JP2000298130A - ネコ又はイヌの血管炎を伴う疾患の検査方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 簡便で客観的にネコ、イヌの血管炎疾患を検
査できる方法を提供すること。 【解決手段】 ネコあるいはイヌの固定された好中球、
ヒト、イヌあるいはネコのミエロパーオキシダーゼ又は
ヒト、イヌあるいはネコのプロテアーゼ−３を抗原とし
て用いた抗原抗体反応を利用した免疫測定法により、ネ
コ又はイヌの血清中の抗好中球細胞質抗体を検出するネ
コ又はイヌの血管炎を伴う疾患の検査方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ネコ又はイヌの血
管炎を伴う疾患の検査方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】抗核抗体（ａｎｔｉ−ｎｕｃｌｅａｒ
ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＮＡ）は自己免疫疾患のスク
リーニング検査上、極めて重要な自己抗体であり、間接
蛍光抗体法で染色パターンにより対応抗原が鑑別され、
膠原病の診断に広く応用されている。膠原病は、関節炎
・関節痛があること、自己成分に対する過剰な免疫応答
によって組織傷害を起こすこと、病変の主座が血管・結
合組織であることからリウマチ性疾患、自己免疫疾患、
血管結合組織疾患の３つの特徴を合せ持つ全身性多臓器
疾患の総称である。近年、膠原病あるいは膠原病近縁疾
患に属する血管炎症侯群の一群に好中球細胞質に対する
自己抗体（ａｎｔｉ−ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｙｔｏ
ｐｌａｓｍｉｃ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＮ
ＣＡ）が高率に認められ、抗核抗体とともに膠原病の血
清学的指標として疾患診断、病態の把握、治療内容およ
びその効果判定、予後判定に利用されている。獣医学領
域では、ＡＮＣＡは比較的新しく発見された自己抗体で
あるため、これまでほとんど研究されていない。

【０００３】一方、ネコ又はイヌで血管炎を伴う疾患は
少なくない。例えば、感染症、膠原病、腎疾患などがあ
る。ネコやイヌの場合、血管炎を伴う疾患に冒されてい
るかどうかは、臨床病理学的に総合診断して判定する。
例えば、血管炎を生じる代表的な疾患の一つに、猫伝染
性腹膜炎（以下、「ＦＩＰ」と記す）がある。この病気
は、コロナウイルスの一種である猫伝染性腹膜炎ウイル
ス（ＦＩＰＶ）を原因とする。進行性で致死的な全身免
疫介在性疾患である。臨床的には、滲出型と非滲出型に
分類されている。滲出型は、多臓器に化膿性肉芽腫性変
化と激しい壊死性血管炎を起こし、腹水、胸水の滲出を
伴う。疾患診断は、臨床症状および腹水・胸水の所見、
血液化学所見、ＦＩＰＶ抗体価の上昇、肝腎の生検所見
など、臨床病理学的に総合して行う。

【０００４】ＦｌＰの診断、特に非滲出型の診断は困難
である。例えば、ＦＩＰＶ抗体価は近縁の腸コロナウイ
ルスに対する抗体との交差反応がある。他の所見に関し
てもＦＩＰに特異的とは言えないからである。その他に
も、病態を把握する有用な指標がなく、治療計画、予後
の判定を困難にしている。小動物疾患で血管炎を呈する
疾患には、ＦｌＰ以外にも、全身性紅斑性狼瘡、フィラ
リア症、犬伝染性肝炎、秋田犬・スピッツ・ドーベルマ
ンの特発性脈管炎などがあるが、血管炎とその病因・病
態との関連性は明らかにされていない。そのため、疾患
の有効な検査方法は実質的にないというのが現実であ
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、診
断、病態の把握が困難であったネコ、イヌの血管炎を伴
う疾患（血管炎症候群）を簡便に検査できる方法を提供
することを目的とする。本発明の別の目的は、ネコ伝染
性腹膜炎（ＦＩＰ）の診断、病態を簡便に検査すること
ができる検査方法を提供することである。本発明の別の
目的は、イヌにおけるバベシア感染症の診断、病態を簡
便に検査することができる検査方法を提供することであ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、今回、鋭
意検討の結果、上記の課題を以下の手段で解決できるこ
とを見いだした。 （１） ネコあるいはイヌの固定された好中球、ヒト、
イヌあるいはネコのミエロパーオキシダーゼ、又はヒ
ト、イヌあるいはネコのプロテアーゼ−３を抗原として
用いた抗原抗体反応を利用した免疫測定法により、ネコ
又はイヌの血清中の抗好中球細胞質抗体を検出すること
を特徴とするネコ又はイヌの血管炎を伴う疾患の検査方
法。

【０００７】（２） 抗原抗体反応を利用した免疫測定
法が、酵素免疫測定法であることを特徴とする前記
（１）に記載のネコ又はイヌの血管炎を伴う疾患の検査
方法。 （３） 血管炎を伴う疾患が、泌尿器疾患又は感染症で
あることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載のネ
コ又はイヌの血管炎を伴う疾患の検査方法。 （４） 血管炎を伴う疾患がネコ伝染性腹膜炎である前
記（１）に記載のネコ又はイヌの血管炎を伴う疾患の検
査方法。 （５） 血管炎を伴う疾患がイヌバベシア感染症である
前記（１）に記載のネコ又はイヌの血管炎を伴う疾患の
検査方法。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を説明
するが、本発明はこれに限定されない。本発明の検査方
法において、抗原抗体反応を利用した免疫測定法として
は、公知の免疫測定法を使用することができるが、具体
的には蛍光物質を標識とする方法（例えば間接蛍光抗体
法（Indirect immunofluorescence test ; IIF））、酵
素を標識とする方法（例えばＥＬＩＳＡ法（enzyme-lin
ked immunosorbent assay））、放射性物質を標識とす
る方法（例えばＲＩＡ法（radioimmuno assay））等が
用いることができる。本発明においては、酵素を標識と
する酵素免疫測定法が好ましく、中でもＥＬＩＳＡ法が
好ましい。これにより、より簡単で、且つ明確な疾患の
検査が可能となる。ここで標識する酵素としては、アル
カリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等
が挙げられ、基質もこれら酵素に対応したものを用いる
ことができる。

【０００９】本発明において、上記免疫測定法に用いる
抗原としては、ネコ又はイヌの固定された好中球、ミエ
ロパーオキシダーゼ（ＭＰＯともいう）、プロテアーゼ
−３（ＰＲ−３ともいう）のうちいずれか１種又は二種
以上を用いる。上記固定された好中球は、ネコ又はイヌ
から採血して、得られた血液から遠心分離等により好中
球を分離し、それを固定液（例えばエタノール、ホルム
アルデヒド）で固定して得られる。上記ＭＰＯ、ＰＲ−
３は、ネコ、イヌ、ヒト等の好中球から精製されたもの
や、ＭＰＯ、ＰＲ−３の遺伝子を大腸菌にて発現させた
組み換えタンパク質、あるいは市販されたものを使用で
きる。本発明においては、抗原としてＭＰＯ、ＰＲ−３
又はこれらの混合物が、検出がより確実になる点と操作
が簡単になる点等で好ましい。

【００１０】上記各種抗原は、基体（例えば、多穴スラ
イドグラス、多穴マイクロタイターウェル等）上に、固
定（固相化）する。上記抗原を含有する溶液（界面活性
剤やＢＳＡ等の添加剤を含んでいてもよいＰＢＳ溶液
等）を基体に分注し、風乾するか、所定時間インキュベ
ートすることにより固定できる。固定後に余分な抗原を
洗浄、除去する。上記抗原が固定された基体上に、被検
個体の血漿（血清）を（そのままあるいは必要により希
釈したもの）分注して、抗原と所定条件（例えば、室温
で１〜３時間）で反応させる。

【００１１】反応後、基体をＰＢＳ等により洗浄し、放
射線物質、蛍光物質あるいは酵素標識された抗ネコある
いは抗イヌＩｇＧ抗体等の標識抗体を基体上に分注し、
所定時間（例えば、室温で１〜３時間）反応させる。こ
こで各種標識抗体は、市販のものを使用できる。反応後
洗浄し、蛍光標識抗体を用いた場合には蛍光顕微鏡で蛍
光を観察する。発色したものの蛍光色素量を蛍光光度計
で測定することにより、ＡＮＣＡを定量的に測定でき
る。

【００１２】一方酵素標識抗体を用いた場合には、該酵
素の基質を添加し、酵素反応させ、発色したものを観察
する。発色したものを特定の波長（例えば４０５ｎｍ）
の光で吸光度（ＯＤ）を測定して、それを抗体価とし、
定量的にＡＮＣＡを検出できる。放射線物質で標識され
た抗体を用いた場合には、上記マイクロタイターウェル
を洗浄後、それぞれのウェルを単離し、γ（ガンマ）−
カウンター等を用いてその放射活性を測定することによ
り、高感度且つ定量的にＡＮＣＡを検出できる。上記の
ように血清中のＡＮＣＡを定量的に測定することで、そ
の量から血管炎を伴う疾患の病態を把握できる。

【００１３】本発明において、血管炎を伴う疾患として
は、腎炎等の泌尿器疾患、伝染性腹膜炎、バベシア感染
症等の感染症、腫瘍、膵炎、皮膚炎等が挙げられる。こ
れらの中では、ネコ伝染性腹膜炎（ＦＩＰ）、バベシア
感染症において、本発明の方法がより有効に適用でき
る。

【００１４】以下、本発明の方法の好ましい態様を示
す。 １）抗原としてヒトのＭＰＯ及び／又はヒトのＰＲ−３
を用いたＥＬＩＳＡ法により、ネコまたはイヌの血清中
のＡＮＣＡを検出することを特徴とするネコ又はイヌの
血管炎を伴う疾患の検査方法。 ２）抗原としてヒトのＭＰＯ及び／又はヒトのＰＲ−３
を用いたＥＬＩＳＡ法により、ネコの血清中のＡＮＣＡ
を検出することを特徴とするネコ伝染性腹膜炎の検査方
法。 ３）抗原としてヒトのＭＰＯ及び／又はヒトのＰＲ−３
を用いたＥＬＩＳＡ法により、イヌの血清中のＡＮＣＡ
を検出することを特徴とするバベシア感染症の検査方
法。

【００１５】以下、抗原としてヒトのＭＰＯを用いたＥ
ＬＩＳＡ法（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ−ＥＬＩＳＡ法）と抗原
としてヒトのＰＲ−３を用いたＥＬＩＳＡ法（ＰＲ−３
−ＡＮＣＡ−ＥＬＩＳＡ法）の具体的方法を以下に示す
が、本発明の内容がこれらに限定されるものではない。 （１） ＭＰＯ−ＡＮＣＡ−ＥＬＩＳＡ法 基体上に、５〜１０μｇ／ｍｌの濃度に調整した、ヒト
好中球細胞質より精製したＭＰＯ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏ
ｘｉｄａｓｅ）を含むＰＢＳを分注し、温度４℃で１晩
（１２時間）放置、固相化させる。固化したＭＰＯをＰ
ＢＳで洗浄し、ＭＰＯをブロッキングする。ブロッキン
グは、ゼラチンを添加したＰＢＳ−Ｇｅｌを注入して行
う。ＰＢＳ−Ｇｅｌのゼラチン濃度は、１〜２重量％が
よい。

【００１６】次に、その基体をＴｗｅｅｎ２０等の界面
活性剤を濃度０．０５〜０．１重量％添加してあるＰＢ
Ｓ（ＰＢＳＴ）を使用して洗浄する。洗浄後、１〜２重
量％ゼラチン添加ＰＢＳＴで１０〜１００倍に希釈した
被験血漿を注入し、室温（２５℃）で１〜２時間で抗原
と反応させる。洗浄後、そこに酵素標識抗体を注入し反
応させる。反応後ＰＢＳＴで洗浄後、アルカリフォスフ
ァターゼ基質を注入し、波長４０５ｎｍにて吸光度（Ｏ
Ｄ）を測定する。ＯＤ平均値をその検体の抗体価とす
る。

【００１７】（２）ＰＲ−３−ＡＮＣＡ−ＥＬＩＳＡ法 ＭＰＯの代わりに、ＰＢＳで５〜１０μｇ／ｍｌの濃度
に調整した、ヒト好中球細胞質より精製したＰＲ−３
（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−３，Ｅａｓｔ Ｃｏａｓｔ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用い、上記の方
法に準じて行うことができる。

【００１８】本発明において、同じ被検個体血清につい
て、抗原として固定された好中球、ＭＰＯ及びＰＲ−３
のいずれか１つの抗原で本発明の方法を実施したのち、
更にそれとは別の抗原を用いて２回目の本発明の方法を
実施してもよい。このように二種以上の抗原を用いて別
々に複数回検査することにより、検査の精度が上がると
ともに、ＡＮＣＡの対応抗原が異なる場合にも対応でき
る。

【００１９】

〔実施例１〕

＜ＭＰＯ−ＥＬＩＳＡ法＞図１に、本実施例の工程図を
示す。 １ 被験血漿（血清） 描血漿サンプルとして、ＦＩＰ自然発症猫２１頭（東京
大学家畜附属病院より供与）、ネコ伝染性腹膜炎ウイル
ス（ＦＩＰＶ）ＫＵＫ−Ｈ、Ｍ９１−２６６、Ｍ９１−
２６７株を接種したＦＩＰ実験感染猫６頭（以下、ＦＩ
Ｐ実験感染猫Ａ群とする）およびＦＩＰＶ Ｍ９１−２
６７株を接種し経時的にサンプルを採取したＦＩＰ実験
感染猫６頭（実験感染猫Ｂ群：山口大学農学部微生物学
研究室より供与）、山口大学農学部家畜附属病院に来院
した何らかの疾患を持った猫３９頭（内訳を下記表１に
示す）、健常描８頭（山口大学農学部微生物学研究室に
て飼育されたＳＰＦ猫６頭、山口大学農学部家畜附属病
院に来院した臨床上異常を認めない猫２頭）、計８０頭
の猫由来の血漿（血清）を用いた。

【００２０】

【表１】

【００２１】なお、ＦＩＰ実験感染猫Ｂ群においては、
安楽死後、山口大学農学部病理学研究室にて病理解剖を
行いその病理組織学的所見を得た。また、犬血漿サンプ
ルとして、山口大学農学部家畜附属病院に来院した何ら
かの疾患を持った犬７６頭（内訳を表２に示す）、およ
び健常犬として当研究室で飼育されているビーグル犬７
頭、計８３頭の血漿を用いた。これらの血漿（血清）
は、検査時まで−２０℃で保存した。

【００２２】

【表２】

【００２３】２ 固相化 ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で１０μｇ／ｍｌの濃度に
調整された、ヒト好中球細胞質より精製したＭＰＯ（Ｍ
ｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＮＡＣＡＬＡＩ ＴＥ
ＳＱＵＥ，Ｉｎｃ．ＪＡＰＡＮ）溶液を、９６穴ＥＬＩ
ＳＡ用プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａnｙ）に
１００μｌずつ分注し４℃で一晩、固相化した。

【００２４】３ 中間処理 翌日、ＭＰＯ溶液を回収した後、該プレートをＰＢＳで
１回洗浄し、２％ゼラチン添加ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｇｅ
ｌ）にて室温で２時間ブロッキングを行った。次に、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳ（ＰＢＳ
Ｔ）で１回洗浄後、該プレートに、１％ゼラチン添加Ｐ
ＢＳＴで５０倍に希釈した上記被験血漿を１００μｌず
つ分注し、室温で２時間反応させた。

【００２５】４ 抗体反応 上記反応後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄後、ＰＢＳ
Ｔ−Ｇｅｌで５００倍に希釈したアルカリフォスファタ
ーゼ標識ウサギ抗猫ＩｇＧ抗体（ＲＯＣＫＬＡＮＤ，
Ｕ．Ｓ．Ａ．）またはアルカリフォスファターゼ標識抗
犬ＩｇＧ抗体（ＲＯＣＫＬＡＮＤ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を１
００μｌずつ分注し２時間反応させた。反応後プレート
をＰＢＳＴで５回洗浄後、アルカリフォスファターゼ基
質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ，）を１００μｌずつ
分注し反応させ、反応後ＥＬＩＳＡリーダー（Ｍｕｌｔ
ｉｓｃａｎ ｂｉｃｒｏｍａｔｉｃｋ，Ｌａｂｏｓｙｓ
ｔｅｍ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて波長４０５ｎｍにて吸
光度（ＯＤ）を測定した。１検体につき２穴ずつ行い、
その２つのウェルのＯＤ平均値をその検体の抗体価とし
た。

【００２６】〔実施例２〕 ＜ＰＲ−３−ＡＮＣＡ−ＥＬＩＳＡ法＞ＭＰＯの代わり
に、ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌの濃度に調整した、ヒト好
中球細胞質より精製したＰＲ−３（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓ
ｅ−３，Ｅａｓｔ ＣｏａｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃｓ，
Ｕ．Ｓ．Ａ．）溶液を用いた外は、実施例１に準じて行
った。

【００２７】〔実施例１、２の結果〕図２は、健常猫
（検体数ｎ＝６）、ＦＩＰ実験感染猫Ａ（ｎ＝６）、Ｆ
ＩＰ自然発症猫（ｎ＝２１）のＭＰＯを認識するＡＮＣ
Ａ抗体価（ＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体価）の分布を示す。健
常猫とＦＩＰ実験感染猫および自然発症猫のＭＰＯ−Ａ
ＮＣＡ抗体価の差を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定に
てそれぞれ比較したところ、ＦＩＰ実験感染猫および自
然発症猫のＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体価はともに健常猫の抗
体価より有意（ｐ＜０．０１）に高かった。

【００２８】図３は、健常猫（ｎ＝６）、ＦＩＰ実験感
染猫Ａ（ｎ＝６）、ＦＩＰ自然発症猫（ｎ＝２１）のＰ
Ｒ−３を認識するＡＮＣＡ抗体価（ＰＲ−３−ＡＮＣＡ
抗体価）の分布を示す。健常猫とＦＩＰ実験感染猫およ
びＦＩＰ自然発症猫のＰＲ−３−ＡＮＣＡ抗体価の差
を、Ｍａｎｎ−ｗｈｉｔｎｅｙ検定にてそれぞれ比較し
たところ、ＦＩＰ実験感染猫および自然発症猫のＰＲ−
３−ＡＮＣＡ力価は、有意（ｐ＜０．０１）に高かっ
た。図４および図５はＦＩＰ実験感染猫Ｂ（ｎ＝６）の
ＦＩＰウィルス接種後の経過日数におけるＭＰＯ−ＡＮ
ＣＡ、ＰＲ−３−ＡＮＣＡ抗体価の推移を個体別に示し
た。

【００２９】ＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体価において、ウィル
ス接種後第１４病日よりＡＮＣＡ抗体価の上昇が認めら
れた。第３０病日では、抗体価にばらつきが認められ、
症例１、２で抗体価の上昇が顕著であり、症例５、６は
軽度であった。これは臨床症状及び剖検所見と一致して
いた。ＰＲ−３−ＡＮＣＡ抗体価においても同様の傾向
が認められた。

【００３０】図６および図７は、健常猫（ｎ＝６）と各
種疾患猫（ｎ＝３９）におけるＭＰＯ−ＡＮＣＡ、ＰＲ
−３−ＡＮＣＡ抗体価のそれぞれの分布を示す。ＭＰＯ
−ＡＮＣＡ抗体価においてＯＤ値が０．３以上の疾患
は、全て腎炎（膀胱炎併発）、腎不全、膀胱炎などの泌
尿器疾患であった。一方、ＰＲ−３−ＡＮＣＡ抗体価に
おいて、ＰＲ−３−ＡＮＣＡ抗体価が健常猫に比べて明
らかに高値を示したのは、わずか１例（腎炎・膀胱炎併
発）で、その他に特徴的な傾向は見られなかった。

【００３１】図８および図９に健常犬（ｎ＝７）と各種
疾患犬（ｎ＝７６）におけるＭＰＯ−ＡＮＣＡ、ＰＲ−
３−ＡＮＣＡ抗体価のそれぞれの分布を示す。ＭＰＯ−
ＡＮＣＡ抗体価においてＯＤ値が０．３以上の疾患は、
全てバベシア感染症であった。一方、ＰＲ−３−ＡＮＣ
Ａ抗体価においてＯＤ値が０．３以上を示したのは、わ
ずか１例（腎不全）だけであった。

【００３２】図１０および図１１に疾患別のＭＰＯ−Ａ
ＮＣＡ抗体価およびＰＲ−３−ＡＮＣＡ抗体価の分布を
示す。健常犬と各疾患群間のＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体価、
およびＰＲ−３−ＡＮＣＡ抗体価の差をＳｔｕｄｅｎｔ
のｔ検定を用いて比較した結果、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体
価において健常犬との間に有意差（ｐ＜０．０５）が認
められたのは、バベシア感染症、毛包虫症、膵炎、腫
瘍、皮膚炎、膿皮症であった。また、ＰＲ−３−ＡＮＣ
Ａ抗体価において健常犬との間に有意差（ｐ＜０．０
５）が認められたのは、毛包虫症と膿皮症であった。

【００３３】以上の結果から、第１にＦＩＰでＡＮＣＡ
が高率に検出され、病態と相関して変動することが分か
った。ＡＮＣＡとＦＩＰの病態との関連性を検討するた
めにＦＩＰ実験感染猫におけるＡＮＣＡ抗体価の経時的
な変動を観察したところ、ほとんどの症例で顕著な抗体
価の上昇が見られた第１４病日は神経症状や発熱などの
臨床症状が現れ始めた時期と一致していた。また、高い
抗体価を示した症例は急性経過をとり、臨床症状も激し
く、安楽死後の病理組織学的所見においても各臓器に重
篤な化膿性肉芽腫および壊死性血管炎が認められたのに
対し、低い抗体価を呈した症例は慢性経過をとり、臨床
症状も比較的に軽く、病理学的所見では腹水の滲出、腹
・胸膜炎を認める程度であった。これらの結果は、ＡＮ
ＣＡが病態と相関して変動することを強く示唆するもの
であった。次に、小動物疾患におけるＰＲ−３−ＡＮＣ
ＡおよびＭＰＯ−ＡＮＣＡの疾患特異性を検討するた
め、さまざまな疾患症例を対象にＰＲ−３−ＡＮＣＡお
よびＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体価の測定を試みた。各種疾患
猫（ｎ＝３８）のＰＲ−３−ＡＮＣＡおよびＭＰＯ−Ａ
ＮＣＡ抗体価をそれぞれ測定したところ、健常猫にくら
べ明らかに高値を示すものがあった。特にＭＰＯ−ＡＮ
ＣＡ抗体価において、ＯＤ値が０．３以上を示した疾患
は全て、腎炎、腎不全、膀胱炎などの泌尿器であり、小
動物疾患においてＭＰＯ−ＡＮＣＡは、腎糸球体などの
毛細血管レベルの太さの血管に壊死性血管炎をおこす可
能性が示唆された。

【００３４】小動物疾患において、泌尿器疾患およびウ
イルス感染症は、最もよく見られる重要な疾患であり無
治療であれば予後不良になる場含も多い。従って、今後
これらの疾患に関してＡＮＣＡが、疾患特異的抗体ある
いは疾患活動性を示す血清学的指標となる可能性を示唆
した。

【００３５】各種疾患犬（ｎ＝７６）のＰＲ−３−ＡＮ
ＣＡ、ＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体価においても、それぞれ健
常犬の抗体価にくらべ明らかに高値を示すものがあっ
た。特にＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体価がＯＤ値０．３以上を
示した疾患は全てバベシア感染犬であり、バベシア感染
症でＡＮＣＡが高頻度に検出される可能性が示唆された
バベシア感染症はマダニ媒介性の血液原虫疾患でこの病
気の臨床症状が進行する原因は進行性の溶血性貧血であ
る。バベシア自然感染犬の約９０％が赤血球のクームス
試験で陽性を示し、しばしば球状赤血球が出現すること
から自己免疫性溶血性貧血の関連性が示唆されており、
最近バベシア感染犬血清の自己赤血球に対する反応性
が、赤血球膜成分の変化により増長することも報告され
ている。今回バベシア感染犬においてＡＮＣＡの上昇が
認められたことから、その病態には、赤血球または好中
球に対する自己抗体が深く関与している可能性が考えら
れた。その他、アトピー性皮膚炎や落葉性天疱瘡などの
免疫介在性疾患で比較的高いＡＮＣＡ値を示しているこ
とからも、ＡＮＣＡがこれらの免疫介在性疾患の発症お
よび病態に関与している可能性が示唆された。

【００３６】〔実施例３〕 ＜間接蛍光抗体法（ＩＩＦ）＞図１２に、本実施例の工
程図を示す。 １ 血漿（血清）サンプル ＦＩＰ自然発症猫２頭、ＦＩＰ実験感染猫２頭、ＦＩＶ
感染猫１頭、腎不全猫１頭、腎炎猫（膀胱炎併発）１
頭、および健常猫としてＳＰＦ猫２頭、臨床上異常を認
めない猫２頭の計１１頭および犬血漿サンプルとしてフ
ィラリア感染犬１頭、バベシア感染犬１頭、腎不全犬１
頭および健常犬２頭の計５頭を用いた。

【００３７】２ 方法 健常猫および健常犬の頚静脈から３．５ｍｌ採血した。
採血にはヘパリンを含んだ注射筒を使用した。採取した
血液をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ （Ｐｏｌｙｍｏｒｐ
ｈｏｐｒｅｐ，ＮＹＣＯＭＥＤ，Ｎｏｒｗａｙ）３．５
ｍｌの上に静かに重層し、室温で４５０×ｇ、３５分間
遠心した。遠心後Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの上部に生
じた層を好中球として分画した。得られた好中球を同量
の赤血球溶解液（０．０１７ＭＴｒｉｓ，０．７５％の
ＮＨ₄Ｃｌ，ｐＨ７．２）に浮遊させ、室温で４００×
ｇ、１０分間遠心して混入した赤血球を溶解させた。溶
解処理後、ペレットを生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）
に浮遊させて、１回洗浄し（４００×ｇ，１０分間）、
さらにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．２）で２回
洗浄した（４００×ｇ，１０分間）。

【００３８】塗抹標本をニューメチレン・ブルーにて染
色し、好中球の確認を行った。分離した好中球の生存率
はＴｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ染色にて算出し、その後２％
の濃度で牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加されたＰＢ
Ｓ（ＢＳＡ−ＰＢＳ）にて細胞数を６．０×１０⁶／ｍ
ｌに調節し、これを好中球浮遊液とした。この好中球浮
遊液を２枚の１２穴スライドガラス（１２ＷＥＬＬ Ｍ
ＵＬＴＩＴＥＳＴ ＳＬＩＤＥ，ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄ
ｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）上に伸展し、４
℃で１０分間一方をエタノールで、もう一方をホルムア
ルデヒドで固定し、風乾させた。次に好中球を固定した
各ウエルに２％ＢＳＡ−ＰＢＳで２０倍に希釈した上記
被験血漿（血清）およびコントロールとして２％ＢＳＡ
−ＰＢＳを分注し、室温にて湿潤箱内で１時間反応させ
た後、ＰＢＳで１０分間、３回洗浄した。

【００３９】続いてＰＢＳで１００倍に希釈したＦＩＴ
Ｃ標識ヤギ抗猫ＩｇＧ（ＣＡＰＰＥＬ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）
およびＦＩＴＣ標識ヤギ抗犬ＩｇＧ（ＣＡＰＰＥＬ，
Ｕ．Ｓ．Ａ．）を１００μ１分注し、湿潤箱内で１時間
反応させた後ＰＢＳで１０分間３回洗浄した。風乾後、
落射式蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）を用いて
４８５ｎｍｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｆｉｌｔｅｒ、５０
０ｎｍ ｂａｒｒｉｅｒ ｆｉｌｔｅｒで観察した。光
源として水銀ランプ（Ｎｉｋｏｎ．Ｊａｐａｎ）を使用
した。判定は、好中球細胞質が明らかに染色されている
ものを腸性とした。

【００４０】〔実施例３結果〕ＳＰＦ猫２頭、および臨
床上異常を認めない健常猫２頭中の１頭は陰性を示した
が、他の１頭で、陽性とは判断できないが好中球細胞質
の弱染が認められた。 ＜ＦＩＰ実験＞感染猫は２頭とも陽性であった。ＦＩＰ
自然発症猫２頭のうち１頭は陽性、他方は陰性であっ
た。図１３に陽性を示したＦＩＰ自然発症猫の蛍光顕微
鏡写真像を示す。また犬においては、健常犬２頭および
フィラリア感染犬では陰性を示したが、バベシア感染症
犬では陽性を示した。図１４に陽性を示したバベシア感
染症犬の蛍光顕微鏡写真像を示す。腎不全犬で好中球細
胞質の弱染が認められたが、陽性と判断できなかった。
また今回、エタノール固定、ホルムアルデヒド固定の両
方を行ったが、ホルムアルデヒド固定では固定・染色さ
れず、判定不可能であった。以上、ＩＩＦを用いた方法
では、疾患の判定に不安定さが残るものの、ＭＰＯ、Ｐ
Ｒ−３以外のＡＮＣＡ対応抗原を検出することが可能で
あると思われ、ある程度の疾患の有無の判定の目安には
使用できる。

【００４１】上記結果から、小動物疾患でもＦＩＰをは
じめ、バベシア症、泌尿器疾患、感染症などにおいて、
ＡＮＣＡ抗体価が高値を示すものがあることが確認され
た。この結果から獣医領域においてＡＮＣＡが膠原病や
腎疾患などの血管炎症候群の診断、疾患活動性および予
後判定の有用な血清学的指標となる可能性が示唆され
た。

【００４２】

【発明の効果】本発明は上記のような構成でなるから、
診断、病態の把握が困難であったネコ、イヌの血管炎を
伴う疾患（血管炎症候群）を簡便に検査できる方法を提
供することができる。本発明により、特に、ネコ伝染性
腹膜炎（ＦＩＰ）の診断、病態を簡便に検査することが
でき、また、イヌにおけるバベシア感染症の診断、病態
を簡便に検査することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本実施例の工程図である。

【図２】健常猫、ＦＩＰ実験感染猫Ａ、ＦＩＰ自然発症
猫のＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体価の分布を示す図である。

【図３】健常猫、ＦＩＰ実験感染猫Ａ、ＦＩＰ自然発症
猫のＰＲ−３−ＡＮＣＡ抗体価の分布を示す図である。

【図４】ＦＩＰ実験感染猫ＢのＦＩＰウィルス接種後の
経過日数におけるＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体価の推移を個体
別に示した図である。

【図５】ＦＩＰ実験感染猫ＢのＦＩＰウィルス接種後の
経過日数におけるＰＲ−３−ＡＮＣＡ抗体価の推移を個
体別に示した図である。

【図６】健常猫と各種疾患猫におけるＭＰＯ−ＡＮＣＡ
抗体価のそれぞれの分布を示す図である。

【図７】健常猫と各種疾患猫におけるＰＲ−３−ＡＮＣ
Ａ抗体価のそれぞれの分布を示す図である。

【図８】健常犬と各種疾患犬におけるＭＰＯ−ＡＮＣＡ
抗体価のそれぞれの分布を示す図である。

【図９】健常犬（ｎ＝７）と各種疾患犬（ｎ＝７６）に
おけるＰＲ−３−ＡＮＣＡ抗体価のそれぞれの分布を示
す図である。

【図１０】疾患別のＭＰＯ−ＡＮＣＡ抗体価の分布を示
す図である。

【図１１】疾患別のＰＲ−３−ＡＮＣＡ抗体価の分布を
示す図である。

【図１２】本発明の実施例の工程図である。

【図１３】腸性を示したＦＩＰ自然発症猫の蛍光顕微鏡
写真図である。

【図１４】陽性を示したバベシア感染症犬の蛍光顕微鏡
写真図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA13 BB01 BB10 BB14 BB22 BB24 BB41 BB46 BB50 CA12 CA26 CB17 FA26 FA29 FB01 FB03 FB16 GC10

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ネコあるいはイヌの固定された好中球、
   ヒト、イヌあるいはネコのミエロパーオキシダーゼ、又
   はヒト、イヌあるいはネコのプロテアーゼ−３を抗原と
   して用いた抗原抗体反応を利用した免疫測定法により、
   ネコ又はイヌの血清中の抗好中球細胞質抗体を検出する
   ことを特徴とするネコ又はイヌの血管炎を伴う疾患の検
   査方法。
2. 【請求項２】 抗原抗体反応を利用した免疫測定法が、
   酵素免疫測定法であることを特徴とする請求項１に記載
   のネコ又はイヌの血管炎を伴う疾患の検査方法。
3. 【請求項３】 血管炎を伴う疾患が、泌尿器疾患又は感
   染症であることを特徴とする請求項１又は２に記載のネ
   コ又はイヌの血管炎を伴う疾患の検査方法。
4. 【請求項４】 血管炎を伴う疾患がネコ伝染性腹膜炎で
   ある請求項１に記載のネコ又はイヌの血管炎を伴う疾患
   の検査方法。
5. 【請求項５】 血管炎を伴う疾患がイヌバベシア感染症
   である請求項１に記載のネコ又はイヌの血管炎を伴う疾
   患の検査方法。