JP2000300281A - 好熱性鎖置換増幅による細胞中の核酸の検出 - Google Patents
好熱性鎖置換増幅による細胞中の核酸の検出Info
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
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Abstract
(57)【要約】
【課題】好熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）を用いて、二本
鎖標的配列を増幅する方法を提供する。 【解決手段】二本鎖ＨＩＶｇａｇ標的配列を増幅する方
法であって、 （ａ）配列番号：１の標的結合配列を含む第一増幅プラ
イマーを該標的配列の第一鎖上の標的配列に対して３′
にハイブリッド形成させ、そして配列番号：２の標的結
合配列を含む第二増幅プライマーを該標的配列の第二鎖
上の標的配列に対して３′にハイブリッド形成させ； （ｂ）第一および第二増幅プライマーをポリメラーゼに
よって伸長させて、第一および第二増幅プライマー伸長
生成物を生成し； （ｃ）第一および第二増幅プライマー伸長生成物を標的
配列から置換し；そして （ｄ）標的配列が増幅されるように、ハイブリッド形
成、伸長および置換の工程を繰返す工程を含む上記方
法。
鎖標的配列を増幅する方法を提供する。 【解決手段】二本鎖ＨＩＶｇａｇ標的配列を増幅する方
法であって、 （ａ）配列番号：１の標的結合配列を含む第一増幅プラ
イマーを該標的配列の第一鎖上の標的配列に対して３′
にハイブリッド形成させ、そして配列番号：２の標的結
合配列を含む第二増幅プライマーを該標的配列の第二鎖
上の標的配列に対して３′にハイブリッド形成させ； （ｂ）第一および第二増幅プライマーをポリメラーゼに
よって伸長させて、第一および第二増幅プライマー伸長
生成物を生成し； （ｃ）第一および第二増幅プライマー伸長生成物を標的
配列から置換し；そして （ｄ）標的配列が増幅されるように、ハイブリッド形
成、伸長および置換の工程を繰返す工程を含む上記方
法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸の増幅、特
に、形態学的に完全な細胞中の核酸の増幅に関する。
に、形態学的に完全な細胞中の核酸の増幅に関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸増幅技術は、少量の核酸の検出およ
び分析のための強力な手段を提供してきた。このような
方法の極端な感度は、伝染病および遺伝病の初期診断、
分析用の遺伝子の単離、並びに法医学における特定の核
酸の検出のためにそれらを開発する試みをもたらしてき
た。核酸増幅技術は、その手順の温度要求条件にしたが
って分類されうる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および転写に基く増幅は、
増幅用に一本鎖標的分子を再生するのに、高温（８５℃
〜１００℃）〜低温（３０℃〜４０℃）の反応の反復循
環を必要とする。対照的に、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、自
己持続配列複製（３ＳＲ）およびＱβレプリカーゼシス
テムなどの方法は、一定温度で行うことができる等温反
応である。
び分析のための強力な手段を提供してきた。このような
方法の極端な感度は、伝染病および遺伝病の初期診断、
分析用の遺伝子の単離、並びに法医学における特定の核
酸の検出のためにそれらを開発する試みをもたらしてき
た。核酸増幅技術は、その手順の温度要求条件にしたが
って分類されうる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および転写に基く増幅は、
増幅用に一本鎖標的分子を再生するのに、高温（８５℃
〜１００℃）〜低温（３０℃〜４０℃）の反応の反復循
環を必要とする。対照的に、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、自
己持続配列複製（３ＳＲ）およびＱβレプリカーゼシス
テムなどの方法は、一定温度で行うことができる等温反
応である。
【０００３】ＰＣＲにおいて、反応温度は、プライマー
伸長後に上昇して、新たに合成された鎖を鋳型から分離
する。次に、温度を低下させてプライマーを再アニーリ
ングし且つ伸長過程を繰返す。したがって、ＰＣＲ反応
工程は、反応の温度束縛の結果として、不連続の相また
はサイクルで起こる。対照的に、鎖置換増幅（ＳＤＡ）
では、プライマーの伸長、一本鎖伸長生成物の置換、伸
長生成物（または元の標的配列）に対するプライマーの
アニーリング、および引き続きのプライマーの伸長は、
反応配合物中で同時に起こる。従来のＳＤＡ（より低温
で、通常は約３５〜４５℃で行われる）は、G.T.ウォー
カー（Walker）ら（1992a.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,
392-396 および 1992b.Nuc.Acids.Res.20,1691-1696）
によって記載されている。ＳＤＡ反応の好熱性変法（ｔ
ＳＤＡ、以下に記載）が最近になって開発されており、
それは、熱安定ポリメラーゼおよび制限エンドヌクレア
ーゼを用いて、より高いがなお一定の温度で行われる。
伸長後に上昇して、新たに合成された鎖を鋳型から分離
する。次に、温度を低下させてプライマーを再アニーリ
ングし且つ伸長過程を繰返す。したがって、ＰＣＲ反応
工程は、反応の温度束縛の結果として、不連続の相また
はサイクルで起こる。対照的に、鎖置換増幅（ＳＤＡ）
では、プライマーの伸長、一本鎖伸長生成物の置換、伸
長生成物（または元の標的配列）に対するプライマーの
アニーリング、および引き続きのプライマーの伸長は、
反応配合物中で同時に起こる。従来のＳＤＡ（より低温
で、通常は約３５〜４５℃で行われる）は、G.T.ウォー
カー（Walker）ら（1992a.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,
392-396 および 1992b.Nuc.Acids.Res.20,1691-1696）
によって記載されている。ＳＤＡ反応の好熱性変法（ｔ
ＳＤＡ、以下に記載）が最近になって開発されており、
それは、熱安定ポリメラーゼおよび制限エンドヌクレア
ーゼを用いて、より高いがなお一定の温度で行われる。
【０００４】ＳＤＡによる増幅の標的は、ＳＤＡ反応で
用いられるエンドヌクレアーゼを用いて、より大きい核
酸をフラグメント化することによって製造することがで
きる。しかしながら、標的が、フラグメント化に必要な
制限エンドヌクレアーゼ認識部位に隣接していない場
合、ＳＤＡにおいてニッキングするのに適当な制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位を有する標的核酸は、ウォーカ
ーら（1992b，上記）および米国特許第5,270,184号明細
書で記載されたように生じることができる。ＳＤＡの場
合と同様、標的生成反応の個々の工程は、同時に且つ連
続的に起こり、ＳＤＡにおいて制限酵素によってニッキ
ングするのに必要な末端認識配列を含む標的配列を生じ
る。ＳＤＡ反応の成分全部が標的生成反応中に存在する
ので、生成された標的配列は自動的に且つ連続的にＳＤ
Ａサイクルに入り且つ増幅される。
用いられるエンドヌクレアーゼを用いて、より大きい核
酸をフラグメント化することによって製造することがで
きる。しかしながら、標的が、フラグメント化に必要な
制限エンドヌクレアーゼ認識部位に隣接していない場
合、ＳＤＡにおいてニッキングするのに適当な制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位を有する標的核酸は、ウォーカ
ーら（1992b，上記）および米国特許第5,270,184号明細
書で記載されたように生じることができる。ＳＤＡの場
合と同様、標的生成反応の個々の工程は、同時に且つ連
続的に起こり、ＳＤＡにおいて制限酵素によってニッキ
ングするのに必要な末端認識配列を含む標的配列を生じ
る。ＳＤＡ反応の成分全部が標的生成反応中に存在する
ので、生成された標的配列は自動的に且つ連続的にＳＤ
Ａサイクルに入り且つ増幅される。
【０００５】in situ 核酸分析法は、形態学的に完全な
細胞中の特定の核酸配列の検出および局在化を可能にす
る。これらの方法は、例えば、米国特許第4,888,278号
明細書で記載のように、標識されたプローブの直接ハイ
ブリダイゼーションに基いて慣用的に用いられてきた。
しかしながら、このような直接ハイブリダイゼーション
法は、目的の核酸に特異的であるが、いずれの場合に
も、極めて低いコピー数の核酸を検出するほど十分に感
受性ではない。極めて低いコピー数を検出する手段とし
ては、in situ 検出前の標的配列の in situ 増幅が極
めて興味深かった。in situ 核酸増幅法は、細胞が増幅
生成物を濃縮するので従来の溶液増幅よりも感受性であ
る可能性があり、したがって、増幅生成物が自由に拡散
する場合またはそれらが、目的の配列を含まない細胞内
容物によって希釈される場合に可能であるよりも少ない
分子の検出を可能にする。核酸は、標的配列の検出前に
細胞から抽出される必要がないので、in situ 法は、集
団中のどの細胞が特定の核酸を含んでいるかに関する情
報を提供し且つ細胞の生化学的および形態学的特性に関
しての核酸の分析を更に可能にする。in situ 増幅法
は、主としてＰＣＲについて開発されてきた（Ｏ．バス
ガラ（Basgara）およびＲ．ポメランツ（Pomerantz），
1993年，AIDS Research and Human Retroviruses 9(1),
69-76；Ｇ．ヌオボ（Nuovo）ら、1992年，Diag.Molec.P
athol.1(2),98-102；M.J.エンブレトン（Embleton）
ら、1992年，Nuc.Acids Res.20(15),3831-3837；Ｊ．エ
メトソン（emmetson）ら、1993年，Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 90,357-361；Ｐ．コミノス（Komminoth）ら、199
2年，Diag.Molec.Phatol.1(2),85-97；K.P.チル（Chil
e）ら、1992年，J.Histochem.Cytochem.40(3),333-34
1；ハーゼ（Haase）ら、1990年，Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 87,4971-4975；Ｏ．バスガラら、1992年，New Engl.
J.Med.326(21),1385-1391；パターソン（Patterson）
ら、1993年，Science 260,976-979）。しかしながら、
加熱および冷却の多サイクル、並びにＰＣＲによってそ
の感受性を達成するのに必要な緊縮ハイブリダイゼーシ
ョン条件は、組織および細胞によって十分に耐えられな
い。増幅した配列の細胞外への拡散は、繰返しの加熱に
よって増加して、試料中の拡散シグナルを増加させてし
まうことがある。細胞からのＰＣＲ生成物の減損を減少
させようと試みて、しばしば、架橋固定液による長時間
の固定（１５時日間〜何時間か）を、ＰＣＲによる in
situ 増幅に用いる。この処理は、しばしば、増幅の前
に固定細胞のプロテアーゼ処理を必要とする（Ｇ．ヌオ
ボら、1992年，Diag.Molec.Pathol.1(2),98-102）。
細胞中の特定の核酸配列の検出および局在化を可能にす
る。これらの方法は、例えば、米国特許第4,888,278号
明細書で記載のように、標識されたプローブの直接ハイ
ブリダイゼーションに基いて慣用的に用いられてきた。
しかしながら、このような直接ハイブリダイゼーション
法は、目的の核酸に特異的であるが、いずれの場合に
も、極めて低いコピー数の核酸を検出するほど十分に感
受性ではない。極めて低いコピー数を検出する手段とし
ては、in situ 検出前の標的配列の in situ 増幅が極
めて興味深かった。in situ 核酸増幅法は、細胞が増幅
生成物を濃縮するので従来の溶液増幅よりも感受性であ
る可能性があり、したがって、増幅生成物が自由に拡散
する場合またはそれらが、目的の配列を含まない細胞内
容物によって希釈される場合に可能であるよりも少ない
分子の検出を可能にする。核酸は、標的配列の検出前に
細胞から抽出される必要がないので、in situ 法は、集
団中のどの細胞が特定の核酸を含んでいるかに関する情
報を提供し且つ細胞の生化学的および形態学的特性に関
しての核酸の分析を更に可能にする。in situ 増幅法
は、主としてＰＣＲについて開発されてきた（Ｏ．バス
ガラ（Basgara）およびＲ．ポメランツ（Pomerantz），
1993年，AIDS Research and Human Retroviruses 9(1),
69-76；Ｇ．ヌオボ（Nuovo）ら、1992年，Diag.Molec.P
athol.1(2),98-102；M.J.エンブレトン（Embleton）
ら、1992年，Nuc.Acids Res.20(15),3831-3837；Ｊ．エ
メトソン（emmetson）ら、1993年，Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 90,357-361；Ｐ．コミノス（Komminoth）ら、199
2年，Diag.Molec.Phatol.1(2),85-97；K.P.チル（Chil
e）ら、1992年，J.Histochem.Cytochem.40(3),333-34
1；ハーゼ（Haase）ら、1990年，Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 87,4971-4975；Ｏ．バスガラら、1992年，New Engl.
J.Med.326(21),1385-1391；パターソン（Patterson）
ら、1993年，Science 260,976-979）。しかしながら、
加熱および冷却の多サイクル、並びにＰＣＲによってそ
の感受性を達成するのに必要な緊縮ハイブリダイゼーシ
ョン条件は、組織および細胞によって十分に耐えられな
い。増幅した配列の細胞外への拡散は、繰返しの加熱に
よって増加して、試料中の拡散シグナルを増加させてし
まうことがある。細胞からのＰＣＲ生成物の減損を減少
させようと試みて、しばしば、架橋固定液による長時間
の固定（１５時日間〜何時間か）を、ＰＣＲによる in
situ 増幅に用いる。この処理は、しばしば、増幅の前
に固定細胞のプロテアーゼ処理を必要とする（Ｇ．ヌオ
ボら、1992年，Diag.Molec.Pathol.1(2),98-102）。
【０００６】
【発明が解決すべき課題】in situ で行われる従来の低
温ＳＤＡは、（１）細胞識別のための免疫表現型決定を
可能にする細胞構造の向上した維持および（２）細胞中
のアンプリコンの有意に向上した保持を含めたin situ
ＰＣＲにまさる多数の利点を有することが判った。しか
しながら、in situ ｔＳＤＡの増加した温度がこれらの
特徴に対してどんな作用を有するかは不明であった。温
度の増加（概して、従来のＳＤＡと比較して約１５〜２
０℃）は、増加した反応特異性および速度の利点を与え
ることがあったが、おそらくは、正確な免疫表現型決定
および細胞識別を妨害するまたは妨げるであろう水準ま
で、細胞破壊を有意に増加させることもあった。反応温
度の顕著な増加はまた、細胞外へのアンプリコンの拡散
を増加させることがあり、そこでそれらは負の細胞によ
って取込まれ且つ偽陽性シグナルを生じることがあっ
た。しかしながら、意外にも、in situ ｔＳＤＡ後の細
胞構造は、フローサイトメトリーでの正常な前方および
側方光散乱性によって実証されるようにほぼ完全な状態
のままであることが判った。したがって、免疫表現型決
定は、in situ ｔＳＤＡの温度およびプロトコルと適合
する。出願人は、より高い温度での細胞の維持が、ＰＣ
Ｒの場合のように加熱および冷却の反復サイクルを細胞
に施すよりも損傷が少ないことがありうると仮定してい
る。意外にも、アンプリコンの拡散はほとんど増加しな
かったことも発見されたが、それは、細胞が、熱サイク
ルを施された場合よりも高い一定温度で維持された場合
にほとんど損傷されないことがありうるためであると考
えられる。
温ＳＤＡは、（１）細胞識別のための免疫表現型決定を
可能にする細胞構造の向上した維持および（２）細胞中
のアンプリコンの有意に向上した保持を含めたin situ
ＰＣＲにまさる多数の利点を有することが判った。しか
しながら、in situ ｔＳＤＡの増加した温度がこれらの
特徴に対してどんな作用を有するかは不明であった。温
度の増加（概して、従来のＳＤＡと比較して約１５〜２
０℃）は、増加した反応特異性および速度の利点を与え
ることがあったが、おそらくは、正確な免疫表現型決定
および細胞識別を妨害するまたは妨げるであろう水準ま
で、細胞破壊を有意に増加させることもあった。反応温
度の顕著な増加はまた、細胞外へのアンプリコンの拡散
を増加させることがあり、そこでそれらは負の細胞によ
って取込まれ且つ偽陽性シグナルを生じることがあっ
た。しかしながら、意外にも、in situ ｔＳＤＡ後の細
胞構造は、フローサイトメトリーでの正常な前方および
側方光散乱性によって実証されるようにほぼ完全な状態
のままであることが判った。したがって、免疫表現型決
定は、in situ ｔＳＤＡの温度およびプロトコルと適合
する。出願人は、より高い温度での細胞の維持が、ＰＣ
Ｒの場合のように加熱および冷却の反復サイクルを細胞
に施すよりも損傷が少ないことがありうると仮定してい
る。意外にも、アンプリコンの拡散はほとんど増加しな
かったことも発見されたが、それは、細胞が、熱サイク
ルを施された場合よりも高い一定温度で維持された場合
にほとんど損傷されないことがありうるためであると考
えられる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、以下の方法：
二本鎖ＨＩＶｇａｇ標的配列を増幅する方法であって、 （ａ）配列番号：１の標的結合配列を含む第一増幅プラ
イマーを該標的配列の第一鎖上の標的配列に対して３′
にハイブリッド形成させ、そして配列番号：２の標的結
合配列を含む第二増幅プライマーを該標的配列の第二鎖
上の標的配列に対して３′にハイブリッド形成させ； （ｂ）第一および第二増幅プライマーをポリメラーゼに
よって伸長させて、第一および第二増幅プライマー伸長
生成物を生成し； （ｃ）第一および第二増幅プライマー伸長生成物を標的
配列から置換し；そして （ｄ）標的配列が増幅されるように、ハイブリッド形
成、伸長および置換の工程を繰返す工程を含む上記方
法、を提供する。
二本鎖ＨＩＶｇａｇ標的配列を増幅する方法であって、 （ａ）配列番号：１の標的結合配列を含む第一増幅プラ
イマーを該標的配列の第一鎖上の標的配列に対して３′
にハイブリッド形成させ、そして配列番号：２の標的結
合配列を含む第二増幅プライマーを該標的配列の第二鎖
上の標的配列に対して３′にハイブリッド形成させ； （ｂ）第一および第二増幅プライマーをポリメラーゼに
よって伸長させて、第一および第二増幅プライマー伸長
生成物を生成し； （ｃ）第一および第二増幅プライマー伸長生成物を標的
配列から置換し；そして （ｄ）標的配列が増幅されるように、ハイブリッド形
成、伸長および置換の工程を繰返す工程を含む上記方
法、を提供する。
【０００８】本発明はさらに、以下の方法：二本鎖ＨＬ
Ａ−ＤＱαエクソン３標的配列を増幅する方法であっ
て、 （ａ）配列番号：６の標的結合配列を含む第一増幅プラ
イマーを該標的配列の第一鎖上の標的配列に対して３′
にハイブリッド形成させ、そして配列番号：７の標的結
合配列を含む第二増幅プライマーを該標的配列の第二鎖
上の標的配列に対して３′にハイブリッド形成させ； （ｂ）第一および第二増幅プライマーをポリメラーゼに
よって伸長させて、第一および第二増幅プライマー伸長
生成物を生成し； （ｃ）第一および第二増幅プライマー伸長生成物を標的
配列から置換し；そして （ｄ）標的配列が増幅されるように、ハイブリッド形
成、伸長および置換の工程を繰返す工程を含む上記方
法、を提供する。
Ａ−ＤＱαエクソン３標的配列を増幅する方法であっ
て、 （ａ）配列番号：６の標的結合配列を含む第一増幅プラ
イマーを該標的配列の第一鎖上の標的配列に対して３′
にハイブリッド形成させ、そして配列番号：７の標的結
合配列を含む第二増幅プライマーを該標的配列の第二鎖
上の標的配列に対して３′にハイブリッド形成させ； （ｂ）第一および第二増幅プライマーをポリメラーゼに
よって伸長させて、第一および第二増幅プライマー伸長
生成物を生成し； （ｃ）第一および第二増幅プライマー伸長生成物を標的
配列から置換し；そして （ｄ）標的配列が増幅されるように、ハイブリッド形
成、伸長および置換の工程を繰返す工程を含む上記方
法、を提供する。
【０００９】本発明はまた、これらの二本鎖標的配列を
増幅する方法において使用できる標的結合配列を含むオ
リゴヌクレオチドを提供する。
増幅する方法において使用できる標的結合配列を含むオ
リゴヌクレオチドを提供する。
【００１０】以下の用語を本明細書中において下記の通
り定義する。増幅プライマーは、プライマーのハイブリ
ダイゼーションおよび伸長による標的配列の増幅のため
のプライマーである。ＳＤＡに対して、増幅プライマー
の３′末端は、標的配列の３′末端でハイブリッド形成
する標的結合配列である。増幅プライマーは、更に、そ
の標的結合配列に対して５′に、概して、その５′末端
付近に制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む。制限
エンドヌクレアーゼ認識部位は、その認識部位がウォー
カーら（1992a）、上記によって記載のように半修飾さ
れている場合にその制限エンドヌクレアーゼの二本鎖認
識部位にニックを入れるであろう制限エンドヌクレアー
ゼによって認識されるヌクレオチド配列である。半修飾
された認識部位は、制限エンドヌクレアーゼの二本鎖認
識部位であり、ここにおいて、一方の鎖は、二重らせん
の鎖の一方が制限エンドヌクレアーゼによって切断され
るのを妨げる少なくとも一つの誘導体化されたヌクレオ
チドを含む。「ニッキング」とは、典型的な二本鎖切断
とは対照的に、二重らせんの一方の鎖だけが制限エンド
ヌクレアーゼによって切断されるこの修飾された活性を
意味する。制限エンドヌクレアーゼによってニッキング
可能である半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識部位はい
ずれも、ＳＤＡにおいて用いるのに適している。ＳＤＡ
のための増幅プライマーは、ウォーカーら（1992ｂ）、
上記によってＳ1およびＳ2と称される。α−チオ修飾デ
オキシリボヌクレオシド三リン酸を、「ｄＮＴＰα
Ｓ」、「ｄＡＴＰαＳ」、「ｄＣＴＰαＳ」等と略記す
る。
り定義する。増幅プライマーは、プライマーのハイブリ
ダイゼーションおよび伸長による標的配列の増幅のため
のプライマーである。ＳＤＡに対して、増幅プライマー
の３′末端は、標的配列の３′末端でハイブリッド形成
する標的結合配列である。増幅プライマーは、更に、そ
の標的結合配列に対して５′に、概して、その５′末端
付近に制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含む。制限
エンドヌクレアーゼ認識部位は、その認識部位がウォー
カーら（1992a）、上記によって記載のように半修飾さ
れている場合にその制限エンドヌクレアーゼの二本鎖認
識部位にニックを入れるであろう制限エンドヌクレアー
ゼによって認識されるヌクレオチド配列である。半修飾
された認識部位は、制限エンドヌクレアーゼの二本鎖認
識部位であり、ここにおいて、一方の鎖は、二重らせん
の鎖の一方が制限エンドヌクレアーゼによって切断され
るのを妨げる少なくとも一つの誘導体化されたヌクレオ
チドを含む。「ニッキング」とは、典型的な二本鎖切断
とは対照的に、二重らせんの一方の鎖だけが制限エンド
ヌクレアーゼによって切断されるこの修飾された活性を
意味する。制限エンドヌクレアーゼによってニッキング
可能である半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識部位はい
ずれも、ＳＤＡにおいて用いるのに適している。ＳＤＡ
のための増幅プライマーは、ウォーカーら（1992ｂ）、
上記によってＳ1およびＳ2と称される。α−チオ修飾デ
オキシリボヌクレオシド三リン酸を、「ｄＮＴＰα
Ｓ」、「ｄＡＴＰαＳ」、「ｄＣＴＰαＳ」等と略記す
る。
【００１１】「バンパー」すなわち外プライマーは、増
幅プライマーの上流の標的配列に対してアニーリングす
るプライマーであるので、外プライマーの伸長は下流の
プライマーおよびその伸長生成物を置換する、すなわ
ち、増幅プライマーによって与えられた制限エンドヌク
レアーゼ認識部位を含む標的配列のコピーは置換され
る。バンパープライマーは、したがって、標的結合配列
だけから成り、そしてそれらが増幅プライマーの上流に
アニーリングし且つ伸長された場合にそれらを置換する
ように設計される。外プライマーは、ウォーカーら（19
92b）、上記によってＢ1およびＢ2と称される。外プラ
イマーの伸長は、増幅プライマーの伸長生成物を置換す
る一つの方法であるが、若干の場合、加熱もまた適当で
ありうる。
幅プライマーの上流の標的配列に対してアニーリングす
るプライマーであるので、外プライマーの伸長は下流の
プライマーおよびその伸長生成物を置換する、すなわ
ち、増幅プライマーによって与えられた制限エンドヌク
レアーゼ認識部位を含む標的配列のコピーは置換され
る。バンパープライマーは、したがって、標的結合配列
だけから成り、そしてそれらが増幅プライマーの上流に
アニーリングし且つ伸長された場合にそれらを置換する
ように設計される。外プライマーは、ウォーカーら（19
92b）、上記によってＢ1およびＢ2と称される。外プラ
イマーの伸長は、増幅プライマーの伸長生成物を置換す
る一つの方法であるが、若干の場合、加熱もまた適当で
ありうる。
【００１２】標的または標的配列という用語は、増幅さ
れる核酸配列（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を意味す
る。これらには、増幅される元の核酸配列およびその相
補的第二鎖並びに標的配列の増幅によって生成された元
の標的配列のコピーのどちらかの鎖が含まれる。
れる核酸配列（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を意味す
る。これらには、増幅される元の核酸配列およびその相
補的第二鎖並びに標的配列の増幅によって生成された元
の標的配列のコピーのどちらかの鎖が含まれる。
【００１３】増幅生成物、伸長生成物またはアンプリコ
ンは、標的配列の増幅の際に生成された標的配列のコピ
ーを含むオリゴまたはポリヌクレオチドである。発明の概要 好熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）は、懸濁液中、スライド
上または組織中の細胞における核酸標的配列の in situ
増幅に対して、従来の in situ ＳＤＡより優れた速
度、感度および特異性によって適応してきた。優れた検
体形態は、フローサイトメトリーでの正常な光散乱パラ
メーターによって実証されるように、従来の in situ
ＳＤＡより有意に高い温度に対する暴露にもかかわらず
保存される。ｔＳＤＡによる in situ 増幅はまた、増
加した反応温度にもかかわらず免疫化学的技術となお適
合しているので、標的配列の増幅および免疫学的染色の
両方を同一検体で行うことができる。これは、反復温度
循環が目的の細胞性抗原を免疫化学的技術によって検出
不能にすることがある in situ ＰＣＲとは対照的であ
る。
ンは、標的配列の増幅の際に生成された標的配列のコピ
ーを含むオリゴまたはポリヌクレオチドである。発明の概要 好熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）は、懸濁液中、スライド
上または組織中の細胞における核酸標的配列の in situ
増幅に対して、従来の in situ ＳＤＡより優れた速
度、感度および特異性によって適応してきた。優れた検
体形態は、フローサイトメトリーでの正常な光散乱パラ
メーターによって実証されるように、従来の in situ
ＳＤＡより有意に高い温度に対する暴露にもかかわらず
保存される。ｔＳＤＡによる in situ 増幅はまた、増
加した反応温度にもかかわらず免疫化学的技術となお適
合しているので、標的配列の増幅および免疫学的染色の
両方を同一検体で行うことができる。これは、反復温度
循環が目的の細胞性抗原を免疫化学的技術によって検出
不能にすることがある in situ ＰＣＲとは対照的であ
る。
【００１４】in situ ｔＳＤＡのための本発明の方法
は、概して、細胞または組織の簡単な固定に続いて、透
過性付与およびｔＳＤＡに必要な試薬の添加を含む。標
的配列がＤＮＡである場合、細胞または組織を、増幅前
に簡単に加熱して標的配列を変性させる。関与した酵素
の熱安定性ゆえに、加熱は、場合により、酵素を含む試
薬の混合物中で起こりうる。或いは、変性後、試料を所
望の反応温度まで冷却するときに酵素を加えることがで
きる。ｔＳＤＡ反応は、典型的に、５５〜６５℃で１分
間〜２時間インキュベートされるが、選択された酵素に
適合しうるならば、更に高い温度も可能である。標的配
列を変性させるのに前加熱が必要とされない場合、ＳＤ
Ａ反応成分全部を、固定され、透過性付与された細胞に
対して直接的に、増幅を開始する所望の反応温度で単純
に加える。用いられなかったプライマーおよび酵素を洗
浄除去した後、増幅生成物を in situ でまたは細胞か
ら放出後に検出する。
は、概して、細胞または組織の簡単な固定に続いて、透
過性付与およびｔＳＤＡに必要な試薬の添加を含む。標
的配列がＤＮＡである場合、細胞または組織を、増幅前
に簡単に加熱して標的配列を変性させる。関与した酵素
の熱安定性ゆえに、加熱は、場合により、酵素を含む試
薬の混合物中で起こりうる。或いは、変性後、試料を所
望の反応温度まで冷却するときに酵素を加えることがで
きる。ｔＳＤＡ反応は、典型的に、５５〜６５℃で１分
間〜２時間インキュベートされるが、選択された酵素に
適合しうるならば、更に高い温度も可能である。標的配
列を変性させるのに前加熱が必要とされない場合、ＳＤ
Ａ反応成分全部を、固定され、透過性付与された細胞に
対して直接的に、増幅を開始する所望の反応温度で単純
に加える。用いられなかったプライマーおよび酵素を洗
浄除去した後、増幅生成物を in situ でまたは細胞か
ら放出後に検出する。
【００１５】
【発明の実施の形態】ｔＳＤＡによる in situ 核酸増
幅のための本発明の方法は、in situ ｔＳＤＡが、細胞
構造および形態をほとんど損なうことなく、in vitro
（溶液）ｔＳＤＡプロトコルの有意に向上した感度、速
度および特異性を提供するという発見に基く。概して、
核酸標的配列を含有すると疑われる細胞の試料（例え
ば、懸濁液中の細胞または組織切片）は、細胞の形態学
的完全性を維持するが細胞タンパク質を架橋しないまた
は沈殿させない固定液によって固定され、その結果十分
に、プライマーおよび他の試薬の浸透が妨げられる。し
たがって、固定された細胞中へのプライマーおよび試薬
の浸透を達成するための固定後のプロテアーゼによる処
理は、概して、必要とされない。
幅のための本発明の方法は、in situ ｔＳＤＡが、細胞
構造および形態をほとんど損なうことなく、in vitro
（溶液）ｔＳＤＡプロトコルの有意に向上した感度、速
度および特異性を提供するという発見に基く。概して、
核酸標的配列を含有すると疑われる細胞の試料（例え
ば、懸濁液中の細胞または組織切片）は、細胞の形態学
的完全性を維持するが細胞タンパク質を架橋しないまた
は沈殿させない固定液によって固定され、その結果十分
に、プライマーおよび他の試薬の浸透が妨げられる。し
たがって、固定された細胞中へのプライマーおよび試薬
の浸透を達成するための固定後のプロテアーゼによる処
理は、概して、必要とされない。
【００１６】架橋性かまたは沈殿性固定液を、本発明の
実施において用いることができる。例としては、パラホ
ルムアルデヒド、４％グルタルアルデヒド、エタノール
／酢酸固定液、カルノワ固定液（酢酸、エタノール、ク
ロロホルム）、１％四酸化オスミウム、ブワン固定液
（１．２１％ピクリン酸、１１％ホルムアルデヒド、
５．６％酢酸）、ツェンカー固定液（５．０％塩化水
銀、２．５％二塩素酸カリウム、５．０％酢酸、１．０
％硫酸ナトリウム）、および酢酸／メタノール固定液が
ある。FACSTM 溶解液（Lysing Solution）の使用は、溶
解、固定および透過性付与を一つの試薬を用いて可能に
する。本発明において用いるのに好ましい固定液は１〜
４％パラホルムアルデヒドであり、好ましくは、それを
用いて細胞または組織を約１分間〜１時間処理する。概
して、固定された細胞を、増幅の前に、例えば、NP40、
TRITON またはサポニンなどの洗剤を用いて透過性にす
ることは有用である。若干の状況下において、固定は任
意であってよい。すなわち、ｔＳＤＡは、特に、ＲＮＡ
標的が選択的に増幅される場合に非固定細胞中において
in situ で行われうるし且つ予備的熱変性工程を必要
としない（以下を参照されたい）。
実施において用いることができる。例としては、パラホ
ルムアルデヒド、４％グルタルアルデヒド、エタノール
／酢酸固定液、カルノワ固定液（酢酸、エタノール、ク
ロロホルム）、１％四酸化オスミウム、ブワン固定液
（１．２１％ピクリン酸、１１％ホルムアルデヒド、
５．６％酢酸）、ツェンカー固定液（５．０％塩化水
銀、２．５％二塩素酸カリウム、５．０％酢酸、１．０
％硫酸ナトリウム）、および酢酸／メタノール固定液が
ある。FACSTM 溶解液（Lysing Solution）の使用は、溶
解、固定および透過性付与を一つの試薬を用いて可能に
する。本発明において用いるのに好ましい固定液は１〜
４％パラホルムアルデヒドであり、好ましくは、それを
用いて細胞または組織を約１分間〜１時間処理する。概
して、固定された細胞を、増幅の前に、例えば、NP40、
TRITON またはサポニンなどの洗剤を用いて透過性にす
ることは有用である。若干の状況下において、固定は任
意であってよい。すなわち、ｔＳＤＡは、特に、ＲＮＡ
標的が選択的に増幅される場合に非固定細胞中において
in situ で行われうるし且つ予備的熱変性工程を必要
としない（以下を参照されたい）。
【００１７】本発明の重要な特徴は、ＲＮＡかまたはＤ
ＮＡ標的配列、または両方を、本発明の方法を用いて直
接的に増幅させることができるということである。ＲＮ
Ａだけを増幅させるために、逆転写酵素をｔＳＤＡ反応
に対して、それが逆転写ＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ−G.J.ヌオ
ボら、1992年，Diag.Molec.Pathol.1,98-102；G.J.ヌオ
ボら、1991年，Am.J.Pathol.58,518-523；G.J.ヌオボ
ら、1991年，Am.J.Pathol.139,1239-1244）であるよう
に加えることができる。しかしながら、ｔＳＤＡで用い
られるＤＮＡポリメラーゼのいくつかは、現在、逆転写
酵素活性を示すことが判っている。それらは、ＲＮＡか
またはＤＮＡを鋳型として用いて、ｄＮＴＰαＳの包含
およびニックからの置換を伴って、標的配列のＤＮＡコ
ピーを重合させることができる。ＲＮＡ標的配列は、し
たがって、別の逆転写酵素を加えることを必要とするこ
となく、ｔＳＤＡ反応のＤＮＡ増幅部分を行う同一ポリ
メラーゼによって逆転写されうる。ＲＮＡは、熱変性工
程を省くことによってかまたはｔＳＤＡ反応を開始する
前にＤＮアーゼによって処理することによって細胞中で
（すなわち、ＤＮＡ標的の増幅をほとんど伴うことな
く）増幅されうる。次に、細胞中の二本鎖ＤＮＡは依然
として二本鎖で且つ鋳型として利用できないままである
が、プライマーは、利用可能な一本鎖ＲＮＡに対してハ
イブリッド形成することができるし且つｃＤＮＡを生じ
ることによってＲＮＡ標的配列の特異的増幅を開始する
ことができる。ｃＤＮＡは、順次に、更に増幅するため
の鋳型として役立つ。ＲＮＡ標的配列の特異的増幅はま
た、ＳＤＡを開始する前にＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼに
よって細胞を処理することによって達成されうる。固定
は加熱中の細胞の完全性の維持を助けるので、予備的熱
変性工程が存在しない場合、固定を必要としなくてよ
い。しかしながら、非固定細胞または組織を透過性にす
ることはなお有用でありうる。
ＮＡ標的配列、または両方を、本発明の方法を用いて直
接的に増幅させることができるということである。ＲＮ
Ａだけを増幅させるために、逆転写酵素をｔＳＤＡ反応
に対して、それが逆転写ＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ−G.J.ヌオ
ボら、1992年，Diag.Molec.Pathol.1,98-102；G.J.ヌオ
ボら、1991年，Am.J.Pathol.58,518-523；G.J.ヌオボ
ら、1991年，Am.J.Pathol.139,1239-1244）であるよう
に加えることができる。しかしながら、ｔＳＤＡで用い
られるＤＮＡポリメラーゼのいくつかは、現在、逆転写
酵素活性を示すことが判っている。それらは、ＲＮＡか
またはＤＮＡを鋳型として用いて、ｄＮＴＰαＳの包含
およびニックからの置換を伴って、標的配列のＤＮＡコ
ピーを重合させることができる。ＲＮＡ標的配列は、し
たがって、別の逆転写酵素を加えることを必要とするこ
となく、ｔＳＤＡ反応のＤＮＡ増幅部分を行う同一ポリ
メラーゼによって逆転写されうる。ＲＮＡは、熱変性工
程を省くことによってかまたはｔＳＤＡ反応を開始する
前にＤＮアーゼによって処理することによって細胞中で
（すなわち、ＤＮＡ標的の増幅をほとんど伴うことな
く）増幅されうる。次に、細胞中の二本鎖ＤＮＡは依然
として二本鎖で且つ鋳型として利用できないままである
が、プライマーは、利用可能な一本鎖ＲＮＡに対してハ
イブリッド形成することができるし且つｃＤＮＡを生じ
ることによってＲＮＡ標的配列の特異的増幅を開始する
ことができる。ｃＤＮＡは、順次に、更に増幅するため
の鋳型として役立つ。ＲＮＡ標的配列の特異的増幅はま
た、ＳＤＡを開始する前にＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼに
よって細胞を処理することによって達成されうる。固定
は加熱中の細胞の完全性の維持を助けるので、予備的熱
変性工程が存在しない場合、固定を必要としなくてよ
い。しかしながら、非固定細胞または組織を透過性にす
ることはなお有用でありうる。
【００１８】二本鎖ＤＮＡの熱変性の前のＲＮアーゼに
よる細胞または組織の処理は、潜在的ＲＮＡ標的配列を
分解し且つ対応するＤＮＡ標的配列の特異的増幅を可能
にする。ＮａＯＨ（約０．１Ｍ）もまた、ＤＮＡ特異的
増幅のために選択的にＲＮＡを分解し且つＤＮＡを変性
させるのに用いることができる。
よる細胞または組織の処理は、潜在的ＲＮＡ標的配列を
分解し且つ対応するＤＮＡ標的配列の特異的増幅を可能
にする。ＮａＯＨ（約０．１Ｍ）もまた、ＤＮＡ特異的
増幅のために選択的にＲＮＡを分解し且つＤＮＡを変性
させるのに用いることができる。
【００１９】熱変性工程が、ＳＤＡプライマーのアニー
リングの前に（ＲＮアーゼ処理を伴うことなく）含まれ
る場合、ＤＮＡおよびＲＮＡ両方の標的配列が増幅され
るであろう。ｔＳＤＡで用いられるＤＮＡポリメラーゼ
によるＲＮＡの in situ 逆転写は、概して、ＤＮＡ合
成よりも有効ではないが、意外にも、若干の場合におい
て従来の逆転写酵素よりも有効であることが判った。し
かしながら、ＲＮＡ標的は、通常、対応するＤＮＡ標的
よりも多数で細胞中に存在し、そして速やかに生じるｃ
ＤＮＡの増幅の高性能は、反応の逆転写工程におけるど
んな低下した効率も克服し且つ補う。ＲＮＡおよびＤＮ
Ａ標的両方の増幅は、これが細胞当りの増幅可能な標的
配列の最大数を与え、そしてその結果として、試料当り
の潜在的に正の細胞の最大の感度および最大数を与える
ので、本発明の大部分の診断的用途に好ましい。
リングの前に（ＲＮアーゼ処理を伴うことなく）含まれ
る場合、ＤＮＡおよびＲＮＡ両方の標的配列が増幅され
るであろう。ｔＳＤＡで用いられるＤＮＡポリメラーゼ
によるＲＮＡの in situ 逆転写は、概して、ＤＮＡ合
成よりも有効ではないが、意外にも、若干の場合におい
て従来の逆転写酵素よりも有効であることが判った。し
かしながら、ＲＮＡ標的は、通常、対応するＤＮＡ標的
よりも多数で細胞中に存在し、そして速やかに生じるｃ
ＤＮＡの増幅の高性能は、反応の逆転写工程におけるど
んな低下した効率も克服し且つ補う。ＲＮＡおよびＤＮ
Ａ標的両方の増幅は、これが細胞当りの増幅可能な標的
配列の最大数を与え、そしてその結果として、試料当り
の潜在的に正の細胞の最大の感度および最大数を与える
ので、本発明の大部分の診断的用途に好ましい。
【００２０】標的を増幅の前に熱変性させる場合、固定
細胞または組織を、ＳＤＡ反応混合物（例えば、ｄＮＴ
Ｐ、ＫｉＰＯ4、ＭｇＣｌ2、ＢＳＡ、ＤＭＳＯ、外プラ
イマー、増幅プライマー、および十分に熱安定性である
場合の酵素）中で加熱することができる。ポリメラーゼ
および制限エンドヌクレアーゼが変性温度で十分に熱安
定性でない場合、試料を所望の反応温度まで冷却した後
にそれらを加えることができる。標的が熱変性されない
場合、制限エンドヌクレアーゼおよび１種類または複数
のポリメラーゼを含めたＳＤＡ反応混合物を細胞試料に
対して増幅を開始するように選択された反応温度で単純
に加えることができる。
細胞または組織を、ＳＤＡ反応混合物（例えば、ｄＮＴ
Ｐ、ＫｉＰＯ4、ＭｇＣｌ2、ＢＳＡ、ＤＭＳＯ、外プラ
イマー、増幅プライマー、および十分に熱安定性である
場合の酵素）中で加熱することができる。ポリメラーゼ
および制限エンドヌクレアーゼが変性温度で十分に熱安
定性でない場合、試料を所望の反応温度まで冷却した後
にそれらを加えることができる。標的が熱変性されない
場合、制限エンドヌクレアーゼおよび１種類または複数
のポリメラーゼを含めたＳＤＡ反応混合物を細胞試料に
対して増幅を開始するように選択された反応温度で単純
に加えることができる。
【００２１】従来のＳＤＡに対するのと同様に、ｔＳＤ
Ａによる増幅のための標的は、標的配列を切断しないエ
ンドヌクレアーゼによる制限によってより大きな核酸を
フラグメント化することにより製造することができる。
しかしながら、in situ ｔＳＤＡおよび従来の in situ
ＳＤＡ両方に対して、概して、増幅反応でニッキング
するための選択された制限エンドヌクレアーゼ認識／切
断部位を有する標的核酸をウォーカーら（1992年，Nuc.
Acids Res.，上記）および米国特許第5,270,184号明細
書で記載のように生じさせることは好ましい。
Ａによる増幅のための標的は、標的配列を切断しないエ
ンドヌクレアーゼによる制限によってより大きな核酸を
フラグメント化することにより製造することができる。
しかしながら、in situ ｔＳＤＡおよび従来の in situ
ＳＤＡ両方に対して、概して、増幅反応でニッキング
するための選択された制限エンドヌクレアーゼ認識／切
断部位を有する標的核酸をウォーカーら（1992年，Nuc.
Acids Res.，上記）および米国特許第5,270,184号明細
書で記載のように生じさせることは好ましい。
【００２２】一つのＳＤＡ反応が別の反応の増幅生成物
によって交差汚染されるのを防止するために、増幅反応
を有意に阻害することなく、ｄＵＴＰをｄＴＴＰの代わ
りにＳＤＡアンプリコン中に包含させることができる。
次に、ウラシル含有核酸を、ＵＤＧ（ウラシルＤＮＡグ
リコシラーゼ）による処理によって特異的に認識し且つ
失活させることができる。したがって、ｄＵＴＰが反応
の前にＳＤＡアンプリコン中に包含される場合、引き続
きのＳＤＡ反応はいずれも、二本鎖標的の増幅の前にＵ
ＤＧによって処理することができるし、そして前に増幅
された反応からのｄＵ含有ＤＮＡはいずれも増幅不能に
なるであろう。引き続きの反応で増幅される標的ＤＮＡ
は、ｄＵを含まないし、そしてＵＤＧ処理によって影響
されないであろう。次に、ＵＤＧを、標的の増幅の前に
Ｕｇｉ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤）による
処理によって阻害することができる。或いは、ＵＤＧは
熱失活されうる。ｔＳＤＡでは、反応自体の更に高い温
度（≧５０℃）を用いて、同時にＵＤＧを失活させ且つ
標的を増幅させることができる。
によって交差汚染されるのを防止するために、増幅反応
を有意に阻害することなく、ｄＵＴＰをｄＴＴＰの代わ
りにＳＤＡアンプリコン中に包含させることができる。
次に、ウラシル含有核酸を、ＵＤＧ（ウラシルＤＮＡグ
リコシラーゼ）による処理によって特異的に認識し且つ
失活させることができる。したがって、ｄＵＴＰが反応
の前にＳＤＡアンプリコン中に包含される場合、引き続
きのＳＤＡ反応はいずれも、二本鎖標的の増幅の前にＵ
ＤＧによって処理することができるし、そして前に増幅
された反応からのｄＵ含有ＤＮＡはいずれも増幅不能に
なるであろう。引き続きの反応で増幅される標的ＤＮＡ
は、ｄＵを含まないし、そしてＵＤＧ処理によって影響
されないであろう。次に、ＵＤＧを、標的の増幅の前に
Ｕｇｉ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤）による
処理によって阻害することができる。或いは、ＵＤＧは
熱失活されうる。ｔＳＤＡでは、反応自体の更に高い温
度（≧５０℃）を用いて、同時にＵＤＧを失活させ且つ
標的を増幅させることができる。
【００２３】ＳＤＡは、５′→３′エキソヌクレアーゼ
活性を欠き、二本鎖核酸中の一本鎖ニックで重合を開始
し、そしてそのニックの下流の鎖を置換すると同時に、
非ニック鎖を鋳型として用いて新しい相補鎖を生じるポ
リメラーゼを必要とする。ポリメラーゼ置換活性は、標
的を更に別のコピーの合成に利用可能にするし且つ第二
増幅プライマーが指数的増幅反応でハイブリッド形成し
うる一本鎖伸長生成物を生じるので、それは増幅反応に
とって不可欠である。より進行的ポリメラーゼは、増幅
されうる標的配列の長さを最大限にすることができるの
で、それらは好ましい。
活性を欠き、二本鎖核酸中の一本鎖ニックで重合を開始
し、そしてそのニックの下流の鎖を置換すると同時に、
非ニック鎖を鋳型として用いて新しい相補鎖を生じるポ
リメラーゼを必要とする。ポリメラーゼ置換活性は、標
的を更に別のコピーの合成に利用可能にするし且つ第二
増幅プライマーが指数的増幅反応でハイブリッド形成し
うる一本鎖伸長生成物を生じるので、それは増幅反応に
とって不可欠である。より進行的ポリメラーゼは、増幅
されうる標的配列の長さを最大限にすることができるの
で、それらは好ましい。
【００２４】従来、ｔＳＤＡに適当であると考えられる
温度での好熱性ポリメラーゼの活性についてはほどんど
知られていない。更に、好熱性制限エンドヌクレアーゼ
の活性と適合しうる温度での好熱性ポリメラーゼの活性
は知られていなかった。したがって、スクリーニング検
定は、存在する場合の候補制限エンドヌクレアーゼおよ
びポリメラーゼを識別するために開発された。ポリメラ
ーゼスクリーニングシステムは、二本鎖鋳型中の一本鎖
ニックで開始する下流の鎖を置換するポリメラーゼの能
力を試験する伸長検定である。それは、５′→３′エキ
ソヌクレアーゼ活性の存在または不存在についても調べ
る。５′→３′エキソヌクレアーゼ活性は、他に適当な
好熱性ポリメラーゼ中に存在する場合、当該技術分野に
おいて知られている常套法によって失活させることがで
きる（ＷＯ92/06200号）。ポリメラーゼ中のエキソヌク
レアーゼ活性を選択的に失活させる最も一般的な方法の
一つは、ポリメラーゼの遺伝子をクローン化し、エキソ
ヌクレアーゼ活性に関与するタンパク質ドメインをコー
ドする遺伝子配列の部分を識別し、そしてそれを in vi
tro 突然変異誘発によって失活させることである。或い
は、エキソヌクレアーゼ活性は、ポリメラーゼをプロテ
アーゼによって処理して、所望の重合および置換活性だ
けを示すフラグメントを単離することによって失活させ
ることができる。したがって、伸長検定で識別された好
熱性ポリメラーゼは、適当な温度で活性であり、ニック
で伸長を開始し、そして修飾されたｄＮＴＰを包含する
が５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有していて、エ
キソヌクレアーゼ活性の削除によってｔＳＤＡに適する
ようにすることができる。
温度での好熱性ポリメラーゼの活性についてはほどんど
知られていない。更に、好熱性制限エンドヌクレアーゼ
の活性と適合しうる温度での好熱性ポリメラーゼの活性
は知られていなかった。したがって、スクリーニング検
定は、存在する場合の候補制限エンドヌクレアーゼおよ
びポリメラーゼを識別するために開発された。ポリメラ
ーゼスクリーニングシステムは、二本鎖鋳型中の一本鎖
ニックで開始する下流の鎖を置換するポリメラーゼの能
力を試験する伸長検定である。それは、５′→３′エキ
ソヌクレアーゼ活性の存在または不存在についても調べ
る。５′→３′エキソヌクレアーゼ活性は、他に適当な
好熱性ポリメラーゼ中に存在する場合、当該技術分野に
おいて知られている常套法によって失活させることがで
きる（ＷＯ92/06200号）。ポリメラーゼ中のエキソヌク
レアーゼ活性を選択的に失活させる最も一般的な方法の
一つは、ポリメラーゼの遺伝子をクローン化し、エキソ
ヌクレアーゼ活性に関与するタンパク質ドメインをコー
ドする遺伝子配列の部分を識別し、そしてそれを in vi
tro 突然変異誘発によって失活させることである。或い
は、エキソヌクレアーゼ活性は、ポリメラーゼをプロテ
アーゼによって処理して、所望の重合および置換活性だ
けを示すフラグメントを単離することによって失活させ
ることができる。したがって、伸長検定で識別された好
熱性ポリメラーゼは、適当な温度で活性であり、ニック
で伸長を開始し、そして修飾されたｄＮＴＰを包含する
が５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有していて、エ
キソヌクレアーゼ活性の削除によってｔＳＤＡに適する
ようにすることができる。
【００２５】ポリメラーゼに関する伸長検定において、
二本鎖核酸からの一本鎖の置換およびニックでの開始
は、互いに直ぐ隣の二つのプライマーを両方のプライマ
ーに対して相補的な完全な配列上でアニーリングするこ
とによって行われる。プライマーは、それらの５′末端
に、通常は32Ｐによって標識される。ポリメラーゼが鎖
置換活性を有し、隣接するハイブリッド形成したプライ
マーによって形成された「ニック」で重合を開始するこ
とができ、そして５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を
欠いている場合、両方のプライマーは伸長し、そして二
つの伸長生成物が検出されるであろう。ポリメラーゼが
５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を欠いているがニッ
クで伸長を開始できない（例えば、それがギャップを必
要とする）場合および／またはそれが置換活性を欠いて
いる場合、下流プイラマーの伸長生成物だけが検出され
るであろう。ニックで開始するが５′→３′エキソヌク
レアーゼ活性を有するポリメラーゼは、上流プライマー
の伸長生成物だけを生じるであろう。伸長検定はまた、
反応中に含まれるα−チオｄＮＴＰ（ｄＮＴＰαＳ）を
ポリメラーゼが包含することができることを必要とす
る。上流および下流プライマー並びにそれらのそれぞれ
の伸長生成物は、概して、オートラジオグラフィーによ
ってゲル上において寸法で識別される。
二本鎖核酸からの一本鎖の置換およびニックでの開始
は、互いに直ぐ隣の二つのプライマーを両方のプライマ
ーに対して相補的な完全な配列上でアニーリングするこ
とによって行われる。プライマーは、それらの５′末端
に、通常は32Ｐによって標識される。ポリメラーゼが鎖
置換活性を有し、隣接するハイブリッド形成したプライ
マーによって形成された「ニック」で重合を開始するこ
とができ、そして５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を
欠いている場合、両方のプライマーは伸長し、そして二
つの伸長生成物が検出されるであろう。ポリメラーゼが
５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を欠いているがニッ
クで伸長を開始できない（例えば、それがギャップを必
要とする）場合および／またはそれが置換活性を欠いて
いる場合、下流プイラマーの伸長生成物だけが検出され
るであろう。ニックで開始するが５′→３′エキソヌク
レアーゼ活性を有するポリメラーゼは、上流プライマー
の伸長生成物だけを生じるであろう。伸長検定はまた、
反応中に含まれるα−チオｄＮＴＰ（ｄＮＴＰαＳ）を
ポリメラーゼが包含することができることを必要とす
る。上流および下流プライマー並びにそれらのそれぞれ
の伸長生成物は、概して、オートラジオグラフィーによ
ってゲル上において寸法で識別される。
【００２６】伸長検定で最初にスクリーニングされた１
１種類の好熱性ＤＮＡポリメラーゼの内６種類、すなわ
ち、exo-Ｖｅｎｔ（ニュー・イングランド・バイオラブ
ズ（New England Biolabs））、exo-ＤｅｅｐＶｅｎｔ
（ニュー・イングランド・バイオラブズ）、Ｂｓｔ（バ
イオラド（BioRad））、exo-Ｐｆｕ（ストラタジーン
（Stratagene））、Ｂｃａ（パンベラ（Panvera））お
よび配列決定等級Ｔａｑ（プロメガ（Promega））は、
本発明で用いるのに必要な特性を全部有すると確認され
た。他は、本発明の技術を用いることなく前述の伸長検
定を用いて常套手段によって識別することができ、そし
てこのようなポリメラーゼはいずれも、ｔＳＤＡで用い
るのに適当であろう。ポリメラーゼＴｔｈ（ベーリンガ
ー（Boehringer））、Ｔｆｌ（エピセントル（Epicentr
e））、REPLINASE（デュポン（DuPont））および REPLI
THERM（エピセントル）は、ニックから鎖置換するが、
５′→３′エキソヌクレアーゼ活性も有する。これらの
ポリメラーゼは、例えば、遺伝子工学によってエキソヌ
クレアーゼ活性を除去後に、本発明の方法において有用
である。これまでに識別された好熱性ポリメラーゼの大
部分は、約５０℃〜７５℃で活性であり、約６５℃〜７
５℃で最適活性であり、そして約５０℃〜６５℃で低活
性である。しかしながら、好熱性制限エンドヌクレアー
ゼの熱安定性は、概して、６５℃未満に限定されるの
で、より低温で最適活性を有する好熱性ポリメラーゼ
（例えば、ＢｓｔおよびＢｃａ）は、反応において好熱
性制限エンドヌクレアーゼと一層適合し、したがって、
好ましい。しかしながら、ポリメラーゼ活性の通常の最
適温度と適合しうる更に高い温度で活性である制限エン
ドヌクレアーゼを識別することができ、そしてそれもま
た本発明で有用である。
１種類の好熱性ＤＮＡポリメラーゼの内６種類、すなわ
ち、exo-Ｖｅｎｔ（ニュー・イングランド・バイオラブ
ズ（New England Biolabs））、exo-ＤｅｅｐＶｅｎｔ
（ニュー・イングランド・バイオラブズ）、Ｂｓｔ（バ
イオラド（BioRad））、exo-Ｐｆｕ（ストラタジーン
（Stratagene））、Ｂｃａ（パンベラ（Panvera））お
よび配列決定等級Ｔａｑ（プロメガ（Promega））は、
本発明で用いるのに必要な特性を全部有すると確認され
た。他は、本発明の技術を用いることなく前述の伸長検
定を用いて常套手段によって識別することができ、そし
てこのようなポリメラーゼはいずれも、ｔＳＤＡで用い
るのに適当であろう。ポリメラーゼＴｔｈ（ベーリンガ
ー（Boehringer））、Ｔｆｌ（エピセントル（Epicentr
e））、REPLINASE（デュポン（DuPont））および REPLI
THERM（エピセントル）は、ニックから鎖置換するが、
５′→３′エキソヌクレアーゼ活性も有する。これらの
ポリメラーゼは、例えば、遺伝子工学によってエキソヌ
クレアーゼ活性を除去後に、本発明の方法において有用
である。これまでに識別された好熱性ポリメラーゼの大
部分は、約５０℃〜７５℃で活性であり、約６５℃〜７
５℃で最適活性であり、そして約５０℃〜６５℃で低活
性である。しかしながら、好熱性制限エンドヌクレアー
ゼの熱安定性は、概して、６５℃未満に限定されるの
で、より低温で最適活性を有する好熱性ポリメラーゼ
（例えば、ＢｓｔおよびＢｃａ）は、反応において好熱
性制限エンドヌクレアーゼと一層適合し、したがって、
好ましい。しかしながら、ポリメラーゼ活性の通常の最
適温度と適合しうる更に高い温度で活性である制限エン
ドヌクレアーゼを識別することができ、そしてそれもま
た本発明で有用である。
【００２７】ＳＤＡに適した制限エンドヌクレアーゼ
は、その制限エンドヌクレアーゼの二本鎖の半修飾され
た認識／切断部位の鎖の一方だけを切断する必要がある
（「ニッキング」）。このニッキング活性は、ニッキン
グが反応を永久化し且つ標的増幅の次のサイクルを開始
させるので極めて重要である。制限酵素は、概して、二
本鎖切れ目を生じるので、二重らせん切断部位における
二つの鎖の一方の切断は選択的に阻害される必要があ
る。これは、通常、修飾鎖かまたは非修飾鎖が切断に対
してもはや感受性でないように、合成の際のＤＮＡの一
方の鎖中にヌクレオチド類似体（例えば、デオキシヌク
レオシドホスホロチオエート）を導入することによって
達成される。非修飾鎖が切断から保護される場合、ヌク
レオチド類似体は、その合成の際にプライマー中に包含
されることができ、したがって、増幅反応に対してヌク
レオチド類似体を加える必要も、ポリメラーゼがこのよ
うなヌクレオチド類似体を包含することができるという
必要条件も排除される。
は、その制限エンドヌクレアーゼの二本鎖の半修飾され
た認識／切断部位の鎖の一方だけを切断する必要がある
（「ニッキング」）。このニッキング活性は、ニッキン
グが反応を永久化し且つ標的増幅の次のサイクルを開始
させるので極めて重要である。制限酵素は、概して、二
本鎖切れ目を生じるので、二重らせん切断部位における
二つの鎖の一方の切断は選択的に阻害される必要があ
る。これは、通常、修飾鎖かまたは非修飾鎖が切断に対
してもはや感受性でないように、合成の際のＤＮＡの一
方の鎖中にヌクレオチド類似体（例えば、デオキシヌク
レオシドホスホロチオエート）を導入することによって
達成される。非修飾鎖が切断から保護される場合、ヌク
レオチド類似体は、その合成の際にプライマー中に包含
されることができ、したがって、増幅反応に対してヌク
レオチド類似体を加える必要も、ポリメラーゼがこのよ
うなヌクレオチド類似体を包含することができるという
必要条件も排除される。
【００２８】ヌクレオチド類似体置換は、いずれの制限
エンドヌクレアーゼによってもニッキングを引き起こさ
ないので、制限エンドヌクレアーゼのニッキング特性を
検定する手段は、多数の利用可能な好熱性制限エンドヌ
クレアーゼの中に存在するかもしれない適当な酵素を識
別するために必要とされた。したがって、所望の性質を
有する好熱性制限エンドヌクレアーゼを識別するための
スクリーニングシステムは、二本鎖制限エンドヌクレア
ーゼ認識／切断部位の一方の鎖中に包含された修飾デオ
キシヌクレオチドが該エンドヌクレアーゼによる切断か
ら二つの鎖の一方を保護するその能力に基いて考案され
た。これを、類似体誘導ニッキング検定または鎖保護検
定と称する。
エンドヌクレアーゼによってもニッキングを引き起こさ
ないので、制限エンドヌクレアーゼのニッキング特性を
検定する手段は、多数の利用可能な好熱性制限エンドヌ
クレアーゼの中に存在するかもしれない適当な酵素を識
別するために必要とされた。したがって、所望の性質を
有する好熱性制限エンドヌクレアーゼを識別するための
スクリーニングシステムは、二本鎖制限エンドヌクレア
ーゼ認識／切断部位の一方の鎖中に包含された修飾デオ
キシヌクレオチドが該エンドヌクレアーゼによる切断か
ら二つの鎖の一方を保護するその能力に基いて考案され
た。これを、類似体誘導ニッキング検定または鎖保護検
定と称する。
【００２９】鎖保護検定において、制限エンドヌクレア
ーゼ認識／切断部位を含む一本鎖鋳型およびその認識／
切断部位以外の鋳型の一部分に対して相補的なプライマ
ーを合成する。次に、その鋳型およびプライマーを、典
型的には放射性標識によって標識する。プライマーおよ
び鋳型をハイブリッド形成させ、そして修飾されたｄＮ
ＴＰをプライマーの伸長によって包含して、半修飾され
た制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位を含有する完
全に二本鎖の分子を生じる。この生成物を、二本鎖の切
断に適当な条件下において制限エンドヌクレアーゼによ
って処理する。変性条件下での反応生成物の電気泳動分
析を用いて、生じたフラグメントの寸法により、認識／
切断部位がニックを入れられたか、切断されたかまたは
切断されなかったか否かを確認する。電気泳動でのフラ
グメントの寸法は、認識／切断部位の二つの鎖（すなわ
ち、修飾または非修飾）のどちらが切断から保護された
かを決定するのにも用いられる。鎖保護検定は、常套手
段によって、本発明の技術を用いることなく、本発明で
の用途のための更に別の制限エンドヌクレアーゼをスク
リーニングするのに適応しうる。
ーゼ認識／切断部位を含む一本鎖鋳型およびその認識／
切断部位以外の鋳型の一部分に対して相補的なプライマ
ーを合成する。次に、その鋳型およびプライマーを、典
型的には放射性標識によって標識する。プライマーおよ
び鋳型をハイブリッド形成させ、そして修飾されたｄＮ
ＴＰをプライマーの伸長によって包含して、半修飾され
た制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位を含有する完
全に二本鎖の分子を生じる。この生成物を、二本鎖の切
断に適当な条件下において制限エンドヌクレアーゼによ
って処理する。変性条件下での反応生成物の電気泳動分
析を用いて、生じたフラグメントの寸法により、認識／
切断部位がニックを入れられたか、切断されたかまたは
切断されなかったか否かを確認する。電気泳動でのフラ
グメントの寸法は、認識／切断部位の二つの鎖（すなわ
ち、修飾または非修飾）のどちらが切断から保護された
かを決定するのにも用いられる。鎖保護検定は、常套手
段によって、本発明の技術を用いることなく、本発明で
の用途のための更に別の制限エンドヌクレアーゼをスク
リーニングするのに適応しうる。
【００３０】鎖保護検定を用いて、２８種類の好熱性制
限エンドヌクレアーゼを試験した（ＡｃｃＩ、Ａｓｐ
Ｉ、ＢｓａＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓｉＹＩ、ＢｓｌＩ、Ｂ
ｓｍＩの二つの縮重部位、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、Ｂ
ｓｍＨＩ、ＢｓｐＷＩ、ＢｓｏＢＩの四つの縮重部位、
ＢｓｏＦＩ、ＢｓｒＩの二つの縮重部位、ＢｓｒＢＲ
Ｉ、ＢｓｒＤＩの二つの縮重部位、Ｂｓｔ７１Ｉ、Ｂｓ
ｔＮＩの二つの縮重部位、ＢｓｔＯＩ、ＢｓｔＸＩ、Ｄ
ｐｎＩ、ＨａｅＩＩ、ＭａｍＩ、ＭｂｏＩＩ、Ｍｖａ
Ｉ、ＭｗｏＩ、ＳｆｉＩおよびＴｔｈｌｌｌＩ）。２８
種類の内１１種類、すなわち、ＡｃｃＩ、ＢｓｌＩ、Ｂ
ｓｍＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｏＢＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＤ
Ｉ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＯＩ、ＢｓｔＸＩおよびＭｗｏ
Ｉは、少なくとも一つのα−チオｄＮＴＰの導入の際に
ニックを入れられた少なくとも一つの制限エンドヌクレ
アーゼ認識／切断部位を有した。ＢｓｍＩの認識部位の
一つは、ｄＣＴＰαＳが包含された場合に非修飾鎖の保
護を示した。５０〜６５℃での熱安定性について試験さ
れた場合、１１種類の内一つ（ＡｃｃＩ）を除く全部が
十分に安定であったかまたは二本鎖ＤＮＡ若しくはＢＳ
Ａなどの一般的な安定剤の添加によって十分に安定化さ
れることができた。したがって、これらのエンドヌクレ
アーゼは、ｔＳＤＡ反応において好熱性ポリメラーゼと
適合した。
限エンドヌクレアーゼを試験した（ＡｃｃＩ、Ａｓｐ
Ｉ、ＢｓａＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓｉＹＩ、ＢｓｌＩ、Ｂ
ｓｍＩの二つの縮重部位、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、Ｂ
ｓｍＨＩ、ＢｓｐＷＩ、ＢｓｏＢＩの四つの縮重部位、
ＢｓｏＦＩ、ＢｓｒＩの二つの縮重部位、ＢｓｒＢＲ
Ｉ、ＢｓｒＤＩの二つの縮重部位、Ｂｓｔ７１Ｉ、Ｂｓ
ｔＮＩの二つの縮重部位、ＢｓｔＯＩ、ＢｓｔＸＩ、Ｄ
ｐｎＩ、ＨａｅＩＩ、ＭａｍＩ、ＭｂｏＩＩ、Ｍｖａ
Ｉ、ＭｗｏＩ、ＳｆｉＩおよびＴｔｈｌｌｌＩ）。２８
種類の内１１種類、すなわち、ＡｃｃＩ、ＢｓｌＩ、Ｂ
ｓｍＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｏＢＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＤ
Ｉ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＯＩ、ＢｓｔＸＩおよびＭｗｏ
Ｉは、少なくとも一つのα−チオｄＮＴＰの導入の際に
ニックを入れられた少なくとも一つの制限エンドヌクレ
アーゼ認識／切断部位を有した。ＢｓｍＩの認識部位の
一つは、ｄＣＴＰαＳが包含された場合に非修飾鎖の保
護を示した。５０〜６５℃での熱安定性について試験さ
れた場合、１１種類の内一つ（ＡｃｃＩ）を除く全部が
十分に安定であったかまたは二本鎖ＤＮＡ若しくはＢＳ
Ａなどの一般的な安定剤の添加によって十分に安定化さ
れることができた。したがって、これらのエンドヌクレ
アーゼは、ｔＳＤＡ反応において好熱性ポリメラーゼと
適合した。
【００３１】更に、鎖保護検定の初期スクリーニング条
件下で部分または低ニッキング活性を有したいくつかの
好熱性エンドヌクレアーゼを識別した（例えば、Ｔｔｈ
ｌｌｌＩ、ＢｓｉＹＩおよびＢｓｏＦＩ）。低下したニ
ッキング活性がＳＤＡを妨げることはなかったが、制限
エンドヌクレアーゼによるニッキングは、反応条件を調
整することによって（例えば、緩衝液を最適化するかま
たは反応温度を調整することによって）最適化されて、
それらの条件をｔＳＤＡにおいて一層有効にすることが
できる。更に、制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位
に隣接する配列は、エンドヌクレアーゼ活性の程度に影
響を与えることがあるということは知られているので、
鋳型の隣接配列の変更は、部分的にしかニックを入れら
れなかったエンドヌクレアーゼのニッキング活性を更に
向上させることができる。
件下で部分または低ニッキング活性を有したいくつかの
好熱性エンドヌクレアーゼを識別した（例えば、Ｔｔｈ
ｌｌｌＩ、ＢｓｉＹＩおよびＢｓｏＦＩ）。低下したニ
ッキング活性がＳＤＡを妨げることはなかったが、制限
エンドヌクレアーゼによるニッキングは、反応条件を調
整することによって（例えば、緩衝液を最適化するかま
たは反応温度を調整することによって）最適化されて、
それらの条件をｔＳＤＡにおいて一層有効にすることが
できる。更に、制限エンドヌクレアーゼ認識／切断部位
に隣接する配列は、エンドヌクレアーゼ活性の程度に影
響を与えることがあるということは知られているので、
鋳型の隣接配列の変更は、部分的にしかニックを入れら
れなかったエンドヌクレアーゼのニッキング活性を更に
向上させることができる。
【００３２】好熱性ＳＤＡは、所望の熱安定ポリメラー
ゼおよび熱安定制限エンドヌクレアーゼの置換を伴っ
て、本質的には従来のＳＤＡと同様に行われる。当然な
がら、反応温度は、選択された好熱性酵素に適したより
高温に調整されるであろうし、そして慣用的な制限エン
ドヌクレアーゼ認識／切断部位は、選択された熱安定エ
ンドヌクレアーゼに適当な制限エンドヌクレアーゼ認識
／切断部位によって置き換えられるであろう。更に、従
来のＳＤＡとは対照的に、実施者は、初期熱変性工程の
前に、その温度で酵素が十分に安定である場合、酵素を
反応混合物中に含めることができる。ｔＳＤＡで用いる
のに好ましい制限エンドヌクレアーゼは、ＢｓｒＩ、Ｂ
ｓｔＮＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｌＩおよびＢｓｏＢＩ（ニ
ュー・イングランド・バイラブズ）並びにＢｓｔＯＩ
（プロメガ）である。好ましい好熱性ポリメラーゼは、
ＢｃａおよびＢｓｔである。
ゼおよび熱安定制限エンドヌクレアーゼの置換を伴っ
て、本質的には従来のＳＤＡと同様に行われる。当然な
がら、反応温度は、選択された好熱性酵素に適したより
高温に調整されるであろうし、そして慣用的な制限エン
ドヌクレアーゼ認識／切断部位は、選択された熱安定エ
ンドヌクレアーゼに適当な制限エンドヌクレアーゼ認識
／切断部位によって置き換えられるであろう。更に、従
来のＳＤＡとは対照的に、実施者は、初期熱変性工程の
前に、その温度で酵素が十分に安定である場合、酵素を
反応混合物中に含めることができる。ｔＳＤＡで用いる
のに好ましい制限エンドヌクレアーゼは、ＢｓｒＩ、Ｂ
ｓｔＮＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｌＩおよびＢｓｏＢＩ（ニ
ュー・イングランド・バイラブズ）並びにＢｓｔＯＩ
（プロメガ）である。好ましい好熱性ポリメラーゼは、
ＢｃａおよびＢｓｔである。
【００３３】高増幅因子（例えば、１０8〜１０9）が可
能な最適なＳＤＡシステムを開発するために、緩衝液シ
ステムの評価および最適化が勧められる。これは、好熱
性ＳＤＡで用いるための新規な制限酵素／ポリメラーゼ
対合を評価する場合でもある。このような最適化法は、
ｔＳＤＡのための任意の制限エンドヌクレアーゼ／ポリ
メラーゼ組合わせに適当な緩衝液を決定するのに応用す
ることができ、本発明の技術を用いることなく慣例的な
試験のみを必要とする。大部分の場合、従来のＳＤＡで
典型的に用いられるＫＰＯ4／ＭｇＣｌ2緩衝液がｔＳＤ
Ａに適しており、記載の通りかまたは成分濃度の若干の
慣例的変更を伴う。
能な最適なＳＤＡシステムを開発するために、緩衝液シ
ステムの評価および最適化が勧められる。これは、好熱
性ＳＤＡで用いるための新規な制限酵素／ポリメラーゼ
対合を評価する場合でもある。このような最適化法は、
ｔＳＤＡのための任意の制限エンドヌクレアーゼ／ポリ
メラーゼ組合わせに適当な緩衝液を決定するのに応用す
ることができ、本発明の技術を用いることなく慣例的な
試験のみを必要とする。大部分の場合、従来のＳＤＡで
典型的に用いられるＫＰＯ4／ＭｇＣｌ2緩衝液がｔＳＤ
Ａに適しており、記載の通りかまたは成分濃度の若干の
慣例的変更を伴う。
【００３４】in situ ｔＳＤＡでは、増幅のための試薬
を、非固定細胞または上記のように固定され且つ透過性
にされた細胞に対して適用する。反応の開始後、標的配
列の増幅を、概して、約５０〜６５℃で１分間〜２時
間、好ましくは、１０分間〜１時間進行させる。ｔＳＤ
Ａまたは従来のＳＤＡによる in situ 増幅に必要な時
間は、ＰＣＲによって同様の水準の標的 in situ 増幅
を得るのに必要な時間よりも有意に少ないことが判って
いる。若干の場合、in situ ｔＳＤＡのための試薬（特
に、プライマー）の濃度を in vitro ｔＳＤＡと比較し
て増加させて、有効な増幅のために十分な量が細胞に入
るのを確実にすることは好都合でありうる。細胞からの
アンプリコンの漏出は、若干の in situ 核酸増幅法に
おいて問題であった。このような漏出は、種々のパラメ
ーター、例えば、アンプリコンの寸法、温度、温度循
環、および細胞が透過性にされた程度の複雑な相互作用
の結果であると考えられる。細胞中のアンプリコンの保
持を促すために、ジゴキシゲニン（「ｄｉｇ」）、ビオ
チンまたはイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴ
Ｃ）などの残基に対して結合したデオキシリボヌクレオ
シド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含むｄＮＴＰ類似体を、場
合により、ｄＮＴＰαＳと一緒に増幅生成物中に包含さ
せることができる。更に別のｄＮＴＰ類似体は、場合に
より、増幅生成物を検出するのに用いられるタグすなわ
ち標識として役立つこともできる。ｄｉｇなどのｄＮＴ
Ｐ類似体の包含は、それぞれの包含された標識残基が、
アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ−α−ｄｉｇ）に結合
した抗ｄｉｇ抗体に対して結合することによってシグナ
ルを生じるので、増強されたシグナルを提供する利点を
有する。増幅された標的配列は、概して、ＰＣＲアンプ
リコンよりも小さいので、このようなｄＮＴＰ類似体の
包含は、in situ ＳＤＡに特に好都合である。しかしな
がら、ＳＤＡアンプリコンがＰＣＲアンプリコンよりも
概して小さいとしても、従来のin situ ＳＤＡに関係し
た漏出は in situ ＰＣＲによるよりも少ないことが観
察された。in situ ｔＳＤＡのより高い温度のために、
アンプリコン漏出は、おそらくは in situ ＰＣＲで観
察された水準まで増加するかもしれないと予想された。
しかしながら、実際は、高温でのアンプリコン漏出の僅
かな増加はありうるが、in situ ｔＳＤＡでのアンプリ
コン漏出は in situ ＰＣＲで見られるよりもなお有意
に少ない。
を、非固定細胞または上記のように固定され且つ透過性
にされた細胞に対して適用する。反応の開始後、標的配
列の増幅を、概して、約５０〜６５℃で１分間〜２時
間、好ましくは、１０分間〜１時間進行させる。ｔＳＤ
Ａまたは従来のＳＤＡによる in situ 増幅に必要な時
間は、ＰＣＲによって同様の水準の標的 in situ 増幅
を得るのに必要な時間よりも有意に少ないことが判って
いる。若干の場合、in situ ｔＳＤＡのための試薬（特
に、プライマー）の濃度を in vitro ｔＳＤＡと比較し
て増加させて、有効な増幅のために十分な量が細胞に入
るのを確実にすることは好都合でありうる。細胞からの
アンプリコンの漏出は、若干の in situ 核酸増幅法に
おいて問題であった。このような漏出は、種々のパラメ
ーター、例えば、アンプリコンの寸法、温度、温度循
環、および細胞が透過性にされた程度の複雑な相互作用
の結果であると考えられる。細胞中のアンプリコンの保
持を促すために、ジゴキシゲニン（「ｄｉｇ」）、ビオ
チンまたはイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴ
Ｃ）などの残基に対して結合したデオキシリボヌクレオ
シド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含むｄＮＴＰ類似体を、場
合により、ｄＮＴＰαＳと一緒に増幅生成物中に包含さ
せることができる。更に別のｄＮＴＰ類似体は、場合に
より、増幅生成物を検出するのに用いられるタグすなわ
ち標識として役立つこともできる。ｄｉｇなどのｄＮＴ
Ｐ類似体の包含は、それぞれの包含された標識残基が、
アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ−α−ｄｉｇ）に結合
した抗ｄｉｇ抗体に対して結合することによってシグナ
ルを生じるので、増強されたシグナルを提供する利点を
有する。増幅された標的配列は、概して、ＰＣＲアンプ
リコンよりも小さいので、このようなｄＮＴＰ類似体の
包含は、in situ ＳＤＡに特に好都合である。しかしな
がら、ＳＤＡアンプリコンがＰＣＲアンプリコンよりも
概して小さいとしても、従来のin situ ＳＤＡに関係し
た漏出は in situ ＰＣＲによるよりも少ないことが観
察された。in situ ｔＳＤＡのより高い温度のために、
アンプリコン漏出は、おそらくは in situ ＰＣＲで観
察された水準まで増加するかもしれないと予想された。
しかしながら、実際は、高温でのアンプリコン漏出の僅
かな増加はありうるが、in situ ｔＳＤＡでのアンプリ
コン漏出は in situ ＰＣＲで見られるよりもなお有意
に少ない。
【００３５】標的増幅後、生成されたアンプリコンは、
特異的核酸配列の検出のための当該技術分野において知
られている方法のいずれによっても検出することができ
る。例えば、増幅生成物は、in situ でまたは細胞から
のアンプリコンの放出後に、オリゴヌクレオチド検出用
プローブに対する特異的ハイブリダイゼーションによっ
て検出することができる。検出用プローブは、検出可能
な標識、すなわち、検出可能なシグナルを生じるかまた
は生じるように製造されうる残基を含む短いオリゴヌク
レオチドである。標識は、オリゴヌクレオチドプローブ
中に、ニックトランスレーションによって、末端標識に
よってまたはプローブの化学合成の際に包含されうる。
オリゴヌクレオチドプローブと一緒に用いるための多数
の直接的および間接的に検出可能な標識が当該技術分野
において知られている。直接的に検出可能な標識として
は、検出可能にするのに更に反応を必要としない標識、
例えば、放射性同位体、蛍光残基および色素がある。イ
ソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）などの蛍光
標識および32Ｐなどの放射性同位体は、in situ 増幅さ
れた標的配列の直接検出用にプローブを標識する場合に
用いるのに好ましい。間接的に検出可能な標識として
は、検出可能にするのに更に別の試薬と反応させる必要
がある標識、例えば、着色反応生成物を生成することが
できる酵素、ビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、抗
原、ハプテンまたは蛍光色素がある。酵素標識からのシ
グナルは、概して、酵素と、その基質および着色酵素反
応生成物を生じるのに必要な何等かの追加の試薬とを反
応させることによって発生する。ビオチン（またはアビ
ジン）標識は、標識されたアビジン（または標識された
ビオチン）または標識された抗ビオチン（または標識さ
れた抗アビジン）抗体に対して結合することによって検
出することができる。ジゴキシゲニンおよびハプテン標
識は、通常、標識された抗ジゴキシゲニン（抗ｄｉｇ）
または抗ハプテン抗体に対して特異的に結合することに
よって検出される。酵素は、本発明において間接的に検
出可能な標識として用いるのに好ましい。最も好ましい
のは、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）であるが、そ
れは安定であり且つ組織および細胞中で標識するのに広
範囲に用いられてきたからである。ＡＰの存在は、基質
との反応によって検出することができる。ＡＰの検出に
好ましい基質は、Vector Red／Vector Blue（ベクター
・ラブズ（Vector Labs），ＣＡ）、５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）／ニトロブ
ルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）（シグマ・ケミカル・カ
ンパニー（Sigma Chemical Company），セント・ルイ
ス，ＭＯ）または Nuclear Fast Red（シグマ・ケミカ
ル・カンパニー）である。Vector Red は、蛍光の利点
を更に有し、従来の光学顕微鏡法によってかまたは蛍光
顕微鏡法によって正のシグナルの可視化を可能にする。
ＡＰとこれらの基質との着色反応生成物を生じさせる方
法は当該技術分野において知られている。
特異的核酸配列の検出のための当該技術分野において知
られている方法のいずれによっても検出することができ
る。例えば、増幅生成物は、in situ でまたは細胞から
のアンプリコンの放出後に、オリゴヌクレオチド検出用
プローブに対する特異的ハイブリダイゼーションによっ
て検出することができる。検出用プローブは、検出可能
な標識、すなわち、検出可能なシグナルを生じるかまた
は生じるように製造されうる残基を含む短いオリゴヌク
レオチドである。標識は、オリゴヌクレオチドプローブ
中に、ニックトランスレーションによって、末端標識に
よってまたはプローブの化学合成の際に包含されうる。
オリゴヌクレオチドプローブと一緒に用いるための多数
の直接的および間接的に検出可能な標識が当該技術分野
において知られている。直接的に検出可能な標識として
は、検出可能にするのに更に反応を必要としない標識、
例えば、放射性同位体、蛍光残基および色素がある。イ
ソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）などの蛍光
標識および32Ｐなどの放射性同位体は、in situ 増幅さ
れた標的配列の直接検出用にプローブを標識する場合に
用いるのに好ましい。間接的に検出可能な標識として
は、検出可能にするのに更に別の試薬と反応させる必要
がある標識、例えば、着色反応生成物を生成することが
できる酵素、ビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、抗
原、ハプテンまたは蛍光色素がある。酵素標識からのシ
グナルは、概して、酵素と、その基質および着色酵素反
応生成物を生じるのに必要な何等かの追加の試薬とを反
応させることによって発生する。ビオチン（またはアビ
ジン）標識は、標識されたアビジン（または標識された
ビオチン）または標識された抗ビオチン（または標識さ
れた抗アビジン）抗体に対して結合することによって検
出することができる。ジゴキシゲニンおよびハプテン標
識は、通常、標識された抗ジゴキシゲニン（抗ｄｉｇ）
または抗ハプテン抗体に対して特異的に結合することに
よって検出される。酵素は、本発明において間接的に検
出可能な標識として用いるのに好ましい。最も好ましい
のは、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）であるが、そ
れは安定であり且つ組織および細胞中で標識するのに広
範囲に用いられてきたからである。ＡＰの存在は、基質
との反応によって検出することができる。ＡＰの検出に
好ましい基質は、Vector Red／Vector Blue（ベクター
・ラブズ（Vector Labs），ＣＡ）、５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）／ニトロブ
ルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）（シグマ・ケミカル・カ
ンパニー（Sigma Chemical Company），セント・ルイ
ス，ＭＯ）または Nuclear Fast Red（シグマ・ケミカ
ル・カンパニー）である。Vector Red は、蛍光の利点
を更に有し、従来の光学顕微鏡法によってかまたは蛍光
顕微鏡法によって正のシグナルの可視化を可能にする。
ＡＰとこれらの基質との着色反応生成物を生じさせる方
法は当該技術分野において知られている。
【００３６】増幅された標的配列を検出用プローブに対
するハイブリダイゼーションによって検出するために、
細胞または組織を、一本鎖の増幅生成物に対するプロー
ブの特異的ハイブリダイゼーションに適当な反応条件下
で、標識されたプローブに対して暴露する。概して、検
出用プローブは、それが、二つの増幅プライマーの結合
部位間にあるアンプリコン中のヌクレオチド配列に対し
てハイブリッド形成するように選択されるであろう。し
かしながら、検出用プローブは、増幅プライマーのどち
らかと同様のヌクレオチド配列を有していてもよい。検
出用プローブに対する in situ ハイブリダイゼーショ
ンによる検出に適当な方法は、J.B.ローレンス（Lawren
ce）ら（1989年，Cell 57,493-502）、J.B.ローレンス
ら（1990年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,5420-5424）
によっておよび米国特許第4,888,278号明細書で記載さ
れている。
するハイブリダイゼーションによって検出するために、
細胞または組織を、一本鎖の増幅生成物に対するプロー
ブの特異的ハイブリダイゼーションに適当な反応条件下
で、標識されたプローブに対して暴露する。概して、検
出用プローブは、それが、二つの増幅プライマーの結合
部位間にあるアンプリコン中のヌクレオチド配列に対し
てハイブリッド形成するように選択されるであろう。し
かしながら、検出用プローブは、増幅プライマーのどち
らかと同様のヌクレオチド配列を有していてもよい。検
出用プローブに対する in situ ハイブリダイゼーショ
ンによる検出に適当な方法は、J.B.ローレンス（Lawren
ce）ら（1989年，Cell 57,493-502）、J.B.ローレンス
ら（1990年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,5420-5424）
によっておよび米国特許第4,888,278号明細書で記載さ
れている。
【００３７】或いは、増幅生成物は、ウォーカーら（19
92b）、上記によって記載のように、in situ でまたは
プライマー伸長による細胞からの放出後に検出すること
ができる。プライマー伸長法では、検出可能な標識を含
むオリゴヌクレオチドプライマーを増幅生成物に対して
ハイブリッド形成させ、そしてポリメラーゼを加えるこ
とによって伸長させる。検出のために、プライマーは、
好ましくは、32Ｐまたは蛍光標識を用いて５′末端に標
識することができる。或いは、ハイブリッド形成したプ
ライマーの伸長は、直接的にまたは間接的に検出可能な
標識を含むｄＮＴＰ類似体を包含することができる。例
えば、プライマーの伸長は、ｄｉｇ誘導体ｄＮＴＰを包
含することができ、次に、それを、ＡＰ−α−ｄｉｇお
よび適当なＡＰ基質との反応によって伸長後に検出す
る。伸長されるプライマーは、増幅プライマーと同じで
あってよいかまたはそれは、増幅プライマーの結合部位
間にあるアンプリコン中のヌクレオチド配列に対してハ
イブリッド形成する異なったプライマーであってよい。
92b）、上記によって記載のように、in situ でまたは
プライマー伸長による細胞からの放出後に検出すること
ができる。プライマー伸長法では、検出可能な標識を含
むオリゴヌクレオチドプライマーを増幅生成物に対して
ハイブリッド形成させ、そしてポリメラーゼを加えるこ
とによって伸長させる。検出のために、プライマーは、
好ましくは、32Ｐまたは蛍光標識を用いて５′末端に標
識することができる。或いは、ハイブリッド形成したプ
ライマーの伸長は、直接的にまたは間接的に検出可能な
標識を含むｄＮＴＰ類似体を包含することができる。例
えば、プライマーの伸長は、ｄｉｇ誘導体ｄＮＴＰを包
含することができ、次に、それを、ＡＰ−α−ｄｉｇお
よび適当なＡＰ基質との反応によって伸長後に検出す
る。伸長されるプライマーは、増幅プライマーと同じで
あってよいかまたはそれは、増幅プライマーの結合部位
間にあるアンプリコン中のヌクレオチド配列に対してハ
イブリッド形成する異なったプライマーであってよい。
【００３８】検出可能な標識は、標的配列増幅の際に、
アンプリコン中に直接的に包含させることもできる。例
えば、従来のＳＤＡ反応におけるｄＮＴＰの一つは、直
接的にまたは間接的に検出可能な標識に対して結合した
ｄＮＴＰを含むｄＮＴＰ類似体によって完全にまたは部
分的に置き換えることができる。例えば、所望の標識に
対して結合したｄＵＴＰは、ＳＤＡ反応においてｄＴＴ
Ｐの代わりに置き換えることができる。次に、ポリメラ
ーゼは、増幅プライマーの伸長によって生じた増幅生成
物中に直接的に標識を包含する。その標識は、直接的に
または間接的に検出することができる。好ましくは、ｄ
ＮＴＰに対して結合した標識は、蛍光顕微鏡法またはフ
ローサイトメトリーによってアンプリコン中で直接的に
検出することができる蛍光標識である。
アンプリコン中に直接的に包含させることもできる。例
えば、従来のＳＤＡ反応におけるｄＮＴＰの一つは、直
接的にまたは間接的に検出可能な標識に対して結合した
ｄＮＴＰを含むｄＮＴＰ類似体によって完全にまたは部
分的に置き換えることができる。例えば、所望の標識に
対して結合したｄＵＴＰは、ＳＤＡ反応においてｄＴＴ
Ｐの代わりに置き換えることができる。次に、ポリメラ
ーゼは、増幅プライマーの伸長によって生じた増幅生成
物中に直接的に標識を包含する。その標識は、直接的に
または間接的に検出することができる。好ましくは、ｄ
ＮＴＰに対して結合した標識は、蛍光顕微鏡法またはフ
ローサイトメトリーによってアンプリコン中で直接的に
検出することができる蛍光標識である。
【００３９】別の好ましい実施態様において、ｄＮＴＰ
に対して結合した標識はビオチンまたはジゴキシゲニン
であり、それは、ストレプトアビジン／ＦＩＴＣとの反
応および蛍光顕微鏡法またはフローサイトメトリーによ
って検出することができる。
に対して結合した標識はビオチンまたはジゴキシゲニン
であり、それは、ストレプトアビジン／ＦＩＴＣとの反
応および蛍光顕微鏡法またはフローサイトメトリーによ
って検出することができる。
【００４０】第二増幅生成物は、標的配列上のシグナル
プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長によっ
て生じた標的配列のコピーである。第二増幅生成物は、
増幅された標的配列の内部セグメント、およびシグナル
プライマーと結合している検出可能な標識を含む。少な
くとも、シグナルプライマーの３′末端は、標的配列に
対してハイブリッド形成する配列を含む。それは、更
に、第二増幅生成物の捕捉または固定化を促進する特徴
を含むことができるので、それらは、検出、定量または
更に別の操作のために単離することができる。in situ
ｔＳＤＡ反応での第二増幅生成物の同時生成は、均一で
あり且つ増幅と同時に行うことができるもう一つの検出
法を提供する、極めて長い in situ プローブハイブリ
ダイゼーション工程は排除され、そしてシグナルプライ
マーの濃度は、ハイブリダイゼーションプローブに対す
るよりも低い。より低い濃度自体がバックグラウンドを
減少させ、そしてバックグラウンドを更に減少させるよ
り高い緊縮洗浄をも可能にする。第二増幅生成物を生じ
るために、少なくとも一つのシグナルプライマーを in
situ ｔＳＤＡ反応混合物中に包含させる。そのシグナ
ルプライマーは、増幅プライマーのハイブリダイゼーシ
ョン部位の下流の標的配列に対してハイブリッド形成
し、そして増幅プライマーの伸長に似た様式でポリメラ
ーゼによって伸長される。増幅プライマーの伸長は、標
的配列からシグナルプライマーの下流伸長生成物を置換
する。次に、反対側の増幅プライマーは、伸長され置換
されたシグナルプライマーに対してハイブリッド形成す
ることができ、そしてそれ自体がポリメラーゼによって
伸長され、結果として、標的増幅を示す一層長い二重ら
せん中へのシグナルプライマーの包含をもたらす。残り
の伸長されないシグナルプライマーはいずれも小さいの
で、それらは細胞外へ洗浄除去することができるが、伸
長されたシグナルプライマーは細胞中に保持される。し
たがって、標的増幅特異的シグナルは、標的が存在して
いる細胞と結合するようになり、そして標的が存在しな
い細胞にはほとんど存在しない。
プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長によっ
て生じた標的配列のコピーである。第二増幅生成物は、
増幅された標的配列の内部セグメント、およびシグナル
プライマーと結合している検出可能な標識を含む。少な
くとも、シグナルプライマーの３′末端は、標的配列に
対してハイブリッド形成する配列を含む。それは、更
に、第二増幅生成物の捕捉または固定化を促進する特徴
を含むことができるので、それらは、検出、定量または
更に別の操作のために単離することができる。in situ
ｔＳＤＡ反応での第二増幅生成物の同時生成は、均一で
あり且つ増幅と同時に行うことができるもう一つの検出
法を提供する、極めて長い in situ プローブハイブリ
ダイゼーション工程は排除され、そしてシグナルプライ
マーの濃度は、ハイブリダイゼーションプローブに対す
るよりも低い。より低い濃度自体がバックグラウンドを
減少させ、そしてバックグラウンドを更に減少させるよ
り高い緊縮洗浄をも可能にする。第二増幅生成物を生じ
るために、少なくとも一つのシグナルプライマーを in
situ ｔＳＤＡ反応混合物中に包含させる。そのシグナ
ルプライマーは、増幅プライマーのハイブリダイゼーシ
ョン部位の下流の標的配列に対してハイブリッド形成
し、そして増幅プライマーの伸長に似た様式でポリメラ
ーゼによって伸長される。増幅プライマーの伸長は、標
的配列からシグナルプライマーの下流伸長生成物を置換
する。次に、反対側の増幅プライマーは、伸長され置換
されたシグナルプライマーに対してハイブリッド形成す
ることができ、そしてそれ自体がポリメラーゼによって
伸長され、結果として、標的増幅を示す一層長い二重ら
せん中へのシグナルプライマーの包含をもたらす。残り
の伸長されないシグナルプライマーはいずれも小さいの
で、それらは細胞外へ洗浄除去することができるが、伸
長されたシグナルプライマーは細胞中に保持される。し
たがって、標的増幅特異的シグナルは、標的が存在して
いる細胞と結合するようになり、そして標的が存在しな
い細胞にはほとんど存在しない。
【００４１】次に、ハイブリッド形成した検出用プロー
ブ、伸長されたプライマー、アンプリコンまたは第二増
幅生成物の標識を、好ましくは、in situ で、増幅され
た標的配列の存在の指標として検出する。これは、Ａ
Ｐ、ビオチンまたはｄｉｇなどの間接的に検出可能な標
識のシグナルを生じるように、細胞に対する試薬の添加
を必要とすることがありうる。細胞の顕微鏡分析は、検
出可能な標識が酵素である場合に好ましい。顕微鏡分析
は、細胞若しくは組織の目視観察（蛍光または光学顕微
鏡法）によるかまたは DISCOVERY（ベクトン・ディキン
ソン・イメージ・サイトメトリー（Becton Dickinson I
mage Cytometry），ライデン，オランダ）などの装置を
用いる自動映像分析によって、正の細胞の数およびシグ
ナル強度を評価することができる。標識が放射性標識で
ある場合、細胞をシンチレーション液中に懸濁させ、そ
してシグナルをシンチレーション計数によって検出する
ことができる。直接的に検出可能な蛍光標識の使用は、
フローサイトメトリー（例えば、FACSCAN、ベクトン・
ディキンソン・イムノサイトメトリー・システムズ（Be
cton Dickinson Immunocytometry Systems），サン・ホ
セ，ＣＡ）による懸濁液中の細胞の蛍光分析を可能にす
る。細胞数対蛍光強度のプロット上でのピーク蛍光の右
側への移動は、標的配列を含有する細胞数の増加を示す
ものである。逆に、プロット上でのピーク蛍光の左側へ
の移動は、標的配列を含有する細胞数の減少を示すもの
である。或いは、増幅生成物は、上記のように検出前に
細胞から放出されうるしまたは、例えば、ＥｔＢｒ染
色、検出用プローブのハイブリダイゼーション若しくは
プライマー伸長によってゲル電気泳動後に増幅生成物の
バンドとして可視化されうる。放射性標識をプライマー
または検出用プローブに対して用いる場合、増幅生成物
は、ゲルのオートラジオグラフィーによって可視化され
うる。
ブ、伸長されたプライマー、アンプリコンまたは第二増
幅生成物の標識を、好ましくは、in situ で、増幅され
た標的配列の存在の指標として検出する。これは、Ａ
Ｐ、ビオチンまたはｄｉｇなどの間接的に検出可能な標
識のシグナルを生じるように、細胞に対する試薬の添加
を必要とすることがありうる。細胞の顕微鏡分析は、検
出可能な標識が酵素である場合に好ましい。顕微鏡分析
は、細胞若しくは組織の目視観察（蛍光または光学顕微
鏡法）によるかまたは DISCOVERY（ベクトン・ディキン
ソン・イメージ・サイトメトリー（Becton Dickinson I
mage Cytometry），ライデン，オランダ）などの装置を
用いる自動映像分析によって、正の細胞の数およびシグ
ナル強度を評価することができる。標識が放射性標識で
ある場合、細胞をシンチレーション液中に懸濁させ、そ
してシグナルをシンチレーション計数によって検出する
ことができる。直接的に検出可能な蛍光標識の使用は、
フローサイトメトリー（例えば、FACSCAN、ベクトン・
ディキンソン・イムノサイトメトリー・システムズ（Be
cton Dickinson Immunocytometry Systems），サン・ホ
セ，ＣＡ）による懸濁液中の細胞の蛍光分析を可能にす
る。細胞数対蛍光強度のプロット上でのピーク蛍光の右
側への移動は、標的配列を含有する細胞数の増加を示す
ものである。逆に、プロット上でのピーク蛍光の左側へ
の移動は、標的配列を含有する細胞数の減少を示すもの
である。或いは、増幅生成物は、上記のように検出前に
細胞から放出されうるしまたは、例えば、ＥｔＢｒ染
色、検出用プローブのハイブリダイゼーション若しくは
プライマー伸長によってゲル電気泳動後に増幅生成物の
バンドとして可視化されうる。放射性標識をプライマー
または検出用プローブに対して用いる場合、増幅生成物
は、ゲルのオートラジオグラフィーによって可視化され
うる。
【００４２】in situ 増幅およびフローサイトメトリー
による分析のための細胞を製造する慣用法は、抗体染色
および／または増幅の前に、全血からの末梢血単核細胞
（ＰＢＭＣ−例えば、FICOLL 勾配遠心分離）の単離を
必要とする。ＰＢＭＣからＴ細胞を単離する追加の工程
もまた必要でありうる。このような慣用的なプロトコル
は、全血試料に関するフローサイトメトリー結果を得る
のに約２日間を要する。現在、全血試料を固定し且つ i
n situ 増幅させて、試料を調製するのに FACS TM溶解液
（ベクトン・ディキンソン・イムノサイトメトリー・シ
ステムズ，サン・ホセ，カリフォルニア）を用いてたっ
た一日でフローサイトメトリー分析することができるこ
とが判っている。この溶解試薬は、ジエチレングリコー
ル、ヘパリン、クエン酸緩衝液およびホルムアルデヒド
を含み、ｐＨ７．２である。ホルムアルデヒドの存在の
ために、FACSTM 溶解液は、生物学的試料からの生物障
害物を減少させる利点を提供する。新規な試料調製プロ
トコルでは、試料を FACST M 溶解液によって簡単に溶解
させた後、上記のように固定し、透過性にし、そして i
n situ 増幅させる。懸濁液中または組織中の細胞を in
situ ｔＳＤＡおよび免疫染色両方によって分析する場
合、溶解および固定の前に抗体を目的のエピトープまた
は抗原に対して結合させること、および抗体を間接的に
検出可能な標識、例えば、ビオチンに対して結合させる
ことが好ましい。次に、抗体結合体を、固定によって細
胞上で安定化させる。in situ ｔＳＤＡ後、結合した抗
体を、適当なシグナル発生試薬、例えば、蛍光色素に結
合したストレプトアビジンまたは蛍光色素に結合した抗
ビオチンとの反応によって検出する。標的増幅の検出の
ための蛍光色素および抗体の蛍光色素は、フローサイト
メトリーで別々に検出可能であり、実施者は、細胞中の
標的の存在を確認し且つ標的が見出される細胞の種類を
識別することを同時にすることができる。新規な試料調
製プロトコルは、増幅反応において蛍光標識されたシグ
ナルプライマーの包含によって更に短縮することができ
る。上記のように、シグナルプライマーは、増幅反応の
際に標的増幅特異的様式で伸長され且つ二本鎖にされ
て、増幅生成物を検出する追加の増幅後工程の必要性を
なくする。
による分析のための細胞を製造する慣用法は、抗体染色
および／または増幅の前に、全血からの末梢血単核細胞
（ＰＢＭＣ−例えば、FICOLL 勾配遠心分離）の単離を
必要とする。ＰＢＭＣからＴ細胞を単離する追加の工程
もまた必要でありうる。このような慣用的なプロトコル
は、全血試料に関するフローサイトメトリー結果を得る
のに約２日間を要する。現在、全血試料を固定し且つ i
n situ 増幅させて、試料を調製するのに FACS TM溶解液
（ベクトン・ディキンソン・イムノサイトメトリー・シ
ステムズ，サン・ホセ，カリフォルニア）を用いてたっ
た一日でフローサイトメトリー分析することができるこ
とが判っている。この溶解試薬は、ジエチレングリコー
ル、ヘパリン、クエン酸緩衝液およびホルムアルデヒド
を含み、ｐＨ７．２である。ホルムアルデヒドの存在の
ために、FACSTM 溶解液は、生物学的試料からの生物障
害物を減少させる利点を提供する。新規な試料調製プロ
トコルでは、試料を FACST M 溶解液によって簡単に溶解
させた後、上記のように固定し、透過性にし、そして i
n situ 増幅させる。懸濁液中または組織中の細胞を in
situ ｔＳＤＡおよび免疫染色両方によって分析する場
合、溶解および固定の前に抗体を目的のエピトープまた
は抗原に対して結合させること、および抗体を間接的に
検出可能な標識、例えば、ビオチンに対して結合させる
ことが好ましい。次に、抗体結合体を、固定によって細
胞上で安定化させる。in situ ｔＳＤＡ後、結合した抗
体を、適当なシグナル発生試薬、例えば、蛍光色素に結
合したストレプトアビジンまたは蛍光色素に結合した抗
ビオチンとの反応によって検出する。標的増幅の検出の
ための蛍光色素および抗体の蛍光色素は、フローサイト
メトリーで別々に検出可能であり、実施者は、細胞中の
標的の存在を確認し且つ標的が見出される細胞の種類を
識別することを同時にすることができる。新規な試料調
製プロトコルは、増幅反応において蛍光標識されたシグ
ナルプライマーの包含によって更に短縮することができ
る。上記のように、シグナルプライマーは、増幅反応の
際に標的増幅特異的様式で伸長され且つ二本鎖にされ
て、増幅生成物を検出する追加の増幅後工程の必要性を
なくする。
【００４３】ＳＤＡのための増幅プライマーの設計は、
概して、目的の標的部分に対して向けられた多数のプラ
イマーの合成に続いて、ＳＤＡ反応においてプライマー
の対の組合わせを試験してそれぞれの対の増幅効率を測
定することを必要とする。これは、ＳＤＡプライマー性
能に影響を与えるパラメーターが十分に理解されていな
いことによる。本発明者は、ＳＤＡのための増幅プライ
マーの標的結合部分の重要でないと思われる変化が、増
幅効率に対して有意の且つ予想外の効果を有することが
あるということ、およびその標的結合部分の融点は、プ
ライミング効率に必ずしも関係していないということを
発見した。in situ ｔＳＤＡの開発において、ＨＩＶの
ｇａｇ遺伝子に特異的な増幅プライマーの第一対を設計
した。ＳＤＡ制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含ま
ないｇａｇ遺伝子の標的部分を選択した。標的部分はま
た、それぞれが約１００ｂｐ離れ且つ比較的不変である
約５０ｂｐの二つの部分を有することを基準として選択
された。次に、プライマー設計ソフトウェアを用いて、
それぞれのプライマー候補の標的結合の融点を決定し且
つプライマーダイマーの形成の可能性を判断した。プラ
イマーは、これらの予備的結果にしたがって修飾される
かまたは放棄された。８種類の候補「左側」増幅プライ
マー（第一鎖上の標的の３′末端に対して向けられた）
および９種類の候補「右側」増幅プライマー（第二鎖上
の標的の３′末端に対して向けられた）の最終リストを
実験用にコンパイルした。バンパープライマーおよび検
出用プローブは、融点および増幅プライマーに関して適
当な配置だけを考慮して設計された。
概して、目的の標的部分に対して向けられた多数のプラ
イマーの合成に続いて、ＳＤＡ反応においてプライマー
の対の組合わせを試験してそれぞれの対の増幅効率を測
定することを必要とする。これは、ＳＤＡプライマー性
能に影響を与えるパラメーターが十分に理解されていな
いことによる。本発明者は、ＳＤＡのための増幅プライ
マーの標的結合部分の重要でないと思われる変化が、増
幅効率に対して有意の且つ予想外の効果を有することが
あるということ、およびその標的結合部分の融点は、プ
ライミング効率に必ずしも関係していないということを
発見した。in situ ｔＳＤＡの開発において、ＨＩＶの
ｇａｇ遺伝子に特異的な増幅プライマーの第一対を設計
した。ＳＤＡ制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含ま
ないｇａｇ遺伝子の標的部分を選択した。標的部分はま
た、それぞれが約１００ｂｐ離れ且つ比較的不変である
約５０ｂｐの二つの部分を有することを基準として選択
された。次に、プライマー設計ソフトウェアを用いて、
それぞれのプライマー候補の標的結合の融点を決定し且
つプライマーダイマーの形成の可能性を判断した。プラ
イマーは、これらの予備的結果にしたがって修飾される
かまたは放棄された。８種類の候補「左側」増幅プライ
マー（第一鎖上の標的の３′末端に対して向けられた）
および９種類の候補「右側」増幅プライマー（第二鎖上
の標的の３′末端に対して向けられた）の最終リストを
実験用にコンパイルした。バンパープライマーおよび検
出用プローブは、融点および増幅プライマーに関して適
当な配置だけを考慮して設計された。
【００４４】「左側」および「右側」プライマーの対の
組合わせの増幅効率は、in vitroｔＳＤＡにおいてｇａ
ｇ標的、ＢｃａポリメラーゼおよびＢｓｏＢＩのプラス
ミドクローンを用いて実験的に決定された。アンプリコ
ンは、32Ｐ標識検出用プローブのハイブリダイゼーショ
ンおよび伸長に続くゲル電気泳動によって検出され且つ
定量された。in vitro で最もよい増幅効率の増幅プラ
イマー対は、in situｔＳＤＡで更に開発するために選
択された。上記のように最適化された緩衝液システムに
おいて、このプライマーセットは、in vitro ｔＳＤＡ
においてｇａｇ標的配列を１０コピー未満検出した（Ｂ
ｓｏＢＩ部位をイタリック体で示し、標的結合配列に下
線を施している）。
組合わせの増幅効率は、in vitroｔＳＤＡにおいてｇａ
ｇ標的、ＢｃａポリメラーゼおよびＢｓｏＢＩのプラス
ミドクローンを用いて実験的に決定された。アンプリコ
ンは、32Ｐ標識検出用プローブのハイブリダイゼーショ
ンおよび伸長に続くゲル電気泳動によって検出され且つ
定量された。in vitro で最もよい増幅効率の増幅プラ
イマー対は、in situｔＳＤＡで更に開発するために選
択された。上記のように最適化された緩衝液システムに
おいて、このプライマーセットは、in vitro ｔＳＤＡ
においてｇａｇ標的配列を１０コピー未満検出した（Ｂ
ｓｏＢＩ部位をイタリック体で示し、標的結合配列に下
線を施している）。
【００４５】
【化１】
【００４６】ＨＬＡ−ＤＱα遺伝子のエクソン３に特異
的な１対の増幅プライマーを、in vitro での候補増幅
プライマー対の評価のために、ヒト胎盤ＤＮＡを用いて
同様に設計した。ＨＬＡ遺伝子は全ての細胞中に存在す
るので、この標的は、in situ ｔＳＤＡの正対照として
用いられるはずであった。アンプリコンの漏出は重要な
問題ではないことが判ったので、僅かながらより小さい
標的部分を候補プライマーの初期識別用に選択した（約
７５〜１００ｂｐ）。３種類の「左側」増幅プライマー
および３種類の候補「右側」増幅プライマーを最初に設
計し、そして対の組み合わせで実験的に試験した。上記
のように最適化された緩衝液システムにおいて、以下の
プライマーセットが最もよい増幅結果を与え、in vitro
ｔＳＤＡにおいてＨＬＡ−ＤＱαエクソン３標的配列
が５コピー未満検出された。
的な１対の増幅プライマーを、in vitro での候補増幅
プライマー対の評価のために、ヒト胎盤ＤＮＡを用いて
同様に設計した。ＨＬＡ遺伝子は全ての細胞中に存在す
るので、この標的は、in situ ｔＳＤＡの正対照として
用いられるはずであった。アンプリコンの漏出は重要な
問題ではないことが判ったので、僅かながらより小さい
標的部分を候補プライマーの初期識別用に選択した（約
７５〜１００ｂｐ）。３種類の「左側」増幅プライマー
および３種類の候補「右側」増幅プライマーを最初に設
計し、そして対の組み合わせで実験的に試験した。上記
のように最適化された緩衝液システムにおいて、以下の
プライマーセットが最もよい増幅結果を与え、in vitro
ｔＳＤＡにおいてＨＬＡ−ＤＱαエクソン３標的配列
が５コピー未満検出された。
【００４７】
【化２】
【００４８】標的結合配列は、増幅プライマーに対して
標的特異性を与える。本発明の増幅プライマーの標的結
合配列は、したがって、ＳＤＡ以外の核酸増幅プロトコ
ル、例えば、ＰＣＲおよび３ＳＲにおいても有用であ
る。具体的に、標的配列に対するプライマーの周期的特
異的ハイブリダイゼーション、標的配列を鋳型として用
いるプライマーの伸長および標的配列からの伸長生成物
の置換を用いるいずれの増幅プロトコルも、本発明の増
幅プライマーの標的結合配列を用いることができる。添
付の配列表で示された増幅プライマーの制限エンドヌク
レアーゼ認識部位などの特殊な非標的結合配列を全く必
要としない増幅法（例えば、ＰＣＲ）に対して、増幅プ
ライマーは、標的結合配列だけから成ることができる。
配列表で示されたものとは異なった特殊な非標的結合配
列を必要とする増幅法（例えば、３ＳＲ）は、挙げられ
た増幅プライマーの標的結合配列および当該技術分野に
おいて知られているような選択された増幅法によって必
要とされる配列または構造を含む増幅プライマーを用い
ることができる。更に、ｔＳＤＡに適当な別の制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位もまた、当該技術分野において
知られている方法を用いて、配列表で示された制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位の代わりに置き換えることがで
きる。
標的特異性を与える。本発明の増幅プライマーの標的結
合配列は、したがって、ＳＤＡ以外の核酸増幅プロトコ
ル、例えば、ＰＣＲおよび３ＳＲにおいても有用であ
る。具体的に、標的配列に対するプライマーの周期的特
異的ハイブリダイゼーション、標的配列を鋳型として用
いるプライマーの伸長および標的配列からの伸長生成物
の置換を用いるいずれの増幅プロトコルも、本発明の増
幅プライマーの標的結合配列を用いることができる。添
付の配列表で示された増幅プライマーの制限エンドヌク
レアーゼ認識部位などの特殊な非標的結合配列を全く必
要としない増幅法（例えば、ＰＣＲ）に対して、増幅プ
ライマーは、標的結合配列だけから成ることができる。
配列表で示されたものとは異なった特殊な非標的結合配
列を必要とする増幅法（例えば、３ＳＲ）は、挙げられ
た増幅プライマーの標的結合配列および当該技術分野に
おいて知られているような選択された増幅法によって必
要とされる配列または構造を含む増幅プライマーを用い
ることができる。更に、ｔＳＤＡに適当な別の制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位もまた、当該技術分野において
知られている方法を用いて、配列表で示された制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位の代わりに置き換えることがで
きる。
【００４９】以下の実験実施例を、本発明のいくつかの
実施態様を例証するために与えるが、請求の範囲によっ
て定義される発明を制限すると解釈されるべきではな
い。
実施態様を例証するために与えるが、請求の範囲によっ
て定義される発明を制限すると解釈されるべきではな
い。
【００５０】
【実施例】実施例１ ＨＬＡ−ＤＱαエクソン３標的を、ヒト急性骨髄性白血
病（ＡＭＬ）細胞（ＫＧ−１ａ）において上記の選択さ
れたプライマーセットを用いて in situ で増幅させ且
つ検出した。最初に、細胞を４％パラホルムアルデヒド
中で３０分間固定し、そして１Ｘリン酸緩衝溶液（ＰＢ
Ｓ）中で３回洗浄した。次に、それらを０．０１％サポ
ニンによって２０分間透過性にし、そして１Ｘ ＰＢＳ
によって３回洗浄した。固定され透過性にされた細胞
（３５ｍＭ Ｋｐi ｐＨ７．６中に細胞１０8個／ｍ
ｌ）５マイクロリットルを、３５ｍＭ Ｋｐi，ｐＨ
７．６、３ｍＭ ＭｇＣｌ2，それぞれ５０μＭのｄＧ
ＴＰ、ＴＴＰおよびｄＡＴＰ、１．４ｍＭ ｄＣＴＰα
Ｓ、５００ｎＭ増幅プライマー、５０ｎＭバンパープラ
イマー並びに１５％グリセロールの４０μＬに対して加
えた。静かに混合した後、試料を９５℃で２分間インキ
ュベートし、そして反応温度（５２℃）で維持された T
HERMAL-LOKTM 温度ブロックに移した。次に、酵素混合
物５マイクロリットルを加え（１０ＮＥＢ２ ０．５μ
Ｌ、２２単位／ｍｌ Ｂｃａ ０．３６μＬ、１６０単
位／ｍｌ ＢｓｏＢＩ １．０μＬおよび水３．１４μ
Ｌ）且つ混合して増幅反応を開始した。最終反応容量は
５０μＬであった。３０分後、反応を氷上に置くことに
よって停止させ、そして増幅生成物を検出した。
病（ＡＭＬ）細胞（ＫＧ−１ａ）において上記の選択さ
れたプライマーセットを用いて in situ で増幅させ且
つ検出した。最初に、細胞を４％パラホルムアルデヒド
中で３０分間固定し、そして１Ｘリン酸緩衝溶液（ＰＢ
Ｓ）中で３回洗浄した。次に、それらを０．０１％サポ
ニンによって２０分間透過性にし、そして１Ｘ ＰＢＳ
によって３回洗浄した。固定され透過性にされた細胞
（３５ｍＭ Ｋｐi ｐＨ７．６中に細胞１０8個／ｍ
ｌ）５マイクロリットルを、３５ｍＭ Ｋｐi，ｐＨ
７．６、３ｍＭ ＭｇＣｌ2，それぞれ５０μＭのｄＧ
ＴＰ、ＴＴＰおよびｄＡＴＰ、１．４ｍＭ ｄＣＴＰα
Ｓ、５００ｎＭ増幅プライマー、５０ｎＭバンパープラ
イマー並びに１５％グリセロールの４０μＬに対して加
えた。静かに混合した後、試料を９５℃で２分間インキ
ュベートし、そして反応温度（５２℃）で維持された T
HERMAL-LOKTM 温度ブロックに移した。次に、酵素混合
物５マイクロリットルを加え（１０ＮＥＢ２ ０．５μ
Ｌ、２２単位／ｍｌ Ｂｃａ ０．３６μＬ、１６０単
位／ｍｌ ＢｓｏＢＩ １．０μＬおよび水３．１４μ
Ｌ）且つ混合して増幅反応を開始した。最終反応容量は
５０μＬであった。３０分後、反応を氷上に置くことに
よって停止させ、そして増幅生成物を検出した。
【００５１】放射性標識された検出用プローブ（２Ｘ１
０6ｃｐｍ）を増幅反応に対して加え、そして増幅生成
物に対して９５℃で３０分に続いて３７℃で６０分間 i
n situ でハイブリッド形成させた。１Ｘ ＳＳＣ ２
００μＬ中で２５分間２回洗浄した後、細胞をシンチレ
ーション液中で計数した。１回のこのような実験の結果
は以下の通りであった。
０6ｃｐｍ）を増幅反応に対して加え、そして増幅生成
物に対して９５℃で３０分に続いて３７℃で６０分間 i
n situ でハイブリッド形成させた。１Ｘ ＳＳＣ ２
００μＬ中で２５分間２回洗浄した後、細胞をシンチレ
ーション液中で計数した。１回のこのような実験の結果
は以下の通りであった。
【００５２】
【表１】
【００５３】試験管１において、増幅されたＫＧ１ａ細
胞は、ＨＬＡ−ＤＱαエクソン３特異的検出用プローブ
によって探査された。試験管２は、制限エンドヌクレア
ーゼが増幅反応から省かれた負の対照であり、ｔＳＤＡ
を妨げた。試験管３および４は試験管１および２に対応
したが、標的配列とは無関係のｇａｇ特異的検出用プロ
ーブによって探査された。必要な酵素全部の存在下で増
幅され且つＨＬＡ−ＤＱαエクソン３特異的プローブに
よって検出された試料は全て、in situ で目的の標的の
特異的増幅を示した。
胞は、ＨＬＡ−ＤＱαエクソン３特異的検出用プローブ
によって探査された。試験管２は、制限エンドヌクレア
ーゼが増幅反応から省かれた負の対照であり、ｔＳＤＡ
を妨げた。試験管３および４は試験管１および２に対応
したが、標的配列とは無関係のｇａｇ特異的検出用プロ
ーブによって探査された。必要な酵素全部の存在下で増
幅され且つＨＬＡ−ＤＱαエクソン３特異的プローブに
よって検出された試料は全て、in situ で目的の標的の
特異的増幅を示した。
【００５４】増幅されていない細胞と in situ で生じ
たアンプリコンとのインキュベーションを含むように実
験を繰返した。これは、アンプリコンの負の細胞への転
移を、細胞表面に対するアンプリコンの付着によってか
または負の細胞によるアンプリコンの取込みによって評
価することであった。in situ 増幅後、反応を遠心分離
して細胞を沈降させた。上澄みを７０℃で１５分間イン
キュベートしてＢｓｏＢＩ活性を除去し、そして予め９
５℃まで２分間加熱された固定され透過性にされたＫＧ
１ａ細胞に対して加えた。混合物を５２℃で３０分間イ
ンキュベートした後、細胞を上記のように、特異的およ
び非特異的（無関係の）検出用プローブ両方を用いてハ
イブリッド形成させ、洗浄し、そして計数した。結果を
以下に示す。
たアンプリコンとのインキュベーションを含むように実
験を繰返した。これは、アンプリコンの負の細胞への転
移を、細胞表面に対するアンプリコンの付着によってか
または負の細胞によるアンプリコンの取込みによって評
価することであった。in situ 増幅後、反応を遠心分離
して細胞を沈降させた。上澄みを７０℃で１５分間イン
キュベートしてＢｓｏＢＩ活性を除去し、そして予め９
５℃まで２分間加熱された固定され透過性にされたＫＧ
１ａ細胞に対して加えた。混合物を５２℃で３０分間イ
ンキュベートした後、細胞を上記のように、特異的およ
び非特異的（無関係の）検出用プローブ両方を用いてハ
イブリッド形成させ、洗浄し、そして計数した。結果を
以下に示す。
【００５５】
【表２】
【００５６】制限エンドヌクレアーゼは、試験管１の負
の対照反応から省かれた。試験管２および３は、特異的
検出によって完全な増幅反応を示した。試験管３は、試
験管２の場合と同様であるが３倍のポリメラーゼ濃度増
加を伴う条件下での in situｔＳＤＡから得られたシグ
ナルを示す。試験管４では、in situ で生じたｔＳＤＡ
アンプリコンを、増幅されていない細胞と一緒にインキ
ュベートした後、それを、増幅された試料の場合と同様
にハイブリッド形成させ、洗浄し、そして検出した。試
験管４には、試験管２の正シグナルがどれほど、増幅さ
れていない細胞に対するアンプリコンの非特異的付着に
よるかを確認することが含まれた。試験管５〜８は、無
関係のｇａｇ検出用プローブを負の対照としてハイブリ
ッド形成させたこと以外は試験管１〜４の反応条件に対
応する。前の実験の場合と同様に、標的の特異的 in si
tu 増幅は、明らかに、必要な酵素を全て含むそれらの
試料中で起こり且つ特異的ＨＬＡ−ＤＱαエクソン３プ
ローブによって検出された。上澄み中で見られることが
あるアンプリコンが増幅されていない細胞によって取込
まれる機序によって生じた偽陽性シグナル発生はある程
度生じることがあるが、試験管２および３での実質的に
より高いシグナルは、明らかに、in situＳＤＡが起こ
っていることを示す。大部分のシグナルは標的特異的で
あるが、アンプリコン転移のためではない。
の対照反応から省かれた。試験管２および３は、特異的
検出によって完全な増幅反応を示した。試験管３は、試
験管２の場合と同様であるが３倍のポリメラーゼ濃度増
加を伴う条件下での in situｔＳＤＡから得られたシグ
ナルを示す。試験管４では、in situ で生じたｔＳＤＡ
アンプリコンを、増幅されていない細胞と一緒にインキ
ュベートした後、それを、増幅された試料の場合と同様
にハイブリッド形成させ、洗浄し、そして検出した。試
験管４には、試験管２の正シグナルがどれほど、増幅さ
れていない細胞に対するアンプリコンの非特異的付着に
よるかを確認することが含まれた。試験管５〜８は、無
関係のｇａｇ検出用プローブを負の対照としてハイブリ
ッド形成させたこと以外は試験管１〜４の反応条件に対
応する。前の実験の場合と同様に、標的の特異的 in si
tu 増幅は、明らかに、必要な酵素を全て含むそれらの
試料中で起こり且つ特異的ＨＬＡ−ＤＱαエクソン３プ
ローブによって検出された。上澄み中で見られることが
あるアンプリコンが増幅されていない細胞によって取込
まれる機序によって生じた偽陽性シグナル発生はある程
度生じることがあるが、試験管２および３での実質的に
より高いシグナルは、明らかに、in situＳＤＡが起こ
っていることを示す。大部分のシグナルは標的特異的で
あるが、アンプリコン転移のためではない。
【００５７】別の検出システムにおいて、フルオレセイ
ンによって標識されたシグナルプライマーを用いて実験
を繰返した。シグナルプライマーを増幅反応に対して１
００ｎＭの濃度で加えた。それによって、蛍光プローブ
はポリメラーゼによって伸長し、そして上流の増幅プラ
イマーの伸長によって標的から置換された。氷上で増幅
反応を停止した後、試料をリン酸緩衝溶液１５０〜２０
０μＬによってそれぞれ５分間の洗浄によって洗浄し
た。より小さい伸長されていないシグナルプライマーが
細胞から洗浄除去されたが、より長い標的増幅特異的蛍
光シグナルプライマーは、増幅が起こった細胞によって
保持された。これらの実験において、洗浄された細胞は
蛍光顕微鏡法によって可視化され、その場合、強い蛍光
シグナルは正の細胞で見られ、そして負の細胞は非蛍光
であった。しかしながら、シグナルプライマー伸長は、
フローサイトメトリーによる蛍光細胞の検出および／ま
たは計数にも適合する。
ンによって標識されたシグナルプライマーを用いて実験
を繰返した。シグナルプライマーを増幅反応に対して１
００ｎＭの濃度で加えた。それによって、蛍光プローブ
はポリメラーゼによって伸長し、そして上流の増幅プラ
イマーの伸長によって標的から置換された。氷上で増幅
反応を停止した後、試料をリン酸緩衝溶液１５０〜２０
０μＬによってそれぞれ５分間の洗浄によって洗浄し
た。より小さい伸長されていないシグナルプライマーが
細胞から洗浄除去されたが、より長い標的増幅特異的蛍
光シグナルプライマーは、増幅が起こった細胞によって
保持された。これらの実験において、洗浄された細胞は
蛍光顕微鏡法によって可視化され、その場合、強い蛍光
シグナルは正の細胞で見られ、そして負の細胞は非蛍光
であった。しかしながら、シグナルプライマー伸長は、
フローサイトメトリーによる蛍光細胞の検出および／ま
たは計数にも適合する。
【００５８】同様の実験系列の第三において、増幅生成
物を比色検定で検出した。細胞を４％パラホルムアルデ
ヒド中で２０分間固定し、１Ｘ ＰＢＳ中で３回洗浄
し、そして０．０１％サポニン中で１０分間透過性にし
た。ＳＤＡ緩衝液（３５ｍＭＫＰＯ4 ｐＨ７．５、１
５％グリセロール、４ｍＭ ＭｇＯＡｃ）中で洗浄した
後、細胞懸濁液（細胞５Ｘ１０5個）５μＬを、上記の
ようなプライマーおよびｄＮＴＰを含むＳＤＡ緩衝液４
０μＬに対して加えた。前記のようなＨＬＡ−ＤＱαエ
クソン３プライマーセットを用い、標的変性後に酵素混
合物５μＬを加えて標的を増幅させ、最終反応容量を５
０μＬにした。ヒトＨＬＡとマウスＭＨＣとの間の相同
性にもかかわらず、マウスＭＨＣ標的はこの増幅システ
ムで増幅されないので、マウス細胞は負の細胞系として
役立った。遺伝子配列データベースの分析は、ここで用
いられたプライマーの結合部分におけるマウスとヒトと
の間の相同性が不十分であることを示し、そして精製マ
ウスＤＮＡをＰＣＲでこれらのプライマーを用いて増幅
できないことによって負であることが確証された。９４
℃で２分間の変性後、ジゴキシゲニンで標識された検出
用プローブ（１〜１０ｎＭ）を３３℃で２時間ハイブリ
ッド形成させた。ハイブリダイゼーションに続いて、１
Ｘ ＳＳＣ中において室温で３回のハイブリダイゼーシ
ョン後洗浄および１００ｍＭトリス ｐＨ７．５／１５
０ｍＭ ＮａＣｌへの緩衝液交換を行った。次に、アル
カリ性ホスファターゼ（ＡＰ）に結合した抗ジゴキシゲ
ニン抗体（Ｆｃフラグメント）を、細胞と一緒に室温で
２〜４時間インキュベートした。負の細胞から非結合抗
体を除去するトリス／ＮａＣｌ洗浄およびアルカリ性ホ
スファターゼ緩衝液（１００ｍＭトリス ｐＨ９．５／
１００ｍＭ ＮａＣｌ／５０ｍＭ ＭｇＣｌ2）への交
換の後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰを用いて、増幅が起こったそ
れらの細胞中で発色させた。細胞をスライド上に塗布し
（cytospun）、そして顕微鏡法によって可視化した。ヒ
ト細胞は、ＨＬＡ−ＤＱαエクソン３検出用プローブを
増幅した細胞中でハイブリッド形成させた場合に強い比
色シグナルを生じた。増幅されていない細胞中でのＨＬ
Ａ−ＤＱαエクソン３検出用プローブに対するハイブリ
ダイゼーションは、負の、または極めて弱いがまだ明ら
かに負の比色応答を生じた。他の負の対照には、増幅の
不存在（すなわち、ＳＤＡ酵素無添加）、検出用プロー
ブの不存在、および非特異的検出用プローブ（すなわ
ち、増幅された細胞中のｇａｇまたはニワトリβ−アク
チン検出用プローブ）が含まれ、それらはいずれも検定
において負であった。マウス細胞単独では、ＨＬＡ−Ｄ
Ｑαエクソン３もｇａｇプローブもほとんど色を生じな
かったが、ヒトおよびマウス細胞を増幅反応の際に混合
した場合、マウス細胞中の比色シグナルが増加した。し
かしながら、結果は、これが比色検出システム自体の人
工物であること、および負の細胞は非特異的に色素を吸
収していることを示唆する。
物を比色検定で検出した。細胞を４％パラホルムアルデ
ヒド中で２０分間固定し、１Ｘ ＰＢＳ中で３回洗浄
し、そして０．０１％サポニン中で１０分間透過性にし
た。ＳＤＡ緩衝液（３５ｍＭＫＰＯ4 ｐＨ７．５、１
５％グリセロール、４ｍＭ ＭｇＯＡｃ）中で洗浄した
後、細胞懸濁液（細胞５Ｘ１０5個）５μＬを、上記の
ようなプライマーおよびｄＮＴＰを含むＳＤＡ緩衝液４
０μＬに対して加えた。前記のようなＨＬＡ−ＤＱαエ
クソン３プライマーセットを用い、標的変性後に酵素混
合物５μＬを加えて標的を増幅させ、最終反応容量を５
０μＬにした。ヒトＨＬＡとマウスＭＨＣとの間の相同
性にもかかわらず、マウスＭＨＣ標的はこの増幅システ
ムで増幅されないので、マウス細胞は負の細胞系として
役立った。遺伝子配列データベースの分析は、ここで用
いられたプライマーの結合部分におけるマウスとヒトと
の間の相同性が不十分であることを示し、そして精製マ
ウスＤＮＡをＰＣＲでこれらのプライマーを用いて増幅
できないことによって負であることが確証された。９４
℃で２分間の変性後、ジゴキシゲニンで標識された検出
用プローブ（１〜１０ｎＭ）を３３℃で２時間ハイブリ
ッド形成させた。ハイブリダイゼーションに続いて、１
Ｘ ＳＳＣ中において室温で３回のハイブリダイゼーシ
ョン後洗浄および１００ｍＭトリス ｐＨ７．５／１５
０ｍＭ ＮａＣｌへの緩衝液交換を行った。次に、アル
カリ性ホスファターゼ（ＡＰ）に結合した抗ジゴキシゲ
ニン抗体（Ｆｃフラグメント）を、細胞と一緒に室温で
２〜４時間インキュベートした。負の細胞から非結合抗
体を除去するトリス／ＮａＣｌ洗浄およびアルカリ性ホ
スファターゼ緩衝液（１００ｍＭトリス ｐＨ９．５／
１００ｍＭ ＮａＣｌ／５０ｍＭ ＭｇＣｌ2）への交
換の後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰを用いて、増幅が起こったそ
れらの細胞中で発色させた。細胞をスライド上に塗布し
（cytospun）、そして顕微鏡法によって可視化した。ヒ
ト細胞は、ＨＬＡ−ＤＱαエクソン３検出用プローブを
増幅した細胞中でハイブリッド形成させた場合に強い比
色シグナルを生じた。増幅されていない細胞中でのＨＬ
Ａ−ＤＱαエクソン３検出用プローブに対するハイブリ
ダイゼーションは、負の、または極めて弱いがまだ明ら
かに負の比色応答を生じた。他の負の対照には、増幅の
不存在（すなわち、ＳＤＡ酵素無添加）、検出用プロー
ブの不存在、および非特異的検出用プローブ（すなわ
ち、増幅された細胞中のｇａｇまたはニワトリβ−アク
チン検出用プローブ）が含まれ、それらはいずれも検定
において負であった。マウス細胞単独では、ＨＬＡ−Ｄ
Ｑαエクソン３もｇａｇプローブもほとんど色を生じな
かったが、ヒトおよびマウス細胞を増幅反応の際に混合
した場合、マウス細胞中の比色シグナルが増加した。し
かしながら、結果は、これが比色検出システム自体の人
工物であること、および負の細胞は非特異的に色素を吸
収していることを示唆する。
【００５９】実施例２ 静脈血を、EDTA VACUTAINERTM 採血管（ベクトン・ディ
キンソン・バクテイナー・システムズ（Becton Dickins
on Vacutainer Systems））に集めた。ＤＮＰ結合抗Ｃ
Ｄ４（Ｌ１２０）およびビオチニル化抗ＣＤ３（Ｌｅｕ
４）抗体を、全血５０μＬに対して加え、そして室温で
２０分間染色した。赤血球を溶解させるために、１Ｘ
FACSTM 溶解液（ベクトン・ディキンソン・イムノサイ
トメトリー・システムズ）１．０ｍＬを各管に対して１
０分間加えた。細胞を４％パラホルムアルデヒド中にお
いて室温で２０分間固定し、そして１Ｘ FACSTM 溶解
液および０．０２５％トゥイーン２０の０．５ｍＬを加
えることによって透過性にした。細胞を３５ｍＭ ＫＰ
Ｏ4によって２回洗浄し、３５ｍＭ ＫＰＯ4緩衝液５μ
Ｌ中に際懸濁させ、そして０．５ｍＬミクロ遠心分離管
に移した。
キンソン・バクテイナー・システムズ（Becton Dickins
on Vacutainer Systems））に集めた。ＤＮＰ結合抗Ｃ
Ｄ４（Ｌ１２０）およびビオチニル化抗ＣＤ３（Ｌｅｕ
４）抗体を、全血５０μＬに対して加え、そして室温で
２０分間染色した。赤血球を溶解させるために、１Ｘ
FACSTM 溶解液（ベクトン・ディキンソン・イムノサイ
トメトリー・システムズ）１．０ｍＬを各管に対して１
０分間加えた。細胞を４％パラホルムアルデヒド中にお
いて室温で２０分間固定し、そして１Ｘ FACSTM 溶解
液および０．０２５％トゥイーン２０の０．５ｍＬを加
えることによって透過性にした。細胞を３５ｍＭ ＫＰ
Ｏ4によって２回洗浄し、３５ｍＭ ＫＰＯ4緩衝液５μ
Ｌ中に際懸濁させ、そして０．５ｍＬミクロ遠心分離管
に移した。
【００６０】in situ ｔＳＤＡに対して、３５ｍＭ Ｋ
ＰＯ4、１．４ｍＭ ｄＣＴＰαＳ、それぞれ２００μ
ＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、４ｍＭ 酢酸
Ｍｇ、１５％グリセロール、０．０５μＭの各バンパー
プライマー並びに０．０５μＭの各増幅プライマーの４
０μＬを、調製された血液試料に対して加えた。試料
を、９５℃で３分間に続いて５２℃〜５５℃で３分間加
熱してプライマーをアニーリングした。プライマーアニ
ーリング後、酵素配合物（１０Ｘ ＮＥＢ２緩衝液０．
５μＬ、ＢｓｏＢＩ １６０単位、Ｂｃａポリメラーゼ
８単位）５μＬを加えて増幅反応を開始した。試験管を
５５℃で３０分間インキュベートした。増幅生成物は、
フルオレセインで標識された検出用プローブに対するハ
イブリダイゼーションによって in situ で検出され
た。ハイブリダイゼーションは、特異的または無関係の
検出用プローブ１００〜１５０ｎｇを含有するＳＤＡ反
応緩衝液２５μＬ中において９５℃で５分間に続いて３
３℃〜３７℃で６０分間行われた。
ＰＯ4、１．４ｍＭ ｄＣＴＰαＳ、それぞれ２００μ
ＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、４ｍＭ 酢酸
Ｍｇ、１５％グリセロール、０．０５μＭの各バンパー
プライマー並びに０．０５μＭの各増幅プライマーの４
０μＬを、調製された血液試料に対して加えた。試料
を、９５℃で３分間に続いて５２℃〜５５℃で３分間加
熱してプライマーをアニーリングした。プライマーアニ
ーリング後、酵素配合物（１０Ｘ ＮＥＢ２緩衝液０．
５μＬ、ＢｓｏＢＩ １６０単位、Ｂｃａポリメラーゼ
８単位）５μＬを加えて増幅反応を開始した。試験管を
５５℃で３０分間インキュベートした。増幅生成物は、
フルオレセインで標識された検出用プローブに対するハ
イブリダイゼーションによって in situ で検出され
た。ハイブリダイゼーションは、特異的または無関係の
検出用プローブ１００〜１５０ｎｇを含有するＳＤＡ反
応緩衝液２５μＬ中において９５℃で５分間に続いて３
３℃〜３７℃で６０分間行われた。
【００６１】或いは、増幅生成物は、増幅の際のフルオ
レセイン標識シグナルプライマーの包含によって検出さ
れた。この場合、増幅反応緩衝液には、特異的または無
関係の５′フルオレセイン標識シグナルプライマー１０
０ｎＭが更に含まれた。初期加熱工程、酵素混合物の添
加および増幅は、上記のように行われた。
レセイン標識シグナルプライマーの包含によって検出さ
れた。この場合、増幅反応緩衝液には、特異的または無
関係の５′フルオレセイン標識シグナルプライマー１０
０ｎＭが更に含まれた。初期加熱工程、酵素混合物の添
加および増幅は、上記のように行われた。
【００６２】検出用プローブの in situ ハイブリダイ
ゼーション後、またはシグナルプライマーの存在下のｔ
ＳＤＡの完了後に、細胞を１Ｘ ＳＳＣによって室温で
３０分間洗浄した。細胞表面マーカーの抗体染色は、抗
ＤＮＰ−フィコエリトリン（ＰＥ）およびＣｙ５／ＰＥ
標識ストレプトアビジンによって展開された。細胞を１
Ｘ ＰＢＳによって１回洗浄し、そしてフローサイトメ
トリー分析のために１Ｘ ＰＢＳ中に再懸濁させた。側
方散乱対前方散乱（ＳＳＣ対ＦＳＣ）のドットプロット
上で、白血球は実験処理によって影響されないことが示
された。すなわち、ＣＤ４／ＣＤ３免疫表現型の、（上
記のプライマーセットを用いて）ＨＬＡ−ＤＱαエクソ
ン３標的の in situ ｔＳＤＡを施された細胞は、リン
パ球、顆粒球および単球の典型的な集団を示した。リン
パ球集団はまた、ＣＤ４対ＣＤ３の蛍光ドットプロット
上で正常に見えた。これらの実験は、FACSTM 溶解液お
よび免疫表現型決定が両方とも in situ ｔＳＤＡに適
合することを実証した。
ゼーション後、またはシグナルプライマーの存在下のｔ
ＳＤＡの完了後に、細胞を１Ｘ ＳＳＣによって室温で
３０分間洗浄した。細胞表面マーカーの抗体染色は、抗
ＤＮＰ−フィコエリトリン（ＰＥ）およびＣｙ５／ＰＥ
標識ストレプトアビジンによって展開された。細胞を１
Ｘ ＰＢＳによって１回洗浄し、そしてフローサイトメ
トリー分析のために１Ｘ ＰＢＳ中に再懸濁させた。側
方散乱対前方散乱（ＳＳＣ対ＦＳＣ）のドットプロット
上で、白血球は実験処理によって影響されないことが示
された。すなわち、ＣＤ４／ＣＤ３免疫表現型の、（上
記のプライマーセットを用いて）ＨＬＡ−ＤＱαエクソ
ン３標的の in situ ｔＳＤＡを施された細胞は、リン
パ球、顆粒球および単球の典型的な集団を示した。リン
パ球集団はまた、ＣＤ４対ＣＤ３の蛍光ドットプロット
上で正常に見えた。これらの実験は、FACSTM 溶解液お
よび免疫表現型決定が両方とも in situ ｔＳＤＡに適
合することを実証した。
【００６３】in situ ｔＳＤＡによるＨＩＶの検出のた
めに、ＨＩＶゲノムを含有する細胞系（Ｈ９＋）を正常
な全血と混合し且つ上記のように処理し、そして上記の
選択されたプライマーを用いてｇａｇ標的配列を増幅さ
せた。更に、検出用プローブまたはシグナルプライマー
として用いることができる更に別のオリゴヌクレオチド
を、配列番号：５に代わるものとして用いるために設計
した。
めに、ＨＩＶゲノムを含有する細胞系（Ｈ９＋）を正常
な全血と混合し且つ上記のように処理し、そして上記の
選択されたプライマーを用いてｇａｇ標的配列を増幅さ
せた。更に、検出用プローブまたはシグナルプライマー
として用いることができる更に別のオリゴヌクレオチド
を、配列番号：５に代わるものとして用いるために設計
した。
【００６４】
【化３】
【００６５】ＳＳＣ対ＦＳＣのドットプロット上で、Ｈ
９＋細胞は、白血球集団のいずれよりも高い前方散乱を
有するリンパ球、単球および顆粒球とは別の集団として
明らかに区別できた。ＨＬＡ−ＤＱαエクソン３および
ＨＩＶｇａｇ標的を、上記のプライマーセットを用いて
in situ ｔＳＤＡによって増幅させ、そしてシグナル
プライマーの検出用プローブハイブリダイゼーションま
たは包含によって検出した。ＦＬ１対細胞計数のヒスト
グラムプロットを図１で示す。ＨＬＡ−ＤＱαエクソン
３正対照は、酵素が加えられなかったまたは無関係のプ
ローブ若しくはシグナルプライマーが検出に用いられな
かった負の対照反応と比較したところ、ピーク蛍光の右
側への実質的な移動（約１００チャンネル）を示した。
ＨＩＶ増幅反応は、ＦＬ１対細胞計数のヒストグラムプ
ロット上で類似した蛍光ピーク移動を示した。これらの
実験は、増幅が in situ で起こったことを確証し、し
かも増幅されたＨＩＶ標的は溶解した全血中においてフ
ローサイトメトリーによって検出することができたこと
を実証した。検出用プローブおよびシグナルプライマー
検出法に関するピーク移動の大きさは類似していた。
９＋細胞は、白血球集団のいずれよりも高い前方散乱を
有するリンパ球、単球および顆粒球とは別の集団として
明らかに区別できた。ＨＬＡ−ＤＱαエクソン３および
ＨＩＶｇａｇ標的を、上記のプライマーセットを用いて
in situ ｔＳＤＡによって増幅させ、そしてシグナル
プライマーの検出用プローブハイブリダイゼーションま
たは包含によって検出した。ＦＬ１対細胞計数のヒスト
グラムプロットを図１で示す。ＨＬＡ−ＤＱαエクソン
３正対照は、酵素が加えられなかったまたは無関係のプ
ローブ若しくはシグナルプライマーが検出に用いられな
かった負の対照反応と比較したところ、ピーク蛍光の右
側への実質的な移動（約１００チャンネル）を示した。
ＨＩＶ増幅反応は、ＦＬ１対細胞計数のヒストグラムプ
ロット上で類似した蛍光ピーク移動を示した。これらの
実験は、増幅が in situ で起こったことを確証し、し
かも増幅されたＨＩＶ標的は溶解した全血中においてフ
ローサイトメトリーによって検出することができたこと
を実証した。検出用プローブおよびシグナルプライマー
検出法に関するピーク移動の大きさは類似していた。
【００６６】或いは、静脈血を EDTA VACUTAINERTM 採
血管に集め、そして FICOLL-PAQUETMによる遠心分離に
よってＰＢＭＣを単離した。集めた細胞を１Ｘ ＰＢＳ
によって洗浄し、そしてヒトＴ細胞強化カラム（Ｒ＆Ｄ
システムズ）を用いて単球およびＢ細胞を除去した。Ｔ
細胞の多い画分を、ＤＮＰ結合抗ＣＤ４およびビオチニ
ル化抗ＣＤ３抗体によって室温で２０分間染色した。Ｐ
ＢＳ中４％パラホルムアルデヒド中の２０分間の固定
後、細胞をＰＢＳによって洗浄し且つ計数した。細胞
を、サポニン１０μｇ／ｍＬによって透過性にし、そし
て３５ｍＭ ＫＰＯ 4によって２回洗浄した。細胞５Ｘ
１０5個をＫＰＯ4緩衝液５μＬ中に再懸濁させ、そして
０．５ｍＬミクロ遠心分離管に移した。in situ ｔＳＤ
Ａ、増幅生成物の検出および免疫表現型決定を、FACSTM
溶解液試料調製法に関して上記に記載のように行っ
た。実験結果は、二つの試料調製法に関してほぼ一致し
た。
血管に集め、そして FICOLL-PAQUETMによる遠心分離に
よってＰＢＭＣを単離した。集めた細胞を１Ｘ ＰＢＳ
によって洗浄し、そしてヒトＴ細胞強化カラム（Ｒ＆Ｄ
システムズ）を用いて単球およびＢ細胞を除去した。Ｔ
細胞の多い画分を、ＤＮＰ結合抗ＣＤ４およびビオチニ
ル化抗ＣＤ３抗体によって室温で２０分間染色した。Ｐ
ＢＳ中４％パラホルムアルデヒド中の２０分間の固定
後、細胞をＰＢＳによって洗浄し且つ計数した。細胞
を、サポニン１０μｇ／ｍＬによって透過性にし、そし
て３５ｍＭ ＫＰＯ 4によって２回洗浄した。細胞５Ｘ
１０5個をＫＰＯ4緩衝液５μＬ中に再懸濁させ、そして
０．５ｍＬミクロ遠心分離管に移した。in situ ｔＳＤ
Ａ、増幅生成物の検出および免疫表現型決定を、FACSTM
溶解液試料調製法に関して上記に記載のように行っ
た。実験結果は、二つの試料調製法に関してほぼ一致し
た。
【図１】図１は、in situ ｔＳＤＡによるＨＩＶ標的配
列およびＨＬＡ−ＤＱαエクソン３標的配列の増幅に関
するフローサイトメトリーの結果を示す。
列およびＨＬＡ−ＤＱαエクソン３標的配列の増幅に関
するフローサイトメトリーの結果を示す。
【配列表】 <110> ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー <120> 好熱性鎖置換増幅による細胞中の核酸の検出 <130> <160> 14 <210> 1 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 accgcatcga atgcatgtct cgggtggtaa aagtagtaga ag 42 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 cgattccgct ccagacttct cggggtgttt agcatggtgt t 41 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 aaatggtaca tcaggcc 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 gcagcttcct cattgat 17 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 ggtggctcct tctgataatg 20 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 accgcatcga atgcatgtct cgggtggtca acatcacatg gc 42 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 cgattccgct ccagacttct cgggtgagag gaagctggtc 40 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 gtcttgtgga caacatcttt cc 22 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 taactgatct tgaagaagga atgatc 26 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 aatgggcact cagtcacaga 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 agccacccca caagattt 18 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 gtaataccca tgttttcagc at 22 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 aaatcttgtg gggtggct 18 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 atgctgaaaa catgggtatt ac 22
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡ ＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥ ＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者 オストレロバ，ナタリー・ブイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94040, マウンテン・ビュー，デル・メディオ・ア ベニュー 141，ナンバー116 (72)発明者 バン・クリーブ，マーク アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27707，ダーラム，カリバー・パーク・ド ライブ 7301，ナンバー202 (72)発明者 リード，ロバート・アラン アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27713，ダーラム，リメリック・レイン 923
Claims (7)
- 【請求項１】二本鎖ＨＩＶｇａｇ標的配列を増幅する方
法であって、 （ａ）配列番号：１の標的結合配列を含む第一増幅プラ
イマーを該標的配列の第一鎖上の標的配列に対して３′
にハイブリッド形成させ、そして配列番号：２の標的結
合配列を含む第二増幅プライマーを該標的配列の第二鎖
上の標的配列に対して３′にハイブリッド形成させ； （ｂ）第一および第二増幅プライマーをポリメラーゼに
よって伸長させて、第一および第二増幅プライマー伸長
生成物を生成し； （ｃ）第一および第二増幅プライマー伸長生成物を標的
配列から置換し；そして （ｄ）標的配列が増幅されるように、ハイブリッド形
成、伸長および置換の工程を繰返す工程を含む上記方
法。 - 【請求項２】第一および第二増幅プライマーがそれぞ
れ、α−チオデオキシヌクレオシド三リン酸の包含によ
って制限エンドヌクレアーゼ認識部位が半修飾されてい
る場合にその制限エンドヌクレアーゼによってニックを
入れられる制限エンドヌクレアーゼの認識部位であっ
て、標的結合配列に対して５′である制限エンドヌクレ
アーゼ認識部位を含み、そして（ａ）外プライマーが、
第一および第二増幅プライマーの上流の標的配列に対し
てハイブリッド形成し；そして（ｂ）第一増幅プライマ
ー、第二増幅プライマーおよび外プライマーが、制限エ
ンドヌクレアーゼおよびα−チオデオキシヌクレオシド
三リン酸の存在下において伸長して、外プライマーの伸
長によって標的配列から置換される第一および第二増幅
プライマー伸長生成物を生成する請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】配列番号：１の標的結合配列または配列番
号：２の標的結合配列を含むオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】二本鎖ＨＬＡ−ＤＱαエクソン３標的配列
を増幅する方法であって、 （ａ）配列番号：６の標的結合配列を含む第一増幅プラ
イマーを該標的配列の第一鎖上の標的配列に対して３′
にハイブリッド形成させ、そして配列番号：７の標的結
合配列を含む第二増幅プライマーを該標的配列の第二鎖
上の標的配列に対して３′にハイブリッド形成させ； （ｂ）第一および第二増幅プライマーをポリメラーゼに
よって伸長させて、第一および第二増幅プライマー伸長
生成物を生成し； （ｃ）第一および第二増幅プライマー伸長生成物を標的
配列から置換し；そして （ｄ）標的配列が増幅されるように、ハイブリッド形
成、伸長および置換の工程を繰返す工程を含む上記方
法。 - 【請求項５】第一および第二増幅プライマーがそれぞ
れ、α−チオデオキシヌクレオシド三リン酸の包含によ
って制限エンドヌクレアーゼ認識部位が半修飾されてい
る場合にその制限エンドヌクレアーゼによってニックを
入れられる制限エンドヌクレアーゼの認識部位であっ
て、標的結合配列に対して５′である制限エンドヌクレ
アーゼ認識部位を含み、そして（ａ）外プライマーが、
第一および第二増幅プライマーの上流の標的配列に対し
てハイブリッド形成し；そして（ｂ）第一増幅プライマ
ー、第二増幅プライマーおよび外プライマーが、制限エ
ンドヌクレアーゼおよびα−チオデオキシヌクレオシド
三リン酸の存在下において伸長して、外プライマーの伸
長によって標的配列から置換される第一および第二増幅
プライマー伸長生成物を生成する請求項４に記載の方
法。 - 【請求項６】標的配列をポリメラーゼ連鎖反応で増幅さ
せる請求項４に記載の方法。 - 【請求項７】配列番号：６の標的結合配列または配列番
号：７の標的結合配列を含むオリゴヌクレオチド。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/531,747 US5631147A (en) | 1995-09-21 | 1995-09-21 | Detection of nucleic acids in cells by thermophilic strand displacement amplification |
| US08/531,749 US5733752A (en) | 1993-12-10 | 1995-09-21 | Detection of nucleic acids in cells by thermophilic strand displacement amplification |
| US08/531747 | 1995-09-21 | ||
| US08/531749 | 1995-09-21 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09512781A Division JP3092163B2 (ja) | 1995-09-21 | 1996-09-12 | 好熱性鎖置換増幅による細胞中の核酸の検出 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000300281A true JP2000300281A (ja) | 2000-10-31 |
Family
ID=27063626
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09512781A Expired - Fee Related JP3092163B2 (ja) | 1995-09-21 | 1996-09-12 | 好熱性鎖置換増幅による細胞中の核酸の検出 |
| JP2000101133A Pending JP2000300281A (ja) | 1995-09-21 | 2000-04-03 | 好熱性鎖置換増幅による細胞中の核酸の検出 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09512781A Expired - Fee Related JP3092163B2 (ja) | 1995-09-21 | 1996-09-12 | 好熱性鎖置換増幅による細胞中の核酸の検出 |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| JP2009060901A (ja) * | 2001-04-13 | 2009-03-26 | Becton Dickinson & Co | 肺炎マイコプラズマの増幅および検出 |
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|---|---|---|---|---|
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| US6187567B1 (en) * | 1999-09-01 | 2001-02-13 | Akzo Nobel N.V. | Methods and reagents for in situ amplification |
| JP2002159295A (ja) * | 2000-11-27 | 2002-06-04 | Keio Gijuku | Ｈｉｖ−１ｒｎａ−ｄｎａハイブリッドの定量法および診断キット |
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| CA2492007A1 (en) | 2001-07-15 | 2003-01-30 | Keck Graduate Institute | Amplification of nucleic acid fragments using nicking agents |
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| FR2878254B1 (fr) * | 2004-11-22 | 2010-08-20 | Bio Rad Pasteur | Composition pour l'amplification d'acides nucleiques |
| WO2011028887A2 (en) | 2009-09-03 | 2011-03-10 | Becton, Dickinson And Company | Methods and compositions for direct chemical lysis |
| CN112391450A (zh) * | 2020-11-19 | 2021-02-23 | 四川大学 | 一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| US5043272A (en) * | 1989-04-27 | 1991-08-27 | Life Technologies, Incorporated | Amplification of nucleic acid sequences using oligonucleotides of random sequence as primers |
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- 1996-09-12 WO PCT/US1996/014648 patent/WO1997011196A2/en not_active Application Discontinuation
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- 1996-09-12 CA CA 2204641 patent/CA2204641A1/en not_active Abandoned
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-
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- 2000-04-03 JP JP2000101133A patent/JP2000300281A/ja active Pending
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|---|---|---|---|---|
| JP2009060901A (ja) * | 2001-04-13 | 2009-03-26 | Becton Dickinson & Co | 肺炎マイコプラズマの増幅および検出 |
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| AU702896B2 (en) | 1999-03-11 |
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