ES2312503T3 - Sistema de prueba para la determinacion de proteasas de la hemostasia que son in-vivo--activas o de la tripsina o de la subtilisina en fluidos biologicos. - Google Patents
Sistema de prueba para la determinacion de proteasas de la hemostasia que son in-vivo--activas o de la tripsina o de la subtilisina en fluidos biologicos. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para determinar la in-vivo-actividad de proteasas de la hemostasia o de la tripsina o de la subtilisina en un líquido biológico, que se caracteriza por lo tanto, que el líquido biológico se incuba con al menos un sustrato cromogénico o fluorogénico para por lo menos una proteasa de la hemostasia o para la tripsina y/o para la subtilisina y que se añade antes de o junto con la adición del sustrato cromogénico o fluorogénico al menos un anticoagulante del grupo EDTA, EGTA, arginina, guanidina y generador de oxígeno singlete.
Description
Sistema de prueba para la determinación de
proteasas de la hemostasia que son
in-vivo-activas o de la tripsina o de la
subtilisina en fluidos biológicos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento global basándose en péptido-sustratos
para la determinación de proteasas de la hemostasia que son
in-vivo-activas o de la tripsina o de la
subtilisina en fluidos biológicos, que en particular se puede
utilizar para determinar la
in-vivo-activación de la hemostasia, en
particular la in-vivo-activación de la
coagulación (GACA) de fluidos biológicos o para diagnosticar una
pancreatitis y/o el grado de severidad de una pancreatitis.
Hemostasia es el sistema de generación y la
degradación de trombóticos, es decir, la hemostasia comprende la
coagulación de la sangre y la fibrinolisis. Normalmente, las enzimas
de la hemostasia se encuentran en la sangre principalmente en una
forma inactiva, sólo una muy pequeña parte de las respectivas
enzimas de la hemostasia, que son principalmente las proteasas de
serina, se encuentran in-vivo en una forma
activa, es decir, hay un pequeño grado de
in-vivo-activación de la hemostasia en la
sangre del organismo sano. Sin embargo, un aumento de la
in-vivo-activación de la hemostasia es
fisiopatológicamente de gran importancia en la patogénesis de
muchas enfermedades. En consecuencia, en una
in-vivo-activación de la hemostasia que es
patológicamente aumentada (como en la coagulación intravascular
diseminada (DIC)) más enzimas de la hemostasia se encuentran en
forma activa. La determinación de estos enzimas de la hemostasis que
son activas in-vivo, es decir, la
determinación del grado de in-vivo-activación
de la hemostasia, es de gran importancia médica para el diagnóstico
de enfermedades, que están vinculadas a un cambio
in-vivo de la activación de la
hemostasia.
Si bien existen pruebas globales para la
determinación de la hemostasia desde hace muchos años (por ejemplo,
el tiempo de protrombina (PT), el tiempo activado de tromboplastina
parcial (APTT), tiempo de trombina (TT), Kher et al. (1997)
Haemostasis 27 (5): 211- 8), no hay ninguna prueba global simple,
que mide la in-vivo-activación de
la hemostasia. Las pruebas habituales de la hemostasia, tales como
APTT, PT, TT no detectan la
in-vivo-activación de la hemostasia; en
cambio, en estas pruebas una activación de la hemostasia es
inducida in-vitro, es decir, miden la
capacidad de la hemostasia y no la
in-vivo-activación de la hemostasia.
Las pruebas que son disponibles al momento para
la detección de la activación de la hemostasia sólo permiten
conclusiones indirectas respectivo la
in-vivo-activación de la hemostasia. Con un
grupo de estas pruebas la actividad de pro-enzimas
de la hemostasia (los llamados zimogenas) se determina; estos
pro-enzimas, por regla general, tienen que ser
convertidas en las proteasas, por lo cual sólo la
in-vitro actividad de las enzimas de la
hemostasia se detecta en muestras. En otro grupo de estas pruebas
marcadores de activación de la hemostasia se determinan con
adiciones suntuosas de proteínas, sobre todo con anticuerpos o
proteínas recombinantes. Ambos grupos de tests dependen de una
multitud de influencias que pueden falsificar el
in-vivo-estado de activación de la
hemostasia, y resultan en conclusiones falsas. Por lo tanto, incluso
a corto tiempo de almacenamiento de las muestras puede cambiarse,
en particular puede ampliarse la actividad de las
\hbox{enzimas
de la hemostasia y una conclusión al
in-vivo -estado es prácticamente
imposible.}
Pruebas de acuerdo con el estado de la técnica
son las pruebas de una parte de Dímero-D,
Trombina-Antitrombina-Complejo,
Prothrombina-Fragmento F1+2 o Factor XIIa o al otro
lado de fibrina soluble o Factor VIIa (Stief (2000) Thromb Haemost
84: 1120 -1; MacCallum et al. (2000) Thromb Haemost 83 (3):
421-6; Bos et al. (1999) Thromb
Haemost 81 (3): 467-8; Cardigan et al.
(1998) BloodCoagul Fibrinolisis 9 (4): 323-32).
Estas pruebas son muy complicadas, requieren la adición de
proteínas específicas, y permiten sólo una conclusión indirecta
respectiva la in-vivo-actividad
de las principales enzimas de la coagulación, es decir, la trombina
(factor IIa) y/o el factor Xa y/o de otras proteasas de la
hemostasia.
De DE-A-19904674
se conoce un método para la determinación de la concentración de
inhibidores de la trombina. El
DE-A-19940389 describe inhibidores
selectivos del urokinasa-activador del plasminógeno.
DE-A-19756773 describe un nuevo
método de diagnóstico y agente para el diagnóstico de la
hemostasia.
En Thrombosis Research Vol. 97, Nº 4, pp.
231-7 (2000) se publica un ensayo de cribado de
ciertos parámetros de la fibrinólisis.
Ninguna de estas publicaciones describe la
presencia de las principales enzimas de la coagulación (trombina
y/o factor Xa) en forma activa in-vivo. Los
sistemas que se describen en estas publicaciones usan la presencia
de factores de la hemostasia, que se activan en el procedimiento de
detección o describen la fibrinolisis y no la coagulación.
Estas pruebas son muy suntuosas, basan en la
adición y/o el uso de proteínas caras (por un lado anticuerpos o al
otro lado proteínas puras de la hemostasia) y permiten sólo
parcialmente conclusiones respectivas a la
in-vivo-activación de la hemostasia. Por lo
tanto, el rendimiento de los métodos descritos no es muy económico
y estos métodos no miden el estado global de la
in-vivo-activación de la hemostasia, en
particular, no la situación global de la
in-vivo-activación de la coagulación, pero
sólo determinan un aspecto parcial de la activación de la
hemostasia.
Sustratos de péptidos cromogénicos y/o
fluorogénicos se utilizan de acuerdo con el estado de la técnica
para medir la actividad de los inhibidores de la coagulación, tales
como anti-thrombinas y/o heparinoidas en la sangre
o para medir la capacidad de la hemostasia (activación de la
hemostasia que es inducida in-vitro).
Hasta ahora no se sabia, que hay una suficiente
in-vivo-actividad de las enzimas de la
hemostasia en la sangre, que permite una detección directa de la
actividad de estas enzimas por medio de sustratos cromogénicos y/o
fluorogenicos que pueden ser degradados por enzimas de la
hemostasia. La invención se basa en la realización, que un grado
bajo de activación del sistema de la hemostasia humana es
fisiológico. Sin embargo, esta
in-vivo-activación es muy pequeña y hasta
ahora no ha sido utilizada para determinar el grado de activación de
la hemostasia.
Además de la determinación de la
in-vivo-activación de la hemostasis, es de
especial interés como una nueva posibilidad de aplicación para el
diagnóstico de una sepsis y/o una pancreatitis y/o para la
clasificación de la severidad de una pancreatitis. En particular,
no hay ninguna prueba clínica-química disponible
para la clasificación de la severidad de una pancreatitis (estado
de la técnica: Kylänpää-Back ML et al. JOP. Journal oft the
Pancreas (online) 2002, 3: 34-48).
En la pancreatitis la
serina-proteasa tripsina se encuentra en la sangre
de los pacientes. Por la determinación de tripsina que es
in-vivo-activa es posible, obtener
información sobre el grado de la severidad de la pancreatitis.
Con la presente invención se presenta por
primera vez un sistema de prueba, que determina la
in-vivo-actividad de proteasas de la
hemostasia o de la tripsina o de la subtilisina, en particular la
in-vivo-activación de la hemostasia o
tripsina o subtilisina que es in-vivo-activa,
tanto en condiciones de muestras normales y en muestras de
pacientes.
De particular importancia es la detección en
corto tiempo de condiciones hipercoagulabilas, porque son o podrían
convertirse en una amenaza para la vida. La prueba del sistema de
acuerdo con la invención permite por primera vez, el diagnóstico de
trombofilia y de coagulación intravascular diseminada (coagulopatía
de consumo) en un tiempo temprano.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un procedimiento para la determinación de proteasas que
son in-vivo-activas, de preferencia de
proteasas de serina o de la tripsina o de la subtilisina que son
in-vivo-activas, en fluidos biológicos,
particularmente en sangre o en plasma de la sangre. Con esta
información el grado de la
in-vivo-activación de la hemostasia o el
grado de la severidad de la pancreatitis o de la septicemia puede
ser evaluado.
Sorprendentemente, se descubrió ahora, que la
in-vivo-actividad de proteasas,
particularmente la in-vivo-actividad de
proteasas de serina puede ser determinada globalmente por incubación
de fluidos biológicos con sustratos cromogénicos o fluorogenicos
para enzimas de coagulación.
Objeto de la presente invención, por lo tanto,
es un método según reivindicación 1 para determinar la
in-vivo-actividad de proteasas de la
hemostasia o de la tripsina y/o de la subtilisina, de
preferencia para determinar la
in-vivo-actividad de las proteasas de serina
en fluidos biológicos, que se caracteriza por lo tanto, que el
líquido biológico después de tomar se incuba con al menos un
sustrato cromogénico o fluorogénico, de preferencia un
péptido-sustrato, para por lo menos una proteasa de
la hemostasia o para tripsina o para subtilisina, preferido una
proteasa de serina, en particular, por lo menos para una enzima de
la hemostasia o para la tripsina y/o para la subtilisina, y antes de
la adición del sustrato cromogénico, se añade al menos un
anticoagulante del grupo de EDTA, EGTA, arginina, guanidina, y
generador de oxígeno singlete.
Objeto de la presente invención es, además, un
sistema de prueba para la determinación de la
in-vivo-actividad de proteasas de la
hemostasia o de tripsina o de subtilisina que son
in-vivo-activas, preferido una proteasa de
serina, en fluidos biológicos, que se caracteriza por lo tanto, que
el sistema de prueba comprende un sustrato fluorogénico o
cromogénico para por lo menos una proteasa de serina, en particular
para por lo menos una enzima de la hemostasia o para la tripsina
y/o para la subtilisina.
El objeto de la invención es además el uso de
este sistema de prueba, en particular el uso de sustratos
cromogénicos o fluorogénicos para por lo menos una enzima de la
hemostasia para determinar la
in-vivo-activación de la hemostasia en
fluidos biológicos o el uso de sustratos cromogénicos o
fluorogénicos para tripsina y/o para subtilisina para determinar la
in-vivo-actividad de la tripsina y/o de la
subtilisina en fluidos biológicos.
Objeto de la presente invención es además un
agente de diagnóstico para la determinación de la
in-vivo-activación de la hemostasia o para
la determinación de la tripsina y/o de la subtilisina que son
in-vivo-activas en fluidos biológicos, que
contenga al menos un sustrato cromogénico o fluorogénico para por lo
menos una enzima de la hemostasia y/o que contenga al menos un
sustrato cromogénico o fluorogénico para la tripsina y/o para la
subtilisina y que contenga opcionalmente más aditivos.
Fluidos biológicos en el sentido de la presente
invención son todo tipo de fluidos del cuerpo que se derivan de las
células de cuerpo, como las culturas de células, que son, por
ejemplo, derivados de las células endoteliales, fluidos de
compartimientos, y preferiblemente sangre y/o plasma, en particular,
EDTA-sangre, EDTA-plasma,
EDTA/arginina-sangre o
EDTA/arginina-plasma.
Material de muestra para la determinación de la
activación de la hemostasia según el estado de la técnica es
sangre con citrato y/o plasma con citrato. Las muestras que se
complementan con otros anticoagulantes, como
EDTA-sangre y/o EDTA-plasma o
EDTA/arginina-sangre y/o
EDTA/arginina-plasma hasta ahora ha no se han
utilizado para este propósito.
El procedimiento de acuerdo con la invención se
realiza con sangre o plasma que se han complementado con
anticoagulantes, como generadores de oxígeno singlete, tales como
cloraminas, en particular chloramine-T®
(N-cloro-toluoene-sulfonamida),
EDTA, EGTA, arginina y/o guanidina y, opcionalmente, también
heparina.
Sorprendentemente ocurrió, que
EDTA-sangre y EDTA-plasma, o
EDTA/arginina-sangre y
EDTA/arginina-plasma, respectivamente, son
especialmente adecuados, a fin de determinar la
in-vivo-activación de la hemostasia o la
tripsina o la subtilisina que son
in-vivo-activas, respectivamente. En lugar de
EDTA o de arginina también se puede utilizar guanidina o
chloramine-T® o una combinación de estas sustancias,
con o sin EDTA.
Preferiblemente, EDTA y/o arginina y/o guanidina
o chloramine-T® ya se añaden en el momento de la
toma de muestras de sangre. Objeto de la presente invención es
además un método para diagnosticar la
in-vivo-activación de la hemostasia o la
tripsina y/o subtilisina que son
in-vivo-activas en un líquido biológico,
dónde como líquido biológico se utiliza EDTA-sangre
o EDTA-plasma, arginina-sangre o
arginina-plasma o
EDTA/arginina-sangre o
EDTA-arginina-plasma.
El procedimiento de acuerdo con la invención
para determinar la in-vivo-activación de la
hemostasia o in-vivo-activa tripsina y/o
in-vivo-activa subtilisina se caracteriza
por lo tanto, que es un procedimiento muy sencillo, preciso y muy
económico para determinar la
in-vivo-activación de la hemostasia o la
in-vivo-actividad de la tripsina y/o de la
subtilisina, que permite la investigación de muestras de sangre de
una gran cantidad de pacientes dentro de muy poco tiempo.
Con el procedimiento de acuerdo con la invención
los CV-valores (coeficientes de variación) son sin
problemas menos del 5%, mientras que los tests conocidos y
anteriormente descritos de detección de enzimas activas de la
hemostasia tienen CV-valores de más del 10%.
Los valores de la activación de la hemostasia o
de la tripsina activa y/o subtilisina activa, respectivamente, que
pueden ser determinados de acuerdo con la invención, son
particularmente la activación de la coagulación sin corrección
(uGACA) y la activación corregida de la coagulación (GACA), según el
cual "GACA" significa "Global Assay of
in-vivo Coagulation Activation".
Basándose en el valor uGACA, en particular, se puede determinar la
activación de la coagulación (GACA), que es corregida por la
capacidad de la fase de contacto (CPC).
De acuerdo con la invención el procedimiento
para determinar el valor GACA se realiza de tal manera, que el
líquido biológico después de tomar se mezcla con un buffer, en su
caso, con un anticoagulante y con más aditivos, y con un sustrato
cromogénico o fluorogénico, y posteriormente esta mezcla se incuba.
Se ha dado como resultado, que el procedimiento de acuerdo con la
invención de una norma general deberá ser realizado en
concentraciones finales de sustrato \leq 2 mmol/l
(respectivamente \leq 2 mM) y/o en cantidades de sustrato de
\leq 3 nmoles/\mul de la
muestra).
muestra).
El uso de mayores concentraciones y/o cantidades
de sustrato puede resultar en una activación no deseada de
pro-enzimas de la hemostasia. El límite inferior de
la concentración de sustrato determina la sensibilidad deseada de
la prueba. La concentración y/o la cantidad necesaria en el caso
dado puede ser determinada por el experto mediante la utilización
de los esquemas de los ejemplos.
Preferiblemente se utilizan concentraciones
finales de sustrato de 0,05 a 1 mM y/o cantidades de sustrato de
\leq 1,5 nmoles/\mul de la muestra, en particular de 0,05 a 0,8
mM, y sobre todo, preferiblemente de 0,5 a 0,6 mM.
En el rango inferior a 1 mM, en particular de
0,5 - 0,6 mM, la determinación de uGACA corresponde aproximadamente
al valor GACA, mientras que las proteasas inespecíficas son activas
principalmente a mayores concentraciones de sustrato. Sólo con
concentraciones de sustrato \geq 1 mM es recomendable, como una
regla, corregir el uGACA obtenido por el CPC.
El aumento de absorbancia, de fluorescencia, y/o
de extinción durante el tiempo de incubación de la muestra se puede
determinar con un espectrómetro y/o espectroscopio. En lugar de
esto, también un nivel basal y un nivel final de absorbancia, de
fluorescencia, y/o de extinción puede ser determinado.
La determinación de fluorescencia, extinción y/o
absorción se realiza preferentemente en una longitud definida de
onda, que se caracteriza por el cromóforo del sustrato cromogénico o
fluorogénico, sobre todo en una longitud de onda, en la que esta
resultando después de la escisión de sustrato por el enzima de la
coagulación una fluorescencia, extinción y/o absorbancia
significante, es decir un cambio que es espectroscópicamente y/o
espectrometricamente detectable. Estos valores son absolutos para la
activación de la coagulación (uGACA).
El período de incubación de acuerdo con la
invención es entre 0,5 y 180 minutos a una temperatura entre 30 y
50ºC, particularmente preferido a una temperatura entre 37 y 45ºC,
especialmente preferido a 37ºC o entre 40 y
45ºC.
45ºC.
Si se usa una incubación a 37ºC, el período de
incubación es preferentemente de 0,5 a 120 minutos, con 42 y 45ºC,
el período de incubación es preferentemente de 0,5 a 60 minutos.
Para determinar el valor GACA en %, los valores
medidos de absorbancia/fluorescencia de las muestras se comparan
con un valor puesto en 100% de la población normal. Por lo tanto,
los valores de activación de la coagulación de un estándar o de
muestras de individuos sanos son determinados y se calcula el valor
medio (= 100%). El resultado obtenido para la muestra del paciente
se expresa en porcentaje del 100% normal-estándar
(como en Standard human plasma ® y/o control plasma N®,
DadeBehring).
Dado que especialmente
pro-enzimas de la fase del contacto de la hemostasia
también degradan amidolíticamente el sustrato cromogénico
utilizado, el obtenido valor GACA sin corrección, en su caso, debe
ser corregido por la capacidad de la fase de contacto (CPC) de la
muestra. Esto es determinado de preferencia en un procedimiento de
un paso o de dos pasos (ver ejemplos). Para determinar la
1-paso-CPC, el líquido
biológico se mezcla con un buffer, si procede, un anticoagulante y
más aditivos, un sustrato cromogénico o fluorogénico y un activador
de la fase de contacto. Posteriormente, la mezcla se incuba,
preferiblemente a una temperatura de entre 15 y 37ºC,
preferentemente inferior a 30 minutos, especialmente preferido entre
0,1 y 10 minutos, en particular entre 0,2 a 2 minutos (a 37ºC).
La determinación de absorción, fluorescencia y/o
extinción se produce aquí como se describe en el procedimiento para
determinar el valor uGACA. Los valores para la capacidad de la fase
de contacto en donantes sanos se miden, y entonces un valor medio
(100%) se calcula. El valor obtenido para las muestras de pacientes
se expresa en porcentaje del valor 100% de donantes sanos = 100%
normal-estándar (como en Standard Human Plasma ® y/o
Control Plasma N®) Como activador de la fase de contacto de acuerdo
con la invención de preferencia se utiliza caolín, ácido elagico, o
especialmente SiO_{2}.
Caolín es utilizado preferentemente en una
concentración de prueba entre 0,1 y 4 g/l, especialmente
preferido en una concentración de prueba entre 0,2 y 2 g/l,
en particular en 0,8 g/l.
Ácido elágico se utiliza de preferencia en una
concentración entre 0,01 y 0,3 g/l, particularmente preferido
entre 0,02 y 0,2 g/l, especialmente en 0,075 g/l.
Como SiO_{2} - reactivo se puede utilizar
Pathromtin SL® (DadeBehring, Marburg, Alemania), diluido 1:2 a
1:16 veces en el ensayo, especialmente preferido 1:3 a 1:8 veces
diluido en el ensayo, en particular, diluido 1:4 veces.
Sorprendentemente, se ha encontrado, que la
administración adicional del activador de la phase de contacto
puede ser omitido, si para la determinación de la CPC se utiliza un
sustrato cromogénico, cuyo grupo final sirve como un activador de
contacto. Ejemplos para tales sustratos para las enzimas de la
hemostasia son sustratos con grupos
methoxy-sulfonas o acetilas, tales como
CH_{3}SO_{2}-D-CHG-Gly-Arg-pNA\cdotAcOH,
Pefachrome®FIXa (PEFA-3107; Pentapharm, Basilea,
Suiza).
El valor de GACA y de la CPC se determinan de
preferencia de acuerdo con la invención por medir la absorción,
fluorescencia y/o extinción a una cierta longitud de onda que es
característica para el cromóforo y/o el fluoróforo del sustrato
cromogénico y/o fluorogénico.
Por lo tanto, el procedimiento de acuerdo con la
invención incluye particularmente preferido los siguientes pasos de
procedimiento:
a) Determinación de la activación de la
hemostasia en muestras de pacientes mediante la adición de un
sustrato cromogénico y/o fluorogénico a cada muestra o a un
estándar, respectivamente; determinación espectroscópica y/o
espectrométrica del cambio de absorbancia, fluorescencia y/o
extinción de la muestra en al menos una longitud definida de onda;
el cálculo del valor uGACA por comparación de muestras de pacientes
con una estándar-muestra conocida (plasma o enzima
pura (por ejemplo, factor Xa o trombina)) y expresión en por ciento
del valor medio de donantes sanos.
b) Determinación de la CPC en forma analógica
como la determinación de uGACA, con la excepción de que también un
activador de fase de contacto se añade a las muestras, y
c) Determinación del valor GACA corregido en
función de la CPC, por sustracción de CPC de uGACA y adición de
100%.
En el rango inferior a 1 mM, en particular entre
0,05 - 0,8 mM, especialmente preferido 0,5 - 0,6 mM, la
determinación de uGACA corresponde aproximadamente al valor final
GACA, mientras que las proteasas inespecíficas como una regla son
activas en concentraciones mas altas de sustrato. Sólo con
concentraciones de sustrato \geq 1 mM es recomendable, como una
regla, corregir el uGACA obtenido por la CPC.
Preferentemente, el sustrato utilizado se
disuelve en EDTA y/o arginina, de manera que está resultando un
concentración final en la prueba de EDTA de al menos
2,1 g/l y de arginina (con pH > 7) de al menos 250 mmol/l.
La muestra aquí es un fluido biológico; la
longitud definida de onda es una longitud característica de onda
para el cromóforo del sustrato cromogénico o fluorogénico.
El líquido biológico de acuerdo con la invención
es sangre o plasma de sangre, en particular preferido
EDTA-sangre o EDTA-plasma,
arginina-sangre o arginina-plasma o
EDTA/arginina-sangre o
EDTA/arginina-plasma.
Para realizar la prueba de acuerdo con la
invención el líquido biológico se mezcla con un buffer, en
particular buffer de fosfato-salina (PBS),
HCO_{3}^{-}, arginina, o Tris con un pH de
7-11, preferiblemente pH 7-9,
especialmente pH 7,4 para PBS, o pH 8,7 para arginina. Junto con el
buffer también otros anticoagulantes se pueden utilizar de acuerdo
con la invención, a fin de evitar la in-vitro
(es decir, artificial) activación de la hemostasia en el líquido
biológico durante la incubación del test de GACA, como, por ejemplo,
Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA), y Etilene Glycol - bis
(\beta-aminoethyl éter)
N,N,N',N'-Tetraacetic Acid (EGTA), arginina, sales
de guanidina, o generadores de oxígeno singlete, en particular del
tipo de las cloraminas.
En contraste con el uso de EDTA, donde la
adición de anticoagulantes no es absolutamente necesario, los
relativamente leves complejos de calcio con citrato como una norma
no son suficientes, para prevenir una
in-vitro activación adicional de la
hemostasia de plasma de sangre en el ensayo, de modo que aquí de
acuerdo con la invención se añaden más anticoagulantes. Por lo
tanto se utiliza de acuerdo con la invención, por ejemplo,
preferentemente EDTA, en una concentración de 0,8 a 2,4 mg/ml, en
particular de 1,6 mg/ml (4,4 mmol/l en sangre corresponden a cerca
de 8 mmol/l en plasma) para estabilizar la muestra de sangre. La
investigación de sangre con citrato requiere la adición de otro
anticoagulante en el ensayo: con plasma con citrato, como otro
anticoagulante según el invento EDTA puede ser utilizado,
preferentemente en concentraciones de ensayo entre
2-20 mmol/l, en particular 5-10
mmol/l, y/o arginina, preferentemente en una concentración de prueba
entre 50-500 mmol/l, especialmente
80-300 mmol/l, en particular preferido 250
mmol/l.
Los sustratos cromogénicos y/o fluorogénicos
para proteasas, en particular para las enzimas de la hemostasia o
para la tripsina y/o para la subtilisina son de acuerdo con la
invención péptidos con una secuencia de amino-ácidos, que puede
ser escindida amidolíticamente por enzimas de la hemostasis,
particularmente preferido por factor Xa y/o por trombina y/o por
otras proteasas de serina de hemostasia o por la tripsina y/o por
la subtilisina, respectivamente; los sustratos poseen un cromóforo,
el cual después de la división amidolítica de los sustratos por una
enzima de la hemostasia o por la tripsina y/o por la subtilisina,
respectivamente, está resultando en un cambio en la absorbancia y/o
en la fluorescencia en el espectro del cromóforo, que puede ser
detectado por espectroscopía o por
espectrometría.
espectrometría.
Preferentemente, estos sustratos comprenden de 2
a 10, en particular preferido de 2, 3, 4 o 5 aminoácidos. Los
aminoácidos también pueden ser no-proteinogénicos, o
derivados de aminoácidos que no existen naturalmente, o otros
compuestos orgánicos. Además, el sustrato puede ser modificado, por
ejemplo, por la ligadura de al menos un grupo de protección, por lo
menos un grupo marcando y/o por lo menos un compuesto orgánico. El
grupo cromogénico y/o fluorogénico es particularmente unido
covalentemente al aminoácido carboxi-terminal
del
sustrato.
sustrato.
Sustratos cromogénicos que son aptos según la
invención son por ejemplo sustratos para enzimas de hemostasia, que
poseen como cromóforo para nitroanilina (pNA), en particular,
sustratos para trombina y/o para factor Xa; por ejemplo, los
siguientes sustratos:
HD-CHG-Ala-Arg-pNA
\cdot 2AcOH, Pefachrome®TH (Pefa-5114),
Pentapharm, Basel, Suiza;
HD-CHA-Ala-Arg-pNA,
Instrumentation Laboratory (IL), Lexincton, EEUU;
HD-Ile-Phe-Pip-Arg-pNA
\cdot HCl
(HD-Phenylalanyl-L-pipecolyl-L-arginine-para
nitroanilide; S-2238®), Chromogenix, Mölndal,
Suecia;
HD-HHT-Gly-Arg-pNA;
HHT = Cyclohexyltyrosin; CHG = Cyclohexylglycin; CHA =
\beta-Cyclohexylalanin;
pNA = para-Nitroanilide; Pefachrome®FXIIa (Pefa-5963), Pentapharm.
pNA = para-Nitroanilide; Pefachrome®FXIIa (Pefa-5963), Pentapharm.
N-\alpha-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA\cdot2HCl
(S-2765®), Chromogenix, Mölndal, Suecia;
Bz-Ile-Glu(\gamma-OR)Gly-Arg-pNA\cdotHCl
(S-2222®), Chromogenix, Mölndal, Suecia;
HD-Ile-Pro-Arg-pNA
\cdot HCl (S-2288®), Chromogenix, Mölndal,
Suecia;
-CO-Ile-Glu-(\gamma-OR)-Gly-Arg-pNA
(FXa, Trypsin; S-2222 ®), Chromogenix;
HD-Val-Leu-Arg-pNA
(Kallikrein; S-2266®), Chromogenix;
D-Pro-Phe-Arg-pNA
(Kallikrein; S-2302®), Chromogenix.
Ejemplos de sustratos para subtilisina,
especialmente para el diagnóstico de una sepsis, son
Z-Gly-Gly-Leu-pNA,
Z-Ala-Ala-Leu-pNA,
Suc-Ala-Ala-Ala-pNA,
Suc-Ala-Ala-Phe-pNA,
y en particular,
Suc-Phe-Ala-Ala-Phe-pNA
(Bachem, Heidelberg, Alemania).
Tripsina como una proteasa de serina de amplio
espectro ataca en particular sustratos cromogénicos y/o
fluorogénicos con una posición final de un aminoácido básico -(en
particular lisina o arginina)- que es ligado al cromóforo.
Para la determinación de la CPC sustratos
adicionales pueden ser utilizados, que son especialmente escindidos
por pro-enzimas de la fase de contacto. Estos son,
por ejemplo
CH_{3}SO_{2}-D-CHA-Abu-Arg-pNA
Pefa IXa
(CH_{3}SO_{2}-D-CHG-Gly-Arg-pNA)
Pefa VIIa
(CH_{3}SO_{2}-D-CHA-But-Arg-pNA)
Pefa Xa
(CH_{3}OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA)
Estos sustratos se caracterizan por lo tanto,
que están escindidos por los enzimas de fase de contacto incluso en
presencia de arginina (incluso en concentraciones > 100 mM).
Según la invención el procedimiento se realiza
por ejemplo de tal manera, que para la determinación de uGACA 100
\mul EDTA-plasma se incuban con 50 \mul 3 mmol/l
péptido-sustrato durante 0,5-120 min
a 37ºC o durante la mitad del tiempo a 40-45ºC. El
aumento de la extinción a 405 nm se determina. El resultado de la
determinación [A] se compara con un estándar conocido (por ejemplo,
un 100% normal-estándar de plasma humano o enzima
puro (6 mUI/ml de trombina o 45 pkat/ml FXa)) y se expresa en %. El
valor normal de uGACA es 100\pm50% (valor medio \pm 2
desviaciones estándar de un colectivo normal).
Para la determinación de la capacidad de la fase
de contacto 100 \mul de muestra a continuación, se incuban con 50
\mul de sustrato cromogénico y 50 \mul de un activador de
contacto (por ejemplo, caolín 2,4 g/l (Pathromtin®, DadeBehring,
Marburg, Alemania), ácido elágico 0,3 g/l (Neothromtin®,
DadeBehring) o SiO_{2} (PathromtinSL®, DadeBehring durante 4 min
a temperatura ambiente (RT). También aquí el resultado [B] se
compara con un 100% estándar normal de plasma humano y se expresa en
por ciento.
La fórmula de corrección para el cálculo del
valor GACA es en consecuencia:
GACA = A - B +
100%.
En una versión particularmente preferida del
procedimiento según la invención se utiliza una concentración final
de sustrato de menos de 1 mmol/l; en concentraciones finales de
sustrato inferiores a 0,8 mmol/l como regla general el valor uGACA
representa el valor GACA. La determinación de la CPC por lo tanto,
puede omitirse. Por lo tanto, una versión de GACA es de particular
importancia en que se incuban 100 \mul de muestra (por ejemplo,
plasma) con 50 \mul de 1,7 mmol/l péptido-sustrato
(como por ejemplo un sustrato de trombina, sobre todo
CHG-Ala-Arg-pNA) en
750 mmol/l arginina, pH 8.7, 6.4 g/l EDTA.
El valor normal de GACA es 100 + - 50% (valor
medio + - 2 desviaciones estándar de un colectivo normal).
La invención debe ser explicada por los
siguientes ejemplos, sin intención de limitar la idea de la
invención:
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El GACA se realiza aquí de la siguiente manera:
100 \mul de muestra (de preferencia de
EDTA-plasma) de a) n = 10 donantes normales y b) n
= 35 pacientes se mezclan con 50 \mul 3 mmol/l sustrato
cromogénico
HD-CHG-Ala-Arg-pNA
en PBS, pH 7.4, preferiblemente que contenga 15-30
mmol/l EDTA, en particular 20 mmol/l EDTA, en una placa de
microtitulación y se determinan la extinción basal a 405 nm por un
fotómetro que funciona con placas de microtitulación (Milenia, DPC,
Los Angeles, EE.UU.). Después de una incubación de 90 min a 37ºC, la
extinción a 405 nm se determina de nuevo y la diferencia respecto a
la extinción basal se calcula.
Resultado: El rango normal de GACA (valor medio
+- 2 desviaciones estándar (SD), calculado a partir de donantes
normales) es de 100 \pm 50%, es decir, la actividad uGACA normal
es de 254 \pm 116 mA/90 min (37ºC). Los pacientes tenían un valor
medio de uGACA de 471 \pm 154 mA/90 min (37ºC). Este valor uGACA
se calculó en % del plasma normal [A], el valor determinado fue
entonces 471/254 = 185%.
Además, la capacidad de la fase de contacto
(CPC) de los plasmas utilizados se determinó, para corregir el
valor obtenido de uGACA, es decir, para obtener un valor de GACA que
es independiente de la fase de contacto. Para esto, 100 \mul
muestra se incubaron con 50 \mul 3 mmol/l
HD-CHG-Ala-Arg-pNA
en PBS, pH 7,4, 20 mmol/l EDTA y 50 \mul Pathromtin SL®
(SiO_{2}; DadeBehring) por 5 min a temperatura ambiente (RT) en
una placa de microtitulación. El resultado de la CPC normal fue
1319 \pm 439 mA (= 100 \pm 33%)/5 min (RT) (los pacientes
tuvieron una CPC de 1339 \pm 442 mA/5 min (RT)). La CPC de cada
uno de los pacientes se ha calculado en % de actividad en
comparación con un 100% estándar (plasma normal). La actividad así
obtenida [B = CPC] se sustrae de la actividad [A = uGACA] y se
añade 100%, lo que está resultando en GACA, corregido por la fase de
contacto:
GACA = A -B +
100%
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Para optimizar el activador de la fase de
contacto en el CPC 100 \mul
- a)
- Neothromtin (0,6 g/l de ácido elágico (botellíta de 3 ml; DadeBehring disuelta en 1,5 ml de H_{2}O).
- b)
- Pathromtin (5 g/l Caolín, DadeBehring).
- c)
- Pathromtin SL (SiO_{2}, Dade Behring).
en 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32,
1:64, 1:128 dilución con H_{2}O o de control 100 \mul
H_{2}O fueron incubados con 100 \mul 1,5 mmol/l
HD-CHG-Ala-Arg-pNA
en PBS y con 100 \mul de plasma normal (con citrato) durante 4
min (RT). El aumento de extinción (405 nm)/4 min se
determinó.
Resultado: óptima actividad de proteasa se
produce a una concentración de prueba de 0,8 g/l (0,2 - 2 g/ l)
caolín (delta A = 2138 mA/4 min, por ejemplo, Pathromtin
DadeBehring, Marburg), 0,05 g/l (0,02 a 0,2 g/l) ácido elágico
(delta A = 1443 mA/4 min) y de 17% (8,5-50%)
concentración final de SiO_{2} como en Pathromtin SL® (delta A =
1375 mA/4 min).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos
3-19
En los siguientes ejemplos un Global Assay of
Coagulation Activation = GACA se describe.
\vskip1.000000\baselineskip
Los volúmenes del test pueden ser cambiados en
la misma proporción (es decir, por ejemplo, 200 \mul de muestra
+ 100 \mul de sustrato).
Muestra = plasma o sangre, sobre todo
- \bullet
- EDTA-plasma que fue estabilizado con arginina (2.6 ml EDTA-sangre + 300 \mul 1.5 M arginina).
- \bullet
- EDTA-plasma (no más viejo que 2 h).
- \bullet
- Plasma con citrato (no más viejo que 2 h).
- \bullet
- si procede, plasma con heparina.
Además se describe la
Contact-Phase-Capacity = CPC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
100 \mul EDTA-plasma normal
(pool de plasma normal) con 250 mM arginina, pH 8.7, o
EDTA-plasma normal, que fue suplementado con 120
mIU/ml trombina bovina (F IIa) y 30 min después con 250
mM arginina, pH 8.7 (= patho-plasma), y controles
de enzimas con 2 mIU/ml o 120 mIU/ml trombina bovina en 500 mM
arginina, 2% Haemaccel®, pH 8.7, se incubaron con 50 \mul
HD-CHG-Ala-Arg-pNA
en H_{2}O con concentraciones diferentes (0 - 6.67 mM
concentración final en el test) durante 2 h a 37ºC. Antes y después
de la incubación la extinción a 405 nm fue determinada. Resultado:
Tabla 1 demuestra las actividades de enzima (enz.-act.) de plasma
normal y de patho-plasma en dependencia de la
concentración final del sustrato cromogénico
HD-CHG-Ala-Arg-pNA.
\global\parskip0.900000\baselineskip
El cociente de las extinciones de
patho-plasma y plasma normal se aproximan al valor
de 1, si las concentraciones finales de sustrato son > 1.5 mM.
Lo más alto ese cociente es, lo más específico es el test para la
activación patológica de la hemostasia, que fue imitado aquí por
adición de 120 mUI/ml trombina bovina. Ese cociente alcanza valores
máximas a concentraciones finales de sustrato \leq 1 mM. Sin
embargo, el cambio máximo de extinción está bajando a
concentraciones bajas de sustrato, especialmente a concentraciones
de sustrato < 0.3 mM, quiere decir se produce agotamiento de
sustrato. Por eso la concentración final de sustrato en el GACA
debe ser entre 0.3 mM y 1.0 mM, preferiblemente entre 0.5 mM y 0.8
mM, particularmente a 0.56 mM. Con esta concentración final de
sustrato el test es muy específico para activación de hemostasia, y
consecuentemente la determinación de la CPC (enfoque B) puede ser
omitido, si procede. Por eso el valor de GACA representa el valor
de uGACA si la concentración final de sustrato es < 0.8 mM, es
decir GACA = enfoque A (sin corrección por enfoque B). Después de
la adición de trombina a EDTA-plasma 90% de trombina
es inactivada, en el GACA solamente el 10% de la actividad
enzimática agregada puede ser detectado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
1. EDTA-plasma normal con 250 mM
arginina, pH 8.7, y 2. EDTA-plasma normal que había
sido suplementado con 120 mUI/ml trombina bovina y 30 min después
con 250 mM arginina, pH 8.7, fueron incubados con 50 \mul
HD-CHG-Ala-Arg-pNA
(0 - 6.67 mM final) en H_{2}O; deltaA/3 h (37ºC) fue determinado
y los valores de 1. fueron sustraídos de los valores de 2. La
diferencia resultante representa la actividad de trombina en plasma
después de la adición de120 mUI/ml trombina (F IIa).
Resultado: la velocidad máxima del enzima es 800 mA/3 h, la
concentración de sustrato a velocidad que es 50% del máximo (valor
K_{m}) es 0.3 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Para determinar los cambios máximos (max.) de
extinción y el agotamiento del sustrato, los tiempos de incubación
de ejemplo 3 fueron aumentados a 24 h; delta A > 2000 mA está
resultando a concentraciones (conc.) finales de sustrato > 0.7
mM. Linearidad entre el tiempo de incubación y el cambio de la
extinción existe a aumentos de extinción hasta 1000 mA con una
concentración final de sustrato de 0.6 mM. Concentraciones de
sustrato <0.4 mM dan cambios máximos de extinción de < 1000
mA con una linearidad entre tiempo de incubación y cambio de
extinción de solamente < 500 mA (Tabla 2).
Ejemplo
6
Condiciones de incubación como en ejemplo 3;
pero aquí el plasma STA Preciclot I® (Roche) fue usado, suplementado
con 3.2 g/l EDTA. Como patho-plasma STA
Preciclot I® plasma con EDTA fue usado, que fue suplementado con
120 mUI/ml trombina y con 250 mM arginina. El sustrato cromogénico
HD-CHG-Ala-Arg-pNA
se encontró en 750 mM arginina, 6.4 g/l EDTA, pH 8.7. Así, la
concentración de arginina en el test fue 417 mM. El tiempo de
incubación fue 3 h (37ºC). Resultado: véase tabla 3. Incluso aquí
está resultando una concentración óptima final de sustrato de hasta
0,8 mM, preferido de 0,05 a 0.7 mM, particularmente 0.5 a 0.6 mM con
este enfoque de GACA (100 \mul muestra + 50 \mul sustrato).
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Ejemplo
7
El GACA fue realizado con 100 \mul trombina
bovina pura (0-18 mUI/ml; DadeBehring), con factor
Xa bovina pura (0-150 pkat/ml), o con un preparado
de
Factor-Eight-Inhibitor-Bypassing-Activity-concentrate
(0-2.6 unidades/ml; FEIBA®, Immuno, Vienna) en 500
mM arginina, 2% Hämaccel®, 0.1% Triton X 100® (sustrato aquí =
HD-CHG-Ala-Arg-pNA.
Muestras adicionales fueron Control Plasma N® (CPN, DadeBehring) o
CPN que había sido suplementado con FEIBA (0-2.6
unidades/ml). Incubaciones diferentes de 0 a 4 h fueron usados. El
cambio de extinción respectivo fue determinado. Resultado: aparece
una relación linear entre la concentración de trombina o de factor
Xa usado y el cambio de extinción. 6 mUI/ml IIa o 45 pkat/ml Xa dan
un cambio de extinción, que corresponde al cambio de plasma normal
(100% GACA). Así, el GACA puede ser calibrado y estandardizado con
un reagente de trombina pura o de factor Xa puro. CPN con 2.6
unidades/ml FEIBA tiene un valor de GACA de aproximadamente 200%,
es decir ese adición de FEIBA a CPN aumenta el valor de 100% GACA
por otro 100%. FEIBA pura en buffer tiene una actividad que es 10
veces más elevada, es decir en CPN 90% de FEIBA agregada es
inactivada.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
El GACA fue realizado con STA Preciclot I®-
plasma (100% GACA-actividad; Roche), que contenía
también 3.2 mg/ml EDTA, con STA Preciclot I®-plasma, que contenía
también 3.2 mg/ml EDTA y 60 mUI/ml trombina bovina, con un pool de
plasma con citrato de pacientes, que contenía también 3.2 mg/ml
EDTA, con este pool de plasma con citrato, que contenía también
3.2 mg/ml EDTA y 60 mUI/ml trombina y con un reagente de trombina
pura, que contenía 6 mUI/ml trombina en 500 mM arginina, 2%
Haemaccel®, 0.1% Triton X 100®, pH 8.7. Para eso, 100 \mul de
muestra fueron incubados con 50 \mul 1.7 mM
HD-CHG-Ala-Arg-pNA
en 750 mM arginina, 6.4 g/l EDTA, pH 7.5 a pH 11 durante 30 min. En
otros enfoques tanto el volumen de muestra como el volumen de
reagente fueron doblados. La temperatura de incubación fue 37ºC a
52ºC.
Resultado: una actividad máxima aparecía a 40ºC
a 43ºC con un aumento de extinción que fue aproximadamente dos
veces más alto que lo de 37ºC. Por eso, un aumento más alto de
absorbancia está resultando, si la temperatura de reacción es entre
37ºC y 49ºC, particularmente entre 40ºC y 43ºC. El óptimo de pH es
entre pH 8 y pH 9. Si se aumenta el volumen de muestra o el volumen
del reagente por 2 veces, está resultando un aumento por 2 veces de
la extinción (E) a causa del aumento de "d" (mezcla de reacción
que tiene que traspasar el rayo de luz emitido) en
E = \varepsilon \cdot c \cdot d (c = concentración).
E = \varepsilon \cdot c \cdot d (c = concentración).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
En n = 46 plasmas de pacientes y en CPN (en GACA
y en CPC 100% actividad) el tiempo de protrombina (PT), APTT,
fibrinógeno (fbgen) fueron determinados y el GACA (100 \mul
muestra o 100 \mul 6 mUI/ml trombina + 50 \mul 1.7 mM
HD-CHG-Ala-Arg-pNA
en 6.4 g/l EDTA, 750 mM arginina, pH 8.7; determinación de deltaA/t
(aquí t = 2 h y temperatura = 37ºC)) fue realizado. Los resultados
de los tests clásicos de coagulación PT, APTT, y fibrinógeno
fueron correlacionados con el valor GACA.
Resultado: los coeficientes de correlación (r)
fueron: r (PT/GACA) = 0.062; r (APTT/GACA) = 0.030; r (Fbgen/GACA)
= 0.337.
Así, el GACA siendo un test para la
in-vivo-activación de la coagulación no
correlaciona con los tests clásicos de coagulación (PT, APTT,
fbgen).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Control Plasma N® (DadeBehring), que había sido
suplementado con 3.2 mg/ml EDTA y CPN, que había sido suplementado
con 3.2 mg/ml EDTA y con 120 mUI/ml trombina bovina fueron incubados
durante 0-17 h a temperatura ambiente (RT) o fueron
congelados a -80ºC y descongelados a 37ºC y entonces el GACA fue
realizado (100 \mul muestra + 50 \mul 1.7 mM
HD-CHG-Ala-Arg-pNA
en 6.4 g/l EDTA, 750 mM arginina, pH 8.7).
Resultado: Congelando/descongelando a -80ºC/37ºC
no cambia el valor de GACA. La estabilidad de muestras, que no han
sido estabilizados por arginina es aproximadamente 2 h. Después, de
un lado nace in-vitro una actividad que es
como trombina y al otro lado la actividad de trombina está bajando
en el plasma que había sido suplementado con trombina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Las muestras de ejemplo 10 se completaron con 0
- 300 mm arginina, pH 8.7, fueron incubadas a 17 h (RT), y a
continuación el GACA se realizó (100 \mul de muestra + 50 \mul
de 1,7 mM
HD-CHG-Ala-Arg-pNA
en 6.4 g/l EDTA, 750 mM arginina, pH 8,7).
Resultado: el uso de más de 150 mM arginina,
preferentemente más de 200 mM arginina, especialmente de 250 mM
arginina está resultando en la estabilización de la muestra; los
valores originales (GACA-valores antes de 17 h de
incubación) pueden ser reproducidos, incluso después de 17 h
(RT).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
El CPC se realizó a la prueba de la siguiente
manera: a 100 \mul EDTA-plasma normal se han
añadido 50 \mul Pathromtin SL® (SiO_{2} con fosfolípidos;
DadeBehring). Después de un tiempo de activación de 2 min (RT) 50
\mul del GACA-sustrato (aquí: 1,7 mM
HD-CHG-Ala-Arg-pNA
en 750 mM arginina, 6,4 g/l EDTA, pH 8,7) se añadieron y el cambio
en extinción/tiempo de incubación (en mA/t) se determinó.
Resultado: aparece una relación lineal entre el
tiempo de incubación y el cambio en la extinción a 405 nm
(aproximadamente 35 mA/min).
Entonces el tiempo de la activación en la
2-paso-CPC se ha cambiado de 0 a 7,5
min (RT). Después de un tiempo de incubación de 0 a 16 min (RT) el
cambio en la extinción a 405 nm se determinó.
Resultado: el tiempo óptimo de activación a RT
es de 1,5 a 5 min, preferentemente de 2 a 4 min, en particular de
2,5 - 3 min (correspondiente a aproximadamente 1 min a 37ºC).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
El 2-paso-CPC se
realizó tal como se describe en el ejemplo 12, como una muestra
adicional se utilizó un reagente de trombina pura (1000 mUI/ml en
500 mM arginina, 2% Haemaccel® (polygelina), 0,1% Triton X 100 ®, pH
8,7).
Resultado: la actividad de enzima en la muestra
de plasma en el 2-paso-CPC
corresponde a 165 mUI/ml de trombina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
La CPC se realizó a la prueba como descrito en
ejemplo 12, sin embargo el plasma contenía cada vez más
(0-300 mM) cantidades de arginina, pH 8.7. El
sustrato fue 1,7 mM
HD-CHG-Ala-Arg-pNA
in aqua dest.
Resultado: a partir de concentraciones
plasmáticas de arginina por encima de 100 mM la
Pathromtin SL ® - CPC se redujo a 0% (en comparación con un plasma
normal sin arginina = 100%).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
100 \mul EDTA-plasma normal y
100 \mul EDTA-plasma normal, que se había
complementado con 120 mUI/ml de trombina bovina, fueron incubados
con 50 \mul
HD-CHG-Ala-Arg-pNA
en H_{2}O con concentraciones diferentes (0 - 1,5 mM
concentración final en la prueba) y con 50 \mul PathromtinSL®
durante 4 min a RT. El cambio en la extinción se determinó mediante
un fotómetro a 405 nm.
Resultado: la velocidad máxima de enzima es de
aproximadamente 650 mA/4min (RT). La mitad de la velocidad máxima
se produce a una concentración final de aproximadamente 0,4 mM
HD-CHG-Ala-Arg-pNA.
En este enfoque no existe ninguna diferencia entre
normal-plasma y patho-plasma, como
aparece en ejemplo en 3 o 6 (véase tabla 4).
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
16
100 \mul ControlPlasmaN® o 100 \mul 2.000
mUI/ml trombina bovina en 500 mM arginina, 2% Haemaccel
(polygelina)®, 0,1% Triton X 100®, pH 8.7 fueron incubados con 50 \mul 1,7 mM HD-CHG-Ala-Arg-pNA en H_{2}O y con 50 \mul PathromtinSL® (SiO_{2}) a RT (1-paso-CPC). La absorbancia a 405 nm se determinó mediante un fotómetro.
(polygelina)®, 0,1% Triton X 100®, pH 8.7 fueron incubados con 50 \mul 1,7 mM HD-CHG-Ala-Arg-pNA en H_{2}O y con 50 \mul PathromtinSL® (SiO_{2}) a RT (1-paso-CPC). La absorbancia a 405 nm se determinó mediante un fotómetro.
Resultado: después de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9, 10 min RT los aumentos de la extinción frente al valor de 0 min
fueron los siguientes:
0, 610, 940, 1076, 1174, 1234, 1292, 1318, 1334,
1356 mA.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
17
Para n = 22 plasmas con citrato de pacientes y
para el ControlPlasmaN®(CPN) los siguientes enfoques de CPC se
realizaron: 2-paso-enfoques A, B, C
y 1-paso- enfoques D, E, F.
- A)
- 50 \mul de plasma + 25 \mul Pathromtin SL® (SiO_{2}).
- B)
- 50 \mul de plasma + 25 \mul Pathromtin® (caolín, 2xdiluido con H_{2}O).
- C)
- 50 \mul de plasma + 25 \mul Neothromtin® (ácido elágico)
- 3 min RT tiempo de activación; + 25 \mul 1,7 mM HD-CHG-Ala-Arg-pNA, 750 mM arginina, 6,4 g/l EDTA, pH 8,7.
- D)
- 50 \mul de plasma + 25 \mul 1,7 mM CH_{3}SO_{2}-D-CHG-Gly-Arg-pNA.
- E)
- 50 \mul de plasma + 13 \mul 1,5 M arginina, pH 8.7, + 50 \mul 1,7 mM CH_{3}SO_{2}-D-CHG-Gly-Arg-pNA.
- F)
- 50 \mul de plasma + 25 \mul 1,7 mM HD-CHG-Ala-Arg-pNA en H_{2}O + 25 \mul Pathromtin SL®.
Determinación de deltaA a 405 nm (RT). Los
respectivos cambios en la extinción se correlacionaron entre sí.
Resultado:
PathromtinSL®-2-paso-CPC
correlacionó con Pathromtin
SL®-1-paso-CPC con r=0,798
(deltaA/13 min (RT) para el CPN en la
2-paso-CPC = 354 mA; deltaA/2 min
(RT) para el CPN = 547 mA, es decir, en la
1-paso-CPC se genera una 10x mayor
actividad que es similar a la trombina si se compara con la
2-paso-CPC; los valores
correspondientes para los enfoques B) y C) son aproximadamente 30% o
20% inferior, respectivamente.
PathromtinSL®-2-paso-CPC
correlacionó con
Pathromtin®-2-paso-CPC y con
Neothromtin®-®-2-paso-CPC con r =
0,602 y con
CH_{3}SO_{2}-D-CHG-Gly-Arg-pNA-1-paso-CPC
con r = 0,502. Una correlación algo negativa con r = - 0,533
resultó para la comparación de
PathromtinSL®-1-paso-CPC con
CH_{3}SO_{2}-D-CHG-Gly-Arg-pNA-1-paso-
CPC.
CPC.
1-paso-CPC con
CH_{3}SO_{2}-D-CHG-Gly-Arg-pNA
en presencia y en ausencia de arginina (aquí: 222 mM arginina
final, enfoque D versus enfoque E) correlacionaron con r =
0,768. Así pues, incluso en plasma estabilizado con arginina la
actividad amidolítica contra
CH_{3}SO_{2}-D-CHG-Gly-Arg-pNA
puede ser determinada con fiabilidad, lo que es válido para
sustratos cromogénicos con un grupo CH_{3}SO_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
18
Las extinciones propias de n = 290 plasmas con
citrato de pacientes se determinaron en una placa de microtitulación
(100 \mul volumen de la muestra).
Resultado: la extinción propia media fue 210,1
mA a 405 nm, la desviación estándar fue 72,3 mA. Por lo tanto, con
un 4-8x aumento de la capa (d) en la
micro-cubeta el tiempo de reacción necesario para
conseguir un aumento de la extinción de unos 300 mA puede reducirse
a 25% - 12,5%, respectivamente. Esto corresponde a un aumento en la
extinción de 300 mA/30 o 15 min (a 37ºC), respectivamente. Así, con
un fotómetro sensible, la actividad de GACA de un plasma normal es
10-30 mA/min. Plasmas con extinción propia alta
(> 200% del normal) se diluyen con 500 mM arginina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
19
GACA (100 \mul de muestra + 50 \mul
HD-CHG-Ala-Arg-pNA
en 6,4 g/l EDTA, 750 mM arginina, pH 8,7) y CPC (100 \mul de
muestra + 50 \mul 1,7 mM
HD-CHG-Ala-Arg-pNA,
6,4 g/l EDTA + 50 \mul PathromtinSL®) se realizó con
ControlPlasmaN®, STA Preciclot I®, STA Preciclot II ® y con un pool
de plasmas de pacientes en 10x-determinación.
Resultado: los
intra-ensayo-coeficientes de
variación (CV) para GACA y CPC son entre 1% y 4%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
20
25 \mul de plasma con citrato de un paciente
con pancreatitis, 25 \mul CPN®, 25 \mul 36 pkat/ml
factor Xa bovina en PBS, 0,1% Triton X 100® fueron incubados con
25 \mul de buffer de ensayo, que contenía 600 mM
NaHCO_{3}, pH 8,7 con 600 mM arginina y sin arginina, 25 \mul 25
mM chloramine-T®, 25 \mul 3 mM
N-\alpha-Z-D-Arg-Gly-
Arg-pNA\cdot2HCl (S-2765®;
Chromogenix, Mölndal, Suecia) y 25 \mul aprotinina (0, 2, 20,
200, 2000, 20000 KUI/ml) durante 50 min a 37ºC y el aumento de la
extinción a 405 nm durante este tiempo de incubación se determinó
con un fotómetro que funciona con placas de microtitulación.
Resultados: 25 \mul 0, 2, 20, 200, 2000, 20000
KUI/ml en presencia de arginina resultaron en aumentos de extinción
de 788, 778, 709, 685, 497, 259 mA, respectivamente, y en ausencia
de arginina los aumentos de extinción fueron 738, 733, 715, 531,
294, 103 mA, respectivamente. Los respectivos aumentos de extinción
en el CPN fueron 131, 133, 126, 126, 125, 123 mA en presencia de
arginina y 122, 134, 135, 108, 118, 124 mA en la ausencia de
arginina. Factor Xa puro - en contraste a la tripsina activa (como
otras proteasas de serina activas que interactúan con la
\alpha2-macroglobulina) - no es inhibida por la
aprotinina. Con el sistema de ensayo de acuerdo con la invención
tripsina activa en sangre puede ser detectada, un marcador para la
presencia y/o para la severidad de una pancreatitis.
\vskip1.000000\baselineskip
- A
- unidades de absorbencia
- Abu
- L-alfa-ácido aminobutírico
- Ala
- Alanina
- APTT
- tiempo activado de tromboplastina parcial
- Arg
- Arginina
- But
- Butilo
- Bz
- Benzoilo
- CHA
- \beta-Ciclohexilalanina
- CH_{3}CO
- Acetil
- CH_{3}OCO
- metoxicarbonil
- CH_{3}SO_{2}
- metilsulfonil
- CHG
- Cyclohexilglicina
- CPC
- capacidad de la fase de contacto
- CV
- Coeficiente de variación
- d
- longitud de la capa
- DIC
- coagulación intravascular diseminada
- E
- Extinción
- EDTA
- EtileneDiamineTetraacetic ácido
- EGTA
- EtileneGlicol-bis(\beta-aminoetilo éter) N,N,N',N'-Tetraacetic ácido
- Enz. act.
- Actividad de enzima
- F IIa
- Factor IIa, trombina
- Fbgen
- Fibrinógeno
- FEIBA
- Factor-Eight-Inhibidor-Bypassing-Activity
- GACA
- Global Assay of in-vivo Coagulation Activation
- Glu
- ácido glutámico
- Gly
- Glicina
- HHT
- Ciclohexiltirosina
- Ile
- Isoleucina
- KUI
- Unidades de Inhibición de Kallikreina
- Km
- Constante de Michaelis
- Leu
- Leucina
- Lys
- Lisina
- mA
- mili unidades de absorbancia
- mUI
- mili unidades internacionales
- mM
- mmol/l
- PBS
- tampón fosfato salino
- Phe
- Fenilalanina
- Pip
- ácido pipecolico
- Pro
- Prolina
- PT
- tiempo de protrombina
- pNA
- para-Nitroanilida
- Suc
- Succinil
- t
- tiempo
- TT
- tiempo de trombina
- uGACA
- GACA sin corrección
- Val
- Valina
Claims (12)
1. Procedimiento para determinar la
in-vivo-actividad de proteasas de la
hemostasia o de la tripsina o de la subtilisina en un líquido
biológico, que se caracteriza por lo tanto, que el líquido
biológico se incuba con al menos un sustrato cromogénico o
fluorogénico para por lo menos una proteasa de la hemostasia o para
la tripsina y/o para la subtilisina y que se añade antes de o junto
con la adición del sustrato cromogénico o fluorogénico al menos un
anticoagulante del grupo EDTA, EGTA, arginina, guanidina y generador
de oxígeno singlete.
2. Procedimiento para determinar la activación
corregida de la coagulación GACA que se caracteriza por lo
tanto, que la activación sin corrección de la coagulación uGACA se
determina mediante el procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 y el valor obtenido se corrige por la capacidad de
la fase de contacto.
3. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones antes mencionadas, que se caracteriza por lo
tanto, que el líquido biológico es un líquido de compartimento, es
sangre y/o es plasma.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado por lo tanto, que la sangre o el plasma es
EDTA-sangre, EDTA-plasma,
EDTA/arginina-sangre, o
EDTA/arginina-plasma,
EDTA/guanidina-sangre o
EDTA/guanidina-plasma,
EDTA/chloramineT-sangre o
EDTA/chloramineT-plasma.
5. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones antes mencionadas, que se caracteriza por lo
tanto, que el sustrato cromogénico o fluorogénico se utiliza en una
concentración de 0,05 a 1 mM, y/o en una cantidad de hasta 3
nmoles/\mul de la muestra.
6. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones antes mencionadas, que se caracteriza por lo
tanto, que el sustrato cromogénico o fluorogénico se usa en una
concentración de 0,5 a 0,6 mM y/o en una cantidad de hasta 1,5
nmol/\mul de la muestra.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende los siguientes pasos:
a) a la muestra que será analizada y al
estándar que contienen un líquido biológico, se añade al menos un
sustrato cromogénico y/o fluorogénico para por lo menos una enzima
de la hemostasia o para la tripsina y/o para la
subtilisina,
subtilisina,
b) se determina la absorción, fluorescencia, y/o
extinción de la muestra o del estándar así obtenidos en al menos
una longitud definida de onda,
c) se incuban la muestra o el estándar,
d) se determina de nuevo la absorción,
fluorescencia, y/o extinción de la muestra o del estándar en la
longitud definida de onda o el cambio de absorbancia, de la
fluorescencia y/o de la extinción de la muestra se mide durante la
incubación de la muestra o del estándar, respectivamente,
e) la activación de la hemostasia o la actividad
de la tripsina y/o de la subtilisina se determina como la
diferencia de los valores de la extinción según (b) y (d).
8. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende los siguientes pasos:
a) a la muestra que será analizada o al estándar
que contienen un líquido biológico, se añade al menos un sustrato
cromogénico y/o fluorogénico, para por lo menos una enzima de la
hemostasia junto con al menos un activador de la fase de
contacto,
b) se determina la absorción, fluorescencia, y/o
extinción de la muestra o del estándar así obtenidos en al menos una
longitud definida de onda,
c) se incuban la muestra o el estándar,
d) se determina de nuevo la absorción,
fluorescencia, y/o extinción de la muestra o del estándar en la
longitud definida de onda o el cambio de absorbancia, de la
fluorescencia y/o de la extinción de la muestra se mide durante la
incubación de la muestra o del estándar, respectivamente,
e) la activación de la hemostasia o la actividad
de la tripsina y/o de la subtilisina se determina como la
diferencia de los valores de la extinción según (b) y (d).
9. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones antes mencionadas, que se caracteriza por lo
tanto, que el sustrato cromogénico y/o fluorogénico tiene una
secuencia de aminoácidos que puede ser degradada por al menos una
enzima de la hemostasia.
10. Procedimiento de acuerdo a una de las
reivindicaciones antes mencionadas, que se caracteriza por lo
tanto, que el sustrato cromogénico y/o fluorogénico tiene una
secuencia de aminoácidos que puede ser degradada por factor Xa o
por trombina.
11. Un método según la reivindicación 9,
caracterizado por lo tanto, que el sustrato cromogénico es
un compuesto de un grupo que consiste de
HD-CHG-Ala-Arg-pNA\cdot2AcOH;
HD-CHA-Ala-Arg-pNA;
HD-Ile-Phe-Pip-Arg-pNA\cdotHCl;
HD-HHT-Gly-Arg-pNA;
N-alpha-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA\cdot2HCl;
HD-Ile-Pro-Arg-pNA\cdotHCl;
-CO-Ile-Glu-(\gamma-OR)-Gly-Arg-pNA;
HD-Val-Leu-Arg-pNA
Y
D-Pro-Arg-pNA.
12. Procedimiento de acuerdo con una de las
anteriores la reivindicaciones, caracterizado por lo tanto,
que se añade al fluido biológico antes de o junto con la adición
del sustrato cromogénico o fluorogénico un generador de oxígeno
singlete del grupo de las cloraminas.
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