 3 4 パラメーターゲンタゲンタマイマイシンシン無しＸ因子 n/a 9 30 -26 44 Ｇ因子 n/a 32 41 51 69 経過時間 %X-gal（青色） 24時間 60-70 85-90 80-90 85-95 95-100 48時間 40-50 60 50-60 70 80 72時間 40-50 60 60-70 60 70-75 96時間 10-20 30 50-60 55-60 30 120時間 10-20 20-30 30-40 20-30 30 144時間 10-15 10-20 20 25 20-30 168時間 10-15 2-5 10 10 2-5 細胞培養実験は、代表的には20％の範囲の標準偏差を示す。この理由のため、 25より低いＸおよびＧ因子は、コントロールに対して有意な改善であるとみなされなかった。コントロール実験（表３のプレート1Aおよび1B）を、培養培地中に存在する抗生物質、ゲンタマイシンが上述の実験の結果に影響し得るかどうかを決定するために上述の実験スキームに含有させた。コントロールプレート番号1Aおよび1Bの結果の比較から、ゲンタマイシンがいく分かタンパク質の産生を抑制したことが、明らかである。このことは、プレート1B（ゲンタマイシンを有さないコントロール）と比較して、ゲンタマイシンを有するコントロール（すなわち、プレート 1A）におけるＸおよびＧ因子がわずかに低い値であることにより示唆される。さらに、β−ガラクトシダーゼアッセイからの結果が、この結論を支持した。これらの同じ細胞サンプルにおいて、アンモニア産生と同様に、グルコース消費と乳酸塩産生を分析した。グルコースおよび乳酸塩を、Kodakにより提供された標準プロトコルに従って、Kodak Ektachem DT60 II Analyzerを用いて測定し、そして、臨床研究室において血清中のグルコースおよび乳酸塩レベルを測定するために日常的に用いた。分析は、グルコースまたは乳酸塩のどちらかの測定に必要な試薬を全て含有するフィルムでカバーされたプラスチックスライド（Ekta chem DTスライド(GLU)またはEktachem DTスライド(LAC)）のウェルに、10μｌの各試験サンプルを適用することにより行う。グルコース測定に関しては、分析は、分子酸素とグルコースのグルコースオキシダーゼ触媒反応、次いでその強度がサンプル中のグルコース量に比例する赤い色素を生じる二次反応に基づく。乳酸塩を測定するためのスライドは、スライドに適用した乳酸塩の量に量的に比例して赤色色素を生じさせ得る、酵素および基質を同様に提供する。スライドを、赤色が反射分光光度法により読み取られるEktachem DT60 II Analyzerに設置する。アンモニア分析は、EktaChem DT スライド(NH₃)を用いて、NH₃がブロムフェノールブルーと反応して同じ装置で検出可能な青色色素を生じるという反応に基づいて、同様に行った。時間の関数としてグルコースおよび乳酸塩の濃度を測定した結果を表４に示す。驚くべきことに、表４は、ゲンタマイシンを有するコントロール（プレート1A ）が、どの実験サンプル（これらもまた、ゲンタマイシンを含有する）よりも多くのグルコースを消費し、かつより多くの乳酸塩を産出したことを示す（ゲンタマイシンを有さないコントロール（すなわち、プレート1B）は表４に含有されないことに注意する）。表４のデータは、このコントロールに対して、表２に記載の化学化合物を与えた細胞が、外来遺伝子の実質的により高いレベルの発現と一致する、代謝における意味深い変化を経験したという明らかな微候を提供する。表４のデータに加えて、安息香酸および4-エチル安息香酸の組み合わせもまた、グルコース消費の減少を生じることが観察された。ここで、まずタイプＡ処方物をトランスフェクション工程前および間に、SW480細胞へ適用し、そして、DNA を細胞内へ導入した１日後、タイプＢ処方物を添加した実験を行った。タイプＡ処方物は、1mMの安息香酸、1mMの4-エチルベンゾエート、および4mMのL-グルタミンを含有するOPTI-MEMからなる。一方、タイプＢ処方物は、これらの同じ成分、およびさらに0.1mMのＣ型コンドロイチン-6-硫酸を含有した。ゲンタマイシン (gentomicin)もまた、その実験を通して存在した。本実験では、グルコース消費は、トランスフェクション後14日ほどの間、またはバイオリアクターにおけるトランスフェクション後32日ほどの間、６ウェルプレートにおいて培養された細胞中では、本質的には全く観測されなかった。この間、細胞は、トランスフェクションされたDNAからタンパク質を発現し続けた。グループＩ化合物である酪酸塩は、培養肝細胞に投与したとき、翻訳後グリコシル化におけるグルコース飢餓の効果を補い、細胞内グルコースプールを増加させることが最も予想されることが、以前に報告されている(Morrowら，Biochem． Biophys．Res．Comm．112:115-125(1983))。しかしながら、Morrowらは、それら培養物中のグルコースの消費をアッセイしておらず、従って、グループＩ化合物の存在下で、ここで注目される代謝物における変化を観測しなかった。グルコース代謝において観測される変化は本発明の極めて有意な特徴である。それは、単に遺伝子治療法に関連する化学化合物の効力の増強と相関している（本実施例から明らかなように）のみならず、これらの同じ化学化合物による細胞性代謝プロセスを選択的かつ無毒に向け直す能力が、例えば、肥満症の処置における脂／脂質代謝の調節を含む広範囲の治療に適用され得ることを示唆する。実施例３バイオリアクターにおける増強された一過性の発現一連の４つのリポフェクチンに基づく遺伝子トランスフェクション実験を、Ge nespanプロトタイプインキュベーター装置において高性能中空ファイバー灌流プロトタイプバイオリアクターデバイス（以後、“HPBr”デバイスと称する）で行った。そのデバイスは、２セットの中空ファイバーが通っている無菌チャンバーから本質的になる。培養培地は一方のセットのファイバーを通って連続的に循環し、一方、細胞増殖に必要な気体（例えば、酸素および二酸化炭素）が第２セットのファイバーを通過する。ファイバーは、気体および栄養素が、ある方向に通過し得る多孔性材料で構成され、一方、チャンバー内で増殖する細胞により産生された不用分子は他の方向に通過し得る。そのデバイスで増殖する細胞は懸濁液中に残り得るか、もしくは両セットの中空ファイバーの外面に付着し得る。 HPBrデバイスの有用な特徴は、細胞が、チューブが通過するチャンバーを回転させることによって撹拌され得ることである。チャンバーがその縦軸の周囲をある方向に１２０度回転してそれから他の方向に１２０度回転するとき、これは回転のひとつの「サイクル」を構成する。あるいは、培養物は、回転しないチャンバーを使用して、「静止」条件下で増殖され得る。 HPBrデバイスは、SW480細胞を使用して、一連の実験を行った。各実験は、細胞を従来の10%のCO₂インキュベーターに置いた従来の６ウェルプレートにプレートした対応するコントロールを含んだ。コントロール６ウェルプレートを、実施例１のコントロールプレートに対して上述したプロトコルを使用して培養しそしてトランスフェクトし、一方、次の実験手順をバイオリアクターデバイスに対して用いた。HPBr デバイスによる実験４つのβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子トランスフェクション実験を、６ウェルプレートに対して実施例１に記載されるプロトコルと類似のプロトコルを使用してHPBrデバイスで行った。しかしながら、種々の試薬の容量を、バイオリアクターにおいて、より大きな容量でより多くの細胞数に適応させるために比例的に調整しなければならなかった。HPBrに特徴的である細胞培養物の灌流様式（すなわち、連続的な送り込み）のために、手動の周期的な送り込みに対する必要性はなかった。バイオリアクター実験のための手順は、実施例１に記載された手順とは以下のめに正に荷電した第４級アンモニウム官能基を表面上に有する架橋したデキストランで構成されたマイクロスフェアー；Sigma，St．Louls，MO）をリン酸緩衝生理食塩水であらかじめ膨潤させて、HPBrのサイドポートへ導入した。１０個の細胞あたり約１マイクロキャリヤービーズを使用した。実験の開始時に、１×10⁷ 個の生存可能なSW480細胞および１×10⁶ビーズをデバイスへ同時注入した。表５に記載した培地は、細胞をデバイスへ播種した時に存在した。表５は本研究に用いた回転パラメータ（「cpm」、１分当たりのサイクルに相当）を同定する。839 ml容量の培地を各バイオリアクターに添加した。0.1mMのＣ型コンドロイチン硫酸は、ラン２、ラン３およびラン４（「ラン」は別々の実験を表す）のために、 OPTI-MEMトランスフェクション培地に含有された。トランスフェクションの工程に従って、再循環するOPTI-MEM培地（すなわち、チューブ内の培地）を置き換えたが、しかし細胞を含有する区画（毛細管外側の間隙）の培地は置き換えなかった。置換培地は表５に列挙される化合物を含有した。細胞をバイオリアクターに播種した２４時間後、外来DNAを含有するリポソームを、毛細管外側の間隙に添加した。この間隙はチューブの内側の体積(839ml)と比べて小さな体積(17ml)である。細胞および上清の日周のサンプル（約1.5ml）を各バイオリアクターの細胞区画から採取し、そして、同量の新鮮な培地をそれと置き換えるために添加した。細胞数および生存率を決定し、そして2×10⁴個の生存細胞を溶解して、そして実施例１に記載されるように分光学的方法を使用するβ−ガラクトシダーゼ決定のために保持した。表６は、プレートコントロール（ラン番号１）と４つの灌流デバイス実験（ラン番号２〜５）の結果とを比較するデータを含有する。表６において、「曲線下面積」と表示した欄は、採取した細胞の日割量でβ−ガラクトシダーゼの量を本実験の２週間期間の時間の関数としてプロットした曲線の下方の面積をいう。従って、このような「曲線下面積」欄における値は、任意の単位、すなわちcm²で表され、そしてその値は実験期間中の細胞あたり基準で産生されたβ−ガラクトシダーゼの全量を反映する。表６中の最後の欄は、各ラン、すなわち各プレートまたはバイオリアクターについて、その時に残っているすべての生存細胞において１３日目に存在するβ−ガラクトシダーゼの合計量を示す。灌流バイオリアクターは、遺伝子トランスフェクションおよびトランスフェクトした細胞の採取をスケールアップするために使用され得、これは治療適用（例えば、例えば体細胞治療に使用される、安定にまたは一過性のいずれかで外来遺伝子を発現している多数のTリンパ球および造血性幹細胞の作出）のために有利であるということが明らかである。この系はまた、外来遺伝子の長期発現が容易かつ現実的に研究され得るために人工器官として使用され得る；ある意味では、これはインビボにおいて無傷器官から生検を行うことと等価である。表６のデータは、バイオリアクターの回転パラメーターの操作が、このデバイスの使用において、トランスフェクション効率および持続性一過性発現の増強かつ便利な手段を提供することを示す。ポリアニオン性炭水化物であるＣ型コンドロイチン硫酸の存在がトランスフェクションをスムーズに進行させることを可能にし、そしてまた、遺伝子発現において実質的改良を得る。試験した他のポリアニオン性炭水化物のいくつかは、トランスフェクション方法を活動的に抑制した。これらは、Ａ型コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパリン、カルボキシメチルセルロース、およびＮ−カルボキシメチルキトサンN,S-硫酸塩を含有した（表１）。それゆえに、タイプＣコンドロイチン硫酸に対する細胞の耐性は、培養培地中のポリサッカライドについて、一般的にそれらの耐性に代表的でない。上記のように、ミクロスフェアは細胞のための接着部位を提供するためにチャバーへ導入され得る。例えば、不死化マウスメラノーマ細胞（すなわち、ATCC#B -16-FO）はミクロスフェア存在下でチャンバーへ導入される場合、ミクロスフェアが細胞の大量の蓄積のための「種子」として作用するということが観測されてきた。細胞のこれらの塊がトランスフェクトされ得、その後これらの塊の細胞は一過的にトランスフェクトされたDNAを発現することがこれに視察された。サンプルはチャンバー内の培地のサンプリングによりそのような培養物から容易に得られる。このサンプリングは、細胞塊に対してシリンジから新鮮培地の流れを導くことにより達成され、これは、培地中に懸濁されたサンプル生成のために充分多数の細胞を生じる。細胞塊は固形腫瘍と類似しており、そしてインビボにおける腫瘍に対する治療用タンパク質の送達に効果的な治療法を開発するためのモデル系を提供する。バイオリアクターの内部で増殖する細胞塊に対して効果的な同様のプロトコルを用いて、メラノーマ細胞は、マウスへ皮下注射され、注射部位での腫瘍の発生を可能にする。そしてその後、β-ガラクトシダーゼベクターDNAを含むリポソームが、β−ガラクトシダーゼの一過性発現を達成するために腫瘍へ直接導入された。β−ガラクトシダーゼの発現のための効果的な方法は、他のタンパク質に関しても同様に効果的であることが予想され、そして同様な実験が種々のタンパク質、（例えば治療用タンパク質をコードするDNA）を、インビボにおける固形細胞への直接送達するの効果の評価に貢献する。本発明の方法に使用されるバイオリアクター系は外来性タンパク質の発現を遺伝的に改変した多数の細胞の作製に有用である。そのような細胞は、治療目的の患者に対して投与され得、その後、治療措置指示の期間のみ活性状態を維持され得る。従って、本発明は、遺伝子治療の独特な形式を提供する。ここで、導入された遺伝子が、単に安定化物質への接近の制限、すなわち、治療用タンパク質を一過的に発現している細胞の投与、次いで連続的導入遺伝子発現が所望される間の増強化合物投与により遮断され得る。最終的に、コンドロイチン硫酸（Ｃ型）の使用が、比較的高い回転速度にもかかわらず、足場依存的細胞がマイクロキャリヤーへの付着を可能にするので、重要であることに注目すべきである。この結果は、群IIの化合物が、培養細胞のための固形基質への足場の提供に有効であることを示唆する。コンドロイチン硫酸は、表面における細胞のパターンを制御するためのデバイスにおいて細胞接着表面を提供する化合物であることが提唱されている(米国特許第5,593,814号)。しかし、本発明の手順とは対照的に、米国特許第5,593,814号の方法は、コンドロイチン硫酸が培養培地に添加されることよりも、むしろ固形基層に結合することが必要である。他の研究者は培養系またはインビボにおいて細胞接着を促進するために他の化合物との結合においてコンドロイチン硫酸を使用することを報告している(米国第5,593,814号;米国第4,458,678号;米国第4,418,691号;米国第4,711 ,780号;米国第5,545,722号)。実施例４細胞傷害性の分析多数の化学化合物を実施例１に記載のプロトコルによって６穴プレートで試験して、それらのSW480細胞における細胞傷害性と、外来遺伝子の取り込みおよび発現を促進する能力との関係を決定した。他に断らない限り、コントロールを除く全てのプレートは細菌増殖を遅らせるためにゲンタマイシンならびに4mM Ｌ− グルタミンを含有した。細胞傷害性分析を以下のように実施した。SW480細胞（ウェルあたり約1×10⁶ 細胞個）を細胞傷害性を試験すべき化学化合物の存在下で、０日において６穴培養皿中の1mlのRPMIにプレートした。ウェルへの繙種後24時間で、RPMI培地を除去し、そして実施例１で記載したように、外来遺伝子を含むリポソームを、1ml のOPTI-MEM中の培養物へ添加した。トランスフェクション培地はまた、その細胞傷害性を試験する化学化合物を含有していた。コントロールプレートには、試験化合物が培養培地中に存在しないこと以外は、試験プレートと同一のものが含有された。試験培養物およびコントロール培養物は、「静置」条件、すなわち、プレートを振動しない、回さない、または他の様式で撹拌なしの条件下で増殖させた。全８日間の各日で、１つの試験ウェルおよびコントロールウェルから細胞を採取し、そして生存度をトリパンブルー染色により評価した。リポソームDNAに曝されたコントロール培養物において、細胞数はかなり維持されるか、またはトランスフェクション後の最初４日間わずかに増加し、次いで８日間の最後までにウェルあたり約1×10⁷に増加した。最初の４日間のコントロール培養物の増殖の遅延は、おそらくリポソームDNA自身の緩和な細胞傷害性効果に起因していた。試験する化合物は、外来遺伝子の導入後４日以内に、増殖する細胞数において５０％以上の減少が観察された場合、さらに、８日間の最後に細胞の正味の増殖がなかった場合、その試験濃度で「細胞傷害性である」とみなされた。この試験プロトコールの適用により、個々の化合物もしくは化合物の処方の濃度を、SW480細胞で十分に耐性である濃度に達せさせ、なおこれらの細胞において一過性の発現レベルを増強することもまた可能とするように操作することが多くの場合で可能となった。他の細胞のタイプについて、また該発明の化学化合物のいくつかに耐性である能力について試験した。例えば、ヒトメラノーマ細胞、マウスメラノーマ細胞、およびCOS-7細胞(ATCC CRL 1651)が、表９のプレート番号６に適用された組成物に耐性であるそれらの能力に関して試験shiた。その細胞は、試験した化合物に対するそれらの感受性において幾らか異なったが、しかし一組の濃度が全てのこれらの細胞型によって耐性が示され得ることを同定した。すなわち、これらの濃度で、化合物は上記に記載した分析に従えば細胞傷害性はなかった。一過性発現を増強したスルホン化アミノポリサッカライドは全て、通常の細胞増殖を支持し得ることが見い出された。すなわち、それらはそれほど細胞傷害性がなかったので細胞による耐性を示した。表７中の種々の化学化合物および処方物に露出された細胞に関する細胞増殖曲線および細胞傷害性曲線を、図１と２へ示す。この図において、個々のプロットを記載する数が表７のプレート数に対応する。表７はポリサッカライドヘパリンが一過性発現をブロックするが、しかしＣ型コンドロイチン-6-硫酸塩は一過性発現を増強するということを示す。表７では示されないが、グアラン(guarans)もまた、一過性の発現を増強することが観察された。遺伝子発現のヘパリン媒介抑制はヘパリンとリポソーム内のカチオン性脂質との間に複合体形成の結果であり得る。従って、キャリヤーのない細胞へそれを送達するDNAが残っている。この推論の観点から、遺伝子発現および細胞増殖の両方を支持するコンドロイチン-6-硫酸の能力は驚くべきことである。酪酸塩緩衝液を含むプレートはトランスフェクションした遺伝子を発現した。しかし、この緩衝液は、この一連の実験に用いられた実験条件下でSW480細胞に対して細胞傷害性を示した。実施例５星形ポリマーによるトランスフエクションこの一連の実験は、一過性発現を増強するための本方法の効力が、DNAの細胞への送達手段に依存したかどうかの論点に取り組んだ。２種の異なる化学物質( 表８を参照のこと)の２つの個々の組み合わせを、ここでDNAがリポソームによる送達法を使用する代わりにポリマー性はデンドリマーの存在下で、細胞へ導入されたことを除いて、実施例１のプロトコルと類似したプロトコルを使用してSW48 0細胞へのトランスフェクトに用いた。これらのデンドリマーは、微細な合成ポリマー球体でサイジング(sizing)に用いるための「スターバースト」ポリマー状ビーズの標準としてDow Chemicalsにより最初に商品化された）は、陽イオン性脂質の役割を果たすために化学的に誘導体化され得る。本実施例に用いられたデンドリマーは、F.C．Szoka，Jr.，Department of Pharmacy/Pharmaceutlcal Che mistry，University of California，SanFrancisco，CA.により提供された。リポフェクションまたはデンドリマーを介したプロセスのいずれかについても遺伝子送達の詳細な機構は知られていないが、それらの形状および化学的部分の分布のような物理化学的な特性に基づくと、どうやらそれらはかなり異なるようである。使用された手順は以下の工程において、実施例１の手順から逸脱した。14μｇのＤＮＡを397μｌの脱イオン水中に希釈し、そして56μｇのデンドリマーが393 μｌの脱イオン水で希釈した。ＤＮＡ溶液およびデンドリマー懸濁液を、使用前に１時間以内に合わせた。OPTI-MEM培地（733μｌ）およびDNA／デンドリマー混合溶液（167μｌ）を各ウェルに添加した。そして、６穴プレートが混合を確実にするために手で旋回した。５時間のインキュベーション後、DNA／デンドリマーを含む培地を取り除き、そして1.0mlの培養培地を添加した。その手順において残りの工程は、実施例１に記載されたとおりであった。表８に示すように、デンドリマーを、細胞への外来ＤＮＡの送達方法として使用した場合、試験した化合物は効果的であった。これらの発見は、表８に示される化学化合物の処方物が、DNAの細胞内への導入後、それらの効果を発揮し、従って、効果的なDNAを導入するために使用した方法にかかわらず効果的であることを強く示唆する。実施例６．一過性の発現の間のタンパク質生成以下の実験は、本発明の一過性発現系が前述の実施例で記述された方法を用いて、レシピエント細胞へ導入された外来遺伝子によって発現される、タンパク質生成物の大容量の迅速な生成に有用であることを説明する。 15プレートの実験を行なった。ここで表9に示した化学化合物を、実施例1に記述されたように6ウェルのプレート中でトランスフェクトされたSW480細胞の培養培地に添加した。X、G₁₄ならびにK因子＋2×10⁴細胞中で14日間に産生されたタンパク質の累積量を計算し、表9の最後のカラムに示した。表9に示したデータは、記載した組成物全てがこれらの存在下で生成されたタンパク質の量に関してコントロールより優れていたことを示している。最も有効な処方物は、その効果の順番中に、プレート6、3、13、および14で使用されたものであった。より良好な結果が、タイプAおよびBの処方物を受けとったプレートにおいて観察され、したがってこれらの組合せは動物の試験において（例えば、毒性タンパク質での腫瘍処置、特定組織へのホルモンの送達、もしくは生物活性タンパク質の局所的送達が所望され得る他の病理学的な状態）特に有効である。注釈：全てのプレートの培地はゲンタマイシンを含み、コントロールは以外は 4mM L-グルタミンをさらに含む；コンドロチン-6-硫酸はC型であった。これらの実験例はまた、外来遺伝子が安定に導入された細胞株を最初に樹立する必要なく、ミリグラム量のタンパク質を極めて迅速に産生するための増強された一過性発現の有用性を示している。したがって、増強された一過性発現は、候補となる生体薬物が回収され、薬学的活性について迅速にスクリーニングされるのに十分な量で効果的に発現され得る新規の手段を提供する。したがって、本発明は加速された薬物発見プログラムを実行するための方法を提供する。例えば、プレート6は14日で、2×10⁴細胞当たり約26ngのβ−ガラクトシダーゼを産生した（表9参照）。従来の培養（約2×10⁶個の細胞を含有する）へのスケールアップでは、この処方物を使用した、累積のタンパク質生成は約26mgである。実施例 2で用いられたHPBrデバイスでは10⁹個程の細胞がルーチン的に培養され、したがって、このような培養物においては、数十またはさらに数百ミリグラムの新規、または興味深いタンパク質が数日のうちに得られる。実施例7. 肝細胞での一過性発現ブタ胚細胞（原外胚葉期）に由来する全能性（幹細胞様）クローン化非形質転換細胞株（PICM-19 3BT細胞（以下「PICM-19細胞」と称する））は、Dr.N.Talbo ts(U.S.D.A.,Beltsville,MA)から提供された。これらの細胞は、5%以下のCO₂の存在下で培養される場合には、何カ月もの間、肝臓の幹細胞の様に振る舞い、自己再生特性を示す。より高いレベルのCO₂(例えば、約10%まで）では、これらの細胞は分化を始める。少なくとも二つの異分化した細胞の表現型が、分化したPI CM-19細胞、すなわち成熟肝細胞から単離されている。胆汁を産生する肝臓延性細胞、分化誘導を受けたPICM-19細胞は、著しく似ている細胞型である初代の肝細胞のトランスフェクションの特性を決定する手段として使用された。初代のブタ肝臓細胞培養物を使用した初期の実験では、SW480細胞に関する上の記載を反映した結果が得られた。初代の肝臓培養物は、肝細胞以外の細胞型を含むので、肝細胞様細胞の均一な供給源を提供するPICM-19細胞を用いて実験を繰り返した。実施例1はトランスフェクトしたSW480細胞を1ウェルあたり1×10⁷細胞を使用し、PICM-19細胞を、マイトマイシンC-不活性化STOマウス線維芽支持細胞(CRL 1 503、これなしではPICM-19細胞は通常は増殖しない)の層上へのプレーティングした以外は、使用したプロトコールはSW480細胞をトランスフェクトするために使用した実施例1に記載したものと同じであった。リポソームの調製において、細胞に対するDNA/脂質の比率は実施例1の通りであった。インキュベーターを、これらの実験を通して10%CO₂を維持した。PICM-19細胞は拡大し、これらの培養条件下では成熟肝細胞に分化した。分化が完了したことを確認するために、培養物をトランスフェクション工程の前に3週間、10%CO₂中で維持した。表10は、これらの細胞を用いるトランスフェクション研究において使用された培地、ならびにこれらの培養物中で測定されたX,G₇,およびK因子を記載する。表 10に示される結果は、SW480細胞についての知見、ならびに成体ブタ肝臓からの初代単離物を類似した条件下でのトランスフェクトした場合に観察された結果と一致する。驚くべきことに、支持細胞を欠いたプレートが分化したPICM-19細胞を少なくとも4週間支持し得ることがさらに観察された。これらの細胞は、図1に示すように、さらにトランスフェクトDNAを発現した。肝細胞が、細胞を添加する前に、プレートに支持層、またはタンパク質コーティング（例えば、コラーゲン）を適用することなしに、2、3日より長い間、培養物中で増殖または維持されたことは報告されていないので、この結果は非常に驚くべきことである。特筆すべきことに、支持細胞を含むプレート中の細胞と同様にプレート#4の細胞は癒着した。このことは、C型コンドロイチン-6-硫酸が細胞増殖、および維持のためのインビボ様条件を、産生したことを示唆する。したがって、これらの実験は、コンドロイチンが、インビボでの肝細胞についての観察されるのと同様の表現型を維持しながら、低コストの培地組成物において支持細胞なしで肝細胞を培養することに関するコンドロイチン硫酸の有用性を初めて示す。実施例8. バイオリアクターで増殖したトランスフェクト細胞からのトランスジェニックmRNAおよびcDNAの回収実施例3に記載された高性能バイオリアクターデバイス(HPBr)を、SW480細胞が実施例3および表5に記載されるようにトランスフェクトされ、そして増殖された 32日間実験に使用した。以下で他に記載されない限り、使用した条件およびアッセイは、実施例3の記載と同じである。実験の始めに、組織培養フラスコから新たに採取した1×10⁷個のSW480細胞を、HPBrデバイスに予め膨張したミクロスフェア1×10⁶個と同時に注入した。次いで、細胞を、1ｍＭ安息香酸、および1mＭ4 -エチル安息香酸（A型処方物）を含む培養液中で、回転させずに24時間培養した。24時間後、β-ガラクトシダーゼをコードするプラスミドDNAを加え、バイオリアクターを30cpmの速度で4時間回転させた。次いでDNAを含む培地を、1ｍＭ安息香酸、1ｍＭ4-エチル安息香酸および0.1ｍＭコンドロイチン-6-硫酸(Ｂ型処方物）を含むフィード培地で3回洗い流すことによりバイオリアクターの余分の毛細管スペース(extra-capillary space;ECS)から除去した。その後、バイオリアクターを介して、循環させるための1リットルボトルのフィード培地を、同じB型処方物を含む1リットルボトルのフィード培地に置換した。残りの実験のために、バイオリアクターを介して循環する培地を、B型処方物を含む新鮮な1リットルボトルの供給培地で7日毎に置換した。細胞が腫瘍様の固形塊を形成しないようにデバイスをDNA除去後は回転させなかった。バイオリアクターからDNAの除去後の最初の24時間、細胞のアリコートとECSからの培養上清を32日間、毎日除去した。細胞のサンプリングは、いくつかの細胞を除去するために、培養培地の流れを細胞塊に対して配向し、次いで少量の得られた細胞懸濁液を取り出すことにより達成した。各サンプル中の、細胞および培養培地を、短い遠心分離によって分離させた。毎日の各アリコートからの合計2 ×10⁴個の細胞をβ-ガラクトシダーゼについて分析し、そして各上清を、その代謝的特徴（すなわち、その、グルコース、乳酸塩、およびアンモニアの濃度）について分析した。毎日のサンプル収集後、32日目に残留細胞をトリプシン処理によりECSから回収し、そして2.8×10⁵個の回収した細胞をRNAおよびDNAの抽出に使用した。毎日の細胞サンプルにおけるβ-ガラクトシダーゼを実施例3に記載される通りにアッセイし、これらのアッセイの結果を図4に例示する。図4は、β-ガラクトシダーゼ発現のレベルのピークが4日目に生じることを示し、およそ12日目までは実質的な変化はなかったが、その後値は一貫して減少したが、それでもなお相対的に高く維持された。実施例の最後にトリプシン処理により収集した細胞に相当する最終的なデータのポイントを、正方形のシンボルとして図4に記載し、その値はピーク値のおよそ60%に相当した。したがって、相対的に高レベルのβ− ガラクトシダーゼ生成物は全32日間を通じてこの培養中で生じた。実施例2で記載された手順を使用して、上清中のグルコース、乳酸塩、ならびにアンモニアの濃度を測定し、そしてこれらの測定結果を図5A〜5Cに示す。図5A および5Bから、実験の経過を通してグルコースおよび乳酸塩のいずれの濃度も有意に変化しないことが明らかである（乳酸塩の変動は、これらのサンプル中、乳酸塩が少量であることから見て、および7日後に測定された相対的な一定量から見て、重要とは考えられなかった）。それに対して、アンモニアの濃度は、基底値に低減する、新鮮な培地を供給する各時点の前の培地交換の間の各7日間の終わりに2倍より多く増加した。各培地交換後のアンモニアの繰り返される蓄積は、トランスフェクション安定化成分への曝露は、細胞を、主な炭素源（クエン酸回路）のかわりに、グルコース使用（解糖）から、タンパク質またはアミノ酸使用へ、その代謝を変換させるという概念を強く支持する。この実験例での細胞は、エネルギーの主な供給源としてグルコースを用い、各7日間にアンモニアではなく乳酸塩の濃度が上昇することが予測される（いくらかの解糖が最初の7日間で生じ得ることを、図5は示唆することに留意する事）。アンモニアは脱アミノ化の副生成物であり、クエン酸回路へのアミノ酸代謝物の侵入の初期の工程である。したがって、培養培地中でのアンモニアの蓄積に最も適する説明は、細胞が安定した一過性の発現に用いられる化合物に曝される間、エネルギー源として、アミノ酸、またはおそらくペプチドあるいはタンパク質を使用したということである。これらのアミノ酸は、例えば、培養培地中に存在するペプチドを供給源とし得る。このようなペプチドは培養培地中に存在する血清の熱不活化の間、血清タンパク質の熱誘導分解から作られ得る。エネルギー源として、グルコース使用からアミノ酸の使用への変換を細胞にもたらすその能力は、一過性的に発現を安定化させる化合物の使用を顕著に結びつける。例として、アミノ酸が代謝されるクエン酸回路はまた、油脂および脂質の代謝においても重要である。従って、一過性の発現誘導化合物を有する細胞またはヒト被験者の処置はまた、クエン酸回路の活性化の効果による油脂および脂質の、増加された代謝も生じ得る。従って、化合物は、例として、量を重量制御するための因子として作用し得る。これらの結果はまた、図5A〜5C中で見られる特有の代謝的特徴と、トランスフェクトした遺伝子の一過性の発現が強められ、安定化される生理学的状態との間の関係を例示する。核酸を調製するため、32日目のインキュベーションの終わりに、回収された2. 8×10⁵個のトリプシン処理した細胞を回収し、遠心分離によりペレット化し、カルシウムおよびマグネシウムを含まない5mIPBSで洗浄し、そして1mlのTRIZOL^TM (Life Technologies)試薬を室温で混合した。TRIZOL^TMに懸濁した細胞を次いで、4℃で10分間、インキュベートした。この段階で、サンプルを、-70℃で冷凍保存した。融解後、サンプルを、200μｌのクロロホルムを加える前に20分間室温で静置させ、15秒間激しく混合し、そして5〜20分間室温でインキュベートした。次に、サンプルを15分間、4℃、2,000×gで遠心分離し、エマルジョンを二層界面に分離した。 RNAの単離のために、上層の水層を、界面部分を含まないように注意深く回収し、そしてRNAを沈殿させるために、別のチューブに移した。0.5mlのイソプロパノールをこの水層と混合し、チューブを10〜20分間室温でインキュベートし、次いでRNAペレットを回収するために12,000×g、4℃で遠心分離した。ペレットは1 mlの70%(v/v)エタノールで注意深く洗浄し、室温で5〜10分間風乾し、そして30 μｌのRNAse-free水(Five Prime Three Prime)で再懸濁した。 DNAを単離するために、上述のように下層と有機層を回収し、そして300μｌの 100%エタノールを用いて転倒混合し、次いでDNAを沈殿させるために室温で2〜3 分間静置した。DNAペレットは2,000×g、4℃で、5分間遠心分離することにより回収され、次いで、10%エタノールを含む0.1Mクエン酸ナトリウムで2回洗浄する。2回目の洗浄の後、DNAペレットを再び、2,000×g、4℃、5分間で遠心分離することにより回収し、そして75%エタノール中に10〜20分間、室温で再懸濁することにより洗浄する。ペレットを再び遠心分離により回収し、簡潔に乾燥させ、そして8mM水酸化ナトリウム中に懸濁および溶解させた。 β-ガラクトシダーゼ配列の存在を検出するために、RNA濃度を260nmでの吸光度を読みとることによって決定し、次いでRNA溶液を、最終濃度100μｇ/mlまでR NAse-free水に希釈した。50μｌの希釈したRNA溶液を、次いで37%ホルムアルデヒドと20×SSCの50:50溶液150μｌと混合する。サンプルを、55〜60℃で20分間加熱して標的核酸を変性させ、氷上に置き、そして200μｌのRNA-free水を加える。サンプルを振盪させ、そして簡単に遠心分離して、ペレット片を得、次いで弱い真空下でスロット-ブロット装置のウェルに装填し、GeneScreen Plus^TMメンブレン(New England Nuclear)上にRNAを回収する。ウェルを50μｌの10×SSCで洗浄し、そしてメンブレンを紫外線に曝露してRNAをメンブレンに架橋させ、次いで約9 0℃で1時間ベーキングし、ホルムアルデヒドを除去する。DNAサンプルを、吸引しないことを除いて、同様の手順を用いてスロット-ブロットした。スロット−ブロットメンブレン上のβ-ガラクトシダーゼDNAまたはmRNAの存在を、トランスフェクションに用いたプラスミド中に存在するβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の一部分に相当する³²P標識オリゴヌクレオチドを使用してのハイブリダイゼーションにより決定した。このオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は 5'CTCCAACGCAGCACCATCAC 3'（配列番号1)であった。ハイブリダイゼーションのために、10mlのハイブリダイゼーション緩衝液(1mlの50×Denhardt溶液、10μｌの10mg/mlポリアデニル酸、12.5mlの20×SSC、5mlの10%硫酸ドデシルナトリウム、および2.5mlの0.5M NaPO₄(pH6.5)、最終容量50ml中)を、装填されたスロットーブロットメンブレンおよび1×10⁶カウント/mlの³²P標識プローブを加えたプラスチックバッグ中に配置した。バッグを密閉し、52〜53℃で一晩インキュベートする。ハイブルダイゼーション後、メンブレンを緩衝液(5×SSC、および0.1%硫酸ドデシルナトリウムを含む)で5〜10分間、室温で2回洗浄し、ついで更に2回、同じ緩衝液で52〜53℃で、各洗浄毎に20〜30分間洗浄し、次いでX線フィルムで露出した。オートラジオグラムの結果では、トランスフェクション後32日目で回収した。細胞においてβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を含むトランスフェクトされたDNAの存在を示すシグナルが存在した。従って、DNAは、明らかに32日間の試験期間を通じて相対的に高い量を保持した。また、RNA-スロットブロットのオートラジオグラムは、β-ガラクトシダーゼプローブでのハイブリダイゼーション後の、驚くほど強力なシグナルを示した。過去の多数の実験では、β-ガラクトシダーゼの生成は減少し、そして培養培地から誘導化合物を除去した後2〜3日以内に、細胞から消失することが示された。従って、この実験における検出可能なβ-ガラクトシダーゼDNAおよびmRNAの観察された持続性は、外来DNAが組み込まれた細胞の増殖が原因ではなかった。さらに、mRNAの代表的な半減期は約1〜3日にすぎず、したがって32日間のインキュベーション期間の終了時のβ-ガラクトシダーゼのm RNAの存在は、このmRNAが最近転写され、そしてトランスフェクトされた外来DNA は、したがって32日間の実験を通じて持続したにちがいないことを示唆する。 32日のインキュベーション後のβ-ガラクトシダーゼDNAの検出は、さらに、外来のDNAがこの期間中に、複製し、そしてその量が増加したかもしれないことを示唆する。細胞はこの実験を通じて増殖し、そして分裂し続けたので、0日目に加えられたプラスミドDNAが希釈され、したがって32日後に分析した細胞はごく少量のβ-ガラクトシダーゼDNAを含むことが予想された。したがって、β-ガラクトシダーゼmRNAおよびDNAの容易に検出可能な量の驚くべき存在は、トランスフェクトされたDNAが実験の期間、おそらくミトコンドリアの内部で複製されたかもしれないことを示唆する。実施例9 一過性発現安定化化合物で処理した細胞中のアルカリホスファターゼの誘導以下の実験例の結果は、トリカルボン酸サイクルの誘導に加えて、実施例8に記載されるように処理した細胞の代謝のサイン(metaboric signature)はまた、S W480細胞中で通常かろうじて検出される内因性のアルカリホスファターゼ活性の誘導を含むことを示した。細胞をプラスチックの組織培養皿で培養し、実施例8 に記載される培養培地と同じ培養培地を使用して、トランスフェクトし、そして増殖した。細胞を数日おきに、数mlのフィード用培地を添加することにより栄養を与えた。これらのプレートからの培養培地のアリコートを、トランスフェクション後の初日から始めて14日間毎日回収し、そして実施例8に記載されるように、グルコース、乳酸塩、およびアンモニアの濃度を分析した。予想外のことに、これら同一のサンプルを内因性アルカリホスファターゼ活性について測定したところ、多量の存在が見出された。観察された上昇度は、通常に増殖されたSW480 細胞と比較して、約2倍〜約20倍の範囲であった。 SEAP活性の測定に使用されるアッセイは以下のとおりであった。それぞれのサンプル0.5mlを2×SEAP緩衝液(1xSEAP緩衝液＝1Mジエタノールアミン、0.50mM塩化マグネシウム、pH9.8)と混合した。コントロールとして、ウシ腸粘膜のアルカリホスファターゼを同時にアッセイした。ウシのアルカリホスファターゼを1×S EAPにおいて作成した。これらのアッセイの発色基質は、0.15Ｍ p-ニトロフェニルホスフェートであり、これはアルカリホスファターゼによる切断後、405n mで検出可能な物質を産生した。基質（100μｌ）を、各アッセイ用チューブに加え、次いでチューブを37℃で静置させた。その後コントロールサンプルの吸光度を10分間、毎分測定し、そして各試験サンプルも吸光度を、1分および6分で測定した。試験サンプルのアルカリホスファターゼ/mlの単位は以下の式を用いて決定した：ここで： A405nm=405nmでの吸光度、 V=アッセイチューブ中の容量、 df=希釈因子、 VE=アッセイチューブに添加したサンプルの容量。このセットのアッセイでは、V=1.1ml，df=2.2、およびVE=0.5mlであった。誘導されたアルカリホスファターゼ活性が熱感受性かどうか判定するために、第二のセットのアッセイを、同一のサンプルについて、上述のSEAP緩衝液と同一だが0.001Mホモアルギニンを含むアッセイ緩衝液を使用して行なった。コントロール酵素サンプルおよび培養培地のサンプルを、基質を加える前に、この緩衝液中で65℃、5〜10分間加熱した。この熱処置は酵素を発現するほとんどの哺乳動物細胞中で見られるアルカリホスファターゼを分解することが公知である。この前処置は、これらのサンプル中のアルカリホスファターゼ活性およびコントロール酵素サンプル中の活性を実際に破壊するので、したがって誘導されたアルカリホスファターゼは、胎盤中で存在することが公知の熱耐性種ではなく、動物細胞中で最も普通に検出されるアルカリホスファターゼのタイプに対応することを示す。本発明の好ましい実施態様が例示され、そして記載されているが、多くの変更が、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。

【手続補正書】【提出日】平成１１年９月１日（１９９９．９．１）【補正内容】請求の範囲１．真核生物細胞中での外来遺伝子の一過性発現を増強する方法であって：該細胞中に、該細胞中で発現され得る形態のタンパク質をコードする外来DNA の分子を導入する工程；および該DNAを導入する前、導入している間、または導入した後に、該細胞と一過性発現増強物質とを接触させる工程；を包含し、ここで、該一過性発現増強物質は、式：を有する少なくとも１つのカルボン酸誘導体を含み、ここでR₁は： CHNH₂R₃、ここで、R₃は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、セリン、スレオニン、メチオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、これらの非天然の光学異性体、3-メチル-L-ヒスチジン、α-ケトグルタル酸、β-アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチン、葉酸、グルタチオン、馬尿酸、ホモセリン、N-カルバミルアスパラギン酸、N-ホルミル-L-メチオニン、オルニチン、およびこれらの光学異性体からなる群から選択されるアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体の側鎖である； C₆H₄R₄、ここでR₄は、H、NH₂、COCH₃、CO(CH₂)_nCH₃、C(CH₃)₃、CH(CH₃)₂、(CH₂ )_nCH(CH₃)₂、(CH₂)_nCOCH₃、OCH₃、もしくはO(CH₂)_nCH₃、ここでn=1〜3である； CHNH₂(CH₂)_nR₅、ここでn=1〜7であり、そしてR₅は、CH₃、OH、CONH₂、C₆H₄OH 、もしくはCONHNH₂である； (CH₂)_nR₆、ここでn=3〜9であり、R₆は、インドール基、NCH₃C(=NH)NH₂、SCH₃ 、NH₂、CH₃、CO₂H、CONH₂、もしくはNHC(=NH)NH₂である； (CH₂)_nCHNH₂CO₂H、ここでn=1〜8である； CH(CO₂H)NHCONH₂：または C₅H₄Nであり；そしてここで、R₂は、H、(CH₂)_xO(CH₂)_yCH₃または(CH₂)_xCO(CH₂)_yCH₃から選択され、ここで、x+y=2〜7、またはMであり、ここでMは、金属対イオンまたはアンモニウムである、方法。２．請求項１に記載の方法であって、前記物質が、前記細胞を、その主要なエネルギー源としてタンパク質またはアミノ酸を使用するように誘導する、方法。３．請求項１に記載の方法であって、前記一過性発現増強物質が、3-メチル-L- ヒスチジン、α-ケトグルタル酸、β-アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチン、葉酸、グルタチオン、馬尿酸、ホモセリン、N-(4-アミノベンジル)-L- グルタミンジエチルエステル、N-カルバミルアスパラギン酸、N-ホルミル-L-メチオニン、およびオルニチンからなる群から選択されるアミノ酸誘導体を含む、方法。４．R₁が非極性および疎水性である、請求項１に記載の方法。５．真核生物細胞中で外来遺伝子の一過性発現を増強するための方法であって：該細胞中に、該細胞中で発現され得る形態のタンパク質をコードする外来DNAの分子を導入する工程；および該DNAを導入する前、導入している間、または導入した後に、該細胞と一過性発現増強物質とを接触させる工程；を包含し、ここで、該一過性発現増強物質は、式：を有するスルホン酸誘導体を含み、ここで、R₇は、直鎖または分枝のC₁〜C₅低級アルキル、アリール、置換低級アルキル、または置換アリールであり；そして R₈は、水素、金属対イオン、またはアンモニウムである、方法。６．R₇が、アミノ置換した直鎖または分枝のC₁〜C₅低級アルキル基またはアミノ置換したアリール基である、請求項５に記載の方法。７．前記スルホン酸誘導体が、3-アミノベンゼンスルホン酸、タウリン、およびこれらの塩からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。８．真核生物細胞中で外来遺伝子の一過性発現を増強するための方法であって：該細胞中に、該細胞中で発現され得る形態のタンパク質をコードする外来DNA の分子を導入する工程；および該DNAを導入する前、導入している間、または導入した後に、該細胞と一過性発現増強物質とを接触させる工程；を包含し、ここで、該一過性発現増強物質は、スルホン化アミノボリサッカライドを含む、方法。９．前記スルホン化アミノポリサッカライドが、N-アセチル化アミノポリサッカライドを含む、請求項８に記載の方法。１０．前記N-アセチル化アミノポリサッカライドが、コンドロイチン-6-硫酸およびグアランからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。１1．前記グアランがヒドロキシプロピルグアランである、請求項１０に記載の方法。１２．前記一過性発現増強物質が、アドレナリン、補酵素B12、およびメチルコバラミンからなる群から選択される化合物を含む、請求項１に記載の方法。１３．前記一過性発現増強物質の濃度が、１〜15mMである、請求項１に記載の方法。１４．前記一過性発現増強物質の濃度が、１〜15mMである、請求項５に記載の方法。１５．前記一過性発現増強物質の濃度が、0.01〜0.5mMである、請求項８に記載の方法。１６．前記N-アセチル化アミノポリサッカライドが、約4000ダルトンの分子量を有するコンドロイチン-6-硫酸である、請求項１０に記載の方法。１７．前記一過性発現増強物質が、4.5〜9.0のpHを有する水溶液を含む、請求項１に記載の方法。１８．真核生物細胞中での外来遺伝子の一過性発現を増強する方法であって：該細胞中に、該細胞中で発現され得る形態のタンパク質をコードする外来DNA の分子を導入する工程；および該DNAを導入する前、導入している間、または導入した後に、該細胞と第一および第二の一過性発現増強物質とを接触させる工程；を包含し、ここで、該細胞は、該外来DNAの該細胞への導入の前、導入の間、導入の後に、該第一の一過性発現増強物質と接触され、ここで該物質は、式：を有する少なくとも１つの化合物を含み、ここで、R¹は: CHNH₂R₃、ここで、R₃は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、セリン、スレオニン、メチオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、これらの非天然の光学異性体、3-メチル-L-ヒスチジン、α-ケトグルタル酸、β-アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチン、葉酸、グルタチオン、馬尿酸、ホモセリン、N-カルバミルアスパラギン酸、N-ホルミル-L-メチオニン、オルニチン、およびこれらの光学異性体からなる群から選択されるアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体の側鎖である； C₆H₄R₄、ここでR₄は、H、CH₃、(CH₂)_nCH₃、NH₂、COCH₃、CO(CH₂)_nCH₃、C(CH₃)₃ 、CH(CH₃)₂、(CH₂)_nCH(CH₃)₂、(CH₂)_nCOCH₃、OCH₃、もしくはO(CH₂)_nCH₃、ここでn=1〜3である； CHNH₂(CH₂)_nR₅、ここでn=1〜7であり、そしてR₅は、CH₃、OH、CONH₂、C₆H₄OH 、もしくはCONHNH₂である； (CH₂)_nR₆、ここでn=1〜9であり、R₆は、インドール基、NCH₃C(=NH)NH₂、SCH₃ 、NH₂、CH₃、CO₂H、CONH₂、もしくはNHC(=NH)NH₂である； (CH₂)_nCHNH₂CO₂H、ここでn=1〜8である； CH(CO₂H)NHCONH₂；または C₅H₄Nであり；そしてここで、R₂は、H、CH₃、(CH₂)_nCH₃、ここでn=1〜8、または(CH₂)_xO(CH₂)_yCH₃ もしくは(CH₂)_xCO(CH₂)_yCH₃であり、ここで、x+y=2〜7、またはMであり、ここで Mは、金属対イオンまたはアンモニウムであり、ただし、R₁が、(CH₂)₂CH₃、の場合、R₂は、Hではなく；あるいは、該第一の一過性発現増強物質が、式：を有する化合物を含み、ここで、R₇は、直鎖または分枝のC₁〜C₅の低級アルキル、アリール、置換低級アルキル、または置換アリールであり；そして R₈は、水素、金属対イオン、アンモニウムであり；そして、該外来DNAの導入の後に、該細胞が、該第二の一過性発現増強物質と接触され、ここで該第二の物質は、スルホン化アミノポリサッカライドを含む、方法。１９．前記細胞が、前記外来DNAの該細胞中への導入の前に、前記物質と接触される、請求項１に記載の方法。２０．前記細胞が、前記外来DNAの該細胞中への導入の間に、前記物質と接触される、請求項１に記載の方法。２１．前記細胞が、前記外来DNAの該細胞中への導入の後に、前記物質に継続的に曝露される、請求項１に記載の方法。２２．前記細胞が培養細胞である、請求項１に記載の方法。２３．前記培養細胞が一次培養物である、請求項２２に記載の方法。２４．前記培養細胞が、安定に形質転換された細胞、腫瘍細胞株、およびハイブリドーマ細胞からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。２５．前記培養細胞がSW480 P3細胞である、請求項２４に記載の方法。２６．前記物質が生体適合性である、請求項１に記載の方法。２７．前記外来遺伝子にコードされるタンパク質が回収される、請求項１に記載の方法。２８．前記細胞が生きた宿主に存在し、そして前記一過性発現増強物質が該宿主中に、経口的に、または注入によって導入される、請求項１に記載の方法。２９．前記外来DNAが、前記細胞中に、リポフェクション、ウイルスベクター、リン酸カルシウムの共沈殿物への細胞の曝露、および星形ポリマーの存在下でのトランスフェクションからなる群から選択される方法によって導入される、請求項１に記載の方法。３０．前記DNAが、ウイルスベクターによって前記細胞中に導入され、そして該ウイルスベクターがアデノウイルスに由来する、請求項２９に記載の方法。３１．前記物質が、少なくとも１つの疎水性部分および少なくとも１つの酸性部分を含み、そして該酸性基が、塩またはエステルを形成するように改変され得る、請求項２６に記載の方法。３２．前記酸性部分が、疎水性でありかつ有機である、請求項３１に記載の方法。３３．少なくとも１つの化学化合物を含む物質が、真核生物細胞中の外来遺伝子の一過性発現を増強し得るか否かを決定するために、該物質をスクリーニングする方法であって、ここで、該物質は、生体適合性であり、そして少なくとも１つの疎水性部分および少なくとも１つの酸性部分を含み、該方法は、以下の工程：０日目に、第一および第二のSW480 P3細胞中に、該細胞中で発現され得る形態のタンパク質をコードする外来DNAの分子を導入する工程；該DNAを導入する前、導入する間、または導入する後に、該第二の細胞を該物質と接触させる工程；０日目と４日目との間、または４日目と７日目との間、または４日目と14日目との間で、両方の細胞において、該外来DNAから発現されたタンパク質の量を累積的に測定し、そしてこれらの量を使用して、式：に従うX、G₇、またはG₁₄の値をそれぞれ決定する工程であって、ここで、「Ａ」は、該第一の細胞中で発現される該外来遺伝子によってコードされるタンパク質の量であり、そして「Ｃ」は、該第二の細胞中で発現されるタンパク質の量である、工程；および XまたはG₇またはG₁₄が10より大きい場合に、該物質が一過性発現を増強させ得ることを決定する工程、を包含する、方法。３４．前記X、G₇、またはG₁₄が25より大きい、請求項３３に記載の方法。３５．細胞中で外来遺伝子の一過性発現を増強させる方法であって：該細胞中に、該細胞中で発現され得る形態のタンパク質をコードする外来DNA の分子を導入する工程；および物質が請求項３３に記載のアッセイに従って評価される場合に、該細胞を、X 、G₇、またはG₁₄が25より大きい物質と接触させる工程、を包含する、方法。３６．細胞の代謝を操作して、該細胞のグルコースの消費を低減させる方法であって、該細胞を、該細胞を誘導してその主要なエネルギー源としてタンパク質またはアミノ酸を使用するようにさせる物質と接触させる工程を包含する、方法。３７．前記物質が、前記細胞をさらに誘導して、内因性アルカリホスファターゼ活性を発現させる、請求項３６に記載の方法。３８．細胞の代謝を操作して、該細胞のグルコースの消費を低減させる方法であって、該細胞を物質と接触させる工程を包含し、ここで該物質は、式：を有する少なくとも１つの化学化合物を含み、ここで、R₁は： CHNH₂R₃、ここで、R₃は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、セリン、スレオニン、メチオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、これらの非天然の光学異性体、3-メチル-L-ヒスチジン、α-ケトグルタル酸、β-アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチン、葉酸、グルタチオン、馬尿酸、ホモセリン、N-カルバミルアスパラギン酸、N-ホルミル-L-メチオニン、オルニチン、およびこれらの光学異性体からなる群から選択されるアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体の側鎖である； C₆H₄R₄、ここでR₄は、H、CH₃、(CH₂)_nCH₃、NH₂、COCH₃、CO(CH₂)_nCH₃、C(CH₃)₃ 、CH(CH₃)₂、(CH₂)_nCH(CH₃)₂、(CH₂)_nCOCH₃、OCH₃、もしくはO(CH₂)_nCH₃、ここでn=1〜3である； CHNH₂(CH₂)_nR₅、ここでn=1〜7であり、そしてR₅は、CH₃、OH、CONH₂、C₆H₄OH 、もしくはCONHNH₂である； (CH₂)_nR₆、ここでn=１〜9であり、そしてR₆は、インドール基、NCH₃C(=NH)NH₂ 、SCH₃、NH₂、CO₂H、CONH₂、もしくはNHC(=NH)NH₂である； (CH₂)_nCHNH₂CO₂H、ここでn=1〜8である； CH(CO₂H)NHCONH₂；または C₅H₄Nであり；そしてここで、R₂は、H、CH₃、(CH₂)_nCH₃、ここでn=1〜8、または(CH₂)_xO(CH₂)_yCH₃ もしくは(CH₂)_xCO(CH₂)_yCH₃であり、ここで、x+y=2〜7、またはMであり、ここで Mは、金属対イオンまたはアンモニウムであり、ただし、R₁が、(CH₂)₂CH₃、の場合、R₂は、Hではない；あるいは、式：を有するスルホン酸誘導体からなる基、ここで、R₇は、直鎖または分枝のC₁〜C₅の低級アルキル、アリール、置換低級アルキル、または置換低級アリールであり；そして R₈は、水素原子、金属対イオン、またはアンモニウムである；あるいはスルホン化アミノポリサッカライド、を含む、方法。３９．前記物質が、安息香酸、4-エチル安息香酸、安息香酸緩衝液、およびコンドロイチン-6-硫酸からなる群から選択される化学化合物を含む、請求項３８に記載の方法。４０．前記物質が、インビボで哺乳動物に投与される、請求項３８に記載の方法。４１．培養物下層への細胞の接着を増強する方法であって、ここで約4,000ダルトンの分子量を有するスルホン化アミノポリサッカライドが、該細胞が培養される培地に添加される、方法。４２．前記細胞が、培養物中で増殖するためにフィーダー層を通常必要とする細胞である、請求項４１に記載の方法。４３．前記細胞が、肝細胞であり、そして前記スルホン化アミノポリサッカライドが、コンドロイチン-6-硫酸である、請求項４１に記載の方法。４４．真核生物細胞中での外来遺伝子の一過性発現を増強する方法であって：該細胞中に、該細胞中で発現され得る形態のタンパク質をコードする外来DNA の分子を導入する工程；および該細胞中に該外来DNAを導入する前、導入している間、または導入した後に、該細胞と第一の物質とを接触させる工程であって、ここで該第一の物質が、式：を有する少なくとも１つの化合物を含み、ここで、R₁は： CHNH₂R₃、ここで、R₃は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、セリン、スレオニン、メチオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、これらの非天然の光学異性体、3-メチル-L-ヒスチジン、α-ケトグルタル酸、β-アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチン、葉酸、グルタチオン、馬尿酸、ホモセリン、N-カルバミルアスパラギン酸、N-ホルミル-L-メチオニン、オルニチン、およびこれらの光学異性体からなる群から選択されるアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体の側鎖である； C₆H₄R₄、ここでR₄は、H、CH₃、(CH₂)_nCH₃、NH₂、COCH₃、CO(CH₂)_nCH₃、C(CH₃)₃ 、CH(CH₃)₂、(CH₂)_nCH(CH₃)₂、(CH₂)_nCOCH₃、OCH₃、もしくはO(CH₂)_nCH₃、ここでn=1〜3である； CHNH₂(CH₂)_nR₅、ここでn=1〜7であり、そしてR₅は、CH₃、OH、CONH₂、C₆H₄OH 、もしくはCONHNH₂である； (CH₂)_nR₆、ここでn=１〜9であり、R₆は、インドール基、NCH₃C(=NH)NH₂、SCH₃ 、NH₂、CH₃、CO₂H，CONH₂、もしくはNHC(=NH)NH₂である； (CH₂)_nCHNH₂CO₂H、ここでn=1〜8である； CH(CO₂H)NHCONH₂；または C₅H₄Nであり；そしてここで、R₂は、H、CH₃、(CH₂)_nCH₃、ここでn=1〜8、または(CH₂)_xO(CH₂)_yCH₃ もしくは(CH₂)_xCO(CH₂)_yCH₃であり、ここで、x+y=2〜7、またはMであり、ここで Mは、金属対イオンまたはアンモニウムであり、ただし、R₁が、(CH₂)₂CH₃、の場合、R₂は、Hではない；あるいは、該第一の物質が、式：を有する少なくとも１つの化学化合物を含み、ここで、R₇は、直鎖または分枝のC₁〜C₅の低級アルキル、アリール、置換低級アルキル、または置換アリールであり；そして R₈は、水素原子、金属対イオン、アンモニウムであり；そして、該外来DNAの導入の後に、該細胞が、該第二の物質と接触され、ここで該第二の物質は、少なくとも１つのスルホン化アミノポリサッカライドを含むか、もしくは該第二の物質は、式：を有する少なくとも１つの化学化合物を含み、ここで、R₁は： CHNH₂R₃、ここで、R₃は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、セリン、スレオニン、メチオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、これらの非天然の光学異性体、3-メチル-L-ヒスチジン、α-ケトグルタル酸、β-アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチン、葉酸、グルタチオン、馬尿酸、ホモセリン、N-カルバミルアスパラギン酸、N-ホルミル-L-メチオニン、オルニチン、およびこれらの光学異性体からなる群から選択されるアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体の側鎖である； C₆H₄R₄、ここでR₄は、H、CH₃、(CH₂)_nCH₃、NH₂、COCH₃、CO(CH₂)_nCH₃、C(CH₃)₃ 、CH(CH₃)₂、(CH₂)_nCH(CH₃)₂、(CH₂)_nCOCH₃、OCH₃、もしくはO(CH₂)_nCH₃、ここでn=1〜3である； CHNH₂(CH₂)_nR₅、ここでn=1〜7であり、そしてR₅は、CH₃、OH、CONH₂、C₆H₄OH 、もしくはCONHNH₂である； (CH₂)_nR₆、ここでn=1〜9であり、R₆は、インドール基、NCH₃C(=NH)NH₂、SCH₃ 、NH₂、CH₃、CO₂H、CONH₂、もしくはNHC(=NH)NH₂である； (CH₂)_nCHNH₂CO₂H、ここでn=1〜8である； CH(CO₂H)NHCONH₂；または C₅H₄Nであり；そしてここで、R₂は、H、CH₃、(CH₂)_nCH₃、ここでn=1〜8、または(CH₂)_xO(CH₂)_yCH₃ もしくは(CH₂)_xCO(CH₂)_yCH₃であり、ここで、x+y=2〜7、またはMであり、ここで Mは、金属対イオンまたはアンモニウムであり、ただし、R₁が、(CH₂)₂CH₃、の場合、R₂は、Hではなく；あるいは、該第二の物質が、式：を有する少なくとも１つの化学化合物を含み、ここで、R₇は、直鎖または分枝のC₁〜C₅の低級アルキル、アリール、置換低級アルキル、または置換アリールであり；そして R₈は、水素原子、金属対イオン、アンモニウムである、方法。４５．前記第一の物質が、安息香酸緩衝液であり、そして前記第二の物質が、コンドロイチン-6-硫酸である、請求項４４に記載の方法。４６．前記第一の物質が、安息香酸および4-エチル安息香酸を含み、そして前記第二の物質が、安息香酸緩衝液およびコンドロイチン-6-硫酸を含む、請求項４４に記載の方法。４７．前記第一の物質が、安息香酸緩衝液およびグルタミン酸を含み、そして前記第二の物質が、コンドロイチン-6-硫酸を含む、請求項４４に記載の方法。４８．前記細胞が、前記外来DNAの該細胞への導入の前に、前記第一の物質と約2 0〜24時間接触される、請求項４５に記載の方法。４９．前記物質が、安息香酸および4-エチル安息香酸；または安息香酸緩衝液およびコンドロイチン-6-硫酸；または安息香酸緩衝液およびグルタミン酸；またはグルタチオン、メチオニン、グリシン、α-アミノ-n-ブチル酸、タウリン、フェニルアラニン、安息香酸緩衝液、およびアラニンである、請求項１に記載の方法。５０．前記スルホン化アミノポリサッカライドが、N-アセチル化アミノポリサッカライドを含む、請求項１８に記載の方法。５１．前記N-アセチル化アミノポリサッカライドが、コンドロイチン-6-硫酸またはグアランである、請求項５０に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 Ａ６１Ｐ 43/00 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ // Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 35/76 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．真核生物細胞中での外来遺伝子の一過性発現を増強する方法であって：該細胞中に、該細胞中で発現され得る形態のタンパク質をコードする外来DNA の分子を導入する工程；および該DNAを導入する前、導入している間、または導入した後に、該細胞と一過性発現増強物質とを接触させる工程；を包含し、ここで、該一過性発現増強物質は、式：を有する少なくとも１つのカルボン酸誘導体を含み、ここでR₁は： CHNH₂R₃、ここで、R₃は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、セリン、スレオニン、メチオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、これらの非天然の光学異性体、3-メチル-L-ヒスチジン、α-ケトグルタル酸、β-アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチン、葉酸、グルタチオン、馬尿酸、ホモセリン、N-カルバミルアスパラギン酸、N-ホルミル-L-メチオニン、オルニチン、およびこれらの光学異性体からなる群から選択されるアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体の側鎖である； C₆H₄R₄、ここでR₄は、H、NH₂、COCH₃、CO(CH₂)_nCH₃、C(CH₃)₃、CH(CH₃)₂、(CH₂ )_nCH(CH₃)₂、(CH₂)_nCOCH₃、OCH₃、もしくはO(CH₂)_nCH₃、ここでn=1〜3である； CHNH₂(CH₂)_nR₅、ここでn=1〜7であり、そしてR₅は、CH₃、OH、CONH₂、C₆H₄OH 、もしくはCONHNH₂である； (CH₂)_nR₆、ここでn=3〜9であり、R₆は、インドール基、NCH₃C(=NH)NH₂、SCH₃ 、NH₂、CH₃、CO₂H、CONH₂、もしくはNHC(=NH)NH₂である； (CH₂)_nCHNH₂CO₂H、ここでn=1〜8である； CH(CO₂H)NHCONH₂；または C₅H₄Nであり；そしてここで、R₂は、H、(CH₂)_xO(CH₂)_yCH₃または(CH₂)_xCO(CH₂)_yCH₃から選択され、ここで、x+y=2〜7、またはMであり、ここでMは、金属対イオンまたはアンモニウムである、方法。２．請求項１に記載の方法であって、前記物質が、前記細胞を、その主要なエネルギー源としてタンパク質またはアミノ酸を使用するように誘導する、方法。３．請求項１に記載の方法であって、前記一過性発現増強物質が、3-メチル-L- ヒスチジン、α-ケトグルタル酸、β-アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチン、葉酸、グルタチオン、馬尿酸、ホモセリン、N-(4-アミノベンジル)-L- グルタミンジエチルエステル、N-カルバミルアスパラギン酸、N-ホルミル-L-メチオニン、およびオルニチンからなる群から選択されるアミノ酸誘導体を含む、方法。４．R₁が非極性および疎水性である、請求項１に記載の方法。５．真核生物細胞中で外来遣伝子の一過性発現を増強するための方法であって：該細胞中に、該細胞中で発現され得る形態のタンパク質をコードする外来DNA の分子を導入する工程；および該DNAを導入する前、導入している間、または導入した後に、該細胞と一過性発現増強物質とを接触させる工程；を包含し、ここで、該一過性発現増強物質は、式：を有するスルホン酸誘導体を含み、ここで、R₇は、直鎖または分枝のC₁〜C₅低級アルキル、アリール、置換低級アルキル、または置換アリールであり；そして R₈は、水素、金属対イオン、またはアンモニウムである、方法。６．R₇が、アミノ置換した直鎖または分枝のC₁〜C₅低級アルキル基またはアミノ置換したアリール基である、請求項５に記載の方法。７．前記スルホン酸誘導体が、3-アミノベンゼンスルホン酸、タウリン、およびこれらの塩からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。８．真核生物細胞中で外来遺伝子の一過性発現を増強するための方法であって：該細胞中に、該細胞中で発現され得る形態のタンパク質をコードする外来DNA の分子を導入する工程；および該DNAを導入する前、導入している間、または導入した後に、該細胞と一過性発現増強物質とを接触させる工程；を包含し、ここで、該一過性発現増強物質は、スルホン酸化アミノポリサッカライドを含む、方法。９．前記スルホン酸化アミノポリサッカライドが、N-アセチル化アミノポリサッカライドを含む、請求項８に記載の方法。１０．前記N-アセチル化アミノポリサッカライドが、コンドロイチン-6-硫酸およびグアランからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。１１．前記グアランがヒドロキシプロピルグアランである、請求項１０に記載の方法。１２．前記一過性発現増強物質が、アドレナリン、補酵素B12、およびメチルコバラミンからなる群から選択される化合物を含む、請求項１に記載の方法。１３．前記一過性発現増強物質の濃度が、１〜15mMである、請求項１に記載の方法。１４．前記一過性発現増強物質の濃度が、１〜15mMである、請求項５に記載の方法。１５．前記一過性発現増強物質の濃度が、0.01〜0.5mMである、請求項８に記載の方法。１６．前記N-アセチル化アミノポリサッカライドが、約4000ダルトンの分子量を有するコンドロイチン-6-硫酸である、請求項１０に記載の方法。１７．前記一過性発現増強物質が、4.5〜9.0のpHを有する水溶液を含む、請求項１に記載の方法。１８．真核生物細胞中での外来遺伝子の一過性発現を増強する方法であって：該細胞中に、該細胞中で発現され得る形態のタンパク質をコードする外来DNA の分子を導入する工程；および該DNAを導入する前、導入している間、または導入した後に、該細胞と第一および第二の一過性発現増強物質とを接触させる工程；を包含し、ここで、該細胞は、該外来DNAの該細胞への導入の前、導入の間、導入の後に、該第一の一過性発現増強物質と接触され、ここで該物質は、式：を有する少なくとも１つの化合物を含み、ここで、R₁は： CHNH₂R₃、ここで、R₃は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、セリン、スレオニン、メチオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、これらの非天然の光学異性体、3-メチル-L-ヒスチジン、α-ケトグルタル酸、β-アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチン、葉酸、グルタチオン、馬尿酸、ホモセリン、N-カルバミルアスパラギン酸、N-ホルミル-L-メチオニン、オルニチン、およびこれらの光学異性体からなる群から選択されるアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体の側鎖である； C₆H₄R₄、ここでR₄は、H、CH₃、(CH₂)_nCH₃、NH₂、COCH₃、CO(CH₂)_nCH₃、C(CH₃)₃ 、CH(CH₃)₂、(CH₂)_nCH(CH₃)₂、(CH₂)_nCOCH₃、OCH₃、もしくはO(CH₂)_nCH₃、ここでn=1〜3である； CHNH₂(CH₂)_nR₅、ここでn=1〜7であり、そしてR₅は、CH₃、OH、CONH₂、C₆H₄OH 、もしくはCONHNH₂である； (CH₂)_nR₆、ここでn=1〜9であり、R₆は、インドール基、NCH₃C(=NH)NH₂、SCH₃ 、NH₂、CH₃、CO₂H、CONH₂、もしくはNHC(=NH)NH₂である； (CH₂)_nCHNH₂CO₂H、ここでn=1〜8である； CH(CO₂H)NHCONH₂；または C₅H₄Nであり；そしてここで、R₂は、H、CH₃、(CH₂)_nCH₃、ここでn=1〜8、または(CH₂)_xO(CH₂)_yCH₃ もしくは(CH₂)_xCO(CH₂)_yCH₃であり、ここで、x+y=2〜7、またはMであり、ここで Mは、金属対イオンまたはアンモニウムであり、ただし、R₁が、(CH₂)₂CH₃、の場合、R₂は、Hではなく；あるいは、該第一の一過性発現増強物質が、式：を有する化合物を含み、ここで、R₇は、直鎖または分枝のC₁〜C₅の低級アルキル、アリール、置換低級アルキル、または置換アリールであり；そして R₈は、水素、金属対イオン、アンモニウムであり；そして、該外来DNAの導入の後に、該細胞が、該第二の一過性発現増強物質と接触され、ここで該第二の物質は、スルホン酸化アミノポリサッカライドを含む、方法。１９．前記細胞が、前記外来DNAの該細胞中への導入の前に、前記物質と接触される、請求項１に記載の方法。２０．前記細胞が、前記外来DNAの該細胞中への導入の間に、前記物質と接触される、請求項１に記載の方法。２１．前記細胞が、前記外来DNAの該細胞中への導入の後に、前記物質に継続的に曝露される、請求項１に記載の方法。２２．前記細胞が培養細胞である、請求項１に記載の方法。２３．前記培養細胞が一次培養物である、請求項２２に記載の方法。２４．前記培養細胞が、安定に形質転換された細胞、肺瘍細胞株、およびハイブリドーマ細胞からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。２５．前記培養細胞がSW480 P3細胞である、請求項２４に記載の方法。２６．前記物質が生体適合性である、請求項１に記載の方法。２７．前記外来遺伝子にコードされるタンパク質が回収される、請求項１に記載の方法。２８．前記細胞が生きた宿主に存在し、そして前記一過性発現増強物質が該宿主中に、経口的に、または注入によって導入される、請求項１に記載の方法。２９．前記外来DNAが、前記細胞中に、リポフェクション、ウイルスベクター、リン酸カルシウムの共沈殿物への細胞の曝露、および星形ポリマーの存在下でのトランスフェクションからなる群から選択される方法によって導入される、請求項１に記載の方法。３０．前記DNAが、ウイルスベクターによって前記細胞中に導入され、そして該ウイルスベクターがアデノウイルスに由来する、請求項２９に記載の方法。３１．前記物質が、少なくとも１つの疎水性部分および少なくとも１つの酸性部分を含み、そして該酸性基が、塩またはエステルを形成するように改変され得る、請求項２６に記載の方法。３２．前記酸性部分が、疎水性でありかつ有機である、請求項３１に記載の方法。３３．少なくとも１つの化学化合物を含む物質が、真核生物細胞中の外来遺伝子の一過性発現を増強し得るか否かを決定するために、該物質をスクリーニングする方法であって、ここで、該物質は、生体適合性であり、そして少なくとも１つの疎水性部分および少なくとも１つの酸性部分を含み、該方法は、以下の工程：０日目に、第一および第二のSW480 P3細胞中に、該細胞中で発現され得る形態のタンパク質をコードする外来DNAの分子を導入する工程；該DNAを導入する前、導入する間、または導入する後に、該第二の細胞を該物質と接触させる工程；０日目と４日目との間、または４日目と７日目との間、または４日目と14日目との間で、両方の細胞において、該外来DNAから発現されたタンパク質の量を累積的に測定し、そしてこれらの量を使用して、式：に従うX、G₇、またはG₁₄の値をそれぞれ決定する工程であって、ここで、「Ａ」は、該第一の細胞中で発現される該外来遺伝子によってコードされるタンパク質の量であり、そして「Ｃ」は、該第二の細胞中で発現されるタンパク質の量である、工程；および XまたはG₇またはG₁₄が10より大きい場合に、該物質が一過性発現を増強させ得ることを決定する工程、を包含する、方法。３４．前記X、G₇、またはG₁₄が25より大きい、請求項３３に記載の方法。３５．細胞中で外来遺伝子の一過性発現を増強させる方法であって：該細胞中に、該細胞中で発現され得る形態のタンパク質をコードする外来DNA の分子を導入する工程；および物質が請求項３３に記載のアッセイに従って評価される場合に、該細胞を、X 、G₇、またはG₁₄が25より大きい物質と接触させる工程、を包含する、方法。３６．細胞の代謝を操作して、該細胞のグルコースの消費を低減させる方法であって、該細胞を、該細胞を誘導してその主要なエネルギー源としてタンパク質またはアミノ酸を使用するようにさせる物質と接触させる工程を包含する、方法。３７．前記物質が、前記細胞をさらに誘導して、外来のアルカリホスファターゼ活性を発現させる、請求項３６に記載の方法。３８．細胞の代謝を操作して、該細胞のグルコースの消費を低減させる方法であって、該細胞を物質と接触させる工程を包含し、ここで該物質は、式：を有する少なくとも１つの化学化合物を含み、ここで、R₁は： CHNH₂R₃、ここで、R₃は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、セリン、スレオニン、メチオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、これらの非天然の光学異性体、3-メチル-L-ヒスチジン、α-ケトグルタル酸、β-アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチン、葉酸、グルタチオン、馬尿酸、ホモセリン、N-カルバミルアスパラギン酸、N-ホルミル-L-メチオニン、オルニチン、およびこれらの光学異性体からなる群から選択されるアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体の側鎖である； C₆H₄R₄、ここでR₄は、H、CH₃、(CH₂)_nCH₃、NH₂、COCH₃、CO(CH₂)_nCH₃、C(CH₃)₃ 、CH(CH₃)₂、(CH₂)_nCH(CH₃)₂、(CH₂)_nCOCH₃、OCH₃、もしくはO(CH₂)_nCH₃、ここでn=1〜3である； CHNH₂(CH₂)_nR₅、ここでn=1〜7であり、そしてR₅は、CH₃、OH、CONH₂、C₆H₄OH 、もしくはCONHNH₂である； (CH₂)_nR₆、ここでn=1〜9であり、そしてR₆は、インドール基、NCH₃C(=NH)NH₂ 、SCH₃、NH₂、CO₂H，CONH₂、もしくはNHC(=NH)NH₂である； (CH₂)_nCHNH₂CO₂H、ここでn=1〜8である； CH(CO₂H)NHCONH₂；または C₅H₄Nであり；そしてここで、R₂は、H、CH₃、(CH₂)_nCH₃、ここでn=1〜8、または(CH₂)_xO(CH₂)_yCH₃ もしくは(CH₂)_xCO(CH₂)_yCH₃であり、ここで、x+y=2〜7、またはMであり、ここで Mは、金属対イオンまたはアンモニウムであり、ただし、R₁が、(CH₂)₂CH₃、の場合、R₂は、Hではない；あるいは、式：を有するスルホン酸誘導体からなる基、ここで、R₇は、直鎖または分枝のC₁〜C₅の低級アルキル、アリール、置換低級アルキル、または置換低級アリールであり；そして R₈は、水素原子、金属対イオン、またはアンモニウムである；あるいはスルホン酸化アミノポリサッカライド、を含む、方法。３９．前記物質が、安息香酸、4-エチル安息香酸、安息香酸緩衝液、およびコンドロイチン-6-硫酸からなる群から選択される化学化合物を含む、請求項３８に記載の方法。４０．前記物質が、インビボで哺乳動物に投与される、請求項３８に記載の方法。４１．培養物下層への細胞の接着を増強する方法であって、ここで約4,000ダルトンの分子量を有するスルホン化アミノポリサッカライドが、該細胞が培養される培地に添加される、方法。４２．前記細胞が、培養物中で増殖するためにフィーダー層を通常必要とする細胞である、請求項４１に記載の方法。４３．前記細胞が、肝細胞であり、そして前記スルホン化アミノポリサッカライドが、コンドロイチン-6-硫酸である、請求項４１に記載の方法。４４．真核生物細胞中での外来遺伝子の一過性発現を増強する方法であって：該細胞中に、該細胞中で発現され得る形態のタンパク質をコードする外来DNA の分子を導入する工程；および該細胞中に該外来DNAを導入する前、導入している間、または導入した後に、該細胞と第一の物質とを接触させる工程であって、ここで該第一の物質が、式：を有する少なくとも１つの化合物を含み、ここで、R₁は： CHNH₂R₃、ここで、R₃は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、セリン、スレオニン、メチオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、これらの非天然の光学異性体、3-メチル-L-ヒスチジン、α-ケトグルタル酸、β-アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチン、葉酸、グルタチオン、馬尿酸、ホモセリン、N-カルバミルアスパラギン酸、N-ホルミル-L-メチオニン、オルニチン、およびこれらの光学異性体からなる群から選択されるアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体の側鎖である； C₆H₄R₄、ここでR₄は、H、CH₃、(CH₂)_nCH₃、NH₂、COCH₃、CO(CH₂)_nCH₃、C(CH₃)₃ 、CH(CH₃)₂、(CH₂)_nCH(CH₃)₂、(CH₂)_nCOCH₃、OCH₃、もしくはO(CH₂)_nCH₃、ここでn=1〜3である； CHNH₂(CH₂)_nR₅、ここでn=1〜7であり、そしてR₅は、CH₃、OH、CONH₂、C₆H₄OH 、もしくはCONHNH₂である； (CH₂)_nR₆、ここでn=1〜9であり、R₆は、インドール基、NCH₃C(=NH)NH₂、SCH₃ 、NH₂、CH₃、CO₂H，CONH₂、もしくはNHC(=NH)NH₂である； (CH₂)_nCHNH₂CO₂H、ここでn=1〜8である； CH(CO₂H)NHCONH₂；または C₅H₄Nであり；そしてここで、R₂は、H、CH₃、(CH₂)_nCH₃、ここでn=1〜8、または(CH₂)_xO(CH₂)_yCH₃ もしくは(CH₂)_xCO(CH₂)_yCH₃であり、ここで、x+y=2〜7、またはMであり、ここで Mは、金属対イオンまたはアンモニウムであり、ただし、R₁が、(CH₂)₂CH₃、の場合、R₂は、Hではない；あるいは、該第一の物質が、式：を有する少なくとも１つの化学化合物を含み、ここで、R₇は、直鎖または分枝のC₁〜C₅の低級アルキル、アリール、置換低級アルキル、または置換アリールであり；そして R₈は、水素原子、金属対イオン、アンモニウムであり；そして、該外来DNAの導入の後に、該細胞が、該第二の物質と接触され、ここで該第二の物質は、少なくとも１つのスルホン化アミノポリサッカライドを含むか、もしくは該第二の物質は、式：を有する少なくとも１つの化学化合物を含み、ここで、R₁は： CHNH₂R₃、ここで、R₃は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、セリン、スレオニン、メチオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、これらの非天然の光学異性体、3-メチル-L-ヒスチジン、α-ケトグルタル酸、β-アラニン、カルノシン、シトルリン、クレアチン、葉酸、グルタチオン、馬尿酸、ホモセリン、N-カルバミルアスパラギン酸、N-ホルミル-L-メチオニン、オルニチン、およびこれらの光学異性体からなる群から選択されるアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体の側鎖である； C₆H₄R₄、ここでR₄は、H、CH₃、(CH₂)_nCH₃、NH₂、COCH₃、CO(CH₂)_nCH₃、C(CH₃)₃ 、CH(CH₃)₂、(CH₂)_nCH(CH₃)₂、(CH₂)_nCOCH₃、OCH₃、もしくはO(CH₂)_nCH₃、ここでn=1〜3である； CHNH₂(CH₂)_nR₅、ここでn=1〜7であり、そしてR₅は、CH₃、OH、CONH₂、C₆H₄OH 、もしくはCONHNH₂である； (CH₂)_nR₆、ここでn=1〜9であり、R₆は、インドール基、NCH₃C(=NH)NH₂、SCH₃ 、NH₂、CH₃、CO₂H、CONH₂、もしくはNHC(=NH)NH₂である； (CH₂)_nCHNH₂CO₂H、ここでn=1〜8である； CH(CO₂H)NHCONH₂；または C₅H₄Nであり；そしてここで、R₂は、H、CH₃、(CH₂)_nCH₃、ここでn=1〜8、または(CH₂)_xO(CH₂)_yCH₃ もしくは(CH₂)_xCO(CH₂)_yCH₃であり、ここで、x+y=2〜7、またはMであり、ここで Mは、金属対イオンまたはアンモニウムであり、ただし、R₁が、(CH₂)₂CH₃、の場合、R₂は、Hではなく；あるいは、該第二の物質が、式：を有する少なくとも１つの化学化合物を含み、ここで、R₇は、直鎖または分枝のC₁〜C₅の低級アルキル、アリール、置換低級アルキル、または置換アリールであり；そして R₈は、水素原子、金属対イオン、アンモニウムである、方法。４５．前記第一の物質が、安息香酸緩衝液であり、そして前記第二の物質が、コンドロイチン-6-硫酸である、請求項４４に記載の方法。４６．前記第一の物質が、安息香酸および4-エチル安息香酸を含み、そして前記第二の物質が、安息香酸緩衝液およびコンドロイチン-6-硫酸を含む、請求項４４に記載の方法。４７．前記第一の物質が、安息香酸緩衝液およびグルタミン酸を含み、そして前記第二の物質が、コンドロイチン-6-硫酸を含む、請求項４４に記載の方法。４８．前記細胞が、前記外来DNAの該細胞への導入の前に、前記第一の物質と約2 0〜24時間接触される、請求項４５に記載の方法。４９．前記物質が、安息香酸および4-エチル安息香酸；または安息香酸緩衝液およびコンドロイチン-6-硫酸；または安息香酸緩衝液およびグルタミン酸；またはグルタチオン、メチオニン、グリシン、α-アミノ-n-ブチル酸、タウリン、フエニルアラニン、安息香酸緩衝液、およびアラニンである、請求項１に記載の方法。５０．前記硫酸化アミノポリサッカライドが、N-アセチル化アミノポリサッカライドを含む、請求項１８に記載の方法。５１．前記N-アセチル化アミノポリサッカライドが、コンドロイチン-6-硫酸またはグアランである、請求項５０に記載の方法。