ITTS20000005A1

ITTS20000005A1 - Polisaccaridi coniugati con oligosaccaridi ciclici

Info

Publication number: ITTS20000005A1
Application number: IT2000TS000005A
Authority: IT
Inventors: Paolo Mariotti; Luca Stucchi; Marco Bosco; Luciano Navarini
Original assignee: Cooperativa Ct Ricerch Epoly T
Priority date: 2000-07-24
Filing date: 2000-07-24
Publication date: 2002-01-24
Also published as: ITTS20000005A0; IT1323079B1

Description

Descrizione dell’invenzione industriale avente per titolo:

POLISACCARIDI CONIUGATI CON OLIGOSACCARIDI CICLICI

CAMPO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione riguarda nuovi polisaccaridi coniugati con oligosaccaridi ciclici. L’invenzione comprende i nuovi prodotti ed i loro ulteriori derivati sostituiti nonché i processi per la loro preparazione.

STATO DELLA TECNICA

La maggior parte dei composti organici presenti sulla terra è costituita da carboidrati.

I polisaccaridi, carboidrati polimerici, svolgono funzioni molto importanti in animali e vegetali, come pure nei microorganismi e numerose proprietà sono dovute alla loro struttura macromolecolare. Tra queste è rilevante ricordare la loro capacità di interagire con matrici di tipo organico / biologico o inorganico, caratteristica che si esplica a seguito di fenomeni di adsorbimento o riconoscimento tra lunghe catene polisaccaridiche e matrice solida/insolubile. Insieme ad altre proprietà chimico-fisiche anche la reperibilità di molti di questi prodotti da fonti naturali rinnovabili, nonché le loro caratteristiche di biocompatibilità e biodegradabilità ne hanno favorito l'utilizzo in vari settori. Ad esempio, essi costituiscono spesso gli ingredienti funzionali di prodotti cosmetici e vengono addizionati frequentemente in alimenti. Anche numerosi campi della chimica utilizzano i polisaccaridi per le loro proprietà addensanti o sospendenti o emulsionanti in formulazioni per svariate applicazioni. Nel settore chimico si ricorda inoltre il loro utilizzo nei processi cromatografici nella preparazione e/o purificazione di prodotti sintesi.

Sono usati inoltre nel settore medico e più specificatamente in quello farmaceutico, chirurgico o diagnostico. Essi sono qui usati sia come principi attivi che come matrici di supporto di principi attivi o di agenti di interesse farmaceutico o diagnostico poiché sono estremamente ben tollerati dall’organismo, in quanto, come ad esempio l’acido ialuronico o le eparine, ne sono componenti stessi. In questo ambito, i polisaccaridi sono infatti considerati composti adatti alla preparazione di sistemi di rilascio controllato di farmaci. I polisaccaridi vengono frequentemente utilizzati sia in forma nativa in miscela con molecole di interesse in medicina che in forma di derivati. I derivati sono caratterizzati dalla presenza di un legame covalente che lega il polisaccaride con composti a basso peso molecolare. Questi derivati di polisaccaridi sono ottenuti a seguito di modifica chimica di alcuni gruppi funzionali presenti sulla catena polisaccaridica, quali ad esempio i gruppi carbossilici, o i gruppi amminici o i gruppi ossidrilici, con la formazione di esteri, ammidi, eteri, carbammati. E’ possibile quindi legare un composto a basso peso molecolare ad un polisaccaride sfruttando la reattività dei gruppi funzionali. La presenza di un legame covalente tra polisaccaride ed il composto a basso peso molecolare richiede quindi la presenza di adeguati meccanismi che consentano il rilascio di detto composto. Questi meccanismi di rilascio possono essere ad esempio reazioni di idrolisi in condizioni specifiche di pH o in presenza di enzimi che permettono di scindere il legame specifico. Ovviamente, essendo questi dei meccanismi abbastanza specifici, il legame covalente non sempre costituisce la soluzione migliore per trattenere un composto su un polisaccaride, veicolarlo e rilasciarlo nelle condizioni desiderate.

Un’altra strategia di rilascio controllato di composti (come ad esempio nel campo medico per agenti con elevata tossicità sistemica oppure per agenti con un profilo di assorbimento o distribuzione non adeguato), utilizza formulazioni a base di liposomi o di microsfere nelle quali il prodotto viene immobilizzato e veicolato in modo passivo ai vari distretti. La preparazione di dette formulazioni è però spesso piuttosto complessa e richiede l’uso di tecniche avanzate della chimica farmaceutica.

Una strategia diversa di rilascio controllato di composti viene attuata mediante un’altra classe di carboidrati, gli oligosaccaridi ciclici, costituiti da zuccheri, generalmente glucosio concatenati a formare degli anelli di dimensioni definite. Questi oligosaccaridi presentano proprietà molto diverse da quelle delle strutture polimeriche dei polisaccaridi, da cui si differenziano in modo sostanziale in quanto sono costituiti da un numero ridotto di monosaccaridi.

Tra essi sono noti i glucani ciclici prodotti da microorganismi costituiti da 17-25 unità di (l->2)-P-D-glucosio e i glucani contenenti sia legami glucosidici β-(1 ->3) che β-(1 ->6) (Microbiological Review, 58, 1994, pg. 145-161).

Altri oligo saccaridi ciclici sono le ciclodestrine che sono prodotti ottenuti dall’azione dell’enzima ciclodestrina glicosiltransferasi sull’amido (Polysaccharides in Medicinal Applications, ed Dumitriu, Marcel Dekker Ed, 1996, pg. 575-602). Questi oligosaccaridi ciclici sono costituiti da 6-12 unità di (l->4)-a-D-glucosio. Le più comuni e meglio caratterizzate contengono 6-8 unità di glucosio e sono rispettivamente definite come aciclo destrina, β-ciclodestrina, γ-ciclodestrina. La cavità interna della ciclodestrina ha un carattere relativamente idrofobico, pertanto diverse molecole apolari o gruppi apolari di molecole vengono preferenzialmente incluse dalla cavità. In solventi acquosi o in miscele acqua-solventi organici le ciclodestrine formano quindi complessi di inclusione con diverse molecole e ioni. Questi complessi di inclusione sono specie chimiche dove la ciclodestrina “ospita” nella sua cavità molecole grazie a legami non covalenti che assicurano un’elevata stabilità del complesso. L’inclusione può essere fatta ad esempio per solubilizzare e/o per stabilizzare agenti apolari e, nel caso di agenti di interesse in medicina per modificare la loro biodisponibilità. Le ciclodestrine hanno interessanti usi in svariati settori. Ad esempio, questi oligomeri possono essere usati in campo chimico e medico, in quanto offrono la capacità di includere nella loro cavità molecolare diversi composti chimici, anche ad es farmaci, di opportune dimensioni e polarità. Detti complessi consentono di proteggere i composti inclusi da agenti fisici o chimici oppure di preparare un sistema controllato di rilascio dell’agente incluso.

Un altro settore di interesse per l’applicazione di ciclodestrine e loro derivati è quello della chimica analitica e preparativa dove esse costituiscono fasi stazionarie chirali per la separazioni di miscele di enantiomeri (LC-GC International, Current Issue in HPLC Technology, 1998, pg. 23-31).

Le ciclodestrine vengono comunque ampiamente studiate in quanto nonostante ci sia un enorme interesse, il loro utilizzo pratico è ancora piuttosto limitato. La limitazione al loro uso è legata a diversi fattori. Ad esempio, la costante di stabilità / associazione spesso non è ottimale. Matti, se ad esempio la costante è troppo bassa, il rilascio dell’agente incluso è troppo veloce, e quindi nel caso in cui detto agente sia un farmaco poco solubile, il suo rilascio con una cinetica molto veloce può causare effetti tossici nel distretto corporeo dove viene rilasciato in elevate quantità. Un altro fattore che può risultare limitante al loro utilizzo è la dimensione della molecola desiderata che può essere non adatta ad essere ospitata nella cavità. Per superare questi ed altri problemi, numerosi studi sono dedicati alla preparazione di nuovi derivati di ciclodestrina con l’obiettivo principale di aumentare la solubilità e la stabilità.

Nonostante quindi l’enorme attività di ricerca nel settore degli oligosaccaridi ciclici e della loro modifica chimica rimane l’esigenza ormai avvertita da tempo di disporre di nuovi derivati di ciclodestrine con diverse proprietà di solubilità e stabilità.

Nell’ambito di derivati di polisaccaridi e oligosaccaridi ciclici, in letteratura (Carb.Polymers, 39, 1999, pg. 17-31) è riportata la preparazione di un derivato di acido ialuronico con la ciclodestrina. Il prodotto descritto viene ottenuto a seguito della reazione tra il gruppo carbossile del polisaccaride acido ed i gruppi ossidrili della ciclodestrina. Il prodotto viene proposto per uso in medicina, ma la presenza del legame estereo facilmente idrolizzabile per idrolisi enzimatica e/o chimica, rilascia la ciclodestrina con l’agente incluso piuttosto che il solo agente incluso. Questa reazione di derivatizzazione sull’acido ialuronico consente di preparare un polisaccaride sostituito con ciclodestrina dove il grado di sostituzione del polisaccaride è piuttosto basso. Poiché tutti i tre ossidrili presenti su ogni zucchero della ciclodestrina possono partecipare alla reazione di esterificazione in modo casuale la distribuzione della sostituzione non è regolare. La reazione quindi non è completamente controllabile ed il prodotto, in particolare per quanto riguarda la sostituzione della ciclodestrina, non essendo precisamente definito può non essere sufficientemente affidabile per quanto concerne il suo utilizzo.

SOMMARIO

Si descrivono nuovi polisaccaridi coniugati con oligosaccaridi ciclici dove il legame chimico tra il polisaccaride e l’oligosaccaride è un legame etereo diretto tra gli ossidrili del polisaccaride e gli atomi di carbonio in posizione 6 dei residui glucosidici dell’ oligosaccaride ciclico. Gli atomi di carbonio in posizione 6 non coinvolti nel legame con il polisaccaride sono eventualmente parzialmente o totalmente sostituiti con alogeni.

Si descrive inoltre il processo di preparazione di detti prodotti ed il loro utilizzo quali intermedi di sintesi nella preparazione di prodotti ulteriormente sostituiti caratterizzati dalla presenza di legami esterei, eterei, uretani.

I nuovi polisaccaridi nonché i corrispondenti polisaccaridi ulteriormente sostituiti possono essere usati nella preparazione di complessi d’inclusione di agenti di varia natura e nella preparazione di composizioni per uso in medicina o in chimica analitica e preparativa.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

La presente invenzione riguarda nuovi polisaccaridi coniugati con oligosaccaridi ciclici dove il legame chimico tra il polisaccaride e gli oligosaccaridi ciclici è un legame etereo diretto (quindi in assenza di bracci spaziatori) che avviene tra gli ossidrili del polisaccaride e gli atomi di carbonio in posizione 6 dei residui glucosidici dell’ oligosaccaride ciclico. Gli atomi di carbonio in posizione 6 dei residui glucosidici dell’ oligosaccaride non coinvolti nel legame con il polisaccaride sono eventualmente parzialmente o totalmente sostituiti con alogeni.

L’ oligosaccaride ciclico è scelto tra i glucani ciclici costituiti da 17-25 unità di (1->2)-β -D-glucosio, oppure tra i glucani ciclici contenenti sia legami glucosidici β-(1->3) che β-(1->6), oppure tra gli oligosaccaridi ciclici costituiti da 6-12 unità di (l->4)-a-D-glucosio (ciclodestrine), oppure tra i corrispondenti oligosaccaridi ramificati con residui di D-glucosio.

Tra tutti gli oligosaccaridi ciclici sono preferite le ciclodestrine ed in particolare l’ oc-ciclodestrina, la β-ciclodestrina, la γ-ciclodestrina, che contengono rispettivamente 6, 7, 8 unità di glucosio.

Il polisaccaride utilizzato nella presente invenzione è un polisaccaride neutro, anionico o cationico ad alto peso molecolare. I polisaccaridi possono essere isolati da fonti naturali, quali ad esempio da fonti animali, dall’uomo, da vegetali, da microorganismi. Essi hanno preferibilmente peso molecolare medio pesato (da ora in avanti chiamato: peso molecolare, MW) compreso tra 30000 e 2000000. Preferito è l’intervallo di peso molecolare medio pesato compreso tra 50000 e 500000.

I polisaccaridi possono avere una struttura lineare o ramificata, e sono costituiti da unità monosaccaridiche quali: D-glucosio, D-xilosio, D-arabinosio, D- e L-mannosio, D-galattosio, L-fucosio, D-fruttosio, L-ramnosio, acido D-glucuronico, acido D-mannuronico, acido L-guluronico, acido L-iduronico, acido D-galatturonico, N-acetil-D-glucosammina, N-acetil-D-galattosammina, 3,6-anidro-D-galattosio, 3,6-anidro-L-galattosio, 2-ammino-2-desossi-D-glucosio. Tali monosaccaridi possono contenere gruppi solfato o acetili o succinili.

La catena polisaccaridica principale presenta una struttura β-(1— >3)- o β-(1→2) o β-(1->4)-D-glicosida, oppure α-(l→3), α-(l→4), α-(l→6)-D-glicosidica; la configurazione β è la preferita. Le ramificazioni laterali sono preferibilmente costituite da D-glicosili legati con configurazione β-(1 — >3), β-(1→4), β-(1 — >6) o α-(1→4), α-(l->6), ancora più preferibilmente β-(1— >6).

Quando il polisaccaride è neutro esso è preferibilmente un glucano (polisaccaride del glucosio) isolato da funghi, piante, batteri, lieviti. Detti polisaccaridi possono essere lineari o ramificati. Tra essi sono preferiti i (l->3)-β-D-glucani, polisaccaridi con residui di (l->3)-β-D-glucosio. Esempi preferiti di glucani sono: sclero glucano, lentinano, schizofillano, pachimarano, laminarano e curdlano o loro derivati con acidi bicarbossilici, come ad esempio i derivati succinilati.

Un altro polisaccaride neutro utilizzabile nella preparazione dei prodotti dell’invenzione è la cellulosa, costituita da residui di (l-»4)-β-D-glucosio. Possono essere vantaggiosamente usati anche i derivati eterei ed esterei della cellulosa.

Un altro omopolisaccaride neutro del glucosio interessante per l’ottenimento dei derivati dell’invenzione è l’amido. In alternativa si possono usare i suoi derivati quatemizzati. I costituenti principali dell’amido sono l’amilosio e l’amilopectina. L’amilosio è costituito da catene di residui (l->4)- α-Dglucosio. L’amilopectina ha catene ramificate aventi catene di amilosio di diversa lunghezza collegate tra loro da legami a-(l— >6).

Tra i polisaccaridi anionici, possono venire vantaggiosamente utilizzati i polisaccaridi carbossilati o i loro sali tra cui ad esempio l'acido ialuronico, costituito dall’unità ripetitiva:

(l→3)-β-N-acetil-D-glucosamina - (l->4)β-acido D-glucuronico.

Oppure, detto polisaccaride anionico essere l’acido alginico, costituito da acido (l-4)-α -L-guluronico ed acido β-D-mannuronico.

I polisaccaridi anionici rilevanti per l’invenzione possono essere salificati con cationi di metalli alcalini, preferibilmente Na e K o cationi ammonici. Detti polisaccaridi carbossilati possono anche essere usati nelle forme esterificate al carbossile.

Un altro polisaccaride naturale interessante per fottenimento dei prodotti secondo la presente invenzione è costituito da un polisaccaride solfato isolabile da un'alga marina, la Grateloupia doryphora, appartenente alla famigha delle Grateloupiaceae, descritto in W098/23648. Possono venire utilizzati anche i polisaccaridi solfati ottenuti da altre alghe delle famiglie, delle Grateloupiaceae o Codiaceae.

Tra i polisaccaridi di interesse vengono ancora elencati la chitina ed il chitosano. La chitina è un omoglicano costituito da residui di (1— >4)-β-Ν-acetil-D-glucosammina. Per deacetilazione si ottiene il chitosano, il 2-ammino-2-deossiβ-D-glucano.

Possono infine, venire impiegati i polisaccaridi naturali neutri o anionici derivatizzati con molecole contenenti gruppi salificati con gruppi solfato, fosfato, carbossilato.

Costituisce un ulteriore aspetto dell’invenzione il processo di preparazione dei prodotti coniugati dell’invenzione che utilizza i polisaccaridi e gli oligosaccaridi ciclici descritti sopra.

Il procedimento è caratterizzato dai seguenti passaggi a)-d):

a) Alogenazione, ovvero clorurazione o bromurazione o iodurazione dell’ oligosaccaride ciclico di partenza sul carbonio in posizione 6 del residuo glucosidico;

b) Reazione di sostituzione dell’alogeno dell’ oligo saccaride ciclico con il polisaccaride mediante formazione di un legame etereo;

c) Eventuale dealogenazione o sostituzione dell’alogeno sull’obgosaccaride ciclico;

d) Isolamento e purificazione del prodotto finale.

Il passaggio a) consente di introdurre l’alogeno sostituendo parzialmente o totalmente l’ossidrile sul carbonio in posizione 6 del residuo glucosidico dell’obgosaccaride ciclico. L’ alogenazione, preferibilmente bromurazione avviene per aggiunta di un agente bromurante, quale ad esempio il tionil bromuro, l’ossalil bromuro, Ν-bromosuccinimmide, il tribromuro di fosforo ad una soluzione di oligosaccaride ciclico in solvente organico basico aprotico a bassa temperatura. I solventi organici basici aprotici preferiti sono Ν-metilpirrobdone e Ν,Ν-dimetilformammide. L’agente bromurante viene usato in quantità superiori a 1 equivalente di agente per unità di glucosio dell’obgosaccaride ciclico. Preferibilmente la quantità usata è inferiore a 20 equivalenti di agente bromurante per unità di glucosio deb’ oligosaccaride ciclico. Dopo neutralizzazione deba miscela b prodotto viene isolato, ad esempio per precipitazione, purificato e viene quindi essiccato.

Il passaggio b) permette di sostituire l’alogeno sull’ oligosaccaride ciclico con il polisaccaride. L’ oligosaccaride ciclico ottenuto nel passaggio a) viene omogeneamente sospeso in una miscela di alcool terziario : acqua. Si aggiunge una soluzione o sospensione alcoolica del polisaccaride. Si fa reagire in una soluzione fortemente basica ad elevate temperature (40-60°C) per tempi compresi nell’intervallo 1-3 ore. Dopo neutralizzazione della miscela viene eventualmente eseguito il passaggio c) facendo avvenire la reazione in solvente acquoso o alcolico basico. Infine si applica il passaggio d) ed il prodotto finale viene isolato, ad esempio mediante precipitazione e quindi essiccato.

Il polisaccaride avendo numerosi gruppi ossidrili disponibili reagisce contemporaneamente con più molecole di oligosaccaride ciclico alogenato. Il grado di sostituzione (DS) dei prodotti dell’invenzione viene definito come rapporto di moli di oligosaccaride ciclico per moli di monosaccaride del polisaccaride. Il grado di sostituzione dei polisaccaridi coniugati dell’invenzione è compreso tra 0.05 e 1. E’ preferito il grado di sostituzione compreso tra 0.07 e 0.5.

I polisaccaridi coniugati con oligosaccaridi ciclici sono interessanti in quanto il legame chimico tra oligosaccaride ed il polisaccaride è un legame etereo. Questo legame etereo è un legame stabile ad idrolisi basica, è stabile in soluzione fisiologica anche in presenza di enzimi idrolitici. Grazie a questa proprietà il prodotto dell’invenzione può essere usato in tutte quelle applicazioni, tra cui anche il settore medico, in cui si richieda l’integrità chimica della matrice. Il legame è stabile anche in solvente organico o in miscele di acqua e solvente organico e quindi i derivati sono utilizzabili ampiamente ad esempio anche nella chimica di sintesi dove possono essere usati quali catalizzatori del tipo “phase-trasfer” oppure nella chimica analitica, ad esempio nell’allestimento di sistemi biosensoristici idonei alla determinazione di analiti, ad esempio in alimenti o nell’ambiente o in fluidi biologici.

Un altro aspetto interessante dei prodotti dell’invenzione è la loro applicabilità nella preparazione di complessi di inclusione con agenti di diverso tipo, quali ad esempio farmaceutici, diagnostici, erbici, pesticidi, cosmetici. La presenza del polisaccaride influenza notevolmente le costanti di associazione e la stabilità di detti complessi d’inclusione, consentendo applicazioni nuove rispetto a quelle fino ad oggi effettuate con le ciclodestrine note. Nel caso di applicazioni per il settore medico, le molecole ospiti possono essere agenti per uso in campo farmaceutico che ricadono in diverse categorie terapeutiche oppure agenti per uso in diagnostica. La presenza del polisaccaride inoltre si rivela molto importante nell’ influenzare la distribuzione del complesso nell’organismo in quanto modula il tropismo per i vari distretti corporei. In particolare si è osservato che nel caso in cui il polisaccaride è il (l->3)-β-glucano, il complesso ha elevata affinità per tumori. L’effetto è ancora più evidente per il polisaccaride coniugato che utilizza quale polisaccaride l’acido ialuronico. Per questo tipo di applicazione risulta particolarmente interessante includere nell’ oligosaccaride ciclico un agente il cui utilizzo è legato alla sua presenza nel tumore quale ad esempio un farmaco antitumorale. Esempi di antitumorali da includere sono: complessi del platino, complessi di rutenio descritti in W098/00431.

Gli usi in medicina di questi complessi di inclusione per il trasporto ed il rilascio di principi attivi ed agenti diagnostici prevede anche l’uso nel rilascio selettivo di farmaci chirali.

Uso in medicina diagnostica è interessante in quanto i prodotti dell’invenzione consentono di avere una elevata densità (loadability) di agente di contrasto incluso. Molto spesso detti agenti hanno una notevole tossicità (che si esplica in particolare a livello epatico) quindi l’elevata densità di agente consente la somministrazione di dosaggi più ridotti che consentono comunque di mantenere una risposta adeguata grazie alla presenza del polisaccaride.

I nuovi polisaccaridi coniugati dell’invenzione sono utili inoltre quali intermedi per l’ottenimento di nuovi prodotti ulteriormente sostituiti. In particolare, costituiscono ulteriore oggetto dell’invenzione i derivati sostituiti ottenuti dai polisaccaridi coniugati con oligosaccaridi ciclici dove il legame chimico tra il polisaccaride e oligosaccaride è un legame etereo che avviene tra gli ossidrili del polisaccaride e gli atomi di carbonio in posizione 6 dei residui glucosidici dell’ oligosaccaride ciclico, e dove gli atomi di carbonio in posizione 6 dell’ oligo saccaride non coinvolti nel legame etereo sono eventualmente parzialmente o totalmente sostituiti con alogeni (preferibilmente bromo) con gruppi alchilici, ardici, arilalchilici, acilici, dove detti sostituenti alchilici, ardici, arilalchilici, acilici sono legati tramite un legame estereo, etereo, uretano; e dove gli ossidrili liberi ded’ oligosaccaride ciclico o del polisaccaride o di entrambi sono parzialmente o totalmente sostituiti con gruppi alchilici, ardici, arilalchilici, acilici, dove detti sostituenti sono legati tramite un legame estereo, etereo, uretani. Preferiti sono i derivati sostituiti dei polisaccaridi coniugati dove la sostituzione con gruppi alchilici, ardici, arilalchilici, acilici è totale e dove detti gruppi sostituenti sono acetili, succiniti, fenilcarbammati eventualmente sostituiti con metili o con alogeni (preferibilmente cloro), benzoati eventualmente sostituiti con metili o con alogeni (preferibilmente cloro).

Questi nuovi polisaccaridi coniugati ulteriormente sostituiti mantengono la peculiarità dei polisaccaridi di partenza di avere un legame etereo molto stabile tra polisaccaride e oligosaccaride ciclico e consentono di disporre di prodotti che differiscono dai composti di partenza per il loro profilo di solubilità. Infatti, la solubilità del derivato oggetto dell’invenzione può venire modificata per consentire l’utilizzo dei prodotti dell’invenzione in solventi organici o in miscele di solventi acquosi ed organici, come ad esmepio nei processi cromatografici.

Questo ulteriore processo di sostituzione che viene effettuato sul polisaccaride coniugato con oligosaccaridi ciclici avviene sugli ossidrili Uberi del’oligosaccaride o del polisaccaride o di entrambi ed eventualmente anche sugli alogeni dell ogosaccaride mediante una reazione di esterificazione, eterificazione, carbamoilazione che consente di introdurre gruppi arilalchilici, ardici, alchilici o acilici. Queste reazioni di sostituzione portano al’ ottenimento di prodotti dove la sostituzione può essere parziale o preferibilmente totale.

Se opportuno, si può anche effettuare una reazione di dealogenazione prima di detta reazione di sostituzione. In questo modo, gli alogeni presenti sul carbonio in posizione 6 dei residui glucosidici dell’oligosaccaride vengono sostituiti con ossidrili facendo avvenire la reazione in solvente acquoso o alcolico basico. Detta reazione viene condotta in mezzo organico basico aprotico in presenza di catalisi basica a temperature comprese tra temperatura ambiente e 100°C per un tempo compreso tra 0.5 e 48 ore. Il processo di preparazione dei polisaccaridi coniugati ulteriormente sostituiti, che costituisce ulteriore oggetto dell’invenzione è quindi caratterizzato dai seguenti passaggi a)-e):

c) Eventuale dealogenazione dell’ oligosaccaride ciclico;

d) Reazione di esterificazione, eterificazione o carbamoilazione;

e) Isolamento e purificazione del prodotto finale.

I passaggi a), b), c), e) vengono eseguiti secondo quanto descritto precedentemente nella preparazione dei polisaccaridi coniugati. Il passaggio d) viene condotto secondo le tecniche e procedure note all’esperto del settore.

La presente invenzione comprende inoltre nuove composizioni ovvero miscele dei polisaccaridi coniugati o dei corrispondenti derivati ulteriormente sostituiti o dei loro complessi con ingredienti idonei all’uso previsto.

Ad esempio, per composizioni farmaceutiche che contengono quale prodotto attivo un principio attivo o un agente diagnostico questi prodotti dell’invenzione sono in associazione con eccipienti e/o diluenti farmaceuticamente accettabili. Le composizioni sono in forma solida o liquida o semisolida adatta alla via di somministrazione scelta. Le vie di somministrazione possibili sono la via orale, topica, parenterale, tra cui le preferite sono la intravenosa, intrarticolare, intramuscolare. I diversi tipi di preparazioni farmaceutiche a base dei derivati dell’invenzione, preferibilmente a base di polisaccaridi coniugati o dei loro complessi d’inclusione possono essere messe a punto mediante tecniche note all’esperto del settore.

Altre composizioni sono costituite dai polisaccaridi coniugati dell’invenzione e preferibilmente dai corrispondenti polisaccaridi coniugati ulteriormente sostituiti, che vengono miscelati con un supporto solido idoneo alla preparazione di fasi stazionarie chirali, su cui detti derivati vengono depositati. Il supporto solido può essere di tipo organico o, preferibilmente inorganico. Esempi di supporto inorganico sono gel di silice, allumina, caolino, ossido di titanio, magnesio e silicato. Dette composizioni sono quindi fasi stazionarie chirali innovative particolarmente vantaggiose rispetto alle fasi note. Rispetto alle fasi stazionarie a base di ciclodestrina comprese nello stato dell’arte, nei derivati dell’invenzione la densità dei centri chirali è decisamente superiore in quanto questi prodotti sono depositati sul supporto solido e non legate chimicamente come nel caso delle ciclodestrine note. Rispetto alle fasi stazionarie polisaccaridiche comprese nello stato dell’arte le nuove fasi presentano il vantaggio di poter offrire delle interazioni aggiuntive date dalla formazione di complessi d’inclusione tra Γ oligosaccaride ciclico e l’analita consentendo quindi una migliore separazione di miscele enantiomeriche. Ci sono infatti i meccanismi dovuti al riconoscimento tipico degli oliogosaccaridi ciclici, ovvero delle ciclodestrine (ovvero la separazione per riconoscimento a seguito di parziale o totale inclusione) nonché i meccanismi legati al riconoscimento dovuto alla presenza di centri chirali tipici dei carboidrati che vengono esaltati dalla presenza della catena polisaccaridica. Le nuove fasi stazionarie possono essere usate per preparare colonne cromatografiche per cromatografia liquida, come ad esempio HPLC (High Performance Liquid Chromatography), SFC (Supercritical Fluid Chromatography), SMBC (Simulated Moving Bed Chromatography).

Dette composizioni consentono la messa a punto di un processo per la separazione di miscele di racemi.

Ulteriori usi delle composizioni dei prodotti dell’invenzione vengono previsti nel settore dell’agricoltura per l’incapsulazione di agenti utili nel settore (ad esempio pesticidi, diserbanti, etc) e della cosmetica.

PARTE SPERIMENTALE ESEMPIO 1: Preparazione di 6-deossi-6-bromo-β-ciclodestrina

250 mg di β-ciclodestrina vengono sciolti in 20 mL di N-metilpirrolidone, anidrificato preventivamente su setacci molecolari, in un pallone a tre colli dotato di agitazione magnetica e sotto flusso di azoto. La soluzione così ottenuta viene raffreddata a -8 ÷ -10°C in un bagno di ghiaccio e sale e si aggiungono, ad un flusso non superiore a 0.06 mL/min, 1.19 mL di tionilbromuro. Alla fine del gocciolamento la soluzione che si ottiene viene lasciata in bagno di ghiaccio per 30 minuti. Si porta a temperatura ambiente e poi si riscalda a 80 °C in bagno ad olio per 2 ore. Si aggiungono 10 mL di acqua distillata, si neutralizza con una soluzione satura di bicarbonato e si precipita in 5-6 volumi di acetone, lasciando il precipitato ottenuto a 4°C per 16 ore. Si filtra in depressione e si lava con acetone. Il prodotto viene essiccato in stufa sotto vuoto a temperatura ambiente per circa 4 ore.

Caratterizzazione del derivato. Gli spettri monodimensionali 1H e 13C ottenuti mediante risonanza magnetica nucleare con spettrometro Varian Inova 500 permettono di rilevare che la bromurazione è totale a livello degli atomi di carbonio in posizione 6 della ciclodestrina.

ESEMPIO 2: Preparazione di 6-deossi-6-bromoβ-ciclodestrina

200 mg di β-ciclodestrina vengono trattati come descritto all’Esempio 1 con la sola differenza che il solvente di reazione è la N,Ndimetilformammmide anidrificata su bario ossido a riflusso per diverse ore.

ESEMPIO 3: Preparazione di acido ialuronico coniugato con β-ciclodestrina 200 mg del sale di tetrabutilammonio dell’acido ialuronico (peso molecolare medio pesato, MW: 169000) vengono posti in un pallone provvisto di agitazione magnetica. 2.5 mL di una soluzione acquosa al 40% di tetrabutilammonio idrossido sono aggiunti e il sistema viene tenuto in agitazione a temperatura ambiente fino all’ottenimento di una soluzione. Quindi si aggiungono 2 mL di tert-butanolo.

2.9 g della β-ciclodestrina preparata nell’esempio 2 vengono dispersi in una miscela di tert-butanolo (20 mL) e di acqua (6.5 mL) a temperatura ambiente in un pallone dotato di agitazione magnetica. A questa sistema si aggiunge ad un flusso di 0.5 mL/min la soluzione di acido ialuronico preparata come descritto sopra. Si scalda quindi a 50°C per oltre 2 ore. Si porta a temperatura ambiente, si aggiungono 10 mL di acqua, poi 2 mL di acido acetico glaciale. Si neutralizza con una soluzione concentrata di NaOH. Si concentra in depressione e si dializza contro acqua distillata (4 cambi da 10 L). Il prodotto viene recuperato mediante liofilizzazione (280 mg).

Caratterizzazione del derivato. Dall’analisi dello spettro 1H di risonanza magnetica nucleare condotta con spettrometro Varian Inova 500, si calcola il grado di sostituzione del polisaccaride coniugato. Dall’integrazione dei due segnali anomerici dell’acido ialuronico (4.4 ppm) e del segnale attribuibile al protone anomerico della β-ciclodestrina (4.95 ppm) si ricava che 0.3 unità di ciclodestrina sono presenti per unità ripetitiva di acido ialuronico. Quindi poiché l’unità ripetitiva dell’acido ialuronico è costituita da due monosaccaridi il grado di sostituzione del derivato è pari a 0.15. Dallo spettro si conferma la presenza del singoletto dell’acetile (1.8 ppm) dell’unità N-acetil-D-glucosammina dell’acido ialuronico.

Dallo spettro bidimensionale 1H-13C si conferma la sostituzione del bromo (34 ppm) sulle posizioni 6 della ciclodestrina, la presenza di un segnale metilenico (69.7 ppm 13C, 3.5 ppm IH) assegnabile all’atomo di carbonio in posizione 6 sostituito, ovvero coinvolto nel legame etereo.

L’analisi spettroscopia di risonanza magnetica nucleare sul campione consente di segnalare la esatta corrispondenza dei Chemical shift di tutti i sei atomi di carbonio della ciclodestrina rispetto al corrispondente campione prima della reazione a garanzia dell’integrità dell’anello a sette unità di glucosio. Non sono visibili, inoltre, segnali relativi ad anomerici terminali riducenti a carico dell’acido ialuronico da cui si deduce che le condizioni di reazione non inducono una significativa depolimerizzazione.

ESEMPIO 4: Preparazione di scleroglucano coniugato con β-ciclodestrina 200 mg di scleroglucano vengono posti in un pallone provvisto di agitazione magnetica. 2.5 mL di una soluzione acquosa al 40% di tetrabutilammonio idrossido sono aggiunti e il sistema viene tenuto in agitazione lino all’ottenimento di una soluzione. Quindi si aggiungono 2.5 mL di tertbutanolo.

2.9 g della β-ciclodestrina preparata nell’esempio 2 vengono dispersi in una miscela di tert-butanolo (20 mL) e di acqua (6,5 mL) in un pallone dotato di agitazione magnetica. A questa sistema si aggiunge la soluzione di scleroglucano preparata come descritto sopra. Si scalda quindi a circa 50°C per oltre 2 ore. Si porta a temperatura ambiente, si aggiungono 10 mL di acqua e si ottiene un precipitato. Il precipitato viene raccolto per filtrazione e poi lavato con acqua fino a neutralizzazione delle acque di lavaggio. Il prodotto viene recuperato e seccato in stufa sotto vuoto.

ESEMPIO 5: Preparazione del prodotto ottenuto per debromurazione dal polisaccaride coniugato dell’esempio 3.

Il prodotto ottenuto come descritto all’esempio 3 viene disperso in 200 mL di piridina. Si aggiunge una soluzione acquosa acquosa al 40% di tetrabutilammonio idrossido fino a raggiungere il pH 14 ed il sistema viene tenuto in agitazione alla temperatura di 80°C per 4-6 ore. Si raffredda e si neutralizza con 0.5M HC1. Si concentra in depressione e si dializza contro acqua distillata. Il prodotto viene recuperato mediante liofilizzazione.

ESEMPIO 6: Preparazione del prodotto dell’esempio 3 peracetilato

Il prodotto ottenuto come descritto all’esempio 3 viene disperso in piridina. Si aggiungono 10 mL di acido acetico glaciale ed il sistema viene tenuto in agitazione alla temperatura di 50°C per 4-6 ore. Si aggiungono 15 mL di anidride acetica e si lascia in agitazione alla temperatura di 80°C per 8-10 ore. Il prodotto viene precipitato con acetone e quindi raccolto per filtrazione, poi si lava con acetone fino a neutralizzazione delle acque di lavaggio. Il prodotto viene recuperato e seccato in stufa sotto vuoto.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Polisaccaridi coniugati con oligosaccaridi ciclici dove il legame chimico tra il polisaccaride e oligosaccaride è un legame etereo che avviene tra gli ossidrili del polisaccaride e gli atomi di carbonio in posizione 6 dei residui glucosidici dell’ oligosaccaride ciclico e dove gli atomi di carbonio in posizione 6 del residuo glucosidico dell’ oligosaccaride non coinvolti nel legame etereo sono eventualmente parzialmente o totalmente sostituiti con alogeni.
2. Polisaccaridi coniugati secondo la rivendicazione 1 dove l’alogeno è bromo.
3. Polisaccaridi coniugati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-2 dove il grado di sostituzione, ovvero il rapporto tra moli di oligosaccaride ciclico e moli di monosaccaride del polisaccaride è compreso tra 0.05 e 1.
4. Polisaccaridi coniugati secondo la rivendicazione 3 dove il grado di sostituzione, ovvero il rapporto tra moli di oligosaccaride ciclico e moli di monosaccaride del polisaccaride è compreso tra 0.07 e 0.5.
5. Polisaccaridi coniugati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4 dove l’ oligosaccaride ciclico è costituito da 17-25 unità di residui di D-glucosio contenenti legami β-(1->2), oppure da 17-25 unità di residui di D-glucosio contenenti sia legami glucosidici β-(1->3) che β-(1->6), oppure da una ciclodestrina costituita da 6-12 unità di (l->4)-α-D-glucosio.
6. Polisaccaridi coniugati secondo la rivendicazione 5 dove la ciclodestrina è oc-ciclodestrina, β-ciclodestrina o γ-ciclodestrina.
7. Polisaccaridi coniugati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6 dove il polisaccaride è anionico o neutro o cationico.
8. Polisaccaridi coniugati secondo la rivendicazione 7 dove il polisaccaride ha peso molecolare medio pesato compreso tra 30000 e 2000000.
9. Polisaccaridi coniugati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7-8 dove il polisaccaride è scelto tra acido ialuronico, acido alginico, loro sali, o loro esteri al carbossile.
10. Polisaccaridi coniugati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7-8 dove il polisaccaride è un (l->3)-β-D-glucano o un (1-^4)-β-D-glucano.
11. Polisaccaridi coniugati secondo la rivendicazione 10 dove il polisaccaride è lo scleroglucano.
12. Polisaccaridi coniugati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7-8 dove il polisaccaride è un polisaccaride solfato o suoi sali o esteri.
13. Polisaccaridi coniugati secondo la rivendicazione 12 dove il polisaccaride è un polisaccaride solfato isolato da alghe appartenenti alla famiglia delle Grateloupiaceae o delle Codiaceae.
14. Polisaccaridi coniugati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7-8 dove il polisaccaride è chitosano o chitina.
15. Processo per l’ottenimento dei polisaccaridi coniugati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-13 caratterizzato dai seguenti passaggi a)-d)): a) Alogenazìone, ovvero clorurazione o bromurazione o iodurazione dell’ oligosaccaride ciclico di partenza sul carbonio in posizione 6 del residuo glucosidico; b) Reazione di sostituzione dell’alogeno dell’ oligosaccaride ciclico con il polisaccaride mediante formazione di un legame etereo; c) Eventuale dealogenazione dell’ oligosaccaride ciclico; d) Isolamento e purificazione del prodotto finale.
16. Processo secondo la rivendicazione 15 dove il grado di sostituzione del prodotto finale è compreso tra 0.05 e 1.
17. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15-16 dove il polisaccaride è l’acido labronico, suoi sali, suoi esteri, o scleroglucano.
18. Polisaccaridi coniugati con oligosaccaridi ciclici dove il legame chimico tra il polisaccaride e oligosaccaride è un legame etereo che avviene tra gli ossidrili del polisaccaride e gli atomi di carbonio in posizione 6 dei residui glucosidici dell’ oligosaccaride ciclico; e dove gli atomi di carbonio in posizione 6 del residuo glucosidico dell’ oligosaccaride non coinvolti nel legame etereo sono eventualmente parzialmente o totalmente sostituiti con alogeni, con gruppi alchilici, ardici, arilalchilici, acilici, dove detti sostituenti alchilici, ardici, ardalchdici, acilici sono legati tramite un legame estereo, etereo, uretano; e dove gli ossidrili liberi dell’ oligosaccaride ciclico o del polisaccaride o di entrambi sono parzialmente o totalmente sostituiti con gruppi alchilici, ardici, ardalchdici, acilici, dove detti sostituenti sono legati tramite un legame estereo, etereo, uretano.
19. Polisaccaridi coniugati con oligosaccaridi ciclici secondo la rivendicazione 18 dove gli atomi di carbonio in posizione 6 del residuo glucosidico ded’ohgosaccaride non coinvolti nel legame etereo sono totalmente sostituiti con alogeni, con gruppi alchilici, ardici, ardalchdici, acilici, dove detti sostituenti alchilici, ardici, ardalchilici, acilici sono legati tramite un legame estereo, etereo, uretano; e dove gli ossidrili liberi dell’ oligosaccaride ciclico o del polisaccaride o di entrambi sono totalmente sostituiti con gruppi alchilici, ardici, ardalchilici, acilici, dove detti sostituenti sono legati tramite un legame estereo, etereo, uretano.
20. Polisaccaridi coniugati secondo una qualsiasi dede rivendicazioni 18-19 dove i sostituenti alogeni, ardici, ardalchilici, acilici sono: bromo, cloro, acetili, succinili, fendcarbammati eventualmente sostituiti con metili o con alogeni, benzoati eventualmente sostituiti con metili o con alogeni.
21. Polisaccaridi coniugati secondo una qualsiasi dede rivendicazioni 18-20 dove d grado di sostituzione, ovvero d rapporto tra moli di oligosaccaride ciclico e moli di monosaccaride del polisaccaride è compreso tra 0.05 e 1.
22. Polisaccaridi coniugati secondo una qualsiasi dede rivendicazioni 18-21 dove Γ oligosaccaride ciclico è costituito da 17-25 unità di residui di D-glucosio contenenti legami β-(1->2) oppure da 17-25 unità di residui di D-glucosio contenenti sia legami glucosidici β-(1->3) che β-(1->6) oppure da ciclodestrina costituita da 6-12 unità di (l->4)-α-D-glucosio.
23. Polisaccaridi coniugati secondo la rivendicazione 22 dove la ciclodestrina è oc-ciclodestrina, β-ciclodestrina o γ-ciclodestrina.
24. Polisaccaridi coniugati secondo una qualsiasi dede rivendicazioni 18-23 dove d polisaccaride è anionico o neutro o cationico.
25. Polisaccaridi coniugati secondo la rivendicazione 23 dove d polisaccaride ha peso molecolare medio pesato compreso tra 30000 e 2000000.
26. Polisaccaridi coniugati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 23-25 dove il polisaccaride è scelto tra acido ialuronico,suoi sali, suoi esteri al carbossile.
27. Polisaccaridi coniugati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 23-25 dove polisaccaride è un (l->3)-β-D-glucano o un (l-^4)-β-D-glucano o amido.
28. Processo per ottenimento dei polisaccaridi coniugati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 18-27 caratterizzato dai seguenti passaggi a)-e): a) Alogenazione, ovvero clorurazione o bromurazione o iodurazione dell’ oligosaccaride ciclico di partenza sul carbonio in posizione 6 del residuo glucosidico; b) Reazione di sostituzione dell’alogeno dell’ oligo saccaride ciclico con il polisaccaride mediante formazione di un legame etereo; c) Eventuale dealogenazione dell’ oligosaccaride ciclico; d) Reazione di esterificazione, eterificazione o carbamoilazione; e) Isolamento e purificazione del prodotto finale.
29. Processo secondo la rivendicazione 28 dove il grado di sostituzione del prodotto finale è compreso tra 0.05 e 1.
30. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 28-29 dove il polisaccaride è l’acido ialuronico, suoi sali, suoi esteri, un (1 ->4)-β-D-glucano o amido.
31. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 28-30 dove i sostituenti alogeni, ardici, arilalchilici, acilici sono: bromo, cloro, acetili, succinili, fenilcarbammati eventualmente sostituiti con metili o con alogeni, benzoati eventualmente sostituiti con metili o con alogeni.
32. Polisaccaridi coniugati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-14 o 18-27 per uso in medicina.
33. Polisaccaridi coniugati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1-14 o 18-27 per uso in chimica diagnostica, analitica o preparativa.
34. Uso di polisaccaridi coniugati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-14 o 18-27 per la preparazione di un medicamento.
35. Uso di polisaccaridi coniugati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 18-27 per la preparazione di fasi stazionarie chirali per cromatografia.
36. Complessi di inclusione comprendenti almeno un agente farmaceutico o diagnostico incluso nei polisaccaridi coniugati descritti in una qualsiasi delle rivendicazioni 1-14 o 18-27.
37. Composizioni comprendenti i polisaccaridi coniugati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-14 o 18-27 o loro complessi di inclusione secondo la rivendicazione 36 in combinazione con opportuni eccipienti per uso in medicina.
38. Composizioni comprendenti di polisaccaridi coniugati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 18-27 in combinazione con un supporto solido idoneo per la separazione cromatografica di enantiomeri o di miscele arricchite di racemi.