JP2000093179A - Ｐｅｒに結合する蛋白質、該蛋白質をコードするＤＮＡ、該蛋白質を認識する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 哺乳類動物において、Ｐｅｒと結合する蛋白
質を取得すること。また該蛋白質をコードするＤＮＡお
よび該蛋白質を認識する抗体を提供すること。 【解決手段】 マウスＴｉｍＤＮＡ、該ＤＮＡがコード
する蛋白質および該蛋白質を認識する抗体を提供する。
また、該ＤＮＡとハイブリダイズするポリヌクレオチ
ド、該ポリヌクレオチドがコードする蛋白質を提供す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、サーカディアンリ
ズムに関する蛋白質であるマウスＰｅｒに結合する蛋白
質、該蛋白質をコードするＤＮＡならびに該蛋白質を認
識する抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】地球上のほとんど全ての生物は、外部か
らの時間情報が遮断された際にも、内因的周期で日々の
生命活動を行う。このリズムをサーカディアンリズム
（概日リズム）という。このサーカディアンリズムに関
する遺伝子として、ショウジョウバエでＰｅｒ遺伝子が
同定された。本明細書では、Ｐｅｒ遺伝子がコードする
蛋白質をＰｅｒという。細胞質内で発現されたＰｅｒは
核内へ移行してサーカディアンリズムの機能を発揮する
が、Ｐｅｒ単独では核内に移行できず、Ｐｅｒが核内に
移行するには、他の蛋白質と結合しなければならないと
考えられている。その蛋白質としてはＴｉｍが知られて
いる。

【０００３】マウスでは、サーカディアンリズムに関す
る遺伝子としてＰｅｒ１遺伝子、Ｐｅｒ２遺伝子および
Ｐｅｒ３遺伝子が知られているが、Ｔｉｍ遺伝子につい
ては報告がない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、哺乳類動物
において、Ｐｅｒと結合する蛋白質を取得することを課
題とする。また該蛋白質をコードするＤＮＡおよび該蛋
白質を認識する抗体を提供することを課題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ショウジョ
ウバエＴｉｍ遺伝子の塩基配列をもとにＥＳＴデータベ
ースを探索して該データベースからショウジョウバエＴ
ｉｍ遺伝子とホモロジーのある塩基配列を選び出した。
そして、該塩基配列の一部の塩基配列からなるプライマ
ーを作製した。そして、該プライマーを用いてマウス脳
ｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてそれぞれについてＰ
ＣＲを行うことでマウスにおけるＴｉｍＤＮＡ（マウス
ＴｉｍをコードするＤＮＡ、マウスＴｉｍＤＮＡ）を単
離し、その塩基配列を決定した。

【０００６】本発明は、前記のマウスＴｉｍＤＮＡを提
供するものである。

【０００７】また、本発明は、前記のマウスＴｉｍＤＮ
Ａとハイブリダイズするポリヌクレオチド（アンチセン
スポリヌクレオチドを含む）を提供するものである。

【０００８】また、本発明は、前記マウスＴｉｍＤＮＡ
がコードするアミノ酸配列からなるマウスＴｉｍを提供
するものである。

【０００９】また、本発明は、前記マウスＴｉｍＤＮＡ
とハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードする蛋
白質を提供するものである。

【００１０】また、本発明者は、前記マウスＴｉｍを認
識する抗体を提供するものである。

【００１１】

【発明の実施の形態】配列表の配列番号１に記載の塩基
配列からなる遺伝子のコード領域（配列表の配列番号１
に記載の塩基配列の２４４番目のＡから３８３４番目の
Ａまで）の全部または連続する１２以上の塩基からなる
一部をプローブとして用いて、目的とする哺乳類動物由
来のポリヌクレオチドライブラリーからマウスＴｉｍ遺
伝子とハイブリダイズするポリヌクレオチドを得ること
ができる。ポリヌクレオチドにはＤＮＡとＲＮＡがあ
る。本出願において、ポリヌクレオチドの鎖の数は特に
限定されない。配列番号１に記載の塩基配列からなるＤ
ＮＡにハイブリダイズするＤＮＡは、センス鎖、アンチ
センス鎖および両者からなる二本鎖すべてを含む。ＲＮ
Ａについては、センスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ
を含む。

【００１２】以下にオリゴヌクレオチドプローブを用い
た場合の例をあげて、ｃＤＮＡライブラリーから、マウ
スＴｉｍＤＮＡとハイブリダイズするｃＤＮＡを得る方
法について説明する。以下にあげる以外にも、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９８９年）等の成書を参考に
して条件を変更することは適宜可能である。 １）配列番号１に記載の塩基配列のコード領域からなる
ＤＮＡをＴａｋａｒａＭＥＧＡ ＬＡＢＥＬキット（登
録商標、宝酒造社製）を用いて取扱説明書の通りに標識
する。 ２）次に、下記の組成のＤＮＡ反応液を調製し、この液
を３７℃で３０分間インキュベートした後、７０℃で１
０分間熱処理し、酵素を失活させる。 ＤＮＡプローブ（２ｐｍｏｌ／μｌ） ２μｌ １０倍ホスホライレイション緩衝液 ２μｌ 〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰ（３７０ＭＢｑ／ｍｌ）（アマシャム製） ５μｌ Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ １μｌ 合計１０μｌ

【００１３】３）ＴＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ）で平衡化されたＳｅｐ
ｈａｄｅｘＧ−２５（登録商標、ファルマシア社製）を
１．５ｍｌポリプレップカラム（バイオラッド社製）に
ベッドボリュームが１ｍｌになるように詰め、２）で熱
処理をしたＤＮＡ反応液を該カラムに載せる。 ４）その後、２００μｌＴＥをカラムに４回流し、２回
目の２００μｌで溶出した画分から標識化ＤＮＡプロー
ブを得る。

【００１４】５）前記で得られた標識化ＤＮＡプローブ
画分のうち１５０μｌを、ニトロセルロース膜上に固定
したプラークのｃＤＮＡプローブ（ｃＤＮＡライブラリ
ーのニトロセルロース膜上への固定は、、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ第９
章９．３８ページないし９．４１ページに記載の方法に
したがって行える。）と以下の条件でハイブリダイズさ
せる。 プレハイブリダイゼーション ６×ＳＳＣ ５×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ ０．０５％ ピロリン酸ナトリウム １００μｇ／ｍｌ 変成ニシン精子ＤＮＡ ０．５％ＳＤＳ 総液量 ５０ｍｌ 反応温度３７℃ 反応時間１時間 ハイブリダイゼーション ６×ＳＳＣ １×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ ０．０５％ ピロリン酸ナトリウム １００μｇ／ｍｌ 変成ニシン精子ＤＮＡ １×１０⁶ ｃｐｍ／ｍｌ ｃＤＮＡプローブ 総液量５０ｍｌ 反応温度４２℃ 反応時間１８時間

【００１５】６）ハイブリダイズの終了したニトロセル
ロース膜を以下の条件で１回ずつ洗浄する。 ６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ ５００ｍｌ 温度４０℃ 時間２０分間 ３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ ５００ｍｌ 時間４２℃ 時間２０分間 ７）洗浄したニトロセルロース膜をＸ線フィルム（例え
ば、コダック社製ＸＡＲ５フィルム）に−８０℃で一晩
露光し、オートラジオグラフを撮影する。 ８）得られたオートラジオグラフから、陽性のプラーク
の位置を決定し、対応する寒天上のプラークをＳＭ溶液
に回収する。 ９）回収したプラークは、常法により再度ＮＺＹ寒天培
地上にプラーク形成を行わせ、ニトロセルロース膜上に
固定する。 １０）５）〜９）の過程を３回繰り返し、陽性のプラー
クは単一なものにする。該プラークを回収し、１００μ
ｌのＳＭ溶液に懸濁し、ファージを安定化させる。該プ
ラークから単離した遺伝子がマウスＴｉｍにハイブリダ
イズするｃＤＮＡである。

【００１６】３．マウスＴｉｍＤＮＡにハイブリダイズ
するｃＤＮＡの大量調製 １）ＳＭ溶液に懸濁したプラークのファージ５０μｌと
Ｙ１０９０ｒ−大腸菌２０μｌを混合し、３７℃、１５
分間放置する。 ２）その後、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１０
ｍｌＮＺＹ培地に１）で混合した溶液を移し、３７℃で
６時間培養する。 ３）８０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を回収す
る。 ４）該上清に、５Ｍ ＮａＣｌを１ｍｌ、ポリエチレン
グリコール６０００を１．１ｇを加え、溶かす。 ５）該溶液を氷上に１時間置き、その後１００００ｒｐ
ｍ、４℃で２０分間遠心分離を行う。 ６）沈殿を回収し、７００μｌのＳＭ溶液に懸濁する。 ７）クロロホルムを５００μｌ加えて撹拌し、残った大
腸菌を溶かす。 ８）５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、水層を回収
する。

【００１７】９）これに、１ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ
Ａ、５ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ（共にシグマ製）を各
１μｌずつ加え、３７℃で１時間放置したのち、２０％
ポリエチレングリコール６０００（０．８Ｍ ＮａＣ
ｌ）を６００μｌ加え、氷上に３０分間放置する。 １０）４℃で、１５０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し
た後、沈殿を回収する。 １１）この沈殿に５００μｌのＳＭ溶液、５０μｌの５
Ｍ ＮａＣｌ、５０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加え、
更に、４００μｌのフェノールを加えて撹拌し、ファー
ジを溶かしてｃＤＮＡを遊離させる。 １２）該溶液を室温で１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分
離した後、水層を回収する。これに１ｍｌのエタノール
を加え、１５０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し、液層
を捨てる。 １３）７０％エタノール１ｍｌで沈殿を洗浄し、１００
μｌのＴＥ溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０ １０
ｍＭ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に沈殿を溶かし、ＤＮＡ溶液
を得る。

【００１８】４．形質転換体の作製 実施例１の７．と同様にして前記で得たマウスＴｉｍＤ
ＮＡとハイブリダイズするｃＤＮＡを適当なベクター
（例えば、ｐＧＭＴベクター）に挿入した後、宿主（例
えば、大腸菌）に導入することで形質転換体を作製する
ことができる。

【００１９】前記のようにして得られたポリヌクレオチ
ドがコードする蛋白質は、マウスＴｉｍの主たる機能が
変化することなく、例えば、マウスＰｅｒとの結合能を
維持したままで、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸
配列における一または複数のアミノ酸が置換、欠失また
は付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質となることが
ある。このような蛋白質をＴｉｍ変異体という。

【００２０】Ｔｉｍ変異体がＰｅｒと結合することは以
下の方法により確認することができる。マウスＴｉｍ変
異体がマウスＰｅｒと結合することを確認する場合に
は、マウスＰｅｒ１を用いることが好ましい。 （１）ｉｎ ｖｉｔｒｏバインディング ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスレーションで、³⁵Ｓメチオニ
ンで標識したＴｉｍ変異体を発現させる。このＴｉｍ
を、ビーズに固定したＰｅｒと反応させた後、結合画分
にある蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動し、Ｔｉｍ変
異体のバンドが現れることを確認する方法。Ｐｅｒをビ
ーズに結合させずに、Ｔｉｍ変異体をＰｅｒと結合さ
せ、結合物にＰｅｒ抗体を反応させて免疫沈降させても
よい。また、抗体は、Ｔｉｍ変異体、Ｐｅｒ、導入した
タグを認識できるものであればよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏ
トランスレーションの代わりに大腸菌系、酵母系、バキ
ュロウィルス系でＴｉｍを発現させてもよい。また、Ｔ
ｉｍ変異体を標識する代わりにＰｅｒを標識してもよ
い。また、検出や免疫沈降のためにＴｉｍ変異体または
Ｐｅｒにタグを導入してもよい。

【００２１】（２）ｉｎ ｖｉｖｏバインディング Ｔｉｍ変異体およびＰｅｒの遺伝子を動物細胞中に導入
し、両者を該動物細胞内で発現させた後、抗体で免疫沈
降する方法。前記したように、Ｔｉｍ変異体またはＰｅ
ｒ変異体にタグを導入してもよい。また、抗体は、Ｔｉ
ｍ変異体、Ｐｅｒ、導入したタグを認識できるものであ
ればよい。

【００２２】（３）ツーハイブリッド法 酵母を用いた酵母ツーハイブリッド法も使用可能であ
る。酵母ツーハイブリッドスクリーニングは、クロンテ
ック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社のキットであるマッチメイ
カーツーハイブリッドシステム２（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥ
Ｒ（登録商標）Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ
２）（カタログ番号Ｋ１６０４−１）を用いて、添付の
マニュアルにしたがって行える。ベイトには、Ｔｉｍ変
異体またはＰｅｒのいずれを用いてもよい。

【００２３】本発明のＴｉｍ変異体のアミノ酸配列は、
該変異体をコードする遺伝子の塩基配列から決定するこ
とが可能である。例えば、市販のプログラム（例えば、
ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標、イーストマンケミカル
社製）を用いて可能である。

【００２４】遺伝暗号の縮重により、ポリヌクレオチド
から生産されたポリペプチドのアミノ酸配列を変えるこ
となく、該ポリヌクレオチドの塩基配列の少なくとも一
部の塩基を他の種類の塩基に置換することができる。し
たがって、本発明のＴｉｍをコードするポリヌクレオチ
ドとは、縮重の全てのパターンを含むものである。

【００２５】配列表の配列番号１に記載の塩基配列から
なるＤＮＡは、天然に存在するマウスＴｉｍＤＮＡであ
る。

【００２６】本発明は、前記したように、Ｔｉｍをコー
ドするポリヌクレオチドのアンチセンス鎖の塩基配列か
らなるアンチセンスポリヌクレオチドおよびその誘導体
を含むものである。アンチセンスポリヌクレオチドはポ
リヌクレオチドに含まれるものであるが、本明細書にお
いて、特にアンチセンス鎖の塩基配列からなるポリヌク
レオチドであることを明示する場合にアンチセンスポリ
ヌクレオチドという。該アンチセンスポリヌクレオチド
は、Ｔｉｍをコードするポリヌクレオチドにハイブリダ
イズすることが可能なものであり、それがハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドがコード領域のポリヌクレオチ
ドであれば該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチ
ドの生合成を阻害することが可能である。ポリペプチド
の生合成を阻害するためのアンチセンスポリヌクレオチ
ドは、１２塩基以上からなることが好ましい。一方、細
胞内に全長のアンチセンスポリヌクレオチドを取り込ま
せるのは、あまりに長くても不適である。細胞内にアン
チセンスポリヌクレオチドを取り込ませ、Ｔｉｍの生合
成を阻害させる場合、１２塩基以上３０塩基以下、好ま
しくは１５塩基以上２５塩基以下、より好ましくは１８
塩基以上２２塩基以下の塩基からなるアンチセンスポリ
ヌクレオチドを用いるのがよい。

【００２７】本発明のアンチセンスポリヌクレオチドま
たはその一部分は、塩基、リン酸、糖からなるヌクレオ
チドが複数結合したものが、天然には存在しないものを
含めて全て含まれる。代表的なものは、アンチセンスＤ
ＮＡとアンチセンスＲＮＡである。

【００２８】本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに
ついて、公知のアンチセンス技術を用いて、目的のＤＮ
ＡやｍＲＮＡとの結合力、組織選択制、細胞透過性、ヌ
クレアーゼ耐性、細胞内安定性の高い様々なアンチセン
スポリヌクレオチド誘導体が得られる。

【００２９】ハイブリダイズのし易さの点では、一般的
には、ステムループを形成している領域の塩基配列に相
補的な塩基配列を持つアンチセンスポリヌクレオチドま
たはその誘導体を設計するとよいとされている。本発明
のアンチセンスポリヌクレオチドおよびその誘導体は、
必要に応じ、ステムループを形成することが可能であ
る。

【００３０】また、翻訳開始コドン付近、リボソーム結
合部位、キャッピング部位、スプライス部位の配列に相
補的な配列を有するようなアンチセンスポリヌクレオチ
ドは、一般に高い発現抑制効果が期待できる。したがっ
て、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはその
誘導体であって、Ｔｉｍをコードする遺伝子またはｍＲ
ＮＡの翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、キャ
ッピング部位、スプライス部位の相補的な配列を含むも
のは、高い発現抑制効果が期待される。

【００３１】現在一般的に知られている誘導体は、ヌク
レアーゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少な
くとも一が高められた誘導体であることが好ましい。特
に好ましくは、フォスフォロチオエート結合を骨格構造
として有する誘導体である。本発明のポリヌクレオチド
およびその誘導体についても、これらの機能または構造
を有する誘導体が含まれる。

【００３２】天然型のアンチセンスポリヌクレオチドで
あれば、化学合成機を使用して合成したり、ＴｉｍＤＮ
Ａを鋳型とするＰＣＲ法により本発明のアンチセンスポ
リヌクレオチドを作製することができる。また、メチル
フォスフォネート型やフォスフォロチオエート型等、誘
導体の中には、化学合成できるものもある。この場合に
は、化学合成機に添付されている説明書にしたがって操
作を行い、得られた合成産物を逆相クロマトグラフィー
等を用いたＨＰＬＣ法により精製することによっても、
目的のアンチセンスポリヌクレオチドまたはその誘導体
を得ることができる。

【００３３】本発明のＴｉｍをコードするポリヌクレオ
チド、そのアンチセンスポリヌクレオチドまたはそれら
の一部（連続する１２塩基以上の塩基配列からなるポリ
ヌクレオチド）であるポリヌクレオチドをプローブとし
て、ｃＤＮＡライブラリー等からＴｉｍＤＮＡをスクリ
ーニングするためのプローブとして使用可能である。こ
のときＧＣ含有率が３０ないし７０％のものが好適に使
用可能である。また、連続する１５塩基以上の塩基配列
からなるポリヌクレオチドが特に好ましい。プローブと
して用いる該ポリヌクレオチドは誘導体であってもよ
い。通常、前記の塩基数以上の配列は特異性のある配列
であると認識されている。該プローブを用いたスクリー
ニングにおいて使用するｃＤＮＡライブラリーとして
は、ｍＲＮＡから作製されたものが好ましく使用でき
る。これらのｃＤＮＡライブラリーからランダムサンプ
リングにより選択された一群のｃＤＮＡを検索の試料と
することができる。また、市販のものでも使用可能であ
る。

【００３４】例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基
配列のうちの連続する１２塩基以上の塩基配列からなる
ＤＮＡまたは該ＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレ
オチド（アンチセンスポリヌクレオチド）、ｃＤＮＡラ
イブラリー等からＴｉｍＤＮＡをスクリーニングするた
めのプローブとして使用可能である。

【００３５】また、本発明のＴｉｍをコードするポリヌ
クレオチド、そのアンチセンスポリヌクレオチドまたは
それらの一部であるポリヌクレオチドをプローブとし
て、各組織由来のｍＲＮＡについてノーザンブロットハ
イブリダイゼーションを行うことにより、Ｔｉｍ遺伝子
由来のｍＲＮＡが発現している組織を見出すことが可能
である。

【００３６】ＤＮＡ又はＲＮＡを化学合成するときに、
側鎖をメチル化すること、あるいはビオチン化するこ
と、またはリン酸基部分のＯをＳ置換すること等の化学
的に修飾することはよく知られている。例えば、配列表
の配列番号２に記載のＤＮＡを化学合成するときに、該
化学修飾を行い、配列表に示されたＤＮＡそのものと異
なるものを合成することが可能である。また、ｃＤＮＡ
ライブラリーから取得されたｃＤＮＡであっても放射性
同位体で標識することも可能である。したがって、本発
明のＤＮＡ及びＲＮＡは、上記の化学修飾されたＤＮ
Ａ、ＲＮＡまたはアンチセンスポリヌクレオチドをその
範囲に含むものである。化学修飾されたＤＮＡまたはＲ
ＮＡは、蛋白質をコードする機能またはプローブとして
の機能をいずれも発揮可能なものであり、化学修飾され
たアンチセンスポリヌクレオチドは、プローブまたは蛋
白質の生合成を阻害する機能またはプローブとしての機
能をいずれも発揮可能なものである。

【００３７】プラスミドを大腸菌等の適当な宿主に導入
して、形質転換体を得ることは公知の方法により可能で
ある。本発明のＴｉｍＤＮＡを導入した形質転換体を培
養してＤＮＡの増幅または蛋白質の発現を行わせ、Ｔｉ
ｍまたはＴｉｍ変異体を作製させることが可能である。
次に作製物を回収し、必要に応じて濃縮、可溶化、透
析、各種クロマトグラフィー等の操作を行うことによ
り、本発明のＴｉｍまたはＴｉｍ変異体を精製すること
が可能である。

【００３８】形質転換体の培養については、各種の教科
書があり、本発明に記載の塩基配列に基づいてＴｉｍま
たはＴｉｍ変異体を作製させることは、公知の方法によ
り可能である。このとき、宿主としては、大腸菌等の細
菌、酵母、動物細胞のいずれも使用可能である。細胞に
遺伝子を導入するには、リポソーム法、エレクトロポー
レーション法等を用いることができる。

【００３９】得られた培養物からＴｉｍまたはＴｉｍ変
異体を精製する精製方法には、免疫沈降法、塩析法、限
外濾過法、等電点沈殿法、ゲル濾過法、電気泳動法、イ
オン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフ
ィー法や抗体クロマトグラフィー法等の各種アフィニテ
ィークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、
吸着クロマトグラフィー法および逆相クロマトグラフィ
ー法等があり、適宜選択して行えばよい。

【００４０】また、製造段階において、製造するＴｉｍ
またはＴｉｍ変異体は、他のポリペプチドとの融合ペプ
チドとして形質転換体に作製させてもよい。この場合
は、ＴｉｍまたはＴｉｍ変異体を切り出すことが可能で
ある。その場合、精製工程において、ブロムシアン等の
化学物質やプロテーゼ等の酵素で処理して、Ｔｉｍまた
はＴｉｍ変異体を切り出す操作を行えばよい。

【００４１】本発明のＴｉｍまたはＴｉｍ変異体を認識
する抗体（以下、Ｔｉｍ抗体ということがある）は、Ｔ
ｉｍをＴｉｍが由来する動物およびヒト以外の動物に免
疫感作することにより得られる抗体であって、該抗体が
本発明のＴｉｍを認識することがウェスタンブロット
法、ＥＬＩＳＡ法や免疫染色法（例えばＦＡＣＳ、組織
染色での測定）等により確認される抗体をその範囲内に
含む。

【００４２】また、免疫原として、蛋白質の一部であっ
ても該蛋白質の一部をウシ血清アルブミンなどの他のキ
ャリアー蛋白質に結合させたものを用いることは、よく
用いられる方法である。該蛋白質の一部は、例えばペプ
チド合成機を用いて合成してもよい。なお、蛋白質の一
部としては、８アミノ酸残基以上であることが好まし
い。免疫感作によってポリクローナル抗体が得られるな
らば、該免疫した動物のリンパ球を用いたハイブリドー
マによりモノクローナル抗体が産生されることはよく知
られている（『Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ』（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、
１９８８）Ｃｈａｐｔｅｒ６）。したがって本発明のＴ
ｉｍ抗体はモノクローナル抗体もその範囲内に含むもの
である。

【００４３】本発明においては、抗体は活性フラグメン
トをも包含するものである。活性フラグメントとは、抗
原抗体反応活性を有する抗体のフラグメントを意味し、
具体的には、Ｆ（ａｂ′）₂ 、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖ
などを挙げることができる。例えば、本発明の抗体をペ
プシンで分解するとＦ（ａｂ’）₂ が得られ、パパイン
で分解するとＦａｂが得られる。Ｆ（ａｂ’）₂ を２−
メルカプトエタノールなどの試薬で還元して、モノヨー
ド酢酸でアルキル化するとＦａｂ’が得られる。Ｆｖは
重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーで結合させた
一価の抗体活性フラグメントである。これらの活性フラ
グメントを保持し、その他の部分を他の動物のフラグメ
ントに置換することでキメラ抗体が得られる。

【００４４】Ｔｉｍの検出については、抗体を用いる方
法、酵素反応を利用する方法が挙げられる。抗体を用い
る方法としては具体的には、標識されたＴｉｍ抗体を
用いてＴｉｍを検出する方法、Ｔｉｍ抗体および該抗
体の標識二次抗体を用いてＴｉｍを検出する方法が挙げ
られる。標識としては、例えば放射性同位元素（Ｒ
Ｉ）、酵素、アビジン又はビオチン、もしくは蛍光物質
（ＦＩＴＣやローダミン等）が利用される。

【００４５】酵素反応を利用する方法としては、例え
ば、ＥＬＩＳＡ法、免疫凝集法、ウェスタンブロット
法、フローサイトメトリーを用いた免疫反応分子の同定
方法又はそれらに類似する方法が挙げられる。

【００４６】

【実施例】以下に実施例を挙げて、より詳細に本発明を
説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。

【００４７】＜実施例１＞ＴｉｍＤＮＡのクローニング Ｉ．ＥＳＴデータベースの検索 インターネットのＥＳＴデータベース（ｍＲＮＡの断片
の配列を登録してあるデータベース、ｈｔｔｐ：／／ｗ
ｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．／ｉ ｈｔ
ｍｌ）に登録された配列（ＥＳＴ）から、ショウジョウ
バエＴｉｍ遺伝子がコードするアミノ酸配列とホモロジ
ーのあるアミノ酸配列をコードする塩基配列を、インタ
ーネットのゲノムネットＷＷＷサーバー中のＴＢＬＡＳ
ＴＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｌａｓｔ．ｇｅｎｏｍ
ｅ．ａｄ．ｊｐ）を使用して、ｄｂＥＳＴから検索し
た。その結果、ＡＡ０７２８１４の番号で登録されてい
るＥＳＴ（マウスＤＮＡ）を抽出した。

【００４８】ＩＩ．マウスＴｉｍＤＮＡの単離および塩
基配列の決定 １．プライマーの合成 ＡＡ０７２８１４の塩基配列より以下の４種類のプライ
マーをＤＮＡ合成機（ＡＢＩ社製、モデル３９２）を使
用して作製した。 １）５’ＲＡＣＥ用プライマー Ｒ１：５’−ＧＣＴ ＣＣＡ ＡＣＡ ＴＴＴ ＴＧＡ
ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＴ ＧＧＧ−３’（配列表の配
列番号３に記載の塩基配列） Ｒ２：５’−ＧＣＣ ＡＧＧ ＡＡＴ ＡＧＴ ＴＣＴ
ＣＧＧ ＴＡＣ ＴＣＣ ＡＴＣ−３’（ネステッド
プライマー）（配列表の配列番号４に記載の塩基配列） ２）３’ＲＡＣＥ用プライマー ｆ１：５’−ＧＴＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＡＡＣ ＣＴＣ
ＡＣＣ ＡＡＣ ＴＡＣ ＴＡＣ−３’（配列表の配
列番号５に記載の塩基配列） ｆ２：５’−ＧＡＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＣＴＧ ＡＣＡ
ＧＡＣ ＣＧＣ ＡＡＧ ＧＡＧ−３’（ネステッド
プライマー）（配列表の配列番号６に記載の塩基配列） 合成したプライマーは、蒸留水で２０ｐｍｏｌ／μｌに
調製した。これをＰＣＲプライマーとして用いて、以下
のＰＣＲ操作を行った。

【００４９】２．ＰＣＲ（１） ｃＤＮＡライブラリーには、本発明者自らマウスの脳か
らｍＲＮＡを抽出してマラソン（登録商標）ｃＤＮＡア
ンプリフィケーションキット（クロンテック社製）を用
いてｃＤＮＡライブラリーとしたものを用いて、以下の
条件でＰＣＲを行った。プライマーとしてＲ１プライマ
ーのみを使用し、５’方向への一方向のみのＰＣＲを行
った。ＰＣＲ操作は、マラソン（登録商標）ｃＤＮＡア
ンプリフィケーションキット（クロンテック社製）を使
用して以下の条件で行った。９４℃に１分間おいた。次
いで「９４℃で３０秒間続いて６８℃で４分間」を２５
回繰り返した。次いで７２℃で１０分間反応させて、断
片の伸長反応を行いＰＣＲ操作を完了した。

【００５０】その後、前記で得たＰＣＲ産物を鋳型とし
て、Ｒ２プライマーを用いて２度目のＰＣＲ操作を行っ
た。２度目のＰＣＲ操作は、前記と同様に行った。

【００５１】３．塩基配列の決定（１） 前記で得た５’伸長反応によるＤＮＡ断片（以降、フラ
グメントＡということがある）をミニゲル電気泳動
（０．７５％アガロースゲル）させて、フラグメントＡ
のバンドをゲルから切り出した。ＧｅｎｅＣｌｅａｎ
（バイオ１０１社製）でフラグメントＡを回収して、ミ
ニゲル電気泳動でバンドをチェックした。

【００５２】フラグメントＡを１μｌ取り、９９μｌの
ＴＥにて希釈した。２６０ｎｍでの吸光度（Ａ２６０）
を測定し、ＤＮＡ濃度を計算した（Ａ２６０が１．０の
ときのＤＮＡ濃度を５０μｌ／ｍｌとした。）。ＤＮＡ
濃度が１μｇ／μｌになるようにＴＥでフラグメントＡ
を希釈した。この希釈液について、Ｔ７プライマーを用
いて、ダイターミネーター法により、オートシークエン
サー（ＡＢＩモデル３７３Ａ）を用いて、ＤＮＡシーク
エンスを行い、フラグメントＡの塩基配列を決定した。

【００５３】４．ＰＣＲ（２） ３’側への伸長反応を３．の５’側への伸長反応と同様
の手法を用いて行った。プライマーは、３’プライマー
としてｆ１プライマーのみを使用して前記と同様にして
ＰＣＲを行った。その後、前記で得たＰＣＲ産物を鋳型
として、ｆ２プライマーを用いて２度目のＰＣＲ操作を
行った。ＰＣＲ操作は、前記と同様に行った。

【００５４】５．塩基配列の決定 フラグメントＡとフラグメントＢの塩基配列から全長の
マウスＴｉｍＤＮＡの塩基配列を決定した。この塩基配
列を配列表の配列番号１に示す。フラグメントＡはこの
うちの１番目から１６９４番目までの塩基配列からな
り、フラグメントＢは１５０１番目から４５４２番目ま
での塩基配列からなるものであった。

【００５５】６．アミノ酸配列の決定 マウスＴｉｍの塩基配列より、マウスＴｉｍのアミノ酸
配列を決定した。このアミノ酸配列を配列表の配列番号
２に示す。マウスＴｉｍとショウジョウバエＴｉｍのホ
モロジーは、値が最大になるようにアライメントしたと
しても２０４／１１９６＝１７．１％と非常に低い値で
あった。

【００５６】７．形質転換体の作製 フラグメントＡおよびフラグメントＢをそれぞれ、両者
に共通のＢＳＳＨＩＩサイトで酵素切断し、配列表の配
列番号１の塩基配列の１５４０−１５４５番目でライゲ
ートし、全長のマウスＴｉｍ ｃＤＮＡを作製した。こ
のｃＤＮＡをｐＧＥＭＴイージー（プロメガ社製）ベク
ターに挿入し、大腸菌ＸＬ１０ゴールドに組み込んで形
質転換体を作製した。

【００５７】なお、ショウジョウバエＴｉｍ遺伝子とホ
モロジーを有するヒトＤＮＡとしては、ＡＡ４１７７４
５、ＡＡ１３４８８２、Ｗ８７７５１がＥＳＴデータベ
ースに登録されている。前記と同様にして、これらのＥ
ＳＴ（ヒトＤＮＡ）の塩基配列からプライマーを作製
し、市販のヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣ
Ｒにより、ヒトＴｉｍＤＮＡもクローニングすることが
できる。また、前記ＥＳＴの塩基配列からプローブを作
製し、ヒトｃＤＮＡライブラリーにハイブリダイズさせ
てヒトＴｉｍＤＮＡをクロニーニングすることも可能で
ある。なお、ｃＤＮＡライブラリーには、ヒト視床下部
マラソンｃＤＮＡ（クローンテック社製）を用いること
ができる。ＰＣＲ条件は、以下のものが好ましい。９５
℃に１０分間おく。次いで「９４℃で１５秒間続いて６
８℃で１分間」を２５回繰り返す。次いで７２℃で１０
分間反応させて、断片の伸長反応を行いＰＣＲ操作を完
了する。

【００５８】＜実施例２＞組み換え蛋白質の作製 １．プライマーの作製 マウスＴｉｍおよびマウスＰｅｒ１の塩基配列から下記
のプライマーをＤＮＡ合成機（ＡＢＩ社製、モデル３９
２）を使用して作製した。 ＦＬＡＧ−ＴｉｍＮ（Ｔｉｍの５’側プライマー、ＦＬ
ＡＧをタグとする）：５’−ＡＴＧ ＧＡＣ ＴＡＣ
ＡＡＧ ＧＡＣ ＧＡＣ ＧＡＴ ＧＡＣ ＡＡＡ Ｃ
ＡＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＴＴ
Ｇ ＧＡＣ ＴＴＧ ＴＡＣ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＡＣ
ＴＧＴ Ｇ−３’（配列表の配列番号７に記載の塩基
配列） ＴｉｍＣ（Ｔｉｍの３’側プライマー）：５’−ＴＣＡ
ＧＴＣ ＡＣＣ ＣＴＣ ＡＴＣ ＣＴＣ ＡＡＴ
ＣＴＧ−３’（配列表の配列番号８に記載の塩基配列） ＨＡ−Ｐｅｒ１Ｎ（Ｐｅｒ１の５’側プライマー、ＨＡ
をタグとする）：５’−ＡＴＧ ＣＴＧ ＴＡＴ ＣＣ
Ｔ ＴＡＴ ＧＡＣ ＧＴＧ ＣＣＴ ＧＡＣＴＡＴ
ＧＣＣ ＡＧＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＣＴＡ ＧＡＡ Ｇ
ＧＧ ＧＣＣＧＡＴ Ｇ−３’（配列表の配列番号９に
記載の塩基配列） Ｐｅｒ１Ｃ（Ｐｅｒ１の３’側プライマー）：５’−Ｃ
ＴＡ ＧＣＴ ＧＧＴＧＣＴ ＧＴＴ ＴＴＣ ＴＴＣ
ＴＧＣ−３’（配列表の配列番号１０に記載の塩基配
列）

【００５９】２．ＰＣＲ 全長のＴｉｍ遺伝子およびＰｅｒ１遺伝子を鋳型とし
て、前記のプライマーを使用してそれぞれＰＣＲを行っ
た。ＰＣＲはいずれも以下に示す条件で行った。全長の
Ｐｅｒ１遺伝子はマウス脳ｃＤＮＡライブラリーからＰ
ＣＲにより取得した。このときのプライマーは前記ＨＡ
−Ｐｅｒ１ＮプライマーからＨＡタグ部分をのぞいたプ
ライマー（５’−ＧＴ ＧＧＴ ＣＣＣ ＣＴＡ ＧＡ
Ａ ＧＧＧＧＣＣ ＧＡＴ Ｇ−３’）と前記Ｐｅｒ１
Ｃプライマーを使用した。 Ｍｇ²⁺ ５μｌ １０×ＬＡ ＰＣＲ緩衝液（Ｍｇ²⁺フリー） ５μｌ ｄＮＴＰ ８μｌ ５’側プライマー １μｌ ３’側プライマー １μｌ ＬＡ Ｔａｑ ０．５μｌ ＤＮＡ液 １μｌ 蒸留水 ２８．５μｌ 合計 ５０μｌ Ｍｇ²⁺、ＬＡ Ｔａｑ、ｄＮＴＰは、タカラ社からＬＡ
Ｔａｑとして購入した。ＰＣＲのサイクルは、９４℃
に１分間おいた後、「９８℃ １０秒間、続いて６８℃
１５分間」の３０回繰り返し、４℃にすることとし
た。

【００６０】３．ＤＮＡの回収 ＰＣＲ産物を０．７％アガロースゲルにて電気泳動し、
約４ｋｂに現れた目的のバンド部分のゲルを切り出し、
キアクイックゲル抽出キット（キアゲン社製）を使用し
て該ゲルからＤＮＡを回収した。

【００６１】４．プラスミドＤＮＡの作製 １）回収したＤＮＡをｐＴａｒｇｅＴベクター（プロメ
ガ社製）に導入して発現ベクターを構築した。導入の条
件は以下の通りとした。 ｐＴａｒｇｅＴベクター（６０ｎｇ／μｌ） １μｌ ＤＮＡ ７μｌ １０×緩衝液 １μｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ １μｌ 合計 １０μｌ ４℃で一晩反応させた。その後、この溶液をＪＭ１０９
コンピテントセル（タカラ社製）に５μｌ加え、氷上に
２０分間おいた後、続いて４２℃に４５秒間おき、続い
て氷上に３分間おいた。その後、ＳＯＣメディウムを４
５０μｌ加え、３７℃で１時間培養した。その後、ＬＢ
寒天培地（アンピシリンおよびＩＰＴＧ／Ｘｇａｌを含
む）に培養液を展開し、３７℃で一晩培養した。

【００６２】２）形成されたコロニーのうち、白色のコ
ロニーを２０ｍｌ ＬＢ培地（１００μｇ／ｍｌアンピ
シリン）に植え、３７℃で１６時間培養した ３）その後、１２０００ｒｐｍ、１分間遠心分離して集
菌し、Ｔｉｐ１００Ｍｉｄｉキット（キアゲン社製）を
使用してプラスミドＤＮＡ溶液を回収した。 ４）回収したＤＮＡをシークエンスキットおよび３７３
Ａシークエンサー（ともにＡＢＩ社製）を使用してシー
クエンスし、塩基配列を決定し、ＴｉｍＤＮＡおよびＰ
ｅｒ１ＤＮＡであることをそれぞれ確認した。

【００６３】５．動物細胞形質転換体の作製 トランスフェクションは以下の通りに行った。 １）前日にＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳで８０％コンフルエ
ントに培養していたＣＯＳ７細胞を、当日１０ないし３
０％コンフルエントになるように１７５ｃｍ²ボトル２
０本に植え接いだ。

【００６４】２）翌日、前記で作製したプラスミドＤＮ
ＡであるＦＬＡＧ−Ｔｉｍ／ｐＴａｒｇｅＴおよびＨＡ
−Ｐｅｒ１／ｐＴａｒｇｅＴを以下の手順でＣＯＳ７細
胞に導入した。 （１）ＦＬＡＧ−Ｔｉｍ／ｐＴａｒｇｅＴおよびＨＡ−
Ｐｅｒ１／ｐＴａｒｇｅＴそれぞれ１００μｇを１０ｍ
ｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ギブコ社製）に混合した（以下
１液という）。対照として、ｐＴａｒｇｅＴとＨＡ−Ｐ
ｅｒ１／ｐＴａｒｇｅＴを１００μｇずつ１０ｍｌのＯ
ｐｔｉ−ＭＥＭに混合した液（以下２液という）も用意
した。 （２）トランスフェクション試薬としてリポフェクトア
ミン１５００μｌを２０ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合
した。 （３）１液と（２）で調整したリポフェクトアミン液を
１０ｍｌずつ、また２液１０ｍｌと（２）で調整したリ
ポフェクトアミン液１０ｍｌずつを混合し、室温で４５
分間おいた。 （４）ボトルのＣＯＳ７細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ２０ｍ
ｌで洗浄することを２回繰り返した。 （５）ボトル１本当たり、（３）の混合液いずれか一方
２ｍｌとＯｐｔｉ−ＭＥＭ ３８ｍｌを混合したものを
加えた。 （６）ＣＯＳ７細胞を３７℃で８時間培養し、形質転換
体を得た。

【００６５】６．核抽出液の作製 （１）５．で得られた形質転換体の培養液の培地をＤＭ
ＥＭ−１０％ＦＣＳに交換し、３７℃で４８時間培養し
た。 （２）細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄した後、１０本のボ
トルから０．５ｍｌの細胞が得られた。以下、ＦＬＡＧ
−ＴｉｍＤＮＡを導入した細胞、対照の細胞についてそ
れぞれについて同じ操作を行った。 （３）（２）の細胞を２．５ｍｌの緩衝液Ａ（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ２．３、１０ｍＭ ＫＣｌ、
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭ β−ＭＥ、０．２
ｍＭ ＰＭＳＦ）に懸濁した後、２０００ｒｐｍで１０
分間遠心分離して細胞を回収した。以下の操作は４℃で
行った。 （４）１ｍｌの緩衝液Ａに細胞を懸濁し、ダウンス型ホ
モジナイザー（７ｍｌタイプルーズ型）で８０回ホモジ
ナイズした。

【００６６】（５）液をエッペンドルフチューブに移
し、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、ペレ
ットと上清を別々に回収した。 （６）ペレットに２５０μｌの緩衝液Ｃ１（２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．３、２０ｍＭ ＫＣｌ、
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２５
％ グリセロール、１０ｍＭ β−ＭＥ、０．２ｍＭ
ＰＭＳＦ）を加え懸濁した後、２５０μｌの緩衝液Ｃ２
（緩衝液Ｃ１にＫＣｌを１．２Ｍになるように加えたも
の）を加え、３０分間攪拌した。 （７）その後、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離
し、ペレットと上清を分離した。ペレットは−８０℃で
保存した。 （８）（７）の上清を、５００ｍｌの緩衝液（２５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨｐＨ７．９、６ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂ 、１０％グリセロール、０．１％ ＮＰ４０、０．
５ｍＭ ＤＴＴ、０．１Ｍ ＫＣｌ）に対して３回透析
を行った。得られた抽出液は−８０℃で保存した。この
核抽出液が組み換え蛋白質を含む液である。

【００６７】＜実施例３＞免疫沈降 ４℃で以下の操作を行った。 １．Ｍ２−アガロースの活性化 １）Ｍ２−アガロース（コダック社製）１ｍｌに１Ｍグ
リシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）２５０μｌを加え、室温
で５分間おいた。 ２）この液に、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
５００μｌを加え、２５００ｒｐｍで２分間遠心分離し
た後、上清を除去した。 ３）ペレットに０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）を加え、２５００ｒｐｍで２分間遠心分離した。 ４）ペレットを、ＩＰＢ（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯ
Ｈ ｐＨ７．９、６ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０％グリセロ
ール、０．１％ＮＰ４０、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．１
Ｍ ＫＣｌ）１２．５ｍｌに懸濁し平衡化した後、２５
００ｒｐｍで２分間遠心分離した。 ５）ペレットをＩＰＢ２ｍｌに懸濁した。

【００６８】２．免疫沈降 １）実施例２で調整した核抽出液を１ｍｇ分ずつ分注
し、ＩＰＢで２００μｌにメスアップした。 ２）各核抽出液に１で作製したＭ２−アガロース懸濁液
を１００μｌ加え、１時間攪拌した後、５０００ｒｐｍ
で３０秒間遠心分離し、上清を回収した。 ３）ペレットを１００μｌのＩＰＢで洗浄することを３
回繰り返した。 ４）ＦＬＡＧペプチド（コダック社製）をＩＰＢに０．
２ｍｇ／ｍｌに溶かした後、３）のペレットに１００μ
ｌ加え、１時間反応させ、Ｍ２−アガロースに結合した
ＦＬＡＧ−Ｔｉｍを溶出させた。 ５）反応液を５０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、上
清を回収した。

【００６９】３．ウェスタンブロッティング １）免疫沈降で回収した上清１００μｌに２×ＳＤＳサ
ンプル緩衝液を１００μｌ加えて混合し、９５℃で５分
間処理した。 ２）処理したものを４−２０％のポリアクリルアミド勾
配を有するＳＤＳ−ＰＡＧＥに１レーン当たり１５μｌ
アプライし、２５ｍＡで電気泳動した。対照として、核
抽出液、前記２．２）の操作で回収した上清（Ｍ２−ア
ガロースを分離した上清）も電気泳動した。それぞれ、
Ｔｉｍを導入した形質転換体のものとＴｉｍを導入しな
かった形質転換体のものを電気泳動した。 ３）電気泳動後、ゲルに展開された蛋白質をナイロンメ
ンブラン（イモビロンＰ（ミリポア社製））へウェスタ
ンブロッティングした。 ４）メンブランに転写された蛋白質について、抗ＦＬＡ
Ｇモノクローナル抗体（コダック社製）または抗ＨＡモ
ノクローナル抗体（バブコ社製）を反応させた。検出用
の二次抗体にはプロトブロットＩＩＡＰシステムマウス
用（プロメガ社製、メーカー品番：Ｗ３９５０）を用い
た。

【００７０】結果を図１に示す。図１（Ａ）は抗ＦＬＡ
Ｇモノクローナル抗体を反応させた結果であり、図１
（Ｂ）は抗ＨＡモノクローナル抗体を反応させた結果で
ある。レーン１はマーカー、レーン２はＰｅｒ１遺伝子
のみ導入した形質転換体の核抽出液、レーン３はＴｉｍ
遺伝子およびＰｅｒ１遺伝子を導入した形質転換体の核
抽出液、レーン４はＰｅｒ１遺伝子のみ導入した形質転
換体の核抽出液を免疫沈降させたペレットからＦＬＡＧ
ペプチドで溶出した上清、レーン５はＴｉｍ遺伝子およ
びＰｅｒ１遺伝子のみ導入した形質転換体の核抽出液を
免疫沈降させたペレットからＦＬＡＧペプチドで溶出し
た上清、レーン６はＰｅｒ１遺伝子のみ導入した形質転
換体の核抽出液を免疫沈降させた上清、レーン７はＰｅ
ｒ１遺伝子のみ導入した形質転換体の核抽出液を免疫沈
降させた上清、をそれぞれアプライしたレーンである。
図１（Ａ）ではレーン５に約１４０ｋＤの位置にＴｉｍ
のバンド（矢印Ｔで示す）が、図１（Ｂ）ではレーン５
に約１６０ｋＤの位置にＰｅｒ１のバンド（矢印Ｐで示
す）が観察され、ＴｉｍとＰｅｒ１とが結合することが
確認された。

【００７１】

【発明の効果】本発明のＴｉｍＤＮＡ、該ＤＮＡがコー
ドする蛋白質、該蛋白質を認識する抗体により、Ｐｅｒ
の核内への移行を調整することが可能である。これによ
り、サーカディアンリズムの解明およびそのリズムの異
常の調整が行える。また、サーカディアンリズムの異常
による障害の治療にも有効である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＴｉｍとＰｅｒ１をＣＯＳ７細胞に発現させて
免疫沈降した結果を示す電気泳動写真である。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Sumitomo Electric Industries,Ltd. <120> Per binding protein,DNA coding the protein and antibody recognizin g the protein <130> 098Y0416 <160> 10 <210> 1 <211> 4542 <212> DNA <213> Mus <400> 1 ctaccatcta ctctgcccct ggctgatata agaacaacac cattaacaag gtgtctctct 60 gnccntagat ttcagcggcc gctgaattct agctcagccg agtggcggga aaggctgcga 120 ccccgcacct cagggcctca ggctctgcga ggcttcagag gactcgcgga gagcggtccc 180 gtaggcctca ccctctccgt ccaccatctc tactgcccgc tctgctggtt gggcctctgg 240 tgt atg gac ttg tac atg atg aac tgt gaa ctt cta gcc acg tgt agc 288 gcc ctt ggg tac ttg gaa gga ggg act tac cac aag gag ccg gat tgc 336 ctg gag agt gtg aag gat ttg atc cga tac ctg agg cac gag gat gag 384 acc cga gat gtg cgg cag cag ctg gga gct gca cag atc ctg cag agc 432 gac ctc ctg cca atc ctc acg cag cat cgc cag gac aag cct ctc ttc 480 gat gcc gtg atc agg ctg atg gta aat ttg aca cag cca gcc ttg ctc 528 tgt ttt ggc agc gtg cct aag gac tcc agt gta cgg cac cat ttt ctg 576 cag gtt cta acg tac ctg 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1296 aac tgc tac aac ccg ctc atg ggc gcg gtc aag gat cat ctg ctt cgg 1344 gag aga gcg cag cag cat gac gag act tac tac atg tgg gca atg gct 1392 ttc ttc atg gcc ttc aac cga gct gcc acc ttc cgc ccc ggc ctt gtt 1440 tct gag acc ctc agt atc cgt acc ttt cac ttt gtg gag cag aac ctc 1488 acc aac tac tac gag atg atg ctg aca gac cgc aag gag gcc gcc tcc 1536 tgg gcg cgc agg atg cac ctg gcc ctg aag gcc tac cag gag ctg ctg 1584 gcc acg gtg aac gag atg gac atg tgc cca gat gag gct gtt agg gag 1632 agc agt cgt atc atc aaa aac aac att ttc tat atg atg gag tac cga 1680 gaa cta ttc ctg gcg ctc ttt cga aag ttt gat gag aga tac cat cca 1728 tgc tca ttc ctt cga gac ctg gtg gaa acc acc cac ctc ttc ctc aaa 1776 atg ttg gag cgc ttt tgc cgg agc cgc ggg aac ctg atg gtg cag aac 1824 aaa aga aaa aag agg aaa aag aaa aag aag gtt cag gac cag ggt gtt 1872 gct ttc tca caa agc ccc ggg gag ctg gag gcc atg tgg cca gcc ctg 1920 gca gag cag ctg ctg cag tgt gcc cag gac cct gag ctc agt gtg gac 1968 ccc gtc gtt ccc ttt gat gcg gtc tca gag gtg cca gtg gag gag cag 2016 cgg gta gaa gcc atg gtg agg atc caa gac tgc ctt acg gct ggc cag 2064 gcc ccg caa gcc ctg gcc ctc ctg cgg tct gcc cgg gaa gtg tgg cct 2112 gaa gga aat gcg ttt ggc tct cca gtc att tcc cca ggg gaa gaa atg 2160 cag ttg ctg aaa caa atc ctc tcc acg ccc ctt ccc cgg cag cag gag 2208 cca gaa gaa gga gat gca gag gag gaa gag gaa gag gag gag gaa gag 2256 gag tta cag gtg gtc cag gtg tca gag aag gag ttt aac ttt ctg gaa 2304 tac ctg aaa cgc ttc gca tcc tca acc atc gtg cgg gcc tac gtg ctt 2352 ctc ctg cgg agc tac agg cag aac agt gct cac acc aac cac tgc atc 2400 gcc aag atg ctg cac cgg ctg gcc cat ggc ctg ggg atg gaa gcc ctg 2448 ctt ttc cag ctg tcc ctg ttc tgc ctc ttc aat cgg ctg ctt agt gac 2496 cca gct gct gcg gcc tac aaa gag cta gtg act ttt gcc aaa tac atc 2544 att ggc aag ttc ttt gcg ttg gct gcc gtg aac cag aaa gcg ttt gtg 2592 gag ctg ctg ttc tgg aag aac acc gca gtg gtt cgg gaa atg acc cag 2640 gga tat ggc tcc ctc gac agt ggg tct tcc agc cac aga gct cct ctg 2688 tgg agc cct gag gaa gag gcc cag ctt cag gaa cta tac ctc gcc cac 2736 aag gat gtg gaa ggt caa gat gta gtg gaa acc atg ttg gcg cac ctg 2784 aaa gtc gtt cct cga aca cgc aag cag gtc atc cac cac ctg gtc cgg 2832 atg ggc ctg gcc gac agc gtc aag gag ttc cag aag agg aaa ggg acc 2880 cag att gtc ttg tgg acg gag gac cag gag ctg gag tta cag cgg ctc 2928 ttt gag gag ttc cgg gac tct gat gat gtt ctt ggt caa atc atg aag 2976 aat atc aca gcc aaa cgt tca cgg gct cga gta gtg gac aaa ctg ttg 3024 gcc ctg ggg ttg gtg tct gag cgg agg cag cta tac aag aaa cgg aga 3072 aag aag ctg gcg cct tct tgc atg aat gga gaa aag tcc ccg aga gac 3120 ccc tgg cag gaa gat ccg gaa gag gaa gac gaa cac ttg cca gag gac 3168 gaa agt gaa gat gag gag agt gag gaa ggc ttg cca tca gga cag ggt 3216 cag ggc agc tca tct ctc tct gct gaa aac ctc ggt gag agc ctt cgt 3264 cag gaa ggc ctc tct gct ccc ctc ctg tgg ctc cag agc tcc ctg atc 3312 cga gca gca aat gac cga gaa gag gat ggc tgc tcc cag gca atc cct 3360 ctg gtg cct ctg aca gag gaa aat gag gaa gca atg gag aac gaa cag 3408 ttt cag cat ctg cta cgc aag cta ggg atc cgg ccg ccc agc tca ggg 3456 cag gaa acc ttc tgg aga att cca gcc aaa ctg agc tcc acc cag ctt 3504 cgg agg gtg gct gct tct ttg agt cag caa gaa aac gag gag gaa agg 3552 gaa gag gag cca gag cca gga gtc ccc gga gag cag ggt ccc agt gag 3600 gag cac cgg aca gaa gcc ctg aga gcc ctt ctg tca gcc cgt aag agg 3648 aaa gca ggc ctg ggg cct aca gaa gag gag gcc act ggg gag gaa gaa 3696 tgg aac tca gcg ccc aag aag cgg caa ctg ctg gac agc gac gaa gag 3744 gaa gat gat gag ggg agg agg caa gca gtg tcg gga acg cca aga gtc 3792 cac agg aag aaa cgg ctt cag att gag gat gag ggt gac tga aagccagatg 3844 tgtttgaccg atgtgagttg gaggcacaaa agttactttt gcctgcgttg gaagcaatct 3904 tctctacatt gacagcccag gaattttagg cagcagtgtt gggtggagtc tttgcggtca 3964 gtccttgccc caggttcatc agcgtgcaca gccggtctct gggtccgtct cgtagcaaat 4024 gaagagtggc gaaaggttca aggtggcttg tcctcctcta aggactgcgt cttggcttct 4082 gacggggagc tttataaccc agcacggttg ttcattctgt cctcacaaag cactggattg 4142 ctcccatttt ctttctttca tcccaggaca catgattgaa cccgtttcta cagttgaggg 4202 agagctggga tgcaccactc tcaagctgac aagcatccct gatttgtgtt tcatattaaa 4262 tgtgtacaat taacagttgc tcatctcaga gcggccagcc agccatctgt tgtgtcttcg 4322 gaagaacttt taagagtaaa attaahagac atgtcctgaa ctgagcttgg tagtgtgggc 4382 taatcccatc gtgtgggaga cagaggcaag agaattgcca tgagggagag gaaagagtca 4442 tatagcccta cgcgtgggcc aataaatgta atttaaaaaa tcagcttgat aataaatata 4502 atttttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4542 <210> 2 <211>1196 <212> PRT <213> Mus <400> 2 Met Asp Leu Tyr Met Met Asn Cys Glu Leu Leu Ala Thr Cys Ser Ala 1 5 10 15 Leu Gly Tyr Leu Glu Gly Gly Thr Tyr His Lys Glu Pro Asp Cys Leu 20 25 30 Glu Ser Val Lys Asp Leu Ile Arg Tyr Leu Arg His Glu Asp Glu Thr 35 40 45 Arg Asp Val Arg Gln Gln Leu Gly Ala Ala Gln Ile Leu Gln Ser Asp 50 55 60 Leu Leu Pro Ile Leu Thr Gln His Arg Gln Asp Lys Pro Leu Phe Asp 65 70 75 80 Ala Val Ile Arg Leu Met Val Asn Leu Thr Gln Pro Ala Leu Leu Cys 85 90 95 Phe Gly Ser Val Pro Lys Asp Ser Ser Val Arg His His Phe Leu Gln 100 105 110 Val Leu Thr Tyr Leu Gln Ala Tyr Lys Glu Ala Phe Ala Ser Glu Lys 115 120 125 Ala Phe Gly Val Leu Ser Glu Thr Leu Tyr Glu Leu Leu Gln Leu Gly 130 135 140 Trp Glu Asp Arg Gln Glu Glu Asp Asn Leu Leu Ile Glu Arg Ile Leu 145 150 155 160 Leu Leu Val Arg Asn Ile Leu His Val Pro Ala Asn Leu Glu Gln Glu 165 170 175 Lys Ser Ile Asp Asp Asp Ala Ser Ile His Asp Arg Leu Leu Trp Ala 180 185 190 Ile His Leu Ser Gly Met Asp Asp Leu Leu Leu Phe Leu Ser Ser Ser 195 200 205 Ser Ala Glu Gln Gln Trp Ser Leu His Val Leu Glu Ile Ile Ser Leu 210 215 220 Met Phe Arg Asp Gln Thr Pro Glu Gln Leu Ala Gly Val Gly Gln Gly 225 230 235 240 Arg Leu Ala Gln Glu Arg Ser Thr Asp Val Ala Glu Leu Glu Val Leu 245 250 255 Arg Gln Arg Glu Met Ala Glu Lys Arg Ala Arg Ala Leu Gln Arg Gly 260 265 270 Asn Arg His Ser Arg Phe Gly Gly Ser Tyr Ile Val Gln Gly Leu Lys 275 280 285 Ser Ile Gly Glu Lys Asp Val Val Phe His Lys Gly Leu His Asn Leu 290 295 300 Gln Asn Tyr Ser Ser Asp Leu Gly Lys Gln Pro Arg Arg Val Pro Lys 305 310 315 320 Arg Arg Gln Ala Ala Gln Glu Leu Ser Val His Arg Arg Ser Val Leu 325 330 335 Asn Val Arg Leu Phe Leu Arg Asp Phe Cys Ser Glu Phe Leu Glu Asn 340 345 350 Cys Tyr Asn Pro Leu Met Gly Ala Val Lys Asp His Leu Leu Arg Glu 355 360 365 Arg Ala Gln Gln His Asp Glu Thr Tyr Tyr Met Trp Ala Met Ala Phe 370 375 380 Phe Met Ala Phe Asn Arg Ala Ala Thr Phe Arg Pro Gly Leu Val Ser 385 390 395 400 Glu Thr Leu Ser Ile Arg Thr Phe His Phe Val Glu Gln Asn Leu Thr 405 410 415 Asn Tyr Tyr Glu Met Met Leu Thr Asp Arg Lys Glu Ala Ala Ser Trp 420 425 430 Ala Arg Arg Met His Leu Ala Leu Lys Ala Tyr Gln Glu Leu Leu Ala 435 440 445 Thr Val Asn Glu Met Asp Met Cys Pro Asp Glu Ala Val Arg Glu Ser 450 455 460 Ser Arg Ile Ile Lys Asn Asn Ile Phe Tyr Met Met Glu Tyr Arg Glu 465 470 475 480 Leu Phe Leu Ala Leu Phe Arg Lys Phe Asp Glu Arg Tyr His Pro Cys 485 490 495 Ser Phe Leu Arg Asp Leu Val Glu Thr Thr His Leu Phe Leu Lys Met 500 505 510 Leu Glu Arg Phe Cys Arg Ser Arg Gly Asn Leu Met Val Gln Asn Lys 515 520 525 Arg Lys Lys Arg Lys Lys Lys Lys Lys Val Gln Asp Gln Gly Val Ala 530 535 540 Phe Ser Gln Ser Pro Gly Glu Leu Glu Ala Met Trp Pro Ala Leu Ala 545 550 555 560 Glu Gln Leu Leu Gln Cys Ala Gln Asp Pro Glu Leu Ser Val Asp Pro 565 570 575 Val Val Pro Phe Asp Ala Val Ser Glu Val Pro Val Glu Glu Gln Arg 580 585 590 Val Glu Ala Met Val Arg Ile Gln Asp Cys Leu Thr Ala Gly Gln Ala 595 600 605 Pro Gln Ala Leu Ala Leu Leu Arg Ser Ala Arg Glu Val Trp Pro Glu 610 615 620 Gly Asn Ala Phe Gly Ser Pro Val Ile Ser Pro Gly Glu Glu Met Gln 625 630 635 640 Leu Leu Lys Gln Ile Leu Ser Thr Pro Leu Pro Arg Gln Gln Glu Pro 645 650 655 Glu Glu Gly Asp Ala Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 660 665 670 Leu Gln Val Val Gln Val Ser Glu Lys Glu Phe Asn Phe Leu Glu Tyr 675 680 685 Leu Lys Arg Phe Ala Ser Ser Thr Ile Val Arg Ala Tyr Val Leu Leu 690 695 700 Leu Arg Ser Tyr Arg Gln Asn Ser Ala His Thr Asn His Cys Ile Ala 705 710 715 720 Lys Met Leu His Arg Leu Ala His Gly Leu Gly Met Glu Ala Leu Leu 725 730 735 Phe Gln Leu Ser Leu Phe Cys Leu Phe Asn Arg Leu Leu Ser Asp Pro 740 745 750 Ala Ala Ala Ala Tyr Lys Glu Leu Val Thr Phe Ala Lys Tyr Ile Ile 755 760 765 Gly Lys Phe Phe Ala Leu Ala Ala Val Asn Gln Lys Ala Phe Val Glu 770 775 780 Leu Leu Phe Trp Lys Asn Thr Ala Val Val Arg Glu Met Thr Gln Gly 785 790 795 800 Tyr Gly Ser Leu Asp Ser Gly Ser Ser Ser His Arg Ala Pro Leu Trp 805 810 815 Ser Pro Glu Glu Glu Ala Gln Leu Gln Glu Leu Tyr Leu Ala His Lys 820 825 830 Asp Val Glu Gly Gln Asp Val Val Glu Thr Met Leu Ala His Leu Lys 835 840 845 Val Val Pro Arg Thr Arg Lys Gln Val Ile His His Leu Val Arg Met 850 855 860 Gly Leu Ala Asp Ser Val Lys Glu Phe Gln Lys Arg Lys Gly Thr Gln 865 870 875 880 Ile Val Leu Trp Thr Glu Asp Gln Glu Leu Glu Leu Gln Arg Leu Phe 885 890 895 Glu Glu Phe Arg Asp Ser Asp Asp Val Leu Gly Gln Ile Met Lys Asn 900 905 910 Ile Thr Ala Lys Arg Ser Arg Ala Arg Val Val Asp Lys Leu Leu Ala 915 920 925 Leu Gly Leu Val Ser Glu Arg Arg Gln Leu Tyr Lys Lys Arg Arg Lys 930 935 940 Lys Leu Ala Pro Ser Cys Met Asn Gly Glu Lys Ser Pro Arg Asp Pro 945 950 955 960 Trp Gln Glu Asp Pro Glu Glu Glu Asp Glu His Leu Pro Glu Asp Glu 965 970 975 Ser Glu Asp Glu Glu Ser Glu Glu Gly Leu Pro Ser Gly Gln Gly Gln 980 985 990 Gly Ser Ser Ser Leu Ser Ala Glu Asn Leu Gly Glu Ser Leu Arg Gln 995 1000 1005 Glu Gly Leu Ser Ala Pro Leu Leu Trp Leu Gln Ser Ser Leu Ile Arg 1010 1015 1020 Ala Ala Asn Asp Arg Glu Glu Asp Gly Cys Ser Gln Ala Ile Pro Leu 1025 1030 1035 1040 Val Pro Leu Thr Glu Glu Asn Glu Glu Ala Met Glu Asn Glu Gln Phe 1045 1050 1055 Gln His Leu Leu Arg Lys Leu Gly Ile Arg Pro Pro Ser Ser Gly Gln 1060 1065 1070 Glu Thr Phe Trp Arg Ile Pro Ala Lys Leu Ser Ser Thr Gln Leu Arg 1075 1080 1085 Arg Val Ala Ala Ser Leu Ser Gln Gln Glu Asn Glu Glu Glu Arg Glu 1090 1095 1100 Glu Glu Pro Glu Pro Gly Val Pro Gly Glu Gln Gly Pro Ser Glu Glu 1105 1110 1115 1120 His Arg Thr Glu Ala Leu Arg Ala Leu Leu Ser Ala Arg Lys Arg Lys 1125 1130 1135 Ala Gly Leu Gly Pro Thr Glu Glu Glu Ala Thr Gly Glu Glu Glu Trp 1140 1145 1150 Asn Ser Ala Pro Lys Lys Arg Gln Leu Leu Asp Ser Asp Glu Glu Glu 1155 1160 1165 Asp Asp Glu Gly Arg Arg Gln Ala Val Ser Gly Thr Pro Arg Val His 1170 1175 1180 Arg Lys Lys Arg Leu Gln Ile Glu Asp Glu Gly Asp 1185 1190 1195 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gctccaacat tttgaggaag aggtggg 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gccaggaata gttctcggta ctccatc 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gtggagcaga acctcaccaa ctactac 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gagatgatgc tgacagaccg caaggag 27 <210> 7 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 atggactaca aggacgacga tgacaaacac catcaccatc accatttgga cttgtacatg 60 atgaactgtg 70 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tcagtcaccc tcatcctcaa tctg 24 <210> 9 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 atgctgtatc cttatgacgt gcctgactat gccagtggtc ccctagaagg ggccgatg 58 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ ｐｒｉｍｅｒ ＜４００＞ １０ ｃｔａｇｃｔｇｇｔｇ ｃｔｇｔｔｔｔｃｔｔ ｃｔｇｃ
２４

【手続補正書】

【提出日】平成１０年１０月８日（１９９８．１０．
８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｇ０１Ｎ 33/577 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 21/08 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 西川 和子 神奈川県横浜市栄区田谷町１番地 住友電 気工業株式会社横浜製作所内 (72)発明者 丹羽 真一郎 神奈川県横浜市栄区田谷町１番地 住友電 気工業株式会社横浜製作所内 (72)発明者 内匠 透 兵庫県神戸市中央区楠町七丁目５番１号 神戸大学医学部解剖学第二教室内 Ｆターム(参考） 4B024 BA21 BA44 BA80 DA06 EA04 EA06 GA11 HA01 4B063 QA01 QQ02 QQ43 QR33 QR55 QS25 4B064 AG01 AG02 AG27 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 4H045 AA10 BA10 CA40 DA01 DA86 EA20 EA21 FA74

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に記載の塩基配列の
   ２４４番目のＡから３８３４番目のＡまでの塩基配列か
   らなるＤＮＡ。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のＤＮＡとハイブリダイ
   ズするポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配
   列からなる蛋白質。
4. 【請求項４】 請求項２に記載のポリヌクレオチドがコ
   ードする蛋白質。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号１に記載の塩基配列か
   らなるＤＮＡにハイブリダイズする１２塩基以上の塩基
   からなるポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 化学修飾された請求項２または５に記載
   のポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 請求項３または４に記載の蛋白質を認識
   する抗体。