JP2000505474A

JP2000505474A - 抗菌剤及び抗癌剤としてのヘキサヒドロルプロンの利用

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Publication number: JP2000505474A
Application number: JP9531114A
Authority: JP
Inventors: ナッター，ルイーズ; オー．ンゴ，エミリー; ジェイ．マナリング，ギルバート; ステファン，トーマス
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 1996-02-27
Filing date: 1997-02-27
Publication date: 2000-05-09
Also published as: WO1997031630A1; US6313178B1; US5827895A; CA2247370A1; EP0885003A1

Abstract

(57)【要約】本発明は癌細胞増殖を阻害するのに有効な量の水素化ルプロン又はその誘導体もしくは類似体を含んでなる薬理組成物及びその利用方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】抗菌剤及び抗癌剤としてのヘキサヒドロルプロンの利用発明の背景癌の処置及び／又は治療はかなり研究されており、多種多様な治療法において全盛を極めている。癌は典型的には手術、放射線及び化学治療により、単独で、又はとりわけ薬剤、生物剤、抗体及び放射活性免疫コンジュゲートを採用する様々な療法と組合されて処置されている。癌処置の共通の目標は、正常組織及び細胞に対する毒性による望ましくない又は生命に脅威的な副作用を最少限にして癌性腫瘍及び細胞を排除又は改善することにあり、又そうあり続けている。しかしながら、幾多の研究にもかかわらず、これらの目標はほとんど達成されていない。有効な非侵襲性薬剤療法が開発されたとしても、固体悪性腫瘍及び血液悪性障害を有する患者は往々にして多重薬剤耐性にかかってしまう。現状の療法は癌細胞が耐性となり始めた１もしくは複数種の抗癌薬の用量を増やして投与すること及び／又は薬剤耐性細胞における薬剤蓄積欠陥を復帰させるようにデザインされた因子の投与を包括する。しかしながら、これらの療法は患者への毒性の危険性により制約されている。ホップに由来するアルファー及びベーター酸は微生物の増殖を阻害する能力を有する。これらの酸のいくつかは抗菌剤及び抗真菌剤として使用されている。更に、アルファー酸（フムロンとしても知られる）はマウスにおいて12−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−13−アセテートの腫瘍促進効果を阻害することが示されている（Yasukawaら、Oncology 52:156-158(1995))。コルプロンはHela細胞、CEM白血病細胞並びにアドリアマイシン及びビンブラスチン耐性CEM細胞に対して活性であることが報告されている(Manneringら、Food，Nutrition and Chemic al Toxicity，Parkeら、編、Smith Gordon G.B.（1993）at ch.28)。従って、最少限の副作用を有し且つ多重薬剤耐性癌細胞に対しても有効である癌処置用の新規、且つ有効な薬剤療法についてのニーズが存在する。発明の概要本発明は癌細胞の増殖を阻害し、これにより癌を処置する方法であって、癌に冒された哺乳動物に有効量の次式の化合物（式中、Ｒは（Ｃ₃−Ｃ₈）アルキル、好ましくは−CH₂CH(CH₃)₂，−CH(CH₃)₂又は−CH(CH₃)CH₂CH₃である）又はその薬理学的に許容される塩を投与することを含んで成る方法を提供する。本発明の好適な態様において、Ｒは−CH(CH₃)₂である。本発明は更に有効量の式（Ｉ）の化合物と細菌細胞とを接触させることにより細菌細胞の増殖を阻害する方法を提供する。本発明は更に薬理組成物、例えば局所投与用に仕上げられた組成物であって薬理学的に許容される担体と組合さった有効量の式（Ｉ）の化合物を含んで成る組成物を提供する。本発明の化合物はグラム陽性菌、例えばミコバクテリア（mycobacterium）株、例えば薬剤耐性Ｍ．ツベルキュロシス(M．tube rculosis）株又はミコバクテリア・アビアン（Mycobacterial avian)複合体（MH C)に対して極めて有効である。これらの化合物はメトシリン耐性Ｓ．アウレウス（S．aureus）等のＳ．アウレウスに対しても活性である。本明細書において用いる語アルキルは枝分れ及び直鎖アルキル基、並びにシクロアルキル及び（シクロアルキル）アルキルを包括する。図面の簡単な説明図１はスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)に対するHHC の活性を示す。発明の詳細な説明本発明は所定のβ−酸の利用を介する癌細胞の殺傷及び／又はその増殖の阻害の方法を提供する。好適な態様において、本方法はルプロン又はその類似体を利用する。一般に好適なのはルプロンの水素化誘導体であり、例えば次式の化合物（式中、Ｒは（Ｃ₃−Ｃ₈）アルキル、好ましくは−CH₂CH(CH₃)₂(ヘキサヒドロルプロン)、−CH(CH₃)₂（ヘキサヒドロコルプロン又は「HHC」）又は−CH(CH₃)CH₂ CH₃(ヘキサヒドロアドルプロン)である）又はその薬理学的に許容される塩を利用する。本発明の好適な態様において、Ｒは−CH(CH₃)₂である。この化合物は１又は複数の式（Ｉ）の化合物を含んで成る混合物として投与してもよい。式（Ｉ）の化合物の互変異性体も本方法の範囲に属する。ベーター酸（ルプロンとしても知られる）、そして特にテトラヒドロイソフムロン及びヘキサヒドロコルプロンは食品病原体、例えばリステリア・モノムサイトジエンス(Listeria monomcytogenes)(米国特許第5,286,506号；5,455,038号) の増殖を阻害できる。更に、ヘキサヒドロルプロンは一定のラクトバシリ（Lact obacilli）の増殖を阻害する（米国特許第5,082,975号）。しかしながら、水素化ルプロンの抗腫瘍作用は今までに報告されていない。これらの化合物は非常に有効な細胞増殖抑制剤及び細胞障害剤であることが見い出された。例えば、ヘキサヒドロコルプロンはヒト乳腺癌腫細胞、ヒト急性リンパ芽球白血病細胞、ビンブラスチン耐性細胞、ヒトバーキットリンパ腫細胞、ヒト口内類表皮癌腫細胞及びヒト頸部類上皮癌腫細胞に対して細胞障害効果及び／又は細胞増殖抑制効果を有することが見い出された。ヘキサヒドロコルプロン（HHC）は薬剤耐性ヒト癌細胞系列、例えばビンブラスチン耐性ヒト急性リンパ芽球白血病細胞に対する有効性も実証されている。抗癌化合物に対する多重薬剤耐性は癌の化学療法における最も恐ろしい問題の一つである。その広域な抗癌活性に加えて、本発明の化合物はその比較的低いIC₅₀濃度（IC₅₀はin vitroアッセイで癌細胞を50％殺すのに必要な化合物の濃度を示す）により示される通り、その高い効能に基づき潜在的な臨床用途を有する。更に、一般に認定されている安全なホップエキスの誘導体として、HHCは摂取したときに無視できるほどの毒性であると考えられ、数多くの現存の化学療法剤より有利である。水素化ルプロンはその非水素化親化合物よりも活性且つ安定であると考えられる。例えば、ヘキサヒドロコルプロンはコルプロンよりも活性であり（前掲のManneringら、参照）、一方ヘキサヒドロルプロンはルプロンよりも安定であることが見い出されている(Carson，J.Amer.Chem.Soc．73:1850-1852(1 951))。本発明によれば、癌細胞は有効な量の式（Ｉ）の化合物を癌に冒された哺乳動物に投与することにより阻害される。「有効な量」とは究極的には癌細胞の増殖阻害又は殺傷のいづれか処置の目標であるかに依存するであろう。しかしながら、本明細書に記載の通り、適切な用量は１日当り体重１kgにつき約0.5〜約100mg の範囲であろう。本明細書に記載の組成物は固体哺乳動物腫瘍又は血液悪性腫瘍の処置において有効であると信じられ、そしてその中には多重薬剤耐性を発症せしめうるものが含まれる。このような固形腫瘍には頭及び首、肺、中皮、縦隔、食道、胃、膵臓、肝・胆汁系、小腸、結腸、直腸、肛門、腎臓、尿管、膀胱、前立腺、尿道、陰茎、精巣、婦人科学器官、卵巣、乳、内分泌系、皮膚中枢神経系の癌；軟質組織及び骨の肉腫；並びに皮膚及び眼内起源の黒色腫が含まれる。血液悪性腫瘍には子供白血病及びリンパ腫、ホジキン病、リンパ細胞及び皮膚起源のリンパ腫、急性及び慢性白血病、血漿細胞新生形成及びAIDS関連癌が含まれる。処置に関して好適な哺乳動物種はヒト及び家畜動物である。何ら特定の作用メカニズム論に拘束されるわけではないが、蛍光活性化セルソーティング（FACS）法を利用した事前の結果はHHCが細胞サイクルのＧ１−Ｓ相転移に対して効果を有することを示唆する。その他の研究は癌細胞に対するHHC の細胞障害作用がDNA，RNA又はタンパク質合成に対する主要効果に基づかないことを示唆する。本発明の別の態様において、式（Ｉ）の化合物又はその塩又はその薬理組成物を細菌細胞の増殖を阻害するのに用いる。好適な方法において、この細菌はグラム陽性菌である。より好適な態様において、このグラム陽性菌はスタフィロコッカス・アウレウスである。別の好適な態様において、この細菌はミコバクテリアである。より好適な態様において、このミコバクテリアはツベルキュロシス又はミコバクテリア・アビアン複合体（MHC）である。本発明の更なる態様において、式（Ｉ）の化合物又はその塩又はその薬理組成物は例えば下記の実施例VIIに示す通り殺寄生物剤として有用である。本発明の化合物は住血鞭毛虫類、例えばレイシュマニア（leishmania）に対して利用できうる。ヘキサヒドロルプロンはホップの構成成分である（5〜7％まで）ルプロンの水素化誘導体である。ヘキサヒドロコルプロンは当業界公知の数多くの方法を利用してコルプロンの化学水素化を介して構築できうる。例えば、水素化はRiedl（B er．89:1863(1956))又はCarson（J.Am.Chem.Soc．73:1850(1951)）に記載の通りにして触媒として酸化プラチナ（IV）を用いて達成できうる。好適な方法において、ベーター酸は米国特許第4,918,240号に記載の通りに精製され、そして米国特許第5,082,975号に記載の通りにして水素化される（双方とも引用することで本明細書に組入れる）。ベーター酸を精製する好適な方法に従うと、パラジウム又はプラチナ触媒毒は、水性アルカリ性ベーター酸溶液をpH 約10以上、好ましくは約11〜12.9においてパラジウム及びプラチナ以外の多価金属の存在下で撹拌することによりその溶液から除去する。不溶性触媒毒含有材を次に分離する。好ましくは、使用する多価金属は食することのできる金属イオン、好ましくはマグネシウム及びカルシウムであり、そして更には亜鉛、アルミニウム又は鉄であってもよい。好ましは、pHは約11〜12.9とする。溶媒は触媒毒を除く必要はないが、水混和性食品級の溶媒が使用されうる。その例には炭化水素、例えばヘキサン、エステル、液状脂肪アルコール、及びテルペン、例えばリモネンが含まれる。水素化工程の準備において、精製ベーター酸はCowles（米国特許第4,590,296 号）のCO₂法によりアルカリ水性相から回収し得る。他方、ベーター酸溶液をほぼ等容量の有機溶媒、例えばヘキサンと混合する、ベーター酸はリン酸の如き酸を用い約9.5〜9.8のpHが達せられるまで撹拌しながらゆっくり酸性化することにより溶媒の中に抽出する。実質的に全てのベーター酸がこの手順により水性相から除去される。次いでベーター酸は当業界公知の手順により部分エバポレーション及び冷却により、又は真空下でのヘキサンの除去により溶媒から回収できうる。任意の公知の水素化の方法が利用できうるが、高純度のベーター酸を供するのが好ましい。好ましくは、精製したベーター酸を非酸性条件下で水素化する。好適な方法に従うと、ベーター酸を溶媒及び水に溶解する。任意の無毒で非反応性の溶媒、例えば低級アルコール、水混和性有機溶媒又はTHFを使用してよい。水素化触媒、例えばパラジウム又はプラチナを使用してよい。反応槽を真空にし、水素を導入し、そして水素の吸収が止まるまで反応槽を撹拌する。水素化生成物で濾過して触媒を除去する。次に水及び炭化水素溶媒、例えばヘキサンの溶液を加える。この混合物を撹拌し、そして水素化ベーター酸をヘキサン相の中に抽出する。ヘキサンの部分エバポレーションの後、この混合物に種結晶を加え、冷却し、生成物を結晶化させる。純粋な水素化ベーター酸へと変換させるため、使用する最小pHは約３、好ましくは４より高くし、最も好ましい範囲は約７〜９である。水素化速度は追加量の触媒の使用又は温度上昇により加速しうる。ヒドロルプロンの水性液体水性溶液は米国特許第5,082,975号に記載の通りにして調製し得る。他方、水を含むものは含まないプロピレングリコール、グリセリン、類似の安定アルコール及びポリオール、又はそれらの混合物を水性溶液の水と置換してよい。更に、上記の水性溶液はグリコール又はグリセリン等と混合して当該生成物の標準化溶液にしてよく、それは水に容易に分散可能であり、また安定である。本明細書に記載の生物活性化合物の薬理学的に、許容される塩を請求の範囲の方法を実施するうえで同様に使用してよい。薬理学的に許容される塩は有機又は無機塩基、例えばNaOH，Na(CO₃)₂，NaHCO₃，KOH、アミン等を利用して生成してよい。本明細書に記載の化合物及び／又はその塩は純粋な化合物として投与してよいが、当該活性成分を薬理組成物を供することが好ましい。従って本発明は更に１もしくは複数種の化合物及び／又はその薬理学的に許容される塩と１もしくは複数種のその薬理学的に許容される担体、並びに任意的にその他の治療及び／もしくは予防成分とを含んで成る薬理組成物の利用を提供する。この担体は当該組成物のその他の成分との混和性の観点で「許容される」ものでなくてはならず、且つその受容者に有害であってはならない。薬理組成物には経口又は非経腸（筋肉内、皮下及び静脈内を含む）投与に適するものが含まれる。当該組成物は、適宜、独立単位投与形態で供されるのが好都合であり、そして薬品業界において公知の任意の方法により調製し得る。かかる方法は活性化合物を液体担体、固体マトリックス、半固形担体、細分化固体担体又はそれらの組合せと一緒にし、次いで適宜生成物を所望のデリバリーシステムに成形する工程を含む。かかる方法は更に当業界公知の方法により治療的に有効な量の活性成分をリポソーム内に封入することも含む。経口投与に適する薬理組成物は独立単位投与形態、例えばそれぞれ所定量の活性成分を含む硬質又は軟質ゼラチンカプセル、カシェ剤又は錠剤として；粉末として、リポソーム調製品として、又は顆粒として；溶液として、懸濁物として、又はエマルションとして供されうる。口内局所投与に適する組成物には単位投与形態、例えばフレーバーベース、通常はスクロース及びアカジア又はトラガカンス内に活性成分を含んで成るロゼンジー；不活性ベース、例えばゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシア内に活性成分を含んで成るパスチル；適当な液体担体内に活性成分を含んで成る粘膜収着ゲル及びマウスウォッシュが含まれる。所望するなら、上記の組成物は例えば天然ゲル、合成ポリマーゲル又はそれらの混合物等を含んで成る一定の親水性ポリマーマトリックスとの組合せにより、採用する活性成分の徐放を供するように仕上げてよい。表皮への局所投与のため、活性成分はオイントメント、クリーム又はローション、又はパッチとして配合してよい。オイントメント及びクリームは、例えば適当な増粘剤及び／又はゲル化剤の添加を伴い、水性又は油性ベースと配合してよい。ローションは水性又は油性ベースと配合してよく、そして一般に１又は複数種の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、又は着色剤も含むであろう。活性成分は例えば米国特許第4,140,122；4,383,529；又は4,051,842号に開示のようにして適当なリザーバーからイオン導入法を介して導入することもできる。当該活性成分は経皮投与のためにパッチを介して導入することができる。適当な経皮デリバリーシステムは例えば米国特許第4,788,603号、同第4,931,279号；同第4,668,506号、同第4,713,224号及び同第5,560,922号に開示されている。経皮デリバリー用のパッチは裏地層及びポリマーマトリックスを含んで成ってよく、その中に有効量の活性成分が１又は複数種の皮膚浸透増強剤と共に分散又は溶解されている。当該裏地層は任意の適当な材料であって本発明の類似体又は誘導体が不透過性である材料より成っていてよい。この裏地層はマトリックス層の保護カバーを担い、そして支持機能を供する。この裏地はポリマーマトリックスと本質的に同サイズの層となるように成形するか、又はポリマーマトリックスの側部を張り出しているかもしくはポリマーマトリックスの１もしくは複数の側部に重なり、裏地層の張り出し面が接着手段のための土台となるように外側に張り出すことができるような大きめの寸法となるように成形してよい。他方、このポリマーマトリックスは接着ポリマー、例えばポリアクリレート又はアクリレート／酢酸ビニルコポリマーを含む、又はそれらが配合されていてよい。長期適用のため、皮膚の水和又は浸柔が最少限となるように微孔質及び／又は呼吸可能な裏地ラミネートを利用することが所望されうる。裏地層を作成するのに適当な材料の例は高密度及び低密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリビニルクロリド、ポリエステル、例えばポリ（エチレンフタレート）、金属ホイル、かかる適当なポリマーフィルムの金属ホイルラミネート等である。好ましくは、裏地層のために使用する材料はかかるポリマーフィルムと金属ホイル、例えばアルミニウムホイルとのラミネートである。かかるラミネートにおいて、ラミネートのポリマーフィルムは通常接着ポリマーマトリックスと接しているであろう。この裏地層は所望の保護及び支持機能を供するであろう任意の適当な厚みであってよい。適当な厚みは約10〜約200ミクロンであろう。一般に、生物学的に許容される接着ポリマー層を形成するのに使用するこれらのポリマーは成形本体、薄壁又はコーティグであって治療剤がコントロールされた速度及び通過しうるものを成形可能なものである。適当なポリマーは生物学的及び薬理学的に適合性であり、非アレルゲン性であり、そして当該製剤の接触する体液又は組織と適合性である。可溶性ポリマーの利用は避け、なぜなら皮膚水分によるマトリックスの溶解又は浸食は治療剤の放出速度及び投与単位が簡単に取外しできるように設置される能力に影響を及ぼすであろうからである。接着ポリマー層を構築するための典型的な材料にはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、エチレン／プロピレンコポリマー、エチレン／エチルアクリレートコポリマー、エチレン／酢酸ビニルコポリマー、シリコーンエラストマー、特に医薬級ポリジメチルシロキサン、ネオプレンゴム、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、塩素化ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマー、架橋化ポリメタクリレートポリマー（ヒドロゲル）、ポリ塩化ビニリデン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ブチルゴム、エピクロロヒドリンゴム、エチレンビニルアルコールコポリマー、エチレンビニルオキシエタノールコポリマー；シリコーンコポリマー、例えばポリシロキサン−ポリカーボネートコポリマー、ポリシロキサンポリエチレンオキサイドコポリマー、ポリシロキサン−ポリメタクリレートコポリマー、ポリシロキサン−アルキレンコポリマー（例えばポリシロキサン−エチレンコポリマー）、ポリシロキサン−アルキレンシランコポリマー（例えばポリシロキサン−エチレンシランコポリマー）、等；セルロースポリマー、例えばメチル又はエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びセルロースエステル；ポリカーボネート；ポリテトラフルオロエチレン、等が含まれる。好ましくは、生物学的に許容される接着ポリマーマトリックスはガラス転移温度が室温より低いポリマーから選ばれるべきである。このポリマーは、必須ではないが、室温にて結晶性をある程度有してよい。架橋性モノマー単位又は部位をかかるポリマーに組込んでよい。例えば、架橋性モノマーをポリアクリレートポリマーに組込んでよく、それは治療剤をポリマーの中に分散させた後にマトリックスの架橋のための部位を担う。ポリアクリレートポリマー用の公知の架橋性モノマーにはポリオールのポリメタクリル系エステル、例えばブチレンアクリレート及びジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート等が含まれる。かかる部位を供するその他のモノマーにはアリルアクリレート、アリルメタクリレート、ジアリルマレエート等が含まれる。好ましくは、可塑剤及び／又は保湿剤を接着ポリマーマトリックス内に分散させる。水溶性ポリオールが一般にこの目的に適する。製剤への保湿剤の組込みは投与単位が皮膚の表層に収着することを可能にし、このことは皮膚の刺激を抑え、そしてデリバリーシステムの接着ポリマー層が不良化するのを防ぐ。経皮デリバリーシステムから放出される治療剤は皮膚の各層に浸透できるものでなくてはならない。治療剤の浸透速度を高めるため、浸透剤、例えば脂肪アルコール又はグリコール、例えばプロピレングリコールを皮膚の最外層である角質層への治療剤の浸透を高めるのに使用してよい。活性剤又は誘導体は吸引もしくは吸入による投与、又は鼻、眼内もしくはその他の局所（例えば頬及び舌下）投与に適するように配合してもよい。例えば、吸引による上部（鼻）又は下部呼吸管への投与のため、活性剤又は誘導体は吸引器、噴霧器もしくは加圧パック、又はその他のエアゾールスプレーを導入するための簡単な手段から好適に導入されうる。加圧パックは適当な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又はその他の適当な気体を含んで成ってよい。加圧エアゾールの場合、投与単位は計量された量をデリバリーするバルブを供することにより決定できうる。他方、吸引又は吸入による投与のため、当該活性剤は乾燥粉末組成物の形態、例えば活性剤と適当な粉末ベース、例えばラクトース又はデンプンとの粉末混合物の形態をとってよい。この粉末組成物は単位投与形態、例えばカプセルもしくはカートリッジ、又は例えばゼラチンもしくはブリスターパックにおいて供してよく、それより粉末は吸引器、吸入器又は計量投与吸入器の助けを借りて投与されうる。鼻内投与のため、当該活性剤はノーズドロップ、液体スプレーを介して、例えばプラスチックボトルアトマイザー又は計量投与吸引器を介して投与されうる。アトマイザーの典型例はMistometer(登録商標)(Wintrop)及びMedihaler(登録商標)(Riker)である。本発明に係る薬理組成物はその他のアジュバント、例えば風味料、着色料、抗菌剤又は保存剤も含んでよい。処置に必要とされる当該化合物又はその塩もしくは誘導体の量は選定した特定の塩のみならず、投与ルート、処置すべき症状の種類及び患者の症状により変わり、そして最終的にはかかりつけの医師又は臨床技師の判断によるであろう。しかしながら、一般に適切な用量は、１日当り体重１kgにつき約 0.5〜約100mg／kg、例えば約10〜約75mg、例えば１日当り受容者の体重１kgにつき３〜約50mg、好ましくは６〜90mg／kg／日の範囲、最も好ましくは15〜60mg ／kg／日の範囲であろう。当該化合物は好都合には単位投与形態で投与し、これは例えば単位投与形態当り５〜1000mg、好都合には10〜75mg、最も好都合には50〜500mgの活性成分を含む。事実、当該活性成分は約0.5〜約75μＭ、好ましくは約１〜50μＭ、最も好ましくは約２〜約30μＭの活性化合物ピーク血漿濃度を達成せしめるように投与すべきである。これは例えば任意的に食塩水中の0.05〜５％の活性成分溶液の静脈内注射により、又は約１〜100mgの活性成分を含むボーラスとしての経口投与により達成し得る。所望の血液レベルは約0.01〜5.0mg／kg／hrを供する連続点滴により、又は約0.4〜15mg／kgの活性成分を含む断続点滴により維持し得る。所望の用量は好都合には一回の投与で供するか、又は適当な間隔で、例えば１日当り２回、３回、４回もしくはそれより多くのサブ投与にて分割投与してよい。サブ投与自体をいくつかの独立した適当に間隔を置いた投与に更に分けてよい。例えば、吸入器からの数回の吸入又は目への数回の点眼適用の如きである。本明細書に記載の全ての公開物、特許、特許書類は引用することで本明細書に組入れる。本発明を様々な実施例で例示するが、それらは本発明を限定するものではない。下記の実施例は本発明を限定することなく例示する。実施例実施例Ｉ−細胞増殖抑制活性 HHCをトリパンブルー排除アッセイを利用して細胞増殖抑制活性について試験した。このアッセイの目的は細胞をHHCに連続曝露したときに細胞増殖が50％阻害される(即ち、ID₅₀）HHCの濃度を決定することにある。２×10⁵ 個の細胞／mlの混合物５mlをＴ−25フラスコの中に入れた。HHC又はコントロール（HHCなし又はDMSOビヒクル)を加えた。細胞を５％のCO₂下で37℃で24又は48 時間インキュベーションした。付着する単層細胞は、細胞の付着を可能にするためにHHCの添加前は少なくとも14時間インキュベーションする必要がある。細胞は（付着細胞を）パンクリアチン処理する又は（未付着細胞を）よく懸濁することにより脱離させる。100μｌのサンプルを細胞懸濁物から取り出し、そしてボロシリケートガラス試験管に入れた。100μｌの0.4％のトリパンブルー溶液(リン酸緩衝食塩水中のトリパンブルー(Sigma))を細胞懸濁サンプルに加え、そしてよく混合した。細胞をヘモサイトメーターを利用して計測した。ID₅₀は50％阻害を下まわる薬剤濃度及び50％阻害を上まわる薬剤濃度を選定し、そして50％阻害に相当する値を外挿することにより計算した。下記の式を利用した：％阻害＝100−％増殖ここで％増殖＝〔(Ｃ₁−Ｃ₀)／(Ｃ_t1−Ｃ₀)〕×100であり、ここでＣ₀は「０」時での細胞計測数；Ｃ₁は「ｔ」時でのHHC処理サンプルの細胞計測数；そしてＣ_t1は「ｔ」時でのコントロールサンプルの細胞計測数である。表Ｉは様々な癌細胞系に対するHHCの活性に基づくデーターを示す。MCF-7細胞はヒト乳腺癌腫細胞であり、分化した哺乳動物上皮細胞のいくつかの特徴を有する（即ち、ドーム形成及び細胞質エストロゲンレセプターを介するエストラジオールプロセシング）。CEM細胞はヒト急性リンパ芽球白血病細胞であり、これは形態学的にリンパ芽球細胞に似ている。CIMビンブラスチン耐性細胞はＰ−糖タンパク質を含み、従ってそれらは幾多の構造的に無縁な化合物に対して多重薬剤耐性を発揮する。Raji細胞はヒトリンパ腫細胞であり、リンパ芽球様である。 KB細胞はヒト口内類表皮癌腫細胞である。HeLa S3細胞はヒト頸部類上皮癌腫細胞である。 ¹インキュベーション時間＝48ｈ；²インキュベーション時間＝24ｈ。結果が示している通り、HHCは多種多様な癌細胞タイプに対して有効且つ有能な細胞増殖抑制剤である。実施例II−細胞障害活性 HHCは18時間パルス曝露を利用するコロニー形成アッセイを利用して細胞障害活性について試験した。クローン原性アッセイの目的は細胞を所定の時間HHCに曝露したとき（即ち、生体異物に対するパルス曝露）に細胞増殖を50％阻害する (即ち、IC₅₀)２HHC濃度を決定することにある。２×10⁵個の細胞／ml(MCF-7細胞)の混合物５mlをRPMI（Gibco）培地の入った4 T-25フラスコをそれぞれに入れた。細胞を５％のCO₂下で少なくとも14時間37℃ でインキュベーションし、細胞を付着させた。細胞に０，1.5及び25μＭの濃度のHHC又はDMSOを18時間パルスした。培地をフラスコから取り出し（即ち、浮遊細胞）、そして15mlのポリプロピレン遠沈管１〜４に入れた（表IIにまとめる）。フラスコを１mlのPBSで洗い、そして洗浄液を適切な管１〜４に入れた。管１〜４を150rpmで遠心分離し、そして培地をアスピレーションした。細胞をパンクレアチン処理によりフラスコから脱離させた。フラスコ由来の約１mlの細胞懸濁物を適切な管（１〜４）に加え、そしてペレットを懸濁した。管１〜４の中の細胞をフラスコ中の細胞と共にプールした細胞を再懸濁した。フラスコ由来の１mlの細胞懸濁物を９mlの培地と共に適当な10×管（管５〜８）に加え、そしてよく懸濁した。各10×管中の１mlの懸濁物を４mlの培地と共に適当な50×管（管９〜12）に入れた。 ^aチューブ番号 ^b 〔HHC〕＝０オリジナルの細胞懸濁物内（即ち、フラスコ内）の細胞をトリパンブルー排除アッセイ（実施例IIに記載）を利用して計測した。この計測に基づき、50×管中の細胞数を計算した。約5400個の細胞を獲得するために必要な容量を決定した。この容量を50×懸濁物から取り出し、そして50mlのポリプロピレン管（管13−16 ）に入れた。培地を加え、18mlの容量にした。次いで細胞を懸濁した。各管13〜16由来の懸濁物５mlを60×15mmの組織培養皿に移した（トリプリケートで）。細胞を50個以上の細胞のコロニーができるまで（約６〜８日）インキュベーションした。細胞をギムザ染色液(100％のメタノール中の１％のギムザ染色液(Sigma)の溶液)で染色した。培養皿をインキュベーターから取り出し、そして培地をアスピレーションした。皿をリン酸緩衝食塩（３〜４ml）で２回洗浄した。皿の底部をカバーするのに十分の量の３〜４mlのエタノールを各皿に加え、30分放置した。染色液を冷水で洗い流した。コロニーが失われないようにして水を注ぎ出した。プレートを逆さにし、そして乾燥させた。50個以上の細胞より成るコロニーの細胞を計測した。ID₅₀は実施例IIに記載の通りに決定した。データーを表IIIに示す。データーが示すように、HHCはMCF-7癌細胞を低用量で有効に殺傷することができる。事前のデーターはC1300細胞（マウス神経芽細胞）に対するHHCのin vitro ID₅ ₀ が48時間の連続曝露の後約1.94μＭであることを示唆した。実施例III−in vivo研究 HHCの最大寛容用量(MTD)はBDF1マウスにおいてi.p.注射により決定した。マウスは見かけ上の副作用なしで200μモラーのHHC当量に対して寛容できた。実施例IV−作用メカニズムの決定蛍光活性化セルソーティング（FACS）を利用し、細胞の何パーセントが48時間の連続HHC曝露を経て表示の細胞サイクル段階において見い出せうるかを決定した。細胞及びその遺伝子材料の倍化に至る４通りの細胞サイクル期がある。Ｇ０／Ｇ１期においては細胞は休止しているか、又は混合生合成機能を行っている。Ｓ期の間は染色体の複製に至るDNA合成が行われている。Ｇ２は前有糸分裂間隔であり、Ｍ期は細胞が分裂する時期である。細胞を1.5μＭ及び25μＭの濃度のHHC並びにDMSOに曝露した。DMSOは細胞サイクルに対して有意義な効果を有さず、そのプロフィールは「薬剤なし」のコントロールのそれとほとんど同じであった。結果は低〔HHC〕（即ち、1.5μＭ）がＧ０／Ｇ１における細胞数を増やし、そしてＳ期における細胞数を減らすことを示した。高〔HHC〕（即ち、25μＭ）では、Ｇ０／Ｇ１期における細胞数の減少があり、そしてＳ期における細胞数の増加があった。これはHHCが細胞サイクルのＧ１−Ｓ期転移に対して見かけ上の効果を有することを示唆する。実施例Ｖ−抗菌活性（スタフィロコッカス・アウレウス）スタフィロコッカス・アウレウスの単一コロニーを細菌シェーカーの中で強力に撹拌しながら２mlのLuria-Bertani(LB)培地の中で37℃で一夜増殖させた。0.5 mlの培養物を250mlのLBに移し、そしてOD₆₀₀(光学密度)値が約0.2となるまで37 ℃で増殖させた（1 OD₆₀₀値は約８×10⁸個の細胞／mlの細胞濃度を示す）。培養物を管当り13mlの細菌培養物を含む50mlの管に小分けした。0.5，1.0，2.5，5.0 ，10及び25μＭのHHCを管に加えた。薬剤なし及びDMSO溶媒をコントロールとして用いた。細菌培養物のアリコートを２時間毎に取り出し、OD₆₀₀値を得た。結果が示すには（図１）、HHCは細菌増殖の有効なインヒビターである。実施例VI−抗菌活性（Ｍ．ツベルキュロシス）薬剤感受性はBACTEC法を利用して試験した（Siddigi，BACTEC TB System Prod uct and Procedure Manual，Becton Dickinson Corp (1989); Inderlied，Antimycobacterial Agents in Antibiotics in Laboratory Medicine，ed．Lorian，3rd edition，Williams and Wilkins）。HHCの入った及び入っていない液体培地中のミコバクテリアの増殖曲線を４〜12日間プロットする。耐性は１％比例方法の改良により決定する。コントロールバイアルに１： 100の希釈率の生物を接種し、そしてHHCの入ったバイアルより高い増殖速度は感受性の徴候と解釈した。耐性は99％未満の生物がHHCにより阻害される場合に認められる。材料：１）BACTEC 12Bバイアル２）HHC ３）特製希釈用流体（DF）：0.2％の脂肪酸フリー牛血清アルブミン及び0.02 ％のポリソルベート80；水に希釈し、pH 6.8±0.2に調整し、下記のアリコートに分注して滅菌：ａ）3.0ml；８〜10個のガラスビーズ入り（１〜２mm／ea）；ｂ）1.5ml；ｃ）9.9ml；及びｄ）9.0ml ４）上記（３）と同じ管内の0.5Mc Farland標準品５）ディスポーザブル滅菌培養ループ６）1.0mlのツベルクリンシリンジ；固定式２２−２６ゲージ針付き７）個装アルコールワイプ８）ボルテックスミキサー９）ATCC 27294（S.I.R.E.感受性Ｍ．ツベルキュロシス）一定量のATCC 27294増殖物を滅菌アプリケータースティックで固体培地から取り、そしてガラスビーズ及びDFの入った管に入れる。細菌塊を乳化するのにボルテックスを用いる。この懸濁物0.1mlを新しいプレガスBACTECバイアルを接種するのに用いる。バイアルを 37℃インキュベーションし、そして毎日モニターする。培養物は増殖指数（GI）が900〜999に達した日にHHC及びコントロールバイアルへの接種の用意が整う。 999に１日以上なっているバイアルは使用すべきでなく、なぜなら細菌負荷量が高すぎてしまいうるからである。900の指数を下まわる増殖物の接種されたコントロールバイアルは必要とされる12日の実験期間において３０の試験カットオフ値に確実に達しない。ATCC生物のBACTEC〜BACTEC系列転移は実験期間の範囲内で許容される。 BACTECバイアルをBACTEC装置に流し、適当なCO₂レベルを樹立する。HHCをラベルバイアルの中に無菌的に接種する(0.1mlのHHC溶液／バイアル)。各HHCバイアル及び9.9mlのDFを含むDFバイアルに0.1mlのATCC BACTEC培養物を接種する。１：100の希釈率の細菌懸濁物を含んでいるDFバイアルを10回反転させて混合し、そして0.1mlを抜き取り、コントロール12Ｂバイアルに接種する。１：10のコントロールを上記と同じようにして9.0mlのDF及び1.0mlのATCC BACTEC培養物を有するバイアルを用いて作る。全ての試験バイアルを37℃±１℃で４〜12日間、毎日BACTEC装置で読みながらインキュベーションする。バイアルは毎日ほぼ同じ時間に実行しなければならない。試験はコントロールバイアルのGIが30に達し、そして５日以上経過したら終了する。一の値から別の値へのGIにおける変化（デルタ変化）は増殖速度の指標である。変化がコントロールと比べてHHCバイアルにおいて大きいとき、単離物はH HCに対して耐性である；もしほぼ同じなら、単離物は感受性においてボーダーラインにある；そしてもしコントロールより低いなら、単離物はHHCに対して感受性である。HHCバイアルにおけるGIが当初非常に高く(＞300)、そしてコントロールにおけるGIが低いなら、接種物はおそらく塊を含み、従って試験は繰り返す必要がある。コントロールが30に達したとき特定の HHCバイアルにおけるGIが500に達し、そして下降するなら、この単離物はHHCに対して耐性と考えられる。コントロールが30に達する前にHHCバイアルにおけるG Iが900に達し、そして下降するなら、単離物は耐性と考えられる。コントロールが30に達する前にバイアルのGIが900に達したら、接種物は重厚すぎることであり、従って試験は繰り返す必要がある。コントロールが30に達するのと同じ日に GIが999に達し、そしてデルタGIがコントロールより高いなら、耐性を報告できる。しかしながら感受性は999の値では決定できず、そして試験は繰り返す必要がある。HHCバイアルについてのデルタGIがコントロールのデルタGIに近いなら（10％）、これは部分的な耐性を示唆し、追加の測定（１〜３日）を行うべきである。１：10のコントロールは標準１％比例方法の一部として利用しないが、標準１％方法では明らかとならないことのある小さめの薬剤効果を測定するためにここに含ませる。実施例VII−レイシュマニアに対するHHCの活性レイシュマニアの直接感受性をグロス阻害を利用して調べた。HHCに対するレイシュマニアの６及び24時間の曝露後、レイシュマニアをホルムアルデヒドで固定し、そしてヘマサイトメーターで計測する。結果は、2.5μＭのHHCに対する24 時間の曝露の後、90％のレイシュマニアの増殖が阻害されたことを示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年３月５日（１９９８．３．５）【補正内容】請求の範囲１．ミコバクタリア・アビウム複合体の増殖を阻害するのに有効な医薬品の調製のための次式（Ｉ）の化合物：（式中、Ｒは(Ｃ₃−Ｃ₈)アルキルである）又はその薬理学的に許容される塩の利用。２．Ｒが−CH(CH₃)₂である、請求項１記載の利用。３．Ｒが−CH₂CH(CH₃)₂又は−CH(CH₃)CH₂CH₃である請求項１記載の利用。４．前記医薬品が２種以上の式（Ｉ）の化合物を含んで成る混合物を含んで成る請求項１記載の利用。５．前記化合物又はその塩を薬理学的に許容される担体と組合せる、請求項１記載の利用。６．前記担体が液体ビヒクルである、請求項５記載の利用。７．前記医薬品を非経腸投与のために仕上げる、請求項６記載の利用。８．前記医薬品を局所投与のために仕上げる、請求項５記載の利用。９．前記医薬品を経皮パッチによる投与のために仕上げる、請求項５記載の利用。 10．前記医薬品をイオン導入による投与のために仕上げる、請求項８記載の利用。 11．前記医薬品を経口投与のために仕上げる、請求項５記載の利用。 12．前記担体がリポソームである、請求項５記載の利用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ンゴ，エミリーオー. アメリカ合衆国，コネチカット 06517, ハンデン，フィットニーアベニュ＃314 1199 (72)発明者マナリング，ギルバートジェイ. アメリカ合衆国，ミネソタ 55113，セントポール，ノースフェアビューアベニュ 1865 (72)発明者ステファン，トーマスアメリカ合衆国，ミネソタ 55414，ミネアポリス＃103，トゥウェンティセブンスアベニュサウスイースト 48

Claims

【特許請求の範囲】１．癌細胞の増殖を阻害するための治療方法であって、癌に冒された哺乳動物に前記癌細胞の増殖を阻害するのに有効な量の次式の化合物（式中、Ｒは（Ｃ₃−Ｃ₈）アルキルである）又はその薬理学的に許容される塩を投与することを含んで成る方法。２．Ｒが−CH(CH₃)₂である請求項１記載の方法。３．Ｒが−CH₂CH(CH₃)₂又は−CH(CH₃)CH₂CH₃である請求項１記載の方法。４．２種以上の式（Ｉ）の化合物を含んで成る混合物を投与することを含んで成る請求項１記載の方法。５．前記癌細胞が多重薬剤耐性である請求項１記載の癌細胞を処置するための方法。６．前記哺乳動物がヒトである請求項１記載の方法。７．前記癌が白血病又は黒色腫である請求項１記載の方法。８．前記癌が固体腫瘍である、請求項１記載の方法。９．前記腫瘍が乳、肺、結腸又は卵巣腫瘍である、請求項８記載の方法。 10．前記化合物又はその塩を薬理学的に許容される担体と組合せた薬理組成物として投与する、請求項１記載の方法。 11．前記担体が液体ビヒクルである、請求項10記載の方法。 12．前記組成物が非経腸投与のために仕上げられている、請求項11記載の方法。 13．前記組成物が局所投与のために仕上げられている、請求項12記載の方法。 14．前記組成物が経皮パッチによる投与のために仕上げられている、請求項13 記載の方法。 15．前記組成物がイオン導入による投与のために仕上げられている、請求項13 記載の方法。 16．前記組成物が経口投与のために仕上げられている、請求項10記載の方法。 17．前記担体が前記量を封入したリポソームである、請求項10記載の方法。 18．癌細胞の増殖を阻害するのに有効な量の次式の化合物（式中Ｒは（Ｃ₃−Ｃ₈）アルキルである）又はその薬理学的に許容される塩及び薬理学的に許容される担体を含んで成る薬理組成物。 19．Ｒが−CH(CH₃)₂である請求項18記載の組成物。 20．Ｒが−CH₂CH(CH₃)₂又は−CH(CH₃)CH₂CH₃である請求項18記載の組成物。 21．請求項18記載の組成物を含んで成る単位投与形態。 22．２種以上の式（Ｉ）の化合物を含んで成る請求項18記載の組成物。 23．前記担体が液体ビヒクルである請求項18記載の組成物。 24．非経腸投与のために仕上げられている請求項18記載の組成物。 25．局所投与のために仕上げられている請求項24記載の組成物。 26．経皮パッチによる投与のために仕上げられている請求項25記載の組成物。 27．イオン導入を介する投与のために仕上げられている請求項24記載の組成物。 28．前記担体が前記量を封入するリポソームである請求項18記載の組成物。 29．細菌の細胞増殖を阻害する方法であって、前記細菌の増殖を阻害するのに有効な量の次式の化合物（式中、Ｒは（Ｃ₃−Ｃ₈）アルキルである）又はその薬理学的に許容される塩を細菌と接触させることを含んで成る方法。 30．前記細菌がグラム陽性菌である、請求項29記載の方法。 31．前記グラム陽性菌がスタフィロコッカス・アウレウスである請求項30記載の方法。 32．前記細菌がミコバクテリアである請求項29記載の方法。 33．前記ミコバクテリアがツベルキュロシスである請求項32記載の方法。 34．細菌感染した哺乳動物における細菌細胞増殖を阻害する治療方法であって、前記細菌の増殖を阻害するのに有効な量の式（Ｉ）の化合物（式中、Ｒは（Ｃ₃−Ｃ₈）アルキルである）又はその薬理学的に許容される塩を投与することを含んで成る方法。 35．前記細菌がグラム陽性菌である請求項34記載の方法。 36．前記グラム陽性菌がスタフィロコッカス・アウレウスである請求項35記載の方法。 37．前記細菌がミコバクテリアである請求項34記載の方法。 38．前記ミコバクテリアがツベルキュロシスである請求項37記載の方法。 39．前記化合物を非経腸的に投与する請求項34記載の方法。 40．前記化合物を局所投与する請求項39記載の方法。 41．前記化合物を経皮パッチにより投与する請求項40記載の方法。 42．前記化合物をイオン導入により投与する請求項40記載の方法。 43．前記化合物を経口投与する請求項34記載の方法。 44．前記量をリポソームに封入する請求項43記載の方法。