JP2000325080A

JP2000325080A - 完全長ｃＤＮＡライブラリーの作成法

Info

Publication number: JP2000325080A
Application number: JP11143429A
Authority: JP
Inventors: Yoshihide Hayashizaki; 良英林崎
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1999-05-24
Filing date: 1999-05-24
Publication date: 2000-11-28
Anticipated expiration: 2019-05-24
Also published as: JP4304357B2

Abstract

(57)【要約】【課題】極微量しか存在しないクラスIII(レア) に属
し、かつ新規なｃＤＮＡを含むライブラリーを、より効
率よく得ることができる方法の提供。【解決手段】複数の完全長ｃＤＮＡを含む集団から、
新規な完全長ｃＤＮＡの存在割合の高いｃＤＮＡライブ
ラリーを作成する方法であって、前記完全長ｃＤＮＡを
含む集団から、以下の（ａ）〜（ｃ）の核酸とのハイブ
リダイズを利用して、（ａ）〜（ｃ）の核酸とハイブリ
ダイズしたｃＤＮＡを除去する工程を含むことを特徴と
する方法。（ａ）上記ｃＤＮＡライブラリーを作成しようとする組
織における存在量が多い、クラスＩ（アバンダント）及
びクラスＩＩ（インターメディエート）に属する核酸、
（ｂ）上記方法を用いて完全長ｃＤＮＡを含む集団から
ハイブリダイズを利用して分離された核酸−ｃＤＮＡか
ら回収された核酸、及び（ｃ）クラスＩＩＩ（レア）に
属するｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリー中のｃＤＮ
Ａまたはその転写物であるＲＮＡからなる核酸

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な完全長ｃＤ
ＮＡの存在割合が高く、重複の少ない、ｃＤＮＡライブ
ラリーの作成方法に関する。本発明の方法は、全長鎖ｃ
ＤＮＡ（遺伝子）をカタログ化したライブラリーの作成
に有用である。

【０００２】

【従来の技術】全遺伝子種に対応する完全長ｃＤＮＡを
カタログ化したライブラリーの作成は、ヒトゲノムプロ
ジェクト（ＨＧＰ）の重要な課題の１つである。カタロ
グ化したライブラリーとは、ライブラリーに含まれるｃ
ＤＮＡに重複が無いという意味であり、各ｃＤＮＡが１
種類づつ含まれているライブラリーのことである。カタ
ログ化完全長ｃＤＮＡライブラリーの作製には、大規模
な全長鎖ｃＤＮＡライブラリーを作成し、かつ得られる
ライブラリーを重複の少ないものにしていくことが必要
である。全長鎖ｃＤＮＡライブラリーの作成について
は、いくつかの方法が報告されている（Maruyamaら：Ge
ne 25 (1983) 171-174、Ederyら：Mol. Cell. Biol. 15
(1995) 3363-3371、Carninciら：DNA Res. 4 (1997) 6
1-66など）。さらに、ｃＤＮＡの重複を避ける方法とし
ては、２つのｃＤＮＡ集団中に共通して存在するｃＤＮ
Ａを除くサブトラクション法や１つのｃＤＮＡ集団中に
多量に存在するものを優先的に除くノーマライゼーショ
ン法などが知られている（Haraら：Nucleic Acids Res.
19 (1991) 7094-7104、Soaresら：Proc. Natl.Acad. S
ci. USA 91 (1994) 9228-9232、Koら： Nucleic Acids
Res. 18 (1990)5705-5711）。更に、得られたクローン
の塩基配列を解読して、重複をさけることもＥＳＴの場
合にはよく行われている。

【０００３】

【発明が解決しょうとする課題】ところで、ある細胞に
存在するmRNAは、その存在量に応じて、3種類に分類さ
れ、典型的な細胞におけるその存在量と種類は、細胞の
種類により程度の差はあるが、以下の通りである（Bert
ioliら、4520-4523, Nucleic Acids Res. 1995,Vol.23,
No.21）。最も存在量が多いクラスI(アバンダント) に
属するmRNAの種類は4つであり、コピー数は各mRNAにつ
いてそれぞれ12000であり、存在量の平均%は各mRNAにつ
いてそれぞれ3.3である。存在量が中間にあるクラスII
(インターメデェート) に属するmRNAの種類は500であ
り、コピー数は各mRNAについてそれぞれ300であり、存
在量の平均%は各mRNAについてそれぞれ0.08である。最
も存在量が少ないクラスIII(レア) に属するmRNAの種類
は11000であり、コピー数は各mRNAについてそれぞれ15
であり、存在量の平均%は各mRNAについてそれぞれ0.004
である。全量2μgのトータルRNA中に含まれる各mRNAの
平均重量(ng)は、クラスI(アバンダント)のmRNAが3.3ng
であり、クラスII(インターメデェート) のmRNAが0.08n
gであり、クラスIII(レア) のmRNAが0.004ngである。即
ち、クラスIII(レア) に属する１種類のmRNAの重量を1
とすると、クラスII(インターメデェート) に属する１
種類のmRNAの重量は20であり、クラスI(アバンダント)
に属する１種類のmRNAの重量は825である。

【０００４】全長鎖ｃＤＮＡライブラリーの作成方法で
は、まず、このような存在量の異なる3種類のmRNAを含
むmRNAの集団を鋳型として、ｃＤＮＡの集団を作成して
いる。そのため、作成されたｃＤＮＡの集団に含まれる
ｃＤＮＡの存在量は、上記比率に対応しており、クラス
III(レア) に属する１種類のｃＤＮＡの量が1であれ
ば、クラスI(アバンダント) に属する１種類のｃＤＮＡ
の量は概ね825ある。クラスI(アバンダント)及びクラス
II(インターメデェート)に属するｃＤＮＡは、ｃＤＮＡ
ライブラリーの作成の初期の段階でほとんどが見いださ
れるので、カタログ化した全長鎖ｃＤＮＡライブラリー
の作成には、クラスIII(レア) に属する新規なｃＤＮＡ
を効率よく見いだしていくことが必要である。一般に、
全長鎖ｃＤＮＡライブラリーの作成は、ｍＲＮＡから全
長鎖ｃＤＮＡを作成し、この全長鎖ｃＤＮＡをクローニ
ングし、さらにクローニングした全長鎖ｃＤＮＡの配列
を決定するという段階を経て行われる。初期の段階でほ
とんどが見いだされるクラスI(アバンダント)及びクラ
スII(インターメデェート)に属するｃＤＮＡも、ｍＲＮ
Ａから全長鎖ｃＤＮＡを作成する段階では、ｃＤＮＡの
集団に含まれており、この集団に含まれるｃＤＮＡをそ
のままクローニングし、配列決定することは、それだけ
作業効率を低下させることを意味する。即ち、効率的に
カタログ化した全長鎖ｃＤＮＡライブラリーを作成する
には、ｍＲＮＡから転写作成された全長鎖ｃＤＮＡの集
団中に含まれるクラスIII(レア) に属するｃＤＮＡ、そ
れもできれば新規なｃＤＮＡを選択的にクローニング
し、その配列を決定する必要が有る。

【０００５】発明者らは、様々な組織からいくつかの全
長鎖ｃＤＮＡライブラリーを作成し、このライブラリー
から、重複のあるクローンを除する手法として、各クロ
ーンの末端（３‘及び５’末端）の１００前後の塩基配
列を迅速に決定し、この配列に基づいて重複するクロー
ンを排除し、カタログ化した全長鎖ｃＤＮＡライブラリ
ーの作成を試みている。しかし、この方法は、末端の一
部の塩基配列のみを決定する簡便な方法ではあるが、そ
れでも、ライブラリーの作成が進むほどに既知のクロー
ンの割合が増え、効率は低下する。特にライブラリーの
サイズが大きくなるにつれて、同じ遺伝子種の出現頻度
（重複度）が増すことから効率の低下は著しくなる。ま
た、これまでも前述のノーマライゼーション法を用い
て、ｃＤＮＡの集団の作製原料として使用したｍＲＮＡ
を用いて、配列決定前のｃＤＮＡの集団から、クラスI
(アバンダント)及びクラスII(インターメデェート)に属
するｃＤＮＡの存在量を低減することが行われている。
しかるに、極微量しか存在しないクラスIII(レア) に属
するｃＤＮＡのライブラリーを効率よく得るには不十分
であった。

【０００６】そこで本発明の目的は、極微量しか存在し
ないクラスIII(レア) に属し、かつ新規なｃＤＮＡを含
むライブラリーを、より効率よく得ることができる方法
を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明では、クローニン
グ及び配列決定する前の段階で、存在量の多いｃＤＮＡ
のコピー数をなるべく減少させるべく検討した。その結
果、それぞれは既知の方法ではあるが、カタログ化した
全長鎖ｃＤＮＡライブラリーを作成のために組み合わせ
て使用することは知られていない、ノーマライゼーショ
ンとサブトラクションとを組合せ、しかもサブトラクシ
ョンに特定の核酸を用いることで、主にクラスI(アバン
ダント)及びクラスII(インターメデェート)に属するｃ
ＤＮＡの重複率を低減でき、出現頻度の低いいわゆるレ
アなｃＤＮＡクローンの単離を行い易くできることを見
いだして本発明を完成した。

【０００８】本発明は、複数の完全長ｃＤＮＡを含む集
団から、新規な完全長ｃＤＮＡの存在割合の高いｃＤＮ
Ａライブラリーを作成する方法であって、前記完全長ｃ
ＤＮＡを含む集団から、以下の（ａ）〜（ｃ）の核酸と
のハイブリダイズを利用して、（ａ）〜（ｃ）の核酸と
ハイブリダイズしたｃＤＮＡを除去する工程を含むこと
を特徴とする方法に関する。（ａ）上記ｃＤＮＡライブラリーを作成しようとする組
織における存在量が多い、クラスＩ（アバンダント）及
びクラスＩＩ（インターメディエート）に属する核酸、
（ｂ）上記方法を用いて完全長ｃＤＮＡを含む集団から
ハイブリダイズを利用して分離された核酸−ｃＤＮＡか
ら回収された核酸、及び（ｃ）クラスＩＩＩ（レア）に
属するｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリー中のｃＤＮ
Ａまたはその転写物であるＲＮＡからなる核酸

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の方法では、存在量が多く
既知のｃＤＮＡ及び存在量は少ないが既知のｃＤＮＡを
除去して、配列決定の必要な、新規かつレアなｃＤＮＡ
の存在量を高めたｃＤＮＡライブラリーを作成するた
め、複数の完全長ｃＤＮＡを含む集団から、以下の
（ａ）〜（ｃ）の核酸（以下、核酸ドライバーとういこ
とがある）とのハイブリダイズを利用して、（ａ）〜
（ｃ）の核酸とハイブリダイズしたｃＤＮＡを除去す
る。前記（ａ）〜（ｃ）の核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡ
であることができるが、特に、（ａ）〜（ｃ）のＲＮＡ
（以下、ＲＮＡドライバーとういことがある）とのハイ
ブリダイズを利用して、（ａ）〜（ｃ）のＲＮＡとハイ
ブリダイズしたｃＤＮＡを除去することが好ましい。
（ａ）〜（ｃ）のＲＮＡとハイブリダイズするｃＤＮＡ
は、例えば、（ａ）〜（ｃ）のビオチン化ＲＮＡと、前
記完全長ｃＤＮＡを含む集団中のｃＤＮＡとをハイブリ
ダイズさせ、ハイブリダイズしたＲＮＡ−ｃＤＮＡが有
するビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用し
て、ハイブリダイズしたＲＮＡ−ｃＤＮＡをストレプト
アビジン被覆した磁気ビーズを用いることで、完全長ｃ
ＤＮＡを含む集団から除去することができる。（ａ）〜
（ｃ）のＲＮＡは、存在量が多く既知のｃＤＮＡ及び存
在量は少ないが既知のｃＤＮＡに対応するものであるの
で、これらのｃＤＮＡを除去することで、新規かつレア
なｃＤＮＡの存在量を高めることができる。ここでのハ
イブリダイゼーションは、例えば、フォルムアミド液中
３７℃から６０℃（Ｒｏｔ＝0.5〜200）、好ましくは４
２℃から４５℃（Ｒｏｔ＝5〜10）、もっともこのまし
くは４２℃（Ｒｏｔ=5）で行うことが適当である。

【００１０】一本鎖完全長ｃＤＮＡとハイブリダイゼー
ションさせるＲＮＡドライバーとしては、以下の（ａ）
〜（ｃ）のＲＮＡを用いる。（ａ）のＲＮＡドライバー
は、ｃＤＮＡライブラリーを作成しようとする組織にお
ける存在量が多い、クラスＩ（アバンダント）及びクラ
スＩＩ（インターメディエート）に属するＲＮＡであ
る。このようなＲＮＡとしては、例えば、出発材料のｍ
ＲＮＡを用いることができる。ｃＤＮＡ合成出発材料と
してのｍＲＮＡそのものを用いることで、ノーマライゼ
ーションとしてアバンダントに発現しているもの同士が
ハイブリッドを形成し、ｃＤＮＡを含む集団から除去さ
れる。

【００１１】（ｂ）のＲＮＡドライバーは、本発明の方
法を利用して、ハイブリダイズにより除去されたＲＮＡ
−ｃＤＮＡから別途、回収されたＲＮＡであり、主にク
ラスＩ及びクラスＩＩに属するｃＤＮＡに対応するＲＮ
Ａを含む。但し、ｃＤＮＡ（ｂ）のＲＮＡドライバー
は、量は少ないが、クラスＩＩＩに属するｃＤＮＡに対
応するＲＮＡも含む。（ｂ）のＲＮＡドライバーは、特
定の組織で高発現している遺伝子クローン（例えば、組
織特異的酵素の遺伝子クローン）やいくつかの組織に幅
広く発現している遺伝子クローン（例えば、ハウスキー
ピング遺伝子クローン）の約１０００から２０００種類
を in vitro で転写して得られるＲＮＡであることもで
きる。具体的には、出発材料としては９種類（すい臓、
肝臓、肺、腎臓、脳、脾臓、睾丸、小腸、胃）の組織か
らそれぞれミニライブラリーを作成して、９種類のミニ
ライブラリーを混合して得られた遺伝子クローンは、上
記特定の組織で高発現している遺伝子クローンといくつ
かの組織に幅広く発現している遺伝子クローンとなり得
る。ｃＤＮＡのin vitroでの転写は、公知の方法を用い
て行うことができる。（ｃ）のＲＮＡドライバーは、ク
ラスＩＩＩ（レア）を含むｃＤＮＡライブラリー中のｃ
ＤＮＡに対応するＲＮＡである。クラスＩＩＩ（レア）
に属するｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリーは、既存
のライブラリーとして存在する。（ｃ）のＲＮＡドライ
バーを併用することで、存在量が多く既知のｃＤＮＡの
みならず、存在量は少ないが既知のクラスＩＩＩ（レ
ア）に属するｃＤＮＡも除去できる。クラスＩＩＩ（レ
ア）に属するｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリーとし
ては、例えば、理研でカタログ化したｃＤＮＡライブラ
リーを挙げることができ、このライブラリーを in vitr
o で転写して得られるＲＮＡを（ｃ）のＲＮＡドライバ
ーとして用いることができる。ｃＤＮＡのin vitroでの
転写は、公知の方法を用いて行うことができる。

【００１２】これらのＲＮＡはいずれもビオチンで標識
し、第１鎖ｃＤＮＡとハイブリダイゼーションを行うこ
とができる。ＲＮＡのビオチンによる標識は、市販のＲ
ＮＡのビオチンによる標識化キット（ＬａｂｅｌＩＴ
（商標）ＢｉｏｔｉｎＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
ＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ、ＭｕｒｕｓＣｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ）を用いて行うことができる。

【００１３】ビオチンで標識したＲＮＡとｃＤＮＡとの
ハイブリダイゼーションは、上記（ａ）〜（ｃ）のＲＮ
Ａを含む混合物と一本鎖完全長ｃＤＮＡを含む集団とを
所定温度で混合することで行うことができる。さらに、
ハイブリダイゼーション後、ビオチンと結合するストレ
プトアビジンを被覆したマグネットビーズを用い、ビオ
チン標識したＲＮＡとハイブリッドしたｃＤＮＡを除
く。このようにして得られた上清について第２鎖ｃＤＮ
Ａ合成を行い、いわゆるレアな種類のｃＤＮＡの存在割
合の多いｃＤＮＡライブラリーを単離することができ
る。尚、上記ハイブリダイゼーション及びマグネットビ
ーズを用いるビオチン標識したＲＮＡとハイブリッドし
たｃＤＮＡの除去は、必要により、２回以上繰り返し行
い、いわゆるレアな種類のｃＤＮＡの存在割合をさらに
高めることもできる。このように、３つのカテゴリー
〔（ａ）〜（ｃ）〕のＲＮＡをノーマライゼーション／
サブトラクションの対象として用い、ノーマライゼーシ
ョン／サブトラクションを行うことで、一本鎖完全長ｃ
ＤＮＡを含む集団から、新規な完全長ｃＤＮＡの存在割
合の高いｃＤＮＡライブラリーを作成することができ
る。

【００１４】尚、一本鎖完全長ｃＤＮＡを含む集団は、
例えば、特開平１０−１２７２９１号公報に記載の方法
を用いて作成したものであることができる。特開平１０
−１２７２９１号公報に記載の完全長cDNAライブラリー
の作成方法は、mRNAの完全長に対応するcDNAのライブラ
リーを作成する方法であって、mRNAを鋳型とし、oligo
dT等のプライマーより逆転写によりRNA-DNA 複合体を形
成する工程、RNA-DNA複合体を形成しているmRNAの5'Cap
(^7MeG_pppN)サイトに存在するジオール構造に、タッグ
になる分子を化学結合させる工程、及びタッグ分子を結
合したRNA-DNA複合体の内、mRNAの完全長に対応するDNA
を有するRNA-DNA 複合体を、タッグ分子の機能を利用
して分離する工程を含むものである。尚、逆転写により
RNA-DNA複合体を形成する工程をトレハロースの存在下
に行うことで、より長鎖のｃＤＮＡも全長鎖として得ら
れるという利点がある。さらにこの逆転写反応は、例え
ば、４０℃から８０℃で行うことが好ましい。

【００１５】タッグ分子を結合させたmRNAの調製は、例
えば、 mRNAの5'Cap サイトに存在するジオール構造を
過ヨウ素酸ナトリウムで酸化開環してジアルデヒドと
し、次いでヒドラジン末端を有するタッグ分子を前記ジ
アルデヒドと反応させることで行うことができる。ま
た、ヒドラジン末端を有するタッグ分子は、例えば、ヒ
ドラジン末端を有するビオチン分子（ビオチンヒドラザ
イド）またはヒドラジン末端を有するアビジン分子（ア
ビジンヒドラザイド）であることができる。上記方法で
は、１本鎖RNA を切断するRNA 分解酵素でタッグ分子を
結合したRNA-DNA 複合体を消化して、mRNAの完全長に対
応しないDNA を有する複合体の１本鎖RNA 部を切断して
この複合体からタッグ分子を切除し、次いで、タッグ分
子を有するmRNAの完全長に対応するDNA を有する複合体
を分離することができる。また、タッグ分子がmRNAの5'
Cap サイトに存在するジオール構造と結合可能な官能基
を有するビオチン分子である場合、固相支持体上に担持
したアビジンと、RNA-DNA 複合体がタッグ分子として有
するビオチン分子との結合性を利用して、mRNAの完全長
に対応するDNA を有する複合体を分離することができ
る。タッグ分子がmRNAの5'Cap サイトに存在するジオー
ル構造と結合可能な官能基を有するアビジン分子である
場合には、固相支持体上に担持したビオチンと、RNA-DN
A 複合体がタッグ分子として有するアビジン分子との結
合性を利用して、mRNAの完全長に対応するDNA を有する
複合体を分離することができる。また、１本鎖RNA を切
断するRNA 分解酵素としてはリボヌクレアーゼＩを挙げ
ることができる。また分離されたmRNAの完全長に対応す
るDNA を有する複合体から、１本鎖完全長cDNAを回収す
ることができ、さらに、分離されたmRNAの完全長に対応
するDNA を有する複合体に、タバコモザイクウィルスア
ルカリホスファターゼを反応させることによりCap サイ
トよりタッグ分子を切り離すことにより、１本鎖完全長
cDNAを回収することができる。１本鎖完全長cDNAの回収
を、分離されたmRNAの完全長に対応するDNA を有する複
合体に、DNA-RNA ハイブリッドのRNA 鎖を切断する為、
RNase を作用させることにより行うこともできる。DNA-
RNA ハイブリッドのRNA 鎖を切断するRNaseは、例え
ば、RNase H であることができる。

【００１６】回収された第１の１本鎖完全長cDNA鎖を鋳
型として、第２のcDNA鎖を合成する。但し、本発明で
は、回収された第１の１本鎖完全長cDNA鎖に対して、上
記ノーマライゼーション／サブトラクションを施し、重
複の少ないcDNA集団とし、これを第２のcDNA鎖の合成用
の鋳型として用いる。得られた第２のcDNA鎖を合成後、
完全長二重鎖cDNAをクローニングすることができる。こ
の場合、第１のcDNA鎖の3'端にRNA またはDNA のオリゴ
マーをライゲーションして得られたcDNA鎖を鋳型とし、
かつライゲーションしたオリゴマーの相補鎖オリゴマー
をプライマーとして、第２のcDNA鎖の合成を行なうこと
ができる。3'端に鋳型なしにポリG 、ポリC 、ポリA 、
又はポリT を合成できる酵素を用いて第１のcDNA鎖の3'
端にポリG、ポリC 、ポリA 、又はポリT を付加したcDN
A鎖を鋳型とし、かつ各々に相補的なオリゴC 、オリゴG
、オリゴT 、又はオリゴA をプライマーとして、第２
のcDNA鎖の合成を行うことができる。3'端に鋳型なしに
ポリG 、ポリC 、ポリA 、又はポリT を合成できる酵素
は、例えば、ターミナルヌクレオチドトランスフェラー
ゼであることができる。

【００１７】更に、ｃＤＮＡライブラリーを作成する方
法では、レアなｃＤＮＡクローンはサイズの大きいもの
が多いことから、従来のλＰＳベクターを改良したλＰ
Ｓベクターを用いることができる。即ち、前記完全長ｃ
ＤＮＡを含む集団から（ａ）〜（ｃ）のｃＤＮＡを除去
して得られたｃＤＮＡを、長鎖ｃＤＮＡもクローニング
できるように改良したλＰＳベクターを用いてクローニ
ングして、ｃＤＮＡライブラリーを作成することができ
る。また、前記改良したλＰＳベクターは、λＰＳベク
ターの左アームに６Ｋｂのスタッファー断片を挿入した
ベクターであることができる。このような改良したλＰ
Ｓベクターを用いることで、大きなサイズのｃＤＮＡで
もクローニングできるようになる。

【００１８】

【実施例】以下本発明を実施例によりさらに説明する。比較例（標準ｃＤＮＡライブラリーの作成） mRNA調製マウス（Ｂ５７ＢＬ／６）各器官または組織（表１に名
前とＩＤを示す）0.5〜1gを10mlの懸濁液でホモジェナ
イズし、pH4.0 の 2M 酢酸ナトリウム1ml と、同量のフ
ェノール/ クロロホルム( 体積比5:1)混液を加え抽出し
た。抽出後水層に同量のイソプロパノールを加えると、
RNA が水相から分離沈澱した。この試料を氷の上で１時
間インキュベーションした後、15分間4000rpm で冷却遠
心機にかけ、沈澱物を回収した。この検体を70％エタノ
ールで洗い、8ml の水に溶解後2mlの5MNaCl、1 ％CTAB
(cetyltrimethylammonium bromide)、4M尿素、50mMTris
を含むpH7.0 の水溶液16mlを加えることでRNA を沈澱さ
せ、ポリサッカライドを除いた(CTAB 沈澱) 。続いて室
温で4000rpm 、15分間遠心機にかけ、RNA を4ml の7M
グアニジン−Clに溶解した。そして２倍量のエタノール
を加えた後、氷上で１時間インキュベーションし、15分
間4000rpm 遠心機にかけ、生じた沈澱物を70％エタノー
ルで洗いRNA を回収した、これを再度水に溶解し、RNA
の純度をOD比260/280(>1.8) と230/260(<0.45)を読むこ
とによって計測した。

【００１９】第１鎖cDNAの調製 15μg のmRNAを使ってSuperscript II (Gibco BRL) 300
0unit により、最終容量165μl の反応液中で、5-メチ
ル-dCTP 、dATP、dTTP、dGTP各々0.54mM、0.6Mトレハロ
ース、50mMTris-HCl（pH8.3 ）、75mM KCl、3mM MgCl2
、10mM DTT、52ng/ μl BSA 、RNase インヒビター 5
unit の条件下で逆転写反応を行った。Xho I の認識配
列を含むオリゴヌクレオチド（ライブラリーＩＤ06なら
びに12については1st ＮＸプライマーを、またライブラ
リーＩＤ22・23・24・25・26については1st ＢＳプライ
マーを用いる、表１参照）12.6μl をプライマーとして
用いた。なお、1st プライマーの配列は次の通りであ
る。1st ＮＸ：５'-GAGAGAGAGAGCGGCCGCAACTCGAG(T)16V
N-３'（44mer; V=A,G,C; N=A, G, C,T;制限酵素部位Not
I, XhoI）、1st ＢＳ：５'-GAGAGAGAGAAGGATCCAAGAGCTC
(T)16VN-３'（43mer; V=A,G,C; N=A, G, C,T;制限酵素
部位BamHI, SstI）。この反応を始める際、反応液の1
/4 を採取し、それに1.5 μl の［α-32P］-dGTP （300
0Ci/mmol 、10μCi/ μl 、Amersham）を加えるここと
により、第１鎖cDNAの合成効率を測定した。RI標識した
反応液の0.5 μl をDE-81 ペーパー上にスポットし、0.
5Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0 ）で3 回洗った前後
のRI活性を測定し、計算した。その後、RI標識した反応
液と非標識の反応液を混合し、0.5M EDTA 8μl 、10%
SDS 2μl 、プロテイナーゼ(Proteinase)K 20μg を加
え、45℃で15分間加熱した。フェノール／クロロホルム
による抽出、エタノール沈澱後、沈澱をRNase フリーに
処理してある水（以下RNase フリー水とする）47μl に
溶解した。

【００２０】RNA ジオールのビオチン化 RNA のジオール部位（Cap 構造のある5 ’末端と、ポリ
A 鎖のある3 ’末端のリボースの双方に存在）にビオチ
ンを結合させるために、２段階の反応を行った。それら
は、ジオール基の酸化とそれに続くビオチンヒドラジト
と酸化RNA 体のカップリング反応である。まず、逆転写
反応で得られたRNA-第１鎖cDNA複合体 15 μg を、6.6m
M 酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.5 ）と、酸化剤として過
ヨウ素酸ナトリウムを用いて50μlの反応液中で処理す
る。この酸化反応は遮光条件の元、氷上で45分間行う。
続いて、5M塩化ナトリウム11μl 、10%SDS 0.5μl 、そ
して同量のイソプロパノールを加え、60分間氷上に放置
した後、4 ℃で15分間15000rpm遠心し沈澱させる。沈澱
物は70％エタノールで洗い、RNase フリー水50μl に再
溶解させる。その試料に1M酢酸ナトリウム（pH6.1 ）5
μl 、10％SDS 5 μl 、10mMビオチンヒドラジド（Sigm
a 社）150 μl を加え、室温（22-26 ℃）で終夜反応さ
せる。最後に、5M NaCl 5 μl 、1M酢酸ナトリウム（pH
6.1 ）75μl 、および2.5 倍量のエタノールを加え、1
時間の氷上冷却後、4 ℃において15分間遠心し、ビオチ
ン化したRNA-DNA 複合体を再沈澱させる。沈澱物は70％
エタノールで１回、更に80％エタノールで１回洗い、RN
ase フリー水70μl に溶解する。

【００２１】RNase Ｉによる完全長cDNAの選択１本鎖RNA を消化するRNase Ｉで処理することにより、
逆転写反応時に完全なcDNAの伸長が得られなかったmRN
A、およびmRNAの3 ’末端に標識されたビオチン残基を
取り除いた。具体的には、ビオチン化反応で得られた試
料70μl に10×RNase Ｉバッファー（100mM Tris-HCl
(pH7.5)、50mM EDTA 、2M NaOAc）10μl 、RNase Ｉ（R
Nase One TM:Promega社）200unit を加えて、37℃で15
分間1 本鎖RNA を消化した。

【００２２】完全長cDNAの採取ストレプトアビジンコートしたマグネティックビーズに
cDNAが非特異的吸着するのを防止するため、100 μg の
酵母tRNA（DNase I 処理したもの）を5mg （500 μl ）
のマグネティックビーズ（magnetic porous glass (MP
G) particles coated with streptavidin (CPG,NJ) ）
に加え、1 時間氷上に放置した後、50mM EDTA 、2M NaC
lの溶液にて洗った。このビーズを50mM EDTA 、2M NaCl
の溶液500μl 中に懸濁し、RNase I 処理を施されたcD
NAを加えた。室温にて30分間撹拌することで、マグネテ
ィックビーズと完全長cDNAを結合させた。完全長cDNAを
捕獲したビーズを50mM EDTA 、2M NaCl の溶液で4 回、
0.4 ％ SDS、50μg/μl 酵母tRNAで1 回、10mM NaCl 、
0.2mM EDTA、10mM Tris-HCl （pH7.5 ）、20% グリセロ
ールで1 回、50μg/μl 酵母tRNA水溶液で1 回、RNase
H バッファー（20mMTris-HCl(pH7.5)、10mM MgCl₂、 2
0mM KCl 、0.1mM EDTA、0.1mM DTT ）で1回洗浄した
後、RNase Hバッファー 100μl に懸濁し、RNase H 3 u
nitを加え、37℃下30分間加温した。その後、10% SDS 1
μl 、0.5M EDTA 2 μl を加えて、10分間、65℃に曝
し、その上清を回収した。このようにして回収された1
本鎖完全長cDNAはフェノール／クロロホルムで抽出さ
れ、スピードバッグにて液量を100 μl 以下に減じてか
らG25/G100 Sephadex クロマトグラフィーに付した。RI
活性を持った分画はシリコン処理したマイクロチューブ
に収集するとともに、グリコーゲン2 μg を加え、エタ
ノール沈澱にて得られた沈澱物を30μl の超純水に溶解
した。

【００２３】１本鎖cDNAへのオリゴdG付加上記により回収された１本鎖cDNA30μl は、最終容量50
μl の反応液中で、200mM カコジル酸ナトリウム（pH6.
9 ）、1mM MgCl₂、1mM CoCl₂、1mM 2-メルカプトエタ
ノール、100 μM dGTPの条件のもと、ターミナルデオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TaKaRa社）32 u
nit を用いて37℃で30分間のオリゴdG付加反応に付され
た。反応終了時にEDTAを50mMとなるように加え、一連の
フェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱
を経て、31μl の超純水に溶解した。

【００２４】第２鎖cDNA合成第１鎖cDNAを鋳型にした第２鎖cDNAの合成は以下のよう
に行った。最終容量60μlの反応系で、第２鎖低バッフ
ァー（200mM Tris-HCl (pH8.75) 、100mM KCl、100mM
(NH₄)₂SO₄、20mM MgSO₄、1% Triton X-100 、1mg/μlBS
A） 3μl、第２鎖高バッファー（200mM Tris-HCl (pH9.
2)、600mM KCl 、20mM MgCl₂） 3μl、dCTP、dATP、dTT
P、dGTP各々0.25mM、β-NADH 6 μl 、オリゴdG付加さ
れた第１鎖cDNA31μl 、第２鎖プライマー- アダプター
（ライブラリーＩＤ6・12については2nd ＡＴを、ライ
ブラリーＩＤ22・23・24・25・26については 2ndＸを用
いた、表１を参照）600ng を加え、Ex Taq DNAポリメラ
ーゼ（TaKaRa Ex Taq ：TaKaRa社）15 unit、耐熱性DNA
リガーゼ（Ampligase: Epicentre） 150 unit、耐熱性
RNase H（Hybridase ：Epicentre ） 3 unit によって
第２鎖cDNAを合成した。0.5M EDTAを 1μl 加えること
で反応を停止させ、更に蛋白成分を溶解するために、10
% SDS 1 μl 、プロテイナーゼ(Proteinase) K 10 μg
の存在下に45℃で15分間加熱し、最終的にフェノール／
クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱にて精製した
２本鎖完全長cDNAを得た。なお、2nd プライマーの配
列は次の通りである。2nd ＡＴ：５'-GAGAGAGAGAAGGATC
CAAGAGCTCAATTAATTAATTAAACCCCCCCCCCC -３'（51mer;
制限酵素部位BamHI, SstI）、2nd Ｘ：５'-GAGAGAGAGAT
TCTCGAGTTAATTAAATTAATCCCCCCCCCCCCC-３'（45mer;制限
酵素部位XhoI, C13）。

【００２５】以上の方法により得られた二本鎖完全長cD
NAは、λZAPIIIベクターに挿入し、ライブラリーとして
回収した。λZAPIIIベクターはλZAPII (STRATAGENE)ベ
クターのマルチクローニングサイトの一部の配列AAAAGC
TGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGG
CTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAをAAAA
GCTGGAGCTATGGCCCTTATGGCCGAGCTCGCGGCCGCGAATTCCTCGAG
GGCCGATTTGGCCAATCGAGに改変し、二つのSfiIサイトを新
たに導入したものである。

【００２６】実施例（ノーマライゼーション／サブトラクション）比較例で
は、ライブラリー作成時にノーマライゼーション／サブ
トラクションはせず、ベクターとしてはλZAPIIIを用い
た。本実施例においては、比較例と同様の方法であっ
て、ベクターとしてλZAPIII以外にλPS(RIKEN)を用い
るとともに、ライブラリー作成時にはノーマライゼーシ
ョン／サブトラクションを行った。λPS(RIKEN)（λ-FL
C-1と命名（FLCとはFULL-LENGTH cDNAを意味する））と
は、MoBiTec（ドイツ）のλPSベクターをｃＤＮＡ用に
改変したものである。即ち10 kbp stufferの両側に存在
するクローニングサイトにｃＤＮＡ挿入に便利なBamHI
ならびにSalIを各々導入するとともに、0.5kbから13kb
程度までのｃＤＮＡがクローニングできるようにXbaIサ
イトに6kbのＤＮＡ断片を挿入したものである（図
１）。このλ-FLC-1を用いると、例えば肺臓ｃＤＮＡラ
イブラリーの場合には、インサートの平均鎖長は2.57kb
となり、実際に0.5kbから12kbまでのインサートをクロ
ーニングすることが出来た。従来法のλZAPの場合に
は、インサートの平均鎖長は0.97kbであったことから、
λ-FLC-1を用いることによって、サイズの大きなｃＤＮ
ＡもλZAPに比べて効率よくクローニングできることが
わかる。

【００２７】以下ｃDNAライブラリーのノーマライゼー
ション／サブトラクションについて説明する。ドライバ
ーの調製：出発材料として用いたｍRNA〔（ａ）ＲＮＡ
ドライバー〕及びin vitro転写反応で作成したRNAをド
ライバーとして用いた。後者のRNAはさらに２種類
〔（ｂ）及び（ｃ）ＲＮＡドライバー〕に分けられる。
１つはノーマライゼーションにより除かれたRNA−ｃDNA
からｃDNAを回収し、ファージベクターにクローニング
する。大腸菌に感染後１つの出発材料あたり１０００か
ら２０００プラークを混ぜ合わせて１つのライブラリー
（ミニライブラリー）とし、常法によりプラスミドDNA
に変換する（ファージをヘルパーファージとともに再度
大腸菌に感染させ、ファージミドとし、さらにもう一度
感染させてプラスミドDNAを得る）。得られたDNAについ
てin vitro転写反応（T3RNAポリメラーゼまたはT7RNAポ
リメラーゼを用いる）を行い、DNase I （RQ1-RNase fr
ee、 Promega）、ProteinaseK処理後、フェノール/クロ
ロホルム抽出をしてRNA〔（ｂ）ＲＮＡドライバー〕を
得る。この際、通常出発材料としては９種類（すい臓、
肝臓、肺、腎臓、脳、脾臓、睾丸、小腸、胃）の組織か
らそれぞれミニライブラリーを作成して、９種類のミニ
ライブラリーを混合してRNAを得る。もう一つのRNAはす
でに重複のないクローンとして保存されているライブラ
リー（クローン数約２万個）を培養し、得られたDNAに
ついて(b) ＲＮＡドライバーと同様にin vitro転写反応
を行ったものである〔（ｃ）ＲＮＡドライバー〕。これ
ら３種のRNAは、Label-IT Biotin Labeling Kit (Mirus
Corporation)を用いてビオチン化標識を行ったあと、
１：１：１の割合でテスターｃDNAに添加し、Rot１０で
の反応（42℃）を行い、ストレプトアビジンビーズ(CP
G)処理を行って回収した上清について、第２鎖の合成を
行った。

【００２８】図２はマウス膵臓から作成した全長鎖ｃＤ
ＮＡの分布について、ノーマライゼーション／サブトラ
クションの効果をみたものである。この図からも明らか
なようにノーマライゼーション／サブトラクションを導
入することによって、サイズの大きな全長鎖ｃＤＮＡ
が、従来サイズの小さな全長鎖ｃＤＮＡだけであったも
のに加えて認められるようになる。表１に、ノーマラ
イゼーション／サブトラクションを用いずに作成したｃ
ＤＮＡをλZAPにクローニングし、全長鎖ｃＤＮＡの割
合などを調べた結果(スタンダード)とノーマライゼーシ
ョン／サブトラクションを用いて作成したｃＤＮＡをλ
ZAPにクローニングし、全長鎖ｃＤＮＡの割合などを調
べた結果(ノーマライゼーション／サブトラクション)を
示す。この結果から、ノーマライゼーション／サブトラ
クションの有無で、完全長翻訳領域を持つクローン数
（Ｂ）に対するヒット数（Ａ）〔Ｂ／Ａ〕にほとんど変
化はなく、ノーマライゼーション／サブトラクションの
有無で、全長鎖ｃＤＮＡの割合などには変化がないこと
がわかる。

【００２９】

【表１】

【００３０】（シークエンシング用ＤＮＡの調製とシー
クエンシング）Ｑボットマシンで釣菌し培養した各ｃＤ
ＮＡクローンからのプラスミドＤＮＡは、多試料の処理
に適した簡便で迅速な伊藤らの方法で調製した（Itoh
ら：Nucleic Acids Res. 25 (1997) 1315-1316）。ま
た、塩基配列の決定は dye-terminator 法によりＡＢＩ
ー３７７ならびにＲＩＳＡを用いて行った（第２１回日
本分子生物学年会抄録１Ｐー５７０（１９９８年１２月
横浜））。

【００３１】（コンピューターによる解析）５'末端ま
たは３'末端100b以上シーケンシングして得られた配列
について、理化学研究所末端配列データベースと照合し
（末端の100bについて、３'末端についてはポリＡテー
ルを除く100bについて、BLASTの P valueが10^-25以下の
ものを同一と見做す。相同性に換算すると88％以上に相
当する。）、未登録のものについて更にＮＣＢＩのGenB
ank、EMBL、DDBJ、PDB各塩基配列データベースならびに
マウスＥＳＴ・ヒトＥＳＴデータベースとの検索（末端
の100bについて、３'末端についてはポリＡテールを除
く100bについて、BLASTの P valueが10^-10以下のものを
既知と見做す。相同性に換算すると約75％以上に相当す
る。）を行った。表２は、胃、舌、１０日目胚から作成
したライブラリーについて、本発明のノーマライゼーシ
ョン／サブトラクションの効果を評価したものである。
表中、クローン数は配列決定を行ったクローン数であ
り、この中から重複を排除して残ったクローン数をユニ
ークと表示した。重複度は（ユニークなクローン数）／
（配列決定を行ったクローン数）である。例えば、胃の
場合、スタンダードでは、ユニークは８３８個中３３３
個（重複度２．５２）であったのに対して、本発明のノ
ーマライゼーション／サブトラクションを用いた場合、
ユニークは８４９個中５９２個（重複度１．４３）であ
った。即ち、ノーマライゼーション／サブトラクション
を用いることで重複度を低減できることが分かる。さら
に、表中の非ＥＳＴとは、クローン中の新規な配列の割
合である。例えば、胃の場合、スタンダードでは、３３
３個のユニーク中に３８個（１１．４％）の新規配列を
有するクローンが含まれていた。一方、本発明のノーマ
ライゼーション／サブトラクションを用いた場合、５９
２個のユニーク中に９８個（１６．５％）の新規配列を
有するクローンが含まれていた。即ち、本発明のノーマ
ライゼーション／サブトラクションを用いた方法では、
新規配列を有するクローンの個数の割合が約3倍になっ
ている。このように、ノーマライゼーション／サブトラ
クションを行うことによって、重複のないｃＤＮＡが単
離しやくなり、より効率よくカタログ化されたライブラ
リーを作成できる。また、ＥＳＴとして未登録である新
規なｃＤＮＡの割合も増加する。

【００３２】

【表２】

【００３３】

【発明の効果】本発明の方法によれば、全長鎖ｃＤＮＡ
ライブラリーの作成に際して、重複のないｃＤＮＡが単
離しやくなり、ライブラリーサイズを大きくしても重複
のないカタログ化が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】新規ベクターλ-FLC-1の制限酵素地図。

【図２】マウス膵臓から作成したｃＤＮＡ標品の電気泳
動ゲルパターン。右側はノーマライゼーション／サブト
ラクションを行ったもの、左側はノーマライゼーション
／サブトラクションを行っていないコントロール。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】複数の完全長ｃＤＮＡを含む集団から、
新規な完全長ｃＤＮＡの存在割合の高いｃＤＮＡライブ
ラリーを作成する方法であって、前記完全長ｃＤＮＡを
含む集団から、以下の（ａ）〜（ｃ）の核酸とのハイブ
リダイズを利用して、（ａ）〜（ｃ）の核酸とハイブリ
ダイズしたｃＤＮＡを除去する工程を含むことを特徴と
する方法。（ａ）上記ｃＤＮＡライブラリーを作成しようとする組
織における存在量が多い、クラスＩ（アバンダント）及
びクラスＩＩ（インターメディエート）に属する核酸、
（ｂ）上記方法を用いて完全長ｃＤＮＡを含む集団から
ハイブリダイズを利用して分離された核酸−ｃＤＮＡか
ら回収された核酸、及び（ｃ）クラスＩＩＩ（レア）に
属するｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリー中のｃＤＮ
Ａまたはその転写物であるＲＮＡからなる核酸
【請求項２】（ａ）〜（ｃ）の核酸がＲＮＡである請
求項１に記載の方法。
【請求項３】（ａ）〜（ｃ）のＲＮＡがビオチン化Ｒ
ＮＡであり、このビオチン化ＲＮＡを前記完全長ｃＤＮ
Ａを含む集団中のｃＤＮＡとハイブリダイズさせ、ハイ
ブリダイズしたＲＮＡ−ｃＤＮＡをストレプトアビジン
被覆した磁気ビーズを用いて前記集団から除去する請求
項２に記載の方法。
【請求項４】前記完全長ｃＤＮＡを含む集団から
（ａ）〜（ｃ）の核酸とハイブリダイズしたｃＤＮＡを
除去して得られたｃＤＮＡを、長鎖ｃＤＮＡもクローニ
ングできるように改良したλＰＳベクターを用いてクロ
ーニングして、ｃＤＮＡライブラリーを作成する請求項
１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】前記改良したλＰＳベクターが、λＰＳ
ベクターの左アームに６Ｋｂのスタッファー断片を挿入
したベクターである請求項４記載の方法。