JP2000236898A - アンチトロンビンｉｉｉの測定法 - Google Patents
アンチトロンビンｉｉｉの測定法Info
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- JP2000236898A JP2000236898A JP11044280A JP4428099A JP2000236898A JP 2000236898 A JP2000236898 A JP 2000236898A JP 11044280 A JP11044280 A JP 11044280A JP 4428099 A JP4428099 A JP 4428099A JP 2000236898 A JP2000236898 A JP 2000236898A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 被検体中のアンチトロンビンIIIに酵素
を反応させて残存酵素活性を合成基質法で測定するアン
チトロンビンIIIの測定法において、反応系にアルギニ
ン又はアルギニンを含む２〜６個のアミノ酸からなるオ
リゴペプチドを添加することを特徴とするアンチトロン
ビンIIIの測定法。 【効果】 検体を希釈せずアンチトロンビンIIIを測定
できる。
を反応させて残存酵素活性を合成基質法で測定するアン
チトロンビンIIIの測定法において、反応系にアルギニ
ン又はアルギニンを含む２〜６個のアミノ酸からなるオ
リゴペプチドを添加することを特徴とするアンチトロン
ビンIIIの測定法。 【効果】 検体を希釈せずアンチトロンビンIIIを測定
できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、血液中の活性型凝
固因子の最も重要な阻害物質として血液の凝固、線溶を
コントロールしているアンチトロンビンIII（以下「Ａ
ＴIII」という）の測定法に関する。
固因子の最も重要な阻害物質として血液の凝固、線溶を
コントロールしているアンチトロンビンIII（以下「Ａ
ＴIII」という）の測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体内における酵素反応は、その活性化
物質やその反応を阻害する阻害物質により制御・調整さ
れ、機能の調節が図られている。例えば、血液凝固機能
においては血管損傷部位以外での血液凝固反応や、過度
の凝固亢進・線溶亢進を阻害する酵素阻害物質が存在
し、これにより血液凝固・線溶の制御・調節が行われて
いる。酵素阻害物質のうち、ＡＴIIIは、血液中の活性
型凝固因子の最も重要な阻害物質として、血液の凝固、
線溶をコントロールしている。その血中レベルは汎発性
血管内凝固症（ＤＩＣ）、肝疾患、ネフローゼ症候群で
低下するなど種々の疾患、症状により変動し、また、血
中レベルが低下すると、ヘパリン治療の効果が現れない
ことがある。そのため、ＡＴIIIの活性は、これらの疾
患のスクリーニング、病体解析、予後判定、及びヘパリ
ン治療、あるいはＡＴIII濃縮製剤投与時の指標となっ
ている。従って、ＡＴIIIを測定することは、重要な意
義を有する。
物質やその反応を阻害する阻害物質により制御・調整さ
れ、機能の調節が図られている。例えば、血液凝固機能
においては血管損傷部位以外での血液凝固反応や、過度
の凝固亢進・線溶亢進を阻害する酵素阻害物質が存在
し、これにより血液凝固・線溶の制御・調節が行われて
いる。酵素阻害物質のうち、ＡＴIIIは、血液中の活性
型凝固因子の最も重要な阻害物質として、血液の凝固、
線溶をコントロールしている。その血中レベルは汎発性
血管内凝固症（ＤＩＣ）、肝疾患、ネフローゼ症候群で
低下するなど種々の疾患、症状により変動し、また、血
中レベルが低下すると、ヘパリン治療の効果が現れない
ことがある。そのため、ＡＴIIIの活性は、これらの疾
患のスクリーニング、病体解析、予後判定、及びヘパリ
ン治療、あるいはＡＴIII濃縮製剤投与時の指標となっ
ている。従って、ＡＴIIIを測定することは、重要な意
義を有する。
【０００３】従来、この様な酵素阻害物質は、測定対象
である酵素阻害物質と過剰量の酵素と反応させ、残存す
る酵素を測定することにより定量されてきた。例えば、
生体試料（検体）中のＡＴIII量を測定する場合には、
ＡＴIIIが活性型血液凝固第１０因子（ＦＸａ）あるい
はトロンビンを阻害することを利用して、一定量のＦＸ
ａあるいはトロンビンを検体中のＡＴIIIと反応させた
後、残存するＦＸａあるいはトロンビンの活性を測定す
ることにより、ＡＴIII量を求めることが行われてい
る。そして、この場合、ＦＸａあるいはトロンビンの活
性は、発色性合成基質の加水分解速度を吸光度の変化を
もって測定する方法などにより求められる。
である酵素阻害物質と過剰量の酵素と反応させ、残存す
る酵素を測定することにより定量されてきた。例えば、
生体試料（検体）中のＡＴIII量を測定する場合には、
ＡＴIIIが活性型血液凝固第１０因子（ＦＸａ）あるい
はトロンビンを阻害することを利用して、一定量のＦＸ
ａあるいはトロンビンを検体中のＡＴIIIと反応させた
後、残存するＦＸａあるいはトロンビンの活性を測定す
ることにより、ＡＴIII量を求めることが行われてい
る。そして、この場合、ＦＸａあるいはトロンビンの活
性は、発色性合成基質の加水分解速度を吸光度の変化を
もって測定する方法などにより求められる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、検体中
にはＡＴIIIが高濃度（約２５mg／dl）で存在するた
め、通常の検体量（２〜５０μｌ）で希釈せずに従来法
によりＡＴIIIを測定することは次の理由から困難であ
った。
にはＡＴIIIが高濃度（約２５mg／dl）で存在するた
め、通常の検体量（２〜５０μｌ）で希釈せずに従来法
によりＡＴIIIを測定することは次の理由から困難であ
った。
【０００５】（１）高濃度のＡＴIIIを含む検体を希釈
しないで測定するには、検体量を極端に少なくすること
が考えられる。しかし検体量を少なくすると測定値の再
現性が低下するという問題があり、また２μｌ未満のサ
ンプリングは実質的に不可能である。 （２）通常の検体量の非希釈検体を用いて測定しようと
すると、酵素（ＦＸａ又はトロンビン）は希釈検体に対
応した濃度に調整されているため酵素が消費し尽くされ
てしまい、残存酵素量に基づいて検体中のＡＴIII量を
測定することは不可能である。 （３）一方、これを回避するために酵素量を増加させる
と、残存酵素量が多くなりすぎ、合成基質を用いる方法
では吸光度が３以上となり測定が不可能となる。 （４）更に、残存酵素量の差（例えば、ＡＴIII濃度が
０％と１００％での残存酵素量の差）が大きくなること
から、各残存酵素量で反応速度に差が生じやすくなり、
検体の希釈系列は湾曲し、検体の希釈直線性は不十分と
なる。 （５）また、各残存酵素量での反応速度が一定になるよ
うに合成基質濃度を増加させると、反応開始後、短時間
で吸光度が３以上となり測定が不可能となる。特に、分
解されやすい基質を用いた場合、各残存酵素量で反応速
度に差が生じやすく、短い反応時間で吸光度が３以上と
なる傾向が強くなる。
しないで測定するには、検体量を極端に少なくすること
が考えられる。しかし検体量を少なくすると測定値の再
現性が低下するという問題があり、また２μｌ未満のサ
ンプリングは実質的に不可能である。 （２）通常の検体量の非希釈検体を用いて測定しようと
すると、酵素（ＦＸａ又はトロンビン）は希釈検体に対
応した濃度に調整されているため酵素が消費し尽くされ
てしまい、残存酵素量に基づいて検体中のＡＴIII量を
測定することは不可能である。 （３）一方、これを回避するために酵素量を増加させる
と、残存酵素量が多くなりすぎ、合成基質を用いる方法
では吸光度が３以上となり測定が不可能となる。 （４）更に、残存酵素量の差（例えば、ＡＴIII濃度が
０％と１００％での残存酵素量の差）が大きくなること
から、各残存酵素量で反応速度に差が生じやすくなり、
検体の希釈系列は湾曲し、検体の希釈直線性は不十分と
なる。 （５）また、各残存酵素量での反応速度が一定になるよ
うに合成基質濃度を増加させると、反応開始後、短時間
で吸光度が３以上となり測定が不可能となる。特に、分
解されやすい基質を用いた場合、各残存酵素量で反応速
度に差が生じやすく、短い反応時間で吸光度が３以上と
なる傾向が強くなる。
【０００６】従って、従来、ＡＴIIIを測定するには、
検体を希釈せざるを得なかったが、希釈の操作は煩雑で
あり、測定の迅速化、簡便化を図る上でこれは障害とな
っていた。
検体を希釈せざるを得なかったが、希釈の操作は煩雑で
あり、測定の迅速化、簡便化を図る上でこれは障害とな
っていた。
【０００７】これに対し、検体を希釈することなくＡＴ
III等の酵素阻害物質を測定する方法として、第二の酵
素阻害物質を添加する方法が報告されている（特開平６
−１８１７９８号）。しかしながら、この方法に用いる
第二の酵素阻害物質は酵素の活性中心に少量で強く作用
するため、使用濃度の調整が難しく、反応系中に入る微
妙な量の違いや分析装置の攪拌能力の差により、反応液
中での酵素、第二酵素阻害物質及び合成基質の競合の仕
方が測定毎に異なり、このため、データの再現性、希釈
直線性等の性能に問題を有していた。
III等の酵素阻害物質を測定する方法として、第二の酵
素阻害物質を添加する方法が報告されている（特開平６
−１８１７９８号）。しかしながら、この方法に用いる
第二の酵素阻害物質は酵素の活性中心に少量で強く作用
するため、使用濃度の調整が難しく、反応系中に入る微
妙な量の違いや分析装置の攪拌能力の差により、反応液
中での酵素、第二酵素阻害物質及び合成基質の競合の仕
方が測定毎に異なり、このため、データの再現性、希釈
直線性等の性能に問題を有していた。
【０００８】従って、本発明の目的は、検体を希釈する
ことなく、ＡＴIIIを精度良く測定できる方法を提供す
ることにある。
ことなく、ＡＴIIIを精度良く測定できる方法を提供す
ることにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】斯かる実状に鑑み本発明
者は鋭意研究を行った結果、検体と酵素液（ＦＸａ、ト
ロンビン）又は残存酵素と合成基質液のそれぞれの反応
を弱く阻害する物質を新たに見出し、これを用いること
により検体を希釈することなく、ＡＴIIIを上記問題点
がなく測定できることを見出し、本発明を完成した。
者は鋭意研究を行った結果、検体と酵素液（ＦＸａ、ト
ロンビン）又は残存酵素と合成基質液のそれぞれの反応
を弱く阻害する物質を新たに見出し、これを用いること
により検体を希釈することなく、ＡＴIIIを上記問題点
がなく測定できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】すなわち、本発明は、被検体中のＡＴIII
に酵素を反応させて残存酵素活性を合成基質法で測定す
るＡＴIIIの測定法において、反応系にアルギニン又は
アルギニンを含む２〜６個のアミノ酸からなるオリゴペ
プチドを添加することを特徴とするＡＴIIIの測定法を
提供するものである。
に酵素を反応させて残存酵素活性を合成基質法で測定す
るＡＴIIIの測定法において、反応系にアルギニン又は
アルギニンを含む２〜６個のアミノ酸からなるオリゴペ
プチドを添加することを特徴とするＡＴIIIの測定法を
提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明においては、アルギニン又
は上記オリゴペプチドを添加することで、検体と酵素又
は残存酵素と合成基質の反応を弱く阻害する。このうち
オリゴペプチドは、アルギニンを有するジペプチド、ト
リペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド又はヘキ
サペプチドである。オリゴペプチドのアミノ酸配列は、
アルギニンを有すること以外は特に限定されず、アルギ
ニン以外のアミノ酸としては、グリシン、チロシン、ト
レオニン、セリン、グルタミン酸、イソロイシン、アス
パラギン、バリン、グルタミン、アラニン、フェニルア
ラニン、ロイシン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギ
ン酸又はピペコリン酸が好ましい。本発明で用いられる
アミノ酸又はオリゴペプチドを構成するアミノ酸は水溶
液等での溶解性が良好であれば、アセチル基、ベンジル
基等の通常考えられる修飾基が付加されていてもよく、
また、塩酸塩等の塩であってもよい。
は上記オリゴペプチドを添加することで、検体と酵素又
は残存酵素と合成基質の反応を弱く阻害する。このうち
オリゴペプチドは、アルギニンを有するジペプチド、ト
リペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド又はヘキ
サペプチドである。オリゴペプチドのアミノ酸配列は、
アルギニンを有すること以外は特に限定されず、アルギ
ニン以外のアミノ酸としては、グリシン、チロシン、ト
レオニン、セリン、グルタミン酸、イソロイシン、アス
パラギン、バリン、グルタミン、アラニン、フェニルア
ラニン、ロイシン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギ
ン酸又はピペコリン酸が好ましい。本発明で用いられる
アミノ酸又はオリゴペプチドを構成するアミノ酸は水溶
液等での溶解性が良好であれば、アセチル基、ベンジル
基等の通常考えられる修飾基が付加されていてもよく、
また、塩酸塩等の塩であってもよい。
【００１２】本発明で用いられるアルギニン又はオリゴ
ペプチドの濃度又は添加量は、これらの種類により異な
るが、反応系中での終濃度が、検体の希釈系列を測定し
たときに湾曲を生じない濃度であり、かつ測定感度（０
％と１００％濃度のＡＴIII量を測定したときの吸光度
変化量の差）が極端に低下しない濃度であれば、いずれ
の濃度であってもよい。例えば終濃度が２０mM以上とな
るよう添加することが好ましく、特に３０〜２００mMと
なるように添加することが好ましい。
ペプチドの濃度又は添加量は、これらの種類により異な
るが、反応系中での終濃度が、検体の希釈系列を測定し
たときに湾曲を生じない濃度であり、かつ測定感度（０
％と１００％濃度のＡＴIII量を測定したときの吸光度
変化量の差）が極端に低下しない濃度であれば、いずれ
の濃度であってもよい。例えば終濃度が２０mM以上とな
るよう添加することが好ましく、特に３０〜２００mMと
なるように添加することが好ましい。
【００１３】本発明の測定法は、被検体中のＡＴIIIに
酵素を反応させて残存酵素活性を合成基質法で測定する
ＡＴIIIの測定法であり、上記アルギニン又はオリゴペ
プチドはこの反応系に添加すればよく、第１試薬液（Ｆ
Ｘａ等の酵素）又は第２試薬液（合成基質等）のいずれ
でもよい。最近普及してきている血液凝固自動分析装置
を用いることを考慮して、検体希釈液に添加してもよ
い。すなわち、アルギニン又はオリゴペプチドは、残存
酵素と合成基質との反応時に存在していればよい。
酵素を反応させて残存酵素活性を合成基質法で測定する
ＡＴIIIの測定法であり、上記アルギニン又はオリゴペ
プチドはこの反応系に添加すればよく、第１試薬液（Ｆ
Ｘａ等の酵素）又は第２試薬液（合成基質等）のいずれ
でもよい。最近普及してきている血液凝固自動分析装置
を用いることを考慮して、検体希釈液に添加してもよ
い。すなわち、アルギニン又はオリゴペプチドは、残存
酵素と合成基質との反応時に存在していればよい。
【００１４】本発明に用いる酵素、すなわちＡＴIIIが
阻害する酵素は、ＦＸａ又はトロンビンが好ましい。こ
れらの酵素は、分子量の違いによりα型、β型又はγ型
等があり、本発明では、いずれも用いることができる
が、特にα型が好ましい。本発明に用いるこれら酵素
は、クロモジェニックス社等で市販されているものを用
いることもできる。またこれらα型、β型又はγ型のＦ
Ｘａ、更にα型、β型又はγ型のトロンビンは、単独又
は混合物としても用いることができる。また、使用量
は、検体無希釈液に含まれるＡＴIII量の１．５倍量以
上に対応できる量であれば特に制限されないが、ＦＸａ
では、０．２〜６nkat／assay、特に０．５〜３nkat／a
ssay、トロンビンでは、０．２〜６．２nkat／assay、
特に０．５〜３．１nkat／assayとなるような範囲で用
いるのが好ましい。なお、１nkatは、ＦＸａでは１秒間
に１nmolのＦＸａ合成基質（Ｓ−２２２２）を分解する
ＦＸａ量を言い、トロンビンでは１秒間に１nmolのトロ
ンビン合成基質（Ｓ−２２３８）を分解するトロンビン
量をいう。
阻害する酵素は、ＦＸａ又はトロンビンが好ましい。こ
れらの酵素は、分子量の違いによりα型、β型又はγ型
等があり、本発明では、いずれも用いることができる
が、特にα型が好ましい。本発明に用いるこれら酵素
は、クロモジェニックス社等で市販されているものを用
いることもできる。またこれらα型、β型又はγ型のＦ
Ｘａ、更にα型、β型又はγ型のトロンビンは、単独又
は混合物としても用いることができる。また、使用量
は、検体無希釈液に含まれるＡＴIII量の１．５倍量以
上に対応できる量であれば特に制限されないが、ＦＸａ
では、０．２〜６nkat／assay、特に０．５〜３nkat／a
ssay、トロンビンでは、０．２〜６．２nkat／assay、
特に０．５〜３．１nkat／assayとなるような範囲で用
いるのが好ましい。なお、１nkatは、ＦＸａでは１秒間
に１nmolのＦＸａ合成基質（Ｓ−２２２２）を分解する
ＦＸａ量を言い、トロンビンでは１秒間に１nmolのトロ
ンビン合成基質（Ｓ−２２３８）を分解するトロンビン
量をいう。
【００１５】本発明で用いられる合成基質としては、特
に制限されないが、例えばクロモジェニックス社製の合
成基質、ＦＸａでは、Ｓ−２２２２、Ｓ−２３３７、Ｓ
−２７３２、Ｓ−２７６５、Ｓ−２７６７、Ｓ−２７７
２、Ｓ−２７８２、Ｓ−２７８７などが使用できる。ま
た、トロンビンでは、Ｓ−２２３８、Ｓ−２３６６、Ｓ
−２８４６などが使用できる。合成基質の濃度として
は、合成基質の種類により異なり、検体の希釈系列を測
定したときに湾曲を生じない濃度で、更に、測定感度が
極端に低下しない濃度であれば、いずれの濃度でも使用
できる。例えば、Ｓ−２７７２では、０．５mM以上、特
に０．５〜５．０mMとすることが好ましい。
に制限されないが、例えばクロモジェニックス社製の合
成基質、ＦＸａでは、Ｓ−２２２２、Ｓ−２３３７、Ｓ
−２７３２、Ｓ−２７６５、Ｓ−２７６７、Ｓ−２７７
２、Ｓ−２７８２、Ｓ−２７８７などが使用できる。ま
た、トロンビンでは、Ｓ−２２３８、Ｓ−２３６６、Ｓ
−２８４６などが使用できる。合成基質の濃度として
は、合成基質の種類により異なり、検体の希釈系列を測
定したときに湾曲を生じない濃度で、更に、測定感度が
極端に低下しない濃度であれば、いずれの濃度でも使用
できる。例えば、Ｓ−２７７２では、０．５mM以上、特
に０．５〜５．０mMとすることが好ましい。
【００１６】本発明の好ましい実施態様としては、まず
ＦＸａ又はトロンビンを適当な緩衝液に溶解し、これに
血漿等の検体を加え、反応させ、次いでアルギニン又は
上記オリゴペプチドと合成基質を含有する液を加え、吸
光度の変化を測定し、検体中のＡＴIII量を定量する方
法が挙げられる。なおアルギニン又はオリゴペプチドの
添加時は、前記した様にこれに限られない。
ＦＸａ又はトロンビンを適当な緩衝液に溶解し、これに
血漿等の検体を加え、反応させ、次いでアルギニン又は
上記オリゴペプチドと合成基質を含有する液を加え、吸
光度の変化を測定し、検体中のＡＴIII量を定量する方
法が挙げられる。なおアルギニン又はオリゴペプチドの
添加時は、前記した様にこれに限られない。
【００１７】
【発明の効果】本発明によれば、検体を希釈することな
く高い測定精度を維持しながらＡＴIIIを測定すること
ができる。また、本発明は操作性に優れ、簡便かつ迅速
にＡＴIIIを測定でき、特に自動分析装置に好適に使用
することができる。
く高い測定精度を維持しながらＡＴIIIを測定すること
ができる。また、本発明は操作性に優れ、簡便かつ迅速
にＡＴIIIを測定でき、特に自動分析装置に好適に使用
することができる。
【００１８】
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を更に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００１９】実施例１ 下記組成の第１試薬１８０μｌに、所定量のＡＴIIIを
含む血漿検体３μｌを加え、５分間３７℃で反応させ、
次いで下記組成の第２試薬１８０μｌを添加後、１分間
３７℃で反応させ、２％クエン酸９００μｌを添加し、
反応を停止させ、波長４０５nmで吸光度を測定した。本
実施例では、第２試薬液にＡｒｇ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ、Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
−Ｔｈｒ又はＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ
−Ｓｅｒを１００mM添加し、pHを７．４に調整した後使
用した。この時の切片及び感度を表１に示す。
含む血漿検体３μｌを加え、５分間３７℃で反応させ、
次いで下記組成の第２試薬１８０μｌを添加後、１分間
３７℃で反応させ、２％クエン酸９００μｌを添加し、
反応を停止させ、波長４０５nmで吸光度を測定した。本
実施例では、第２試薬液にＡｒｇ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ、Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
−Ｔｈｒ又はＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ
−Ｓｅｒを１００mM添加し、pHを７．４に調整した後使
用した。この時の切片及び感度を表１に示す。
【００２０】第１試薬 牛ＦＸａ ９．８nkat／ml ヘパリン ４IU／ml 50mMトリス・塩酸緩衝液 （pH７．４）
【００２１】第２試薬 Ｓ−２７７２ ２．３mM （アセチル−Ｄ−アルギニル−グリシル−Ｌ−アルギニ
ル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩） 100mMアルギニン・ＨＣｌ又はオリゴペプチド・ＮａＯ
Ｈ緩衝液（pH７．４）
ル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩） 100mMアルギニン・ＨＣｌ又はオリゴペプチド・ＮａＯ
Ｈ緩衝液（pH７．４）
【００２２】
【表１】
【００２３】本結果から明らかなように、アルギニン又
は上記のオリゴペプチドを反応系中に添加することで、
切片及び感度を低下させることができた。なお、切片は
ＡＴIII濃度が０％の時の吸光度、感度は切片からＡＴI
II濃度が１００％の時の吸光度を減じた値を示す。
は上記のオリゴペプチドを反応系中に添加することで、
切片及び感度を低下させることができた。なお、切片は
ＡＴIII濃度が０％の時の吸光度、感度は切片からＡＴI
II濃度が１００％の時の吸光度を減じた値を示す。
【００２４】実施例２ 下記組成の第１試薬５３０μｌに、所定量のＡＴIIIを
含む血漿検体２μｌを加え、１分間３７℃で反応させ、
次いで下記組成の第２試薬５３０μｌを添加後、１分間
３７℃で反応させ、２％クエン酸２６５０μｌを添加
し、反応を停止させ、波長４０５nmで吸光度を測定し
た。本実施例では、第２試薬にＡｒｇ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ
又はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇを１００mM添加
し、pHを７．４に調整した後使用した。この時の切片及
び感度を表２に示す。
含む血漿検体２μｌを加え、１分間３７℃で反応させ、
次いで下記組成の第２試薬５３０μｌを添加後、１分間
３７℃で反応させ、２％クエン酸２６５０μｌを添加
し、反応を停止させ、波長４０５nmで吸光度を測定し
た。本実施例では、第２試薬にＡｒｇ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ
又はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇを１００mM添加
し、pHを７．４に調整した後使用した。この時の切片及
び感度を表２に示す。
【００２５】第１試薬 牛トロンビン ２．２nkat／ml ヘパリン ４IU／ml 50mMトリス・塩酸緩衝液 （pH７．４）
【００２６】第２試薬 Ｓ−２３６６ ２．５mM （Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニル
−ｐ−ニトロアニリド・塩酸塩） 100mMアルギニン・ＨＣｌ又はオリゴペプチド・ＮａＯ
Ｈ緩衝液（pH７．４）
−ｐ−ニトロアニリド・塩酸塩） 100mMアルギニン・ＨＣｌ又はオリゴペプチド・ＮａＯ
Ｈ緩衝液（pH７．４）
【００２７】
【表２】
【００２８】本結果から明らかなように、アルギニン又
は上記のオリゴペプチドを反応系中に添加することで、
切片及び感度を低下させることができた。なお、切片Ａ
ＴIII濃度が０％の時の吸光度、感度は切片からＡＴIII
濃度が１００％の時の吸光度を減じた値を示す。
は上記のオリゴペプチドを反応系中に添加することで、
切片及び感度を低下させることができた。なお、切片Ａ
ＴIII濃度が０％の時の吸光度、感度は切片からＡＴIII
濃度が１００％の時の吸光度を減じた値を示す。
【００２９】実施例３ 下記組成の第１試薬１８０μｌに、所定量のＡＴIIIを
含む血漿検体３μｌを加え、５分間３７℃で反応させ、
次いで下記組成の第２試薬１８０μｌを添加後、波長４
０５nmで１分間当たりの吸光度の変化量を測定し、検体
中のＡＴIII量（活性：％）と吸光度の変化量を求め
た。本実施例では、第２試薬にアルギニンを１００mM添
加し、pHを７．４に調整した後、日立７１５０の自動分
析装置にて、０〜１７５％濃度のＡＴIII検体の希釈系
列を測定した（ｎ＝２測定）。この時の切片及び感度を
表３に示す。また、検体の希釈系列を測定した時のデー
タを図１、２に示す。
含む血漿検体３μｌを加え、５分間３７℃で反応させ、
次いで下記組成の第２試薬１８０μｌを添加後、波長４
０５nmで１分間当たりの吸光度の変化量を測定し、検体
中のＡＴIII量（活性：％）と吸光度の変化量を求め
た。本実施例では、第２試薬にアルギニンを１００mM添
加し、pHを７．４に調整した後、日立７１５０の自動分
析装置にて、０〜１７５％濃度のＡＴIII検体の希釈系
列を測定した（ｎ＝２測定）。この時の切片及び感度を
表３に示す。また、検体の希釈系列を測定した時のデー
タを図１、２に示す。
【００３０】第１試薬 ＦＸａ ９．８nkat／ml ヘパリン ４IU／ml 50mMトリス・塩酸緩衝液 （pH７．４）
【００３１】第２試薬 Ｓ−２７７２ １．３mM （アセチル−Ｄ−アルギニル−グリシル−Ｌ−アルギニ
ル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩） 100mMアルギニン・塩酸緩衝液（pH７．４）
ル−ｐ−ニトロアニリド・二塩酸塩） 100mMアルギニン・塩酸緩衝液（pH７．４）
【００３２】
【表３】
【００３３】本結果から明らかなように、感度の低下が
認められるものの良好な希釈系列が得られた。なお、切
片はＡＴIII濃度が０％の時の吸光度変化量、感度は切
片からＡＴIII濃度が１００％の時の吸光度変化量を減
じた値を示す。
認められるものの良好な希釈系列が得られた。なお、切
片はＡＴIII濃度が０％の時の吸光度変化量、感度は切
片からＡＴIII濃度が１００％の時の吸光度変化量を減
じた値を示す。
【図１】アルギニン無添加の場合の検体の希釈系列を示
す図である。
す図である。
【図２】アルギニン添加の場合の検体の希釈系列を示す
図である。
図である。
Claims (1)
- 【請求項１】 被検体中のアンチトロンビンIIIに酵素
を反応させて残存酵素活性を合成基質法で測定するアン
チトロンビンIIIの測定法において、反応系にアルギニ
ン又はアルギニンを含む２〜６個のアミノ酸からなるオ
リゴペプチドを添加することを特徴とするアンチトロン
ビンIIIの測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04428099A JP4311796B2 (ja) | 1999-02-23 | 1999-02-23 | アンチトロンビンｉｉｉの測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04428099A JP4311796B2 (ja) | 1999-02-23 | 1999-02-23 | アンチトロンビンｉｉｉの測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000236898A true JP2000236898A (ja) | 2000-09-05 |
| JP4311796B2 JP4311796B2 (ja) | 2009-08-12 |
Family
ID=12687107
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04428099A Expired - Fee Related JP4311796B2 (ja) | 1999-02-23 | 1999-02-23 | アンチトロンビンｉｉｉの測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4311796B2 (ja) |
-
1999
- 1999-02-23 JP JP04428099A patent/JP4311796B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
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|---|---|
| JP4311796B2 (ja) | 2009-08-12 |
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