JP2000342258A - Ｄｎａ試料調製方法及びｄｎａ試料調製装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 複数のＤＮＡ検体に由来する注目ＤＮＡ断片
種を同じ条件下で同時にＰＣＲ増幅して、複数の注目Ｄ
ＮＡ断片種毎にＰＣＲ産物を分別回収するＤＮＡ試料調
製方法を提供する。 【解決手段】 増幅しようとする複数種類のＤＮＡ断片
にそれぞれ相補な配列を持ち、ＤＮＡ断片の種類毎にそ
れぞれ特異的に結合する特異プライマーを、特異プライ
マーの種類毎に別々に保持する複数の貫通する孔３０１
−１、〜、３０１−９を持つホルダー３０２と、ＤＮＡ
断片の５’末端に導入されたオリゴヌクレオチドの配列
に共通してハイブリダイズする共通プライマーを含むＰ
ＣＲ反応液、及び複数種類のＤＮＡ断片を収納し、ホル
ダーの一方の端部を受け入れる凹部を具備する反応液保
持板３０３とを有し、各孔の内部で、各特異プライマー
と共通プライマーとを対として、ＤＮＡ断片のＰＣＲ増
幅を行ない、ＤＮＡ断片の種類毎のＰＣＲ増幅産物を各
孔の内部で生成する。 【効果】 プライマー同士の干渉を排除できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は複数の検体にそれぞ
れ由来する複数の注目するＤＮＡ断片種の同時ＰＣＲと
ＰＣＲ産物の分別回収法に関し、特に各検体間で注目す
るＤＮＡ断片種の比較を定量的に行なうために必要なＰ
ＣＲ、ＤＮＡ検査、遺伝子診断等のＤＮＡ分析に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子又はＤＮＡ断片の増幅法として知
られているＰＣＲはターゲットＤＮＡにハイブリダイズ
する２種のプライマーを用いて相補鎖合成を繰り返しこ
の２種のプライマーに挟まれたＤＮＡ配列部分のコピー
数を増やす手法である。独立した複数の部位を１つの反
応でＰＣＲ増幅させることが分析上しばしば必要になり
試みられている。しかし、複数対のプライマーを用いて
複数種類のＤＮＡ断片が含まれる試料をＰＣＲ増幅する
と、予定してないプライマーペアでＰＣＲ増幅される断
片が生じたりすることがある。また、各ＰＣＲ増幅成分
を分離しようとすると非常な困難が伴う。そこで１つの
プライマーペアでＰＣＲ増幅できるＤＮＡ断片群だけを
増幅してＰＣＲ産物を分析するか、相互に影響しないプ
ライマーペアだけを選んで複数のＤＮＡ断片をＰＣＲす
ることが行なわれる。

【０００３】一方、複数種類のＤＮＡ断片の比較分析は
重要課題であり、いろいろ検討されている。しかし、Ｐ
ＣＲにおける増幅率は反応条件に強く依存するので、Ｐ
ＣＲ条件の異なる即ち独立に増幅されたＤＮＡ断片群間
の比較は定量的な検討ができない難点があった。ＰＣＲ
に影響を与えるファクターには、反応温度、プライマー
の配列、試薬の量、夾雑物の種類と量、等があり、異な
る反応でこれらファクターを同一条件にするのはかなり
やっかいである。最近、複数のＤＡＮ検体中に含まれる
同種のＤＮＡ断片を定量的に比較分析するためのＰＣＲ
技術が開発された。この方法はＡＴＡＣ ＰＣＲ（ａｄ
ａｐｔｏｒ−ｔａｇｇｅｄ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ
ＰＣＲ）と呼ばれているが、複数のＤＡＮ検体中に含ま
れる１つのＤＮＡ断片種について注目し比較分析する方
法である。注目するＤＮＡ断片種の両側に既知配列を結
合させる。既知配列は、プライマーがハイブリダイズす
る共通配列と複数の検体を識別するための識別配列から
なる。この場合、各検体中の注目ＤＮＡ断片種は同じ配
列を持つので、ＰＣＲ増幅すると同じ長さのＰＣＲ産物
を与えるので、検体の区別できない。そこで比較しよう
とするＤＡＮ検体毎に異なる長さの識別配列を共通配列
と目的とする注目ＤＮＡ断片種の配列との間に挿入し、
ＰＣＲ産物の長さがＤＡＮ検体毎に変化するように工夫
する。これは注目ＤＮＡ断片種の配列にオリゴマーをラ
イゲーションで結合させる時に、オリゴマーの配列を、
各ＤＮＡ検体の断片に共通して同じ配列を持つ共通配列
と、各ＤＮＡ検体を識別するための識別配列とから構成
することで達成される。このように調製された注目ＤＮ
Ａ断片種を含む検体を混合して一括してＰＣＲを行な
う。プライミングサイトの配列及びＰＣＲ増幅される配
列の大部分が同じ配列であり、また、１つの反応容器の
中で反応するので各々の注目ＤＮＡ断片種の増幅は均一
な条件で行われる。このため増幅効率は注目ＤＮＡ断片
が由来する検体によらず一定であるため、定量的な検討
ができる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】定量的なＰＣＲが必要
な具体例としては、遺伝子発現をモニターするためのｃ
ＤＮＡ解析等がある。試料のｃＤＮＡは種々のＤＮＡ断
片を様々な存在比で含んだ物であり、これらを種々の検
体間で定量的に比較することにより、遺伝子の発現情報
および機能情報を得る。注目するｃＤＮＡの多くは検体
中のコピー数が僅かであり、通常ＰＣＲ増幅してから計
測する。この時、定量的な検討ができるようにＰＣＲ増
幅することが必要であり検体間でＰＣＲ条件が異ならぬ
ように、同時に同じ反応容器内で反応させることが望ま
しい。複数ＤＮＡ成分（種）の同時ＰＣＲ増幅は従来も
試みられているが、ＰＣＲ生成物を目的とするＤＮＡ断
片の種類毎に分別して回収し分析する方法は重要である
にも係わらずその難しさゆえに行われてない。このよう
な事情は遺伝子を用いた診断等のための分析にも共通す
る。

【０００５】以上説明した定量的なＰＣＲは重要である
が、注目するターゲットが１種類であり、種々環境下又
は種々異なる組織に含まれるターゲットについて比較す
る場合等には非常に有効である。しかし、複数のＤＮＡ
断片種、即ち複数種類の遺伝子について比較を行なう場
合には、注目する遺伝子毎あるいはＤＮＡ断片毎に反応
を行なう必要があり、煩雑な手順を必要とする問題があ
る。種々試料に含まれる複数の種類のＤＮＡ断片を同時
に増幅し、それぞれを分別回収して比較分析できれば都
合がよいが、先に述べたようにプライマー同士が干渉し
あい予期せぬ生成物を作り出すという問題、及び生成物
の分別回収が難しい等の問題がある。

【０００６】微量でかつ複数の注目ＤＮＡ断片種の比較
分析は大きな研究課題である。微量なＤＮＡ断片種の分
析にはＰＣＲが用いられている、ＰＣＲによる増幅率は
増幅しようとするＤＮＡ断片の配列、特にプライマーが
ハイブリダイズする領域の配列、温度、夾雑物の有無等
に依存する。このため、ＰＣＲ増幅産物ともとの増幅前
の試料の間で、ＤＮＡ断片種の間で存在比が変化して定
量的な検討が行ないにくくなる等の問題がある。この問
題を解決するために考案されたＡＴＡＣ ＰＣＲ等の方
法では、複数のＤＮＡ断片種について同時に分析できな
い難点があり、複数の注目するＤＮＡ断片種を含む複数
の検体の間で定量的に比較分析するための方法、あるい
は試料調製方法の開発が重要課題であった。即ち、複数
のＤＮＡについてそれらの種類とそれが含まれていた組
織あるいは検体等の種類とを区別しつつ、同じ条件下で
ＰＣＲ増幅して生成物を比較分析する方法の開発が重要
課題であった。

【０００７】本発明は、上記の各問題点、重要課題を解
決するＤＮＡ試料調製方法及びＤＮＡ試料調製装置を提
供し、プライマー同士の干渉を排除し、同時に複数の検
体の各々に由来する複数の注目ＤＮＡ断片種を同じ条件
下でＰＣＲ増幅して、検体毎に複数の注目ＤＮＡ断片種
のＰＣＲ産物を分別回収するＤＮＡ試料調製方法及びＤ
ＮＡ試料調製装置を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明のＤＮＡ試料調製
方法では、１つの反応セル中で複数のＤＮＡ断片種を増
幅するが、ＤＮＡ断片種毎に局在化した場所でＰＣＲ増
幅を行なうことによりプライマーペア間の干渉を防止し
している。具体的には、微粒子又はビーズの表面に、Ｄ
ＮＡ断片の種類毎にそれぞれ特異的に結合するプライマ
ー（特異プライマー）の種類毎に固定し、微粒子又はビ
ーズの表面に固定化された特異プライマーと、微粒子又
はビーズに固定されない遊離のプライマー（遊離プライ
マー又は共通プライマーという）とを対として、各微粒
子又はビーズの表面でＤＮＡ断片種毎にＰＣＲ増幅が行
なわれる。更に、微粒子又はビーズの表面に固定された
特異プローブ（プライマー）の種類毎に微粒子又はビー
ズを保持するセル内の位置を変えて、プライマー間での
相互干渉が起こらないようにする。ＰＣＲ終了後、各微
粒子又はビーズ、各ファイバー等の互いに別々の固体サ
ポート（担体）は分別回収され、固体サポートの表面に
捕捉されたＤＮＡ断片種も分別され回収される。複数の
特異プライマーは、ほぼ同じ長さを持つが配列は異な
る。

【０００９】本発明のＤＮＡ試料調製方法では、検体の
違いはＤＮＡ断片の末端に結合させるオリゴマー（プラ
イミング領域となる）の種類を変えることで識別可能と
し、ＤＮＡ断片の種類はそれらＤＮＡ断片に特異に結合
するプライマー（特異プライマー）を、相互に複数の群
に識別可能な微粒子又はビーズに固定してＰＣＲ産物を
各微粒子又はビーズに捕獲すると共に、ＰＣＲ産物を微
粒子又はビーズの化学的、又は物理的な性質の違いで分
別することにより分取する。ＤＮＡ断片種毎に分取され
るが、この中には複数の検体に由来するＤＮＡ断片種が
同じ比率でＰＣＲ増幅されて含まれている。ＰＣＲ増幅
された複数の検体に由来するＤＮＡ断片種は、末端に結
合したオリゴマーの違いに基づいて分析され比較でき
る。本発明では、複数の検体の各々に由来する複数の注
目ＤＮＡ断片種の各々のをＰＣＲ増幅した後に、複数の
注目ＤＮＡ断片種毎にＰＣＲ産物を分別回収する。各Ｄ
ＮＡ断片種のＰＣＲ増幅は同一条件で行われるので、各
ＤＮＡ断片種の比較分析等が有効にできる。

【００１０】本発明のＤＮＡ試料調製方法は、複数のＤ
ＮＡ成分（断片）が含まれる複数サンプル（検体）から
多種のＤＮＡ成分を同時にＰＣＲ増幅し、分別するのに
も活用できる。即ち、特異プライマーを微粒子又はビー
ズに固定し、１つの容器内で反応させたり、あるいは、
微粒子又はビーズをプローブの種類毎に区分けした状態
とし、ＤＮＡの種類毎に相互干渉が少なくなるようにＰ
ＣＲ増幅して、増幅後、ＤＮＡの種類毎に分別回収して
分析できる。

【００１１】本発明のＤＮＡ試料調製方法は、従来技術
では不可能であった複数の検体に含まれる複数のＤＮＡ
断片種を定量分析可能な状態で、複数の検体にそれぞれ
由来する複数のＤＮＡ断片種のコピー数を増幅し、比較
分析する手法を提供できる。また、従来技術ではＰＣＲ
増幅されたＤＮＡ断片種の分別回収は手間と時間がかか
る上、ＤＮＡ断片長が同じ場合にはゲル分離が適用でき
ず分別回収が困難であったが、本発明ではより簡単に分
別回収できる。本発明の試料調製方法では、複数の検体
にそれぞれ由来する複数のＤＮＡ断片種の配列決定をす
る場合に、複数の検体にそれぞれ由来する複数のＤＮＡ
断片種に関する試料調製を１つの容器内で一括して行な
い注目するＤＮＡ断片種毎に分別分取した後に、ＤＮＡ
断片種毎に塩基配列決定反応を行ない生成物をゲル電気
泳動して非常に効率良く、複数のＤＮＡ断片種の塩基配
列決定ができる。以下、本発明の代表的な構成の特徴を
説明する。

【００１２】本発明のＤＮＡ試料調製方法は、増幅しよ
うとする複数種類のＤＮＡ断片にそれぞれ相補な配列を
持ち、前記相補な配列の種類毎に１又は複数の分別可能
な担体の表面に固定され、前記ＤＮＡ断片の種類毎にそ
れぞれ特異的に結合する特異プライマーと、溶液中に遊
離する遊離プライマーとを対として、前記ＤＮＡ断片の
ＰＣＲ増幅を行なう工程と、ＰＣＲ増幅産物を前記ＤＮ
Ａ断片の種類毎に分別回収する工程とを有することに特
徴があり、前記遊離プライマーが前記複数種類のＤＮＡ
断片に共通してハイブリダイズする共通プライマーであ
ること、前記遊離プライマーが前記複数種類のＤＮＡ断
片に共通してハイブリダイズする共通プライマーであ
り、前記共通プライマーは、前記ＤＮＡ断片の５’末端
に導入されたオリゴヌクレオチドの配列にハイブリダイ
ズすること、前記担体が、比重又は寸法の異なる複数の
微粒子又はビーズであり、前記特異プライマーの種類と
前記比重又は寸法が対応付けられていること、前記担体
が、複数のファイバーであり、前記特異プライマーは種
類毎に異なる前記ファイバーの先端近傍に固定されてい
ること、前記担体が前記複数の群に識別可能な複数の微
粒子又はビーズであり、前記複数の微粒子又はビーズが
単一の反応セルに収納されること、前記担体が複数の微
粒子又はビーズであり、前記複数の微粒子又はビーズが
単一のキャピラリーの内部の異なる区画に分離して保持
されること、前記担体が前記複数の微粒子又はビーズで
あり、前記複数の微粒子又はビーズが単一のキャピラリ
ーの内部の異なる区画に、前記複数の区画を分離するス
ペーサービーズ又はスペーサー微粒子を介して分離して
保持されること、前記担体が前記複数の群に識別可能な
複数の微粒子又はビーズであり、前記微粒子又はビーズ
のサイズ、前記微粒子又はビーズの比重、前記微粒子又
はビーズに着色された色、前記微粒子又はビーズが帯び
る磁化の何れかの差異により、前記複数の群が識別可能
であること、等にも特徴がある。

【００１３】また、本発明のＤＮＡ試料調製方法は、増
幅しようとする複数種類のＤＮＡ断片にそれぞれ相補な
配列を持ち、前記相補な配列の種類毎に１又は複数の分
別可能な担体の表面に固定され、前記ＤＮＡ断片の種類
毎にそれぞれ特異的に結合する特異プライマーと、溶液
中に遊離する遊離プライマーとを対として、前記ＤＮＡ
断片のＰＣＲ増幅を行なう工程と、ＰＣＲ増幅産物を前
記ＤＮＡ断片の種類毎に分別回収する工程とを有し、前
記遊離プライマーが前記複数種類のＤＮＡ断片に共通し
てハイブリダイズする共通プライマーであり、前記共通
プライマーは、前記ＤＮＡ断片の５’末端に導入された
オリゴヌクレオチドの配列にハイブリダイズすることを
特徴とする。

【００１４】更に、本発明のＤＮＡ試料調製装置は、増
幅しようとする複数種類のＤＮＡ断片にそれぞれ相補な
配列を持ち、前記ＤＮＡ断片の種類毎にそれぞれ特異的
に結合する特異プライマーを、前記特異プライマーの種
類毎に別々に保持する複数の貫通する孔を持つホルダー
と、前記ＤＮＡ断片の５’末端に導入されたオリゴヌク
レオチドの配列に共通してハイブリダイズする共通プラ
イマーを含むＰＣＲ反応液、及び、前記ＤＮＡ断片を収
納し、前記ホルダーの一方の端部を受け入れる凹部を有
し、前記各孔の内部で、前記各特異プライマーと、前記
共通プライマーとを対として、前記ＤＮＡ断片のＰＣＲ
増幅を行ない、前記ＤＮＡ断片の種類毎のＰＣＲ増幅産
物を前記各孔の内部で生成することを特徴とし、前記特
異プライマーが固定された微粒子又はビーズが、前記細
管の内部に保持されること、前記特異プライマーが前記
細管の内壁に固定されること、前記特異プライマーが固
定されたフアイバーを含む細い部材が、前記細管の内部
に保持されることにも特徴がある。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明を図面を参照して実
施例により詳細に説明する。物理的又は化学的性質によ
り複数の群に識別して分類可能な、プラスチック、ガラ
ス、セラミック等の材質からなる微粒子又はビーズ、あ
るいは、磁気微粒子又は磁気ビーズ等の、互いに別々の
固相担体の表面に固定され、複数の各々のＤＡＮ断片種
に特異的にハイブリダイズする特異プライマーと、複数
のＤＡＮ断片種の少なくとも一部の複数のＤＡＮ断片種
に共通してハブリダイズし溶液中に遊離する共通プライ
マーとを対として行なう、複数のＤＡＮ断片種の同時Ｐ
ＣＲと、ＰＣＲ後の微粒子、ビーズ等の分別回収法につ
いて説明する。ここで用いる微粒子又はビーズのサイズ
は、直径０．５μｍ〜５００μｍでる。

【００１６】以下、各実施例でＰＣＲ増幅とする試料の
調製方法について説明する。以下の各実施例の説明で
は、図１に示すように、比較しようとするＤＡＮ検体を
２０１−ｉ（ｉ＝ａ、ｂ、〜、ｆ）で表示し、ＤＮＡ検
体−ｉに由来するＤＮＡ断片種−ｊをＤＮＡ断片種を２
０１−ｉ−ｊ（ｉ＝ａ、ｂ、〜、ｆ；ｊ＝１、２、〜、
９）で表示する。以下の各実施例では、複数のＤＮＡ検
体に由来する複数のＤＮＡ断片種（例えば、ｃＤＮＡ断
片種）２０２をＰＣＲ増幅して、ＤＮＡ断片種毎に分離
分取する。以下の各実施例では、検体の数は６個であ
り、注目するＤＮＡ断片種の数は９個である。もちろ
ん、ＤＮＡ検体の数、注目するＤＮＡ断片種の数は、タ
ーゲットＤＮＡにより変化する。ターゲットとするＤＮ
Ａ（ターゲットＤＮＡ）の配列の内、増幅しようとする
注目領域を決定し、増幅しようとする注目領域の配列
（特異配列）に特異的にハイブリダイズするプライマー
（特異プライマ−ｊ）２０７−ｊ（ｊ＝１、２、〜、
９）を用意する。注目領域に存在する制限酵素切断部位
を制限酵素で切断し、得られた断片の末端に既知配列を
持つオリゴマーをライゲーションにより結合して、既知
配列と特異配列とで挟まれた領域をＰＣＲ増幅して比較
分析用の試料とする。なお、以下で説明する図１、図
２、図３に示す断片の例では図を簡略にするため、断片
２０１−ｉ−ｊの５’末端に既知配列を持つオリゴマー
が付加されていない例を示すが、既知配列を持つオリゴ
マーが付加されていても良いことは言うまでもない。更
に、図１、図２、図３に示す例では図を簡略にするた
め、１本鎖の断片２０１−ｉ−ｊの例をとり説明する
が、断片２０１−ｉ−ｊが２本鎖である場合にも同様に
して、既知配列と特異配列とで挟まれた領域をＰＣＲ増
幅して比較分析用の試料とすることができることは言う
までもない。

【００１７】既知配列を持つオリゴマーの配列は、ＤＮ
Ａ検体の断片に共通する同じ配列からなる共通配列２０
８と、共通配列２０８の５’末端に続き、ＤＡＮ検体を
識別する識別配列２０５−ｉ（ｉ＝ａ、ｂ、〜、ｆ）を
持つ。識別配列２０５−ｉは、ＤＮＡ検体−ｉに由来す
るＤＮＡ断片を識別するための配列であり、ＤＮＡ検体
毎に長さを変えている。即ち、ＤＡＮ検体−ｉ（ｉ＝
ａ、ｂ、〜、ｆ）に由来するＤＮＡ断片種２０１−ｉ−
ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）の識別配列２０５−ｉ（ｉ＝
ａ、ｂ、〜、ｆ）は同じ長さであり、ＤＮＡ検体毎に識
別配列の長さは異なっている。ＤＡＮ検体−ｉ（ｉ＝
ａ、ｂ、〜、ｆ）に由来するＤＮＡ断片種２０１−ｉ−
ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）の５’末端の共通配列２０８
は、ＤＮＡ検体、及びＤＮＡ断片種によらず同じ配列で
ある。反応溶液中に遊離しているＰＣＲ増幅の遊離プラ
イマー２０８’は共通配列２０８にハイブリダイズす
る。なお、特異プライマーの５’末端がリンカーを介し
て、特異プライマーの種類毎に微粒子、ビーズ等の互い
に別々の固相担体の表面に固定される。１つの固相担体
の表面には複数分子の同一種類の特異プライマーが固定
されていることは言うまでない。

【００１８】（実施例１）実施例１に説明する方法は、
複数のＤＮＡ検体２０１−ｉ（ｉ＝ａ、ｂ、〜、ｆ）の
各々に由来する複数のＤＮＡ断片種２０１−ｉ−ｊ（ｉ
＝ａ、ｂ、〜、ｆ；ｊ＝１、２、〜、９）に特異的にハ
イブリダイズする特異プローブ（特異プライマー）２０
７−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）を、複数のＤＮＡ断片種
毎に異なる直径を持つ微粒子又はビーズ２０６−ｊ（ｊ
＝１、２、〜、９）の表面に固定し、微粒子又はビーズ
を反応液中に分散させて、複数のＤＡＮ断片種の少なく
とも一部の複数に共通してハブリダイズする共通プライ
マー（遊離プライマー）２０８’と、特異プライマー２
０７−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）とを対として、複数の
ＤＮＡ検体の各々に由来する複数のＤＮＡ断片種２０１
−ｉ−ｊ（ｉ＝ａ、ｂ、〜、ｆ；ｊ＝１、２、〜、９）
をＰＣＲ増幅する方法である。

【００１９】図１は、実施例１に於いて、特異プライマ
ーが固定された径の異なる微粒子又はビーズを用いて複
数のＤＮＡ検体の各々に由来する複数のＤＮＡ断片種を
同時にＰＣＲ増幅する方法を説明する図である。図２
は、実施例１に於いて、特異プライマーが固定された径
の異なる微粒子又はビーズを用いて複数のＤＮＡ検体の
各々に由来する複数のＤＮＡ断片種の同時ＰＣＲ増幅を
模式的に示す図である。

【００２０】ＰＣＲ生成物を選別して分取するために、
特異プライマー２０７−ｊはその種類毎に、それぞれ異
なる直径を持つ微粒子又はビーズ２０６−ｊの表面に固
定される。特異プライマー２０７−ｊが固定された微粒
子又はビーズ２０６−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）をまと
めて反応容器１０１に入れ、また、複数のＤＮＡ検体に
由来する複数のＤＮＡ断片種（ｃＤＮＡ断片）２０２
（全ての、ＤＮＡ断片種２０１−ｉ−ｊ（ｉ＝ａ、ｂ、
〜、ｆ；ｊ＝１、２、〜、９））、酵素、及び反応基質
等、ＰＣＲに必要な試薬を加えＰＣＲを実行する。

【００２１】図１の（ａ）に示すように、ＤＮＡ断片種
２０１−ｉ−ｊの３’末端の共通配列２０８に相補結合
する遊離プライマー２０８’の伸長反応により、ＤＮＡ
断片種２０１−ｉ−ｊの相補鎖が生成する。図１の
（ｂ）に示すように、各微粒子又はビーズ２０６−ｊの
表面では、固定された特異プライマー２０７−ｊがハイ
ブリダイズするＤＮＡ断片種２０１−ｉ−ｊの相補鎖を
鋳型にして相補鎖合成がなされる。特異プライマー２０
７−ｊは、ＤＮＡ検体２０１−ｉに由来するＤＮＡ断片
種２０１−ｉ−ｊの相補鎖の３’末端（又は、ＤＮＡ断
片種２０１−ｉ−ｊの５’末端に付加された既知配列の
オリゴマーの相補鎖の３’末端）と識別配列２０５−ｉ
に相補な配列２０５’−ｉの３’末端と間の固有配列部
分２０３−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）（図示せず）の領
域内でハイブリダイズする。その結果、微粒子又はビー
ズ２０６−ｊの表面に固定された特異プライマー２０７
−ｊは相補鎖伸長して複製されたＤＮＡ鎖をつくる。直
径が異なる微粒子又はビーズ２０６−ｊ毎に異なる特異
プライマー（プローブ）２０７−ｊが固定されているの
で、直径が異なる微粒子又はビーズ２０６−ｊ毎に異な
るｃＤＮＡ断片２０１−ｉ−ｊの相補鎖が鋳型とされ
て、対応する相補鎖がハイブリダイズした形で微粒子又
はビーズにやはりトラップされる。

【００２２】図１の（ｃ）に示すように、特異プライマ
ー２０７−ｊの伸張鎖の３’末端の共通配列２０８に相
補結合する遊離プライマー２０８’の伸長反応により、
特異プライマー２０７−ｊの伸張鎖の相補鎖が生成す
る。図２に示すように、微粒子又はビーズの表面に固定
された特異プライマーの伸長鎖１０７−１、１０７−２
に共通プローブ２０８’がハイブリダイズし共通プロー
ブの伸張鎖１０８−１、１０８−２が生成する。図１の
（ｄ）に示すように、図１の（ｃ）で生成した２本鎖の
各鎖を鋳型、特異プライマー２０７−ｊ、及び遊離プラ
イマー２０８’をプライマーとしてＰＣＲ増幅が進行す
る。

【００２３】以上の反応による生成物を精製すると、図
１の（ｅ）に示すように、３’末端側に、共通配列２０
８と、共通配列２０８に続きＤＮＡ検体２０１−ｉに由
来するＤＮＡ断片種２０１−ｉ−ｊを識別するための識
別配列２０５−ｉとを持ち、５’末端側に、特異プライ
マー（微粒子又はビーズ２０６−ｊに固定されている）
２０７−ｊの配列を持つ第１の１本鎖と、第１の１本鎖
に相補な配列を持つ第２の２本鎖からなり、ＤＮＡ断片
種２０１−ｉ−ｊ（ｉ＝ａ、ｂ、〜、ｆ；ｊ＝１、２、
〜、９）に由来する複製がえられる。この結果、ＤＮＡ
断片種ｊ毎に、２０１’−ｉ−ｊ（ｉ＝ａ、ｂ、〜、
ｆ；ｊ＝１、２、〜、９）を含む断片２０９−ｊが得ら
れる。ＤＮＡ断片種ｊ毎に、２０１’−ｉ−ｊ（ｉ＝
ａ、ｂ、〜、ｆ；ｊ＝１、２、〜、９）を含む断片２０
９−ｊが、（ｉ、ｊ）の全てに組合わせについて得られ
る。なお、図１では、微粒子又はビーズ２０６−ｊの大
きさを●印で示し、例えば、２０６−１の大きさを○
印、２０６−９の大きさを△印で示しているＤＮＡ断片
種ｊ毎に複製された断片２０９−ｊを鋳型とし、蛍光標
識された共通プライマー２０８’（共通配列２０８にハ
イブリダイズする）を用いた相補鎖を合成して電気泳動
を行ない、電気泳動パターンを比較することにより、複
数のＤＮＡ検体２０１−ｉの間での注目する断片種（２
０１−ｉ−ｊ（ｉ＝ａ、ｂ、〜、ｆ；ｊ＝２、３、〜、
９））の存在比を知ることができる。

【００２４】図２に示すように、微粒子又はビーズをＰ
ＣＲ反応液中に分散させているので、それぞれ異なる特
異プライマー２０７−ｊを保持した微粒子又はビーズ２
０６−ｊの周辺での有効な反応領域１０３−ｊ（ｊ＝
１、２、〜、９）は相互に十分離れており、ＰＣＲ生成
物のＤＮＡ鎖は、２本鎖状から遊離して１本鎖になって
もその近傍に存在するので、各微粒子又はビーズに近傍
ほど濃度が高くなる。この状況を更に良く実現するため
粘度の高い物質を共存させても良い。通プローブ２０
８’だけをプライマーとして増幅される鎖も生じるが、
微粒子又はビーズにトラップされたもの以外は反応後に
洗浄除去するので実害はない。

【００２５】図３は、実施例１に於いて、穴付きシート
又はスリット付きシートを用いて微粒子又はビーズをサ
イズ毎に分取して、複数のＤＮＡ断片種を種類毎に分離
分取する方法を示す図である。ＰＣＲ後の反応液を溶媒
で希釈し、フローさせながら穴付きシート１０５又はス
リット付きシート１０５’を用いて微粒子又はビーズを
サイズ毎に分取する。微粒子又はビーズサイズ分離用の
穴１０９−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）の直径、あるい
は、微粒子又はビーズサイズ分離用のスリット１０９’
−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）の径は、微粒子又はビーズ
２０６−ｊをそれぞれ通過可能な大きさを持つ。

【００２６】ＰＣＲ後の反応液及び希釈液を、穴付きシ
ート１０５又はスリット付きシート１０５’を傾斜させ
た状態で希釈液を左から右にフローさせながら、各穴１
０９−ｊ、又は各スリット１０９’−ｊを通過させて、
サイズ分離された微粒子又はビーズ分画１０６−ｊ（ｊ
＝１、２、〜、９）を得る。図１に示す、増幅されたＤ
ＮＡ断片２０９−１、２０９−２、〜、２０９−９は、
分画１０６−１、１０６−２、〜、１０６−９として分
取される。なお、図２に示す微粒子又はビーズの直径の
大きさは、微粒子又はビーズ２０６−２、２０６−１
（図１では、○印で示す）、２０６−３、〜、２０６−
９（図１では、△印で示す）の順に大きくなっている。

【００２７】図４は、実施例１に於いて、微粒子又はビ
ーズに代えて、特異プライマーをフアイバーの表面に固
定して、複数のＤＮＡ検体の各々に由来する複数のＤＮ
Ａ断片種を同時にＰＣＲ増幅して、複数のＤＮＡ断片種
を種類毎に分離分取する方法を説明する図である。図４
に示す構成では、特異プライマーｊ（ｊ＝１、２、〜、
９）が種類毎に別々のファイバー４０８−ｊ（ｊ＝１、
２、〜、９）の表面に固定されている。図２に示す構成
に於いて、各微粒子又はビーズ２０６−ｊ（ｊ＝１、
２、〜、９）に代えて、各特異プライマー２０７−ｊが
固定された各ファイバー４０８−ｊが使用され、図２に
示す反応容器１０１内の反応液に、各ファイバー４０８
−ｊが浸されて、ＰＣＲが実行される。特異プライマー
２０７−ｊは、ファイバー４０８−ｊの先端部及びその
近傍の表面に固定される。フアイバーはプラスチック又
はガラスから構成されるが、フアイバーに限らず一般に
細い糸状の部材であれば良い。フアイバー等の糸状の部
材は、ファイバーは容易にハンドリングできるのでＰＣ
Ｒ産物の分別回収は容易になる。

【００２８】分別回収されるＰＣＲ産物を鋳型として、
特異プライマーに相補な蛍光標識されたプライマーを用
いた相補鎖を合成して電気泳動を行ない、電気泳動パタ
ーンを比較することにより、複数のＤＮＡ検体の間での
注目する断片の存在比を知ることができる。

【００２９】（実施例２）実施例１では、固定している
特異プライマーの種類によらず微粒子又はビーズ（ある
いは、ファイバー）は、まとめて１つの反応容器に入れ
た。実施例２では、反応容器をキャピラリーで構成し、
微粒子又はビーズの表面に固定された特異プライマー
（プローブ）の種類により微粒子又はビーズを区分けし
てキャピラリー内に保持し、ＰＣＲを特異プライマーの
種類毎に空間的に分離された状態で行なう方法を開示す
る。この方法では、プライマー同士の干渉を防止すると
ともに、ＰＣＲ生成物が対応する特異プライマーを保持
した微粒子又はビーズの近傍に局在するので効率のよい
多成分ＰＣＲが行える。

【００３０】図５は、実施例２に於いて、特異プライマ
ーが固定された微粒子又はビーズを特異プライマーの種
類毎にキャピラリー内に区分けして保持しキャピラリー
内で複数ＤＮＡ断片種の同時ＰＣＲを行なう構成を示す
図である。図５に示すように、内径２２０μｍのキャピ
ラリー５０５の中に、３０μｍの微粒子又はビーズ２０
６−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）の各微粒子又はビーズ
が、ダミーの微粒子又はビーズ５０７を挟んで詰められ
ている。微粒子又はビーズ２０６−ｊには、ｊ毎に異な
る特異プライマー２０７−ｊ（図示せず）が固定されて
いる。

【００３１】特異プライマーは種類毎に、ダミーの微粒
子又はビーズ５０７により区分けされている。ダミーの
微粒子又はビーズ５０７として２００μｍの微粒子又は
ビーズを用いているので、特異プローブが固定された微
粒子又はビーズ２０６−ｊはダミーの微粒子又はビーズ
５０７をこえて混じり合わない。キャピラリー５０５の
底部を図示しない１５０μｍ程度の孔を形成した膜を介
して、キャピラリー保持容器５０６に保持して、キャピ
ラリー５０５に、共通プライマーを含むＰＣＲ反応液及
び鋳型ＤＮＡを入れてＰＣＲ増幅を行なう。ＰＣＲ産物
は対応する微粒子又はビーズが存在するキャピラリー内
の位置に局在するので、効率のよい増幅がそれぞれ空間
的に分離された状態で行なわれる。ＰＣＲ生成物はキャ
ピラリーから順次取り出して使用できる。

【００３２】順次取り出され分別回収されるＰＣＲ生成
物を、実施例１と同様にして電気泳動を行ない、複数の
ＤＮＡ検体の間での注目する断片の存在比を知ることが
できる。

【００３３】（実施例３）実施例３は、特異プローブを
表面に固定した微粒子又はビーズを特異プローブの種類
毎に区分けされたホルダー３０２のセル（穴状反応部）
に入れ、反応液及び鋳型ＤＮＡを共通反応液として反応
液保持板３０３から供給する方法である。各セルの間で
溶液は通過可能となっている。

【００３４】図６は、実施例３に於いて、特異プローブ
を種類毎に保持する穴状反応部を持つ短冊型アレーを用
いた反応デバイスの構成を示す斜視図である。反応デバ
イスは、特異プローブ２０７−ｊが保持される穴状反応
部３０１−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）が形成されたホル
ダー３０２と、共通プライマーを含むＰＣＲ反応液及び
鋳型ＤＮＡを収納し、ホルダー３０２の下部側面テーパ
を挿入可能な楔形の凹部を持つ反応液保持板３０３とか
ら構成される。ホルダー３０２は、内径０．２ｍｍの穴
の穴状反応部３０１−ｊを持つ短冊型リボンである。内
径０．２ｍｍの各穴３０１−ｊはホルダー３０２を貫通
している。

【００３５】図６に示す構成例では、短冊型リボンの厚
さ０．５ｍｍ、高さ４ｍｍ、横方向の長さ１６ｍｍの短
冊型リボンを用いた。内径０．２ｍｍ、穴の長さ４っの
穴は０．１ｍｍの間隔を置いて開けられている。図６に
示す例では、穴の数は９個であるが、もちろんもっと多
くすることもできる。反応液保持板３０３の凹部に収納
された反応液は、反応液保持板３０３の楔形の凹部にホ
ルダー３０２の下部側面テーパが挿入された時に、各穴
状反応部３０１−ｊに下部から供給される。この結果、
特定のＤＮＡ断片種だけが選択的に各穴で増幅される。
反応液保持板３０３の楔形の凹部に入れる反応液の量は
２０μＬ（マイクロリットル）程度で良く、この量は通
常のＰＣＲに用いる１回の反応液量と変わらないので、
１つの反応当たりの試薬量を約２０分の１にできる。以
下、特異プローブを種類毎に穴状反応部に保持する方法
について具体的に説明する。

【００３６】図７は、図６に示す短冊型アレー（ホルダ
ー３０２）の各穴状反応部に特異プローブを固定した微
粒子又はビーズを特異プローブの種類毎に収納する構成
を示す断面図、図８は、図６に示す短冊型アレーの各穴
状反応部の内壁に特異プローブの種類毎に固定する構成
を示す断面図、図９は、図６に示す短冊型アレーの各穴
状反応部に特異プローブを固定したファイバーを特異プ
ローブの種類毎に収納する構成を示す断面図である。

【００３７】図７の構成では、各穴状反応部３０１−ｊ
に、特異プローブ２０７−ｊを固定した微粒子又はビー
ズ２０６−ｊを特異プローブ２０７−ｊ（図示せず）の
種類毎に収納する（実施例３では、ｊ＝１、２、〜、
９）。図７に示す構成では、微粒又はビーズ２０６−ｊ
の径は、ｊによらず一定として良い（もちろん、ｊによ
って異なっていても良い）。図７の構成に於いて、図５
に示す構成のように、ｊ（実施例３では、ｊ＝１、２、
〜、９）毎に異なる特異プライマー２０７−ｊ（図示せ
ず）が固定されている微粒子又はビーズ２０６−ｊを、
特異プライマーは種類毎に、ダミーの微粒子又はビーズ
５０７により区分けして、同一の穴状反応部３０１−ｊ
に収納しても良い。なお、ホルダー３０２の底部を図示
しない微粒子又はビーズ２０６−ｊを通過しない程度の
孔を形成した膜を介して、反応液保持板３０３にセット
する。

【００３８】図８の構成では、各穴状反応部３０１−ｊ
の内壁に、特異プローブ２０７−ｊの種類毎に固定する
（実施例３では、ｊ＝１、２、〜、９）。図９の構成で
は、各穴状反応部３０１−ｊに、特異プローブ２０７−
ｊを固定したファイアバー４０８−ｊを特異プローブ２
０７−ｊの種類毎に収納する（実施例３では、ｊ＝１、
２、〜、９）。各穴状反応部３０１−ｊの穴の内径は、
キャピラリー電気泳動で用いるキャピラリーの寸法より
大きくしている。ＰＣＲ後に、各穴状反応部３０１−ｊ
毎で、ＰＣＲ生成物を鋳型として、特異プローブ２０７
−ｊに相補な蛍光標識されたプライマーを用いた相補鎖
を合成し後に、電気泳動用のキャピラリーに導入して
（図１２を参照）、キャピラリー電気泳動を行ない電気
泳動パターンを比較することにより、複数のＤＮＡ検体
の間での注目する断片の存在比を知ることができる。

【００３９】なお、以上説明した、図６〜図９の構成で
は、各穴状反応部３０１−ｊを一次元に配置したが、ホ
ルダー３０２、及び反応液保持板３０３の大きさを変化
させて、２次元に各穴状反応部３０１−ｊを配置しも良
いことは言までもない。これらの配置に特徴的なこと
は、反応液が反応液保持板に３０３に一括保持され、各
反応セル（穴状反応部３０１−ｊ）が反応液を介して連
結している点にあり、タイタープレートに反応液を分割
保持する場合と異なる。実施例３のメリットは、各反応
セルに反応液を分配する必要がない点にもある。

【００４０】（実施例４）図１０は、実施例４に於い
て、特異プローブを種類毎に保持する溝つきプレートを
用いた反応デバイスの構成を示す斜視図である。図１１
は、図１０の反応デバイスを構成する溝付きプレート４
０４の平面図である。図１２は、図１０に於けるＡ−
Ａ’断面図である。図１０に示す反応デバイスは、特異
プローブ２０７−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）が固定され
た微粒子又はビーズ２０６−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）
を保持する反応部４０７−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）
と、液流路用細溝４０６−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）と
が形成された溝付きプレート４０４と、共通プライマー
を含むＰＣＲ反応液及び鋳型ＤＮＡを導入する反応液槽
４０１と、ＰＣＲ生成物を含む液を排出する反応液出口
４０２−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）とが形成された上部
プレート４０３とから構成される。

【００４１】微粒子又はビーズ２０６−ｊの径は、ｊに
よらず一定としても良いし、変化させても良い。反応部
４０７−ｊと液流路用細溝４０６−ｊとは１本の深さが
異なる繋がった溝で構成され、反応部４０７−ｊは液流
路用細溝４０６−ｊよりも深さが浅い溝で構成成されて
いる。深さの浅い一方の側の液流路用細溝４０６−ｊは
反応液槽４０１と繋がり、深さの浅い他方の側の液流路
用細溝４０６−ｊは反応液出口４０２−ｊに繋がってい
る。

【００４２】各反応部４０７−ｊ、各液流路用細溝４０
６−ｊ、各反応液出口４０２−ｊ、及び反応液槽４０１
はそれぞれ、微細加工技術を用いて平板に形成されてい
る。各反応液出口４０２−ｊの細孔の内径は、キャピラ
リー電気泳動で用いる泳動媒体５０１が充填されたキャ
ピラリー５００−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）の寸法より
大きくしている。

【００４３】ＰＣＲ後に、反応液槽４０１に特異プロー
ブ２０７−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）の混合物を入れ
て、反応部４０７−ｊ毎で、ＰＣＲ生成物を鋳型とし
て、特異プローブ２０７−ｊに相補な蛍光標識されたプ
ライマーを用いた相補鎖を合成し後に、電気泳動用のキ
ャピラリーに導入して（図１２を参照）、キャピラリー
電気泳動を行ない電気泳動パターンを比較することによ
り、複数のＤＮＡ検体の間での注目する断片の存在比を
知ることができる。

【００４４】（実施例５）図１３は、実施例５に於い
て、比重に基づいて微粒子又はビーズを分別する構成を
説明する断面図である。実施例１では微粒子又はビーズ
の分別を微粒子又はビーズのサイズで行なったが、プラ
スチック微粒子又はプラスチックビーズに金属類を混
ぜ、比重を変えた微粒子又はビーズを用いて分別しても
良い。即ち、径は同じであるが比重を変えたプラスチッ
ク微粒子又はプラスチックビーズの比重毎に対応させ
て、特異プライマーをプラスチック微粒子又はプラスチ
ックビーズに固定して、実施例１を適用して得られたＰ
ＣＲ生成物から、微粒子又はビーズを比重の差を検出し
て、分別回収することにより、ＤＮＡ断片種毎のＰＣＲ
生成物を分離分取する。

【００４５】ＰＣＲ生成物を含む溶液中の塩濃度を変化
させる等して溶液の比重を大きい方から小さい方へ順次
変えていくと比重の大きい微粒子又はビーズから順に分
別できる。コック付き反応容器６００の内部で、比重差
のある微粒子又はビーズを用いて、実施例１を実行して
ＰＣＲ完了後に、ＰＣＲ増幅産物を含む溶液６０２の塩
濃度を変化させて、溶液の比重を大きい方から小さい方
へ順次変えて、オンオフコック６０１の開閉と溶液６０
２の塩濃度の変化を組合わせて、比重の大きい微粒子又
はビーズから順に分別して、微粒子又はビーズの比重毎
に異なる容器６０３−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）に微粒
子又はビーズを回収できる。

【００４６】分別回収されたＰＣＲ増幅産物は、実施例
１と同様にして電気泳動を行ない、複数のＤＮＡ検体の
間での注目する断片の存在比を知ることができる。

【００４７】（実施例６）図１４は、実施例６に於い
て、微粒子又はビーズの色を光学的に識別して微粒子又
はビーズを分別する構成を説明する断面図である。実施
例１では微粒子又はビーズの分別を微粒子又はビーズの
サイズで行なったが、微粒子又はビーズを種々の色で着
色して光学的に識別できる様にしておき、微粒子又はビ
ーズの色の差を検出して微粒子又はビーズを分別しても
良い。即ち、径は同じであるが色を変えたプラスチック
微粒子又はプラスチックビーズの色毎に対応させて特異
プライマーをプラスチック微粒子又はプラスチックビー
ズに固定して、実施例１を適用して得られたＰＣＲ生成
物から、微粒子又はビーズを色の差を利用することによ
り、ＤＮＡ断片種毎のＰＣＲ生成物を分離分取する。分
別対象となる微粒子又はビーズは混合状態で容器７３０
に収納されている。

【００４８】ＰＣＲ増幅産物を含む溶液６０４と共に微
粒子又はビーズ２０６−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）を、
吸引送流ポンプ６０５により吸引細管７４０に一定速度
で吸引して送流細管７５０に一定速度で送り込む。送流
細管７５０は、緩衝液６０６が入り口から流入し内部に
シースフロー６０７が形成されるシースフローセル７１
０に結合されている。微粒子又はビーズ２０６−ｊは、
シースフロー６０７中に放出される。ビーズ２０６−ｊ
は、空間的に互いに隣の微粒子又はビーズと間隔をおい
て、シースフローセル７１０の出口のキャピラリー中を
緩衝液と一緒に流れる。ースフローセル７１０の出口の
キャピラリーの先端近傍で、レーザー光源６０８からの
レーザーを照射し、レーザー照射部を通過する各微粒子
又はビーズ２０６−ｊからの反射光、あるいは、各微粒
子又はビーズ２０６−ｊから発する蛍光（この場合、各
微粒子又はビーズ２０６−ｊはそれぞれ異なる蛍光を発
するように、蛍光体が混合されたプラスチックにより微
粒子又はビーズが形成されている）を、レーザーの照射
方向と交叉する方向から光検出器６０９によりモニター
して、微粒子又はビーズの種類を認識する。

【００４９】キャピラリーの先端近傍の下方に配置した
スリット付の静電噴霧電極７００に電界を加えて、帯電
した緩衝液の霧滴７０１、帯電した各微粒子又はビーズ
２０６−ｊを噴霧する。静電噴霧電極７００の下方に電
界の強弱で方向を制御する方向制御板７０２を設けてお
く。制御器７２０は、各微粒子又はビーズ２０６−ｊか
ら検出された反射光又は蛍光の情報により、各微粒子又
はビーズ２０６−ｊの種類を識別し、各微粒子又はビー
ズ２０６−ｊを分取すべき分画セル７０５−ｊ（ｊ＝
１、２、〜、９）を選択して、各微粒子又はビーズ２０
６−ｊに付与すべき方向制御量の大きさを決定する。制
御器７２０は、分画セル７０５−ｊを持つ分取容器７０
６を搭載する分取容器移動台７０７の移動量及び移動方
向を制御して、各微粒子又はビーズ２０６−ｊを異なる
分画セル７０５−ｊに集めて回収する。制御器７２０
は、各微粒子又はビーズ２０６−ｊから検出された反射
光又は蛍光の情報により、各微粒子又はビーズ２０６−
ｊの種類を識別すると共に、方向制御板７０２に印加す
る電界の大きさの制御及び分取容器移動台７０７の駆動
を制御する。

【００５０】分別回収されたＰＣＲ増幅産物は、実施例
１と同様にして電気泳動を行ない、複数のＤＮＡ検体の
間での注目する断片の存在比を知ることができる。

【００５１】

【発明の効果】以上述べた様に本発明によれば、複数の
検体にそれぞれ含まれる複数のＤＮＡ断片種を同じ条件
下で同時にＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物をＤＮＡ断片種毎
に分離して回収できる。このように一方のプライマーを
互いに別々の微粒子又はビーズ、ファイバー等の固体担
体の表面に固定することで、ＰＣＲ生成物の分布を固体
担体の表面近傍に局在化させる共に、複数のＤＮＡ断片
種に特異に相補結合する特異的なプライマー同士の相互
作用で生成する目的外のＤＮＡ産物の生成を防止でき
る。これにより複数の検体の各々に含まれる複数のＤＮ
Ａ断片種の定量比較分析が可能となる。また、本発明の
方法では、ＤＮＡ試料調製の手間が省けると共に、反応
試薬の大幅な低減が可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例１に於いて、特異プライマーが
固定された径の異なる微粒子又はビーズを用いて、複数
のＤＮＡ断片種を同時にＰＣＲ増幅する方法を説明する
図。

【図２】本発明の実施例１に於いて、特異プライマーが
固定された径の異なる微粒子又はビーズを用いて、複数
のＤＮＡ断片種の同時ＰＣＲ増幅を模式的に示す図。

【図３】本発明の実施例１に於いて、穴付きシート又は
スリット付きシートを用いて微粒子又はビーズをサイズ
毎に分取して、複数のＤＮＡ断片種を種類毎に分離分取
する方法を示す図。

【図４】本発明の実施例１に於いて、微粒子又はビーズ
に代えて、特異プライマーをフアイバーにの表面に固定
して、複数のＤＮＡ断片種を同時にＰＣＲ増幅して、複
数のＤＮＡ断片種を種類毎に分離分取する方法を説明す
る図。

【図５】本発明の実施例２に於いて、特異プライマーが
固定された微粒子又はビーズを特異プライマーの種類毎
にキャピラリー内に区分けして保持しキャピラリー内で
複数ＤＮＡ断片種の同時ＰＣＲを行なう構成を示す図。

【図６】本発明の実施例３に於いて、特異プローブを種
類毎に保持する穴状反応部を持つ短冊型アレーを用いた
反応デバイスの構成を示す斜視図である。

【図７】本発明の図６に示す短冊型アレーの各穴状反応
部に特異プローブを固定した微粒子又はビーズを特異プ
ローブの種類毎に収納する構成を示す断面図である。

【図８】本発明の図６に示す短冊型アレーの各穴状反応
部の内壁に特異プローブの種類毎に固定する構成を示す
断面図である。

【図９】本発明の図６に示す短冊型アレーの各穴状反応
部に特異プローブを固定したファイバーを特異プローブ
の種類毎に収納する構成を示す断面図である。

【図１０】本発明の実施例４に於いて、特異プローブを
種類毎に保持する溝きプレートを用いた反応デバイスの
構成を示す斜視図。

【図１１】本発明の図１０の反応デバイスを構成する溝
付きプレートの平面図。

【図１２】本発明の図１０に於けるＡ−Ａ’断面図。

【図１３】本発明の実施例５に於いて、比重に基づいて
微粒子又はビーズを分別する構成を説明する断面図。

【図１４】本発明の実施例６に於いて、微粒子又はビー
ズの色を光学的に識別して微粒子又はビーズを分別する
構成を説明する断面図。

【符号の説明】

１０１…反応容器、１０３−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）
…有効な反応領域、１０５…サイズ分離穴付きプレー
ト、１０５’…サイズ分離スリット付きプレート、１０
６−１、１０６−２、〜、１０６−９…サイズ分離され
た微粒子又はビーズ、１０７−１、１０７−２…微粒子
又はビーズの表面に固定された特異プライマーの伸長
鎖、１０８−１、１０８−２…微粒子又はビーズに固定
化された伸長ＤＮＡにハイブリダイズした共通プローブ
の伸張鎖、１０９−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）…微粒子
又はビーズサイズ分離用の穴の直径、１０９’−ｊ（ｊ
＝１、２、〜、９）…微粒子又はビーズサイズ分離用の
スリットの径、２０１−ｉ（ｉ＝ａ、ｂ、〜、ｆ）…Ｄ
ＮＡ検体−ｉ、２０１−ｉ−ｊ（ｉ＝ａ、ｂ、〜、ｆ；
ｊ＝１、２、〜、９）…ＤＮＡ検体−ｉに由来するＤＮ
Ａ断片種−ｊ、２０２…複数のＤＮＡ検体に由来する複
数のＤＮＡ断片種、２０１’−ｉ−ｊ（ｉ＝ａ、ｂ、
〜、ｆ；ｊ＝１、２、〜、９）…複数のＤＮＡ検体の各
々に由来する複数のＤＮＡ断片種の複製、２０３−ｊ
（ｊ＝１、２、〜、９）…各ＤＮＡ検体に由来するＤＮ
Ａ断片種−ｊ（注目するＤＮＡ断片種−ｊ）の固有配列
部分、２０５−ｉ（ｉ＝ａ、ｂ、〜、ｆ）…ＤＮＡ検体
−ｉに由来するＤＮＡ断片を識別するための識別配列、
２０５’−ｉ（ｉ＝ａ、ｂ、〜、ｆ）…識別配列２０５
に相補な配列、２０６−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）…特
異プライマ−ｊが固定された微粒子又はビーズ−ｊ、２
０７−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）…特異プライマ−ｊ、
２０８…各ＤＮＡ断片に共通な既知配列、２０８’…遊
離した共通プライマー、２０９−ｊ（ｊ＝１、２、〜、
９）…特異プライマ−ｊと遊離した共通プライマーによ
り増幅されたＤＮＡ断片、３０１−ｊ（ｊ＝１、２、
〜、９）…特異プローブ−ｊが保持される穴状反応部、
３０２…ホルダー、３０３…反応液保持板、４０１…反
応液槽、４０２−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）…反応液出
口、４０３…上部プレート、４０４…溝付きプレート、
４０６−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）…液流路用細溝、４
０７−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）…微粒子又はビーズを
保持する反応部、４０８−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）…
特異プライマ−ｊが固定されたフアイバー−ｊ、５００
−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）…電気泳動用キャピラリー
−ｊ、５０１…泳動媒体、５０５…キャピラリー、５０
６…キャピラリー保持容器、５０８…ダミーの微粒子又
はビーズ、６００…コック付き反応容器、６０１…オン
オフコック、６０２…ＰＣＲ増幅産物を含む溶液、６０
３−ｊ（ｊ＝１、２、〜、９）…容器、６０４…ＰＣＲ
増幅産物を含む溶液、６０５…吸引送流ポンプ、６０６
…緩衝液、６０７…シースフロー、６０８…光源、６０
９…光検出器、７００…静電噴霧電極、７０１…緩衝液
の霧滴、７０２…方向制御板、７０５−ｊ（ｊ＝１、
２、〜、９）…分画セル、７０６…分取容器、７０７…
分取容器移動台、７１０…シースフローセル、７２０…
制御器、７３０…容器、７４０…吸引細管、７５０…送
流細管。

フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA13 DA13 FB01 FB02 FB15 HA14 4B024 AA11 AA20 BA80 HA14 HA19 4B063 QA01 QA17 QA18 QQ42 QR08 QR55 QR62 QS25 QS34 QX01 4C057 BB02 BB05 CC03 DD01 MM04 MM09

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】増幅しようとする複数種類のＤＮＡ断片に
   それぞれ相補な配列を持ち、前記相補な配列の種類毎に
   １又は複数の分別可能な担体の表面に固定され、前記Ｄ
   ＮＡ断片の種類毎にそれぞれ特異的に結合する特異プラ
   イマーと、溶液中に遊離する遊離プライマーとを対とし
   て、前記ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を行なう工程と、前記
   担体の表面に生成したＰＣＲ増幅産物を前記ＤＮＡ断片
   の種類毎に分別回収する工程とを有することを特徴とす
   るＤＮＡ試料調製方法。
2. 【請求項２】請求項１に記載のＤＮＡ試料調製方法に於
   いて、前記遊離プライマーが前記複数種類のＤＮＡ断片
   に共通してハイブリダイズする共通プライマーであるこ
   とを特徴とするＤＮＡ試料調製方法。
3. 【請求項３】請求項１に記載のＤＮＡ試料調製方法に於
   いて、前記遊離プライマーが前記複数種類のＤＮＡ断片
   に共通してハイブリダイズする共通プライマーであり、
   前記共通プライマーは、前記ＤＮＡ断片の５’末端に導
   入されたオリゴヌクレオチドの配列にハイブリダイズす
   ることを特徴とするＤＮＡ試料調製方法。
4. 【請求項４】請求項１に記載のＤＮＡ試料調製方法に於
   いて、前記特異プライマーを固定した前記担体が、比重
   又は寸法の異なる複数の微粒子であり、前記特異プライ
   マーの種類と前記比重又は寸法が対応付けられているこ
   とを特徴とするＤＮＡ試料調製方法。
5. 【請求項５】請求項１に記載のＤＮＡ試料調製方法に於
   いて、前記担体が、複数のファイバーであり、前記特異
   プライマーは種類毎に異なる前記ファイバーの先端近傍
   に固定されていることを特徴とするＤＮＡ試料調製方
   法。
6. 【請求項６】請求項１に記載のＤＮＡ試料調製方法に於
   いて、前記担体が前記複数の群に識別可能な複数の微粒
   子であり、前記複数の微粒子が単一の反応セルに収納さ
   れることを特徴とするＤＮＡ試料調製方法。
7. 【請求項７】請求項１に記載のＤＮＡ試料調製方法に於
   いて、前記担体が複数の微粒子であり、前記複数の微粒
   子が単一のキャピラリーの内部の異なる区画に分離して
   保持されることを特徴とするＤＮＡ試料調製方法。
8. 【請求項８】請求項１に記載のＤＮＡ試料調製方法に於
   いて、前記担体が前記複数の微粒子であり、前記複数の
   微粒子が単一のキャピラリーの内部の異なる区画に、前
   記複数の区画を分離するスペーサー微粒子を介して、分
   離して保持されることを特徴とするＤＮＡ試料調製方
   法。
9. 【請求項９】請求項１に記載のＤＮＡ試料調製方法に於
   いて、前記担体が前記複数の群に識別可能な複数の微粒
   子であり、前記微粒子のサイズ、前記微粒子の比重、前
   記微粒子に着色された色、前記微粒子が帯びる磁化の何
   れかの差異により、前記複数の群が識別可能であること
   を特徴とするＤＮＡ試料調製方法。
10. 【請求項１０】増幅しようとする複数種類のＤＮＡ断片
    にそれぞれ相補な配列を持ち、前記相補な配列の種類毎
    に１又は複数の分別可能な担体の表面に固定され、前記
    ＤＮＡ断片の種類毎にそれぞれ特異的に結合する特異プ
    ライマーと、溶液中に遊離する遊離プライマーとを対と
    して、前記ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を行なう工程と、Ｐ
    ＣＲ増幅産物を前記ＤＮＡ断片の種類毎に分別回収する
    工程とを有し、前記遊離プライマーが前記複数種類のＤ
    ＮＡ断片に共通してハイブリダイズする共通プライマー
    であり、前記共通プライマーは、前記ＤＮＡ断片の５’
    末端に導入されたオリゴヌクレオチドの配列にハイブリ
    ダイズすることを特徴とするＤＮＡ試料調製方法。
11. 【請求項１１】増幅しようとする複数種類のＤＮＡ断片
    にそれぞれ相補な配列を持ち、前記ＤＮＡ断片の種類毎
    にそれぞれ特異的に結合する特異プライマーを、前記特
    異プライマーの種類毎に別々に保持する複数の貫通する
    孔を持つホルダーと、前記ＤＮＡ断片の５’末端に導入
    されたオリゴヌクレオチドの配列に共通してハイブリダ
    イズする共通プライマーを含むＰＣＲ反応液、及び、前
    記ＤＮＡ断片を収納し、前記ホルダーの一方の端部を受
    け入れる凹部を有し、前記各孔の内部で、前記各特異プ
    ライマーと、前記共通プライマーとを対として、前記Ｄ
    ＮＡ断片のＰＣＲ増幅を行ない、前記ＤＮＡ断片の種類
    毎のＰＣＲ増幅産物を前記各孔の内部で生成することを
    特徴とするＤＮＡ試料調製装置。
12. 【請求項１２】請求項１１に記載のＤＮＡ試料調製方法
    に於いて、前記特異プライマーが固定された微粒子が、
    前記細管の内部に保持されることを特徴とするＤＮＡ試
    料調製装置。
13. 【請求項１３】請求項１１に記載のＤＮＡ試料調製方法
    に於いて、前記特異プライマーが前記細管の内壁に固定
    されることを特徴とするＤＮＡ試料調製装置。
14. 【請求項１４】請求項１１に記載のＤＮＡ試料調製方法
    に於いて、前記特異プライマーが固定されたフアイバー
    を含むの細い部材が、前記細管の内部に保持されること
    を特徴とするＤＮＡ試料調製装置。