ITTO961040A1

ITTO961040A1 - Processo per la produziond di cefazolina

Info

Publication number: ITTO961040A1
Application number: IT96TO001040A
Authority: IT
Inventors: Ichiro Kawahara
Original assignee: Otsuka Kagaku Kk
Priority date: 1996-10-02
Filing date: 1996-12-18
Publication date: 1998-06-18
Also published as: IN187033B; IT1289763B1; CN1084750C; TW434317B; ES2129006B1; CN1178220A; JPH10101679A; ES2129006A1

Description

D E S C R I Z I O N E

del brevetto per Invenzione Industriale

La presente invenzione si riferisce a un nuovo procedimento per la produzione di cefazolina, e precisamente l'acido 7-(lH-tetrazol-l-il)-acetammido-3- (2-metil-l,3,4-tiadiazol-5-il)tiometil -3-cefem-4-carbossilico, che è largamente usato come antibiotico.

TECNICA PRECEDENTE

La cefazolina è un composto corrispondente alla seguente formula (V).

I procedimenti convenzionali per la prepara zione di cefazolina sono generalmente quelli che impiegano, come prodotto di partenza, l'acido 7-ammino-3-acetossimetil-3-cefem-4-carbossilico (7-ACA) .

Secondo la tecnologia di produzione convenzionaie, tuttavia, la reazione per introdurre un gruppo (2-metil-l,3,4-tiadiazol-5-il)tic per sostituzione della parte acetossilica del gruppo 3-acetossimetile nella posizione 3 di 7-ACA consente rese basse e bassa selettività, e la quantità sostanziale di prodotti secondari formati in questa reazione interferisce con la purificazione del prodotto desiderato.

Inoltre, nella tecnologia di produzione convenzionale, la resa e/oppure la purezza dell'intermedio per sintetizzare la cefazolina, cioè l'acido 7-ammino-3-(2-metil-l,3,4-tiadiazol-5-il) tiometil-3-cefem-4-carbossilico è bassa, per cui per produrre la cefazolina desiderata con elevata purezza e buona resa, questo composto intermedio deve essere purificato.

SOMMARIO DELL'INVENZIONE

Uno scopo della presente invenzione consiste nel superare gli inconvenienti suddetti, cioè la bassa selettività e la bassa resa della tecnologia precedente e provvedere un nuovo procedimento per produrre la cefazolina con elevata purezza in modo conveniente.

La presente invenzione provvede un procedimento per la produzione di acido 7-(lH-tetrazol-l-il)

che comprende le fasi di:

(i) far reagire un composto di formula (I)

in cui X rappresenta un atomo di alogeno e R<1 >rappresenta un gruppo protettore del carbossile, con 2-metil-5-mercapto-l ,3, 4-tiadiazolo di formula

in presenza di una base in almeno un solvente scelto dal gruppo costituito da solventi organici ed acqua, o far reagire il composto di formula (I) con un sale basico del composto di formula (Vili) in almeno un solvente scelto dal gruppo costituito da solventi organici ed acqua per formare un composto di formula (II)

in cui R<1 >rappresenta un gruppo protettore del carbossile,

(ii) sottoporre il composto di formula (II) a reazione di de-esterif icazione in presenza di un composto fenolico per ottenere l'acido 7-fenilacetammido-3- (2-metil-l, 3,4-tiadiazol-5-il) tiometil-3-cefem-4-carbossilico di formula (III)

(iii) sottoporre il composto di formula (III) a reazione di deacilazione per staccare il gruppo fenil acetilico con una penicillina G-amidasi immobilizzata, per ottenere l'acido 7-ammino-3- (2-metil-1, 3, 4—tiadiazol-5-il )tiometil-3-cefem-4-carbossilico di formula (IV)

(iv) far reagire il composto di formula (IV) con una anidride acida mista in presenza di una base in un solvente organico, in cui l'anidride acida mista viene preparata facendo reagire l'acido 1H-tetrazol-l-acetico di formula (VI)

con un alogenuro acido o un alchil alocarbonato di formula (VII)

in cui Y rappresenta un atomo di alogeno e R<2 >rappresenta un gruppo alchilico inferiore avente da 1 a 7 atomi di carbonio, che può essere sostituito con uno o più atomi di alogeno oppure un gruppo alcossilico inferiore avente da 1 a 7 atomi di carbonio che può essere sostituito con uno o più atomi di alogeno in presenza di una base in un solvente organico. Nello schema di reazione suddetto, che illustra il procedimento della presente invenzione, X nella formula (I) è preferibilmente un atomo di cloro, un atomo di bromo o un atomo di iodio e R<1 >nelle formule (I) e (II) è preferibilmente pmetossibenzile, difenilmetile o t-butile.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA<' >DELL<11 >INVENZIONE

Il procedimento secondo la presente invenzione impiega un derivato dell'estere 7-fenilacetammido-3-alogenometil-3-cefem-4-carbossilico di formula (I) (indicato in seguito come "composto (I)") come prodotto di partenza, e fornisce cefazolina con elevata resa ed alta selettività.

Il procedimento dell'invenzione è rappresentato dal seguente schema di reazione 1.

Prima fase

Come illustrato nello schema di reazione precedente 1, la prima fase del procedimento comprende il far reagire il composto (I) con 2-metil-5-mercapto-1, 3, 4-tiadiazolo (VIII) in presenza di una base o far reagire il composto (I) con un sale basico del composto (VIII), in almeno un solvente scelto dal gruppo costituito da solventi organici ed acqua per provvedere un composto di formula

(II)-Il composto (I) impiegato come prodotto di partenza nella presente invenzione è un composto noto e facilmente disponibile.

X nella formula (I) rappresenta un atomo di alogeno. Esempi di atomo di alogeno comprendono l'atomo di cloro, di bromo, di iodio, ecc.

R<1 >nella formula (I) rappresenta un gruppo protettore del carbossile. Come gruppo R<1 >per la protezione del carbossile si impiega un'ampia varietà di gruppi protettivi menzionati nel capitolo 5 di "Protettive Groups in Organic Synthesis", by Theodora W. Greene, 1981, John Wiley & Sons, Ine.

Quindi, qualsiasi gruppo protettivo è utilizzabile purché non venga distaccato durante la reazione di questa prima fase e possa essere eliminato nella seconda fase che verrà descritta in seguito. Così, per esempio, si possono menzionare benzile, p-metossibenzile, p-nitrobenzile, difenilmetile; trimetossibenzile, t-butile, metossietossimetile, piperonile, ditolilmetile, trimetossidiclorobenzile, triclorometile, bis (p-metossifenil) metile, ecc.

La procedura per trasformare il composto (I) in derivato dell'estere 7-fenilacetammido-3-(2-metil-1,3,4-tiadiazol-5-il )tiometil-3-cefem-4-carbossilico di formula (II) (indicato nel seguito come "composto (II)") comprende il miscelare il composto (I) con 2-metil-5-mercapto-l,3,4-tiadiazolo di formula (Vili) (indicato nel seguito come "composto (VIII)") in presenza di una base o miscelare il composto (I) con un sale basico del composto (Vili) precedentemente preparato.

Anche il composto (VIII) è noto e facilmente disponibile. Inoltre, la preparazione di un sale basico del composto (Vili) può anche venire realizzata facilmente in modo convenzionale, per esempio per neutralizzazione con una quantità necessaria di una base come idrossido di sodio.

La quantità di composto (VIII) o del suo sale basico può venire scelta in un ampio campo, ma è generalmente tra circa 1 e circa 100 moli, preferibilmente tra circa 1 e circa 10 moli per mole di composto (I).

La base che può venire usata in questa reazione della prima fase comprende bicarbonati, carbonati e idrossidi di metalli alcalini, come bicarbonato di sodio, bicarbonato di potassio, carbonato di sodio, carbonato di potassio, idrossido di sodio, idrossido di potassio, ammoniaca, ammine secondarie o terziarie sostituite con gruppi alchilici inferiori come metile, etile, propile, isopropile, tbutile, particolarmente di-o tri (C1-C4 alchil)animine, ed i loro corrispondenti sali di ammonio quaternario. La base da impiegare nella preparazione di detto sale basico del composto (Vili) può anche venire scelta tra le basi summenzionate.

La quantità di base è generalmente da circa 1 a circa 100 moli, preferibilmente da circa 1 a circa 10 moli, per mole di composto (I). Le basi summenzionate possono venire usate come miscela adatta di almeno due di loro.

Nella prima fase del procedimento secondo l'invenzione, come detta base si può impiegare una resina basica a scambio ionico. Tale resina basica a scambio ionico può essere scelta opportunamente tra le resine basiche a scambio ionico convenzionalmente impiegate nelle reazioni di questo tipo, e può essere qualsiasi resina basica a scambio ionico capace di influenzare la reazione del composto (I) e del composto (Vili). Sono utili sia resine basiche a scambio ionico fortemente basiche che debolmente basiche, ma è generalmente preferibile impiegare una resina a scambio ionico debolmente basica. Esempi tipici di tali resine a scambio ionico basiche comprendono quelle preparate dapprima clorometilando una resina di matrice macromolecolare avente una struttura reticolare tridimensionale e quindi amminando il prodotto risultante, ed esempi di matrice molecolare a reticolo tridimensionale comprendono un copolimero di un monomero costituente dominante come stirene ed un monomero reticolante come divinilbenzene, oppure un polimero acrilico.

Tali resine basiche a scambio ionico sono note e descritte, tra l'altro, in Saishin Kobunshi Zairyo Gijutsu Soran (Manual of Up-to-Date Polymer Materials and Technology) , December 9, 1988, Tekku Shuppan Kabushiki Kaisha, pp. 301-304.

Inoltre, queste resine basiche a scambio ionico sono commercialmente disponibili presso molti produttori. Come tipiche resine basiche a scambio ionico disponibile commercialmente, che sono utili nella presente invenzione, si possono menzionare Diaion<® >WA-10, WA-11, WA-20, WA-21, WA-30 (Mitsubishi Chemical Corp.), Amberlite<® >IRA-35, IRA-;93ZU, IEIA-94S (ORGANO CORP.), e Lewatit<® >MP-62, MP-64, AP-49, CA-9222 (Mitsui Toatsu Chemicals, Ine.). Indipendentemente da quelle sopraindicate, si può anche impiegare un'ampia scelta di altre resine basiche a scambio ionico, purché siano resine basiche a scambio ionico.

Non è necessario controllare criticamente la quantità di resina basica a scambio ionico. Generalmente,. essa viene usata in una quantità corrispondente ad una capacità operativa da circa 1 a circa 100 moli, preferibilmente da circa 1 a circa 10 moli per mole di composto (I).

Il solvente di reazione da usare nella reazione della prima fase può essere qualsiasi solvente o qualsiasi miscela solvente, purché sia in grado di disciogliere il composto (I), il composto (Vili) e la base, almeno fino ad un certo punto, e non interferisca con la reazione. È inteso che la resina a scambio ionico non deve venire disciolta. Quindi, il solvente di reazione che può venire usato comprende chetoni come acetone, metil etil chetone, dietil chetone, metil isobutil chetone, ecc., esteri come formiato di metile, formiato di etile, formiato di propile, acetato di metile, acetato di etile, acetato di propile, propionato di metile, propionato di etile, ecc., alcoli alifatici come metanolo, etanolo, propanolo, ecc., eteri come dietil etere, dipropil etere, dibutil etere, tetraidrofurano, diossano, ecc., idrocarburi alogenati come diclorometano, dibromometano, cloroformio, bromoformio, tetracloruro di carbonio, ecc., nitroalcani come nitrometano, nitroetano, nitropropano, ecc., nitrili come acetonitrile, propionitrile, butirronitrile, valeronitrile, ecc., tra gli altri solventi organici, come pure acqua. Particolarmente preferita è L'acqua oppure un. solvente organico idrosolubile scelto tra i vari solventi summenzionati. La quantità di solvente è generalmente da circa 1 a circa 100 parti in peso, preferibilmente da circa 5 a 20 parti in peso, per parte in peso di composto (I).

Questa reazione nella prima fase viene generalmente realizzata a pressione atmosferica, ma, quando necessario, può venire realizzata sotto pressione elevata. La temperatura di reazione è generalmente tra -20°C e 110°C, e preferibilmente tra 0°C e 80°C. Il tempo di reazione dipende dalla temperatura di reazione, concentrazione dei reagenti e numero di moli di composto (Vili) impiegate e simili, ma è generalmente tra 0,1 e 24 ore e preferibilmente tra 0,5 e 8 ore.

Riferendosi ulteriormente alla reazione suddetta, non vi sono particolari limitazioni al modo di miscelare il composto (I), il composto (VIII) e la base. Tipicamente, il composto (I) viene disperso nel solvente di reazione suddetto per preparare una dispersione, alla quale si aggiunge una soluzione contenente sia il composto (VIII) che una base. Tuttavia, il composto (I), il composto (VIII) e la base non devono necessariamente essere del tutto disciolti. Il sistema di reazione può essere qualsiasi sistema omogeneo o eterogeneo. Questa reazione viene realizzata in un reattore chiuso o in un reattore aperto. Completata la reazione, la miscela di reazione viene raffreddata tra circa 0°C e circa 10°C, se l-o si desidera, ed i cristalli risultanti vengono raccolti per filtrazione. In questo modo, il composto desiderato (II) può venire ottenuto con resa quantitativa.

Seconda fase

Per convertire il composto (II) a acido 7-fenilacetammido-3- (2-meti1-1,3,4-tiadiazol-5-il) tiometil-3-cefem-4-carbossilico di formula (III) (indicato in seguito come "composto (III)"), si può utilizzare il procedimento descritto nella pubblicazione di brevetto giapponese esaminata (Kokoku) n. H6-4638 (4638/1994).

Quindi, questa reazione di de-esterificazione viene condotta in un composto fenolico opzionalmente in presenza di un acido.

Il composto fenolico da usare nella presente invenzione comprende fenolo, n-cresolo, o-cresolo, p-cresolo, ecc. Si possono anche impiegare altri composti contenenti uno o più gruppi ossidrilici fenolici .

La quantità di composto fenolico da impiegare nella reazione è da circa 1 a circa 1000 moli, preferibilmente da circa 5 a circa 100 moli, per mole di composto (II).

In questa reazione si può impiegare un acido per accelerare la reazione, se lo si desidera. L'acido da usare per questo scopo comprende acidi minerali come acido cloridrico, acido solforico, acido nitrico, acido fosforico, ecc. ed acidi organici come acido formico, acido acetico, acido propionico, acido trifluoroacetico, ecc. Si possono pure impiegare altre sostanze acide. L'acido agisce come catalizzatore che accelera la reazione, e quindi può venire aggiunto in qualsiasi modo adatto. Inoltre, l'aggiunta dell'acido non è necessariamente essenziale. Quando si usa l'acido, la sua quantità è generalmente fino a circa 10 parti in peso, preferibilmente da circa 0,01 a 1 parte in peso, per parte in peso di composto (II).

In questa reazione, il composto fenolico funziona anche come solvente. Quindi, la reazione può essere realizzata senza l'uso di solvente. Tuttavia, se lo si desidera, si può utilizzare un solvente. Tali solventi comprendono chetoni come acetone, metil etil chetone, dietil chetone, metil isobutil chetone, ecc. , esteri come metil formiato, etil formiato, propil formiato, acetato di metile, acetato di etile, acetato di propile, propionato di metile, propionato di etile, ecc., alcoli alifatici come metanolo, etanolo, propanolo, ecc., eteri come dietil etere, dipropil etere, dibutil etere, tetraidrofurano, diossano, ecc.·, idrocarburi alogenati come diclorometano, dibromometano, cloroformio, bromoformio, tetracloruro di carbonio, ecc., nitroalcani come nitrometano, nitroetano, nitropropano, ecc., nitrili come acetonitrile, propionitrile, butirronitrile, valeronitrile, ecc., tra gli altri solventi organici, nonché acqua. Questi solventi possono venire usati da soli o in combinazione.

Questa reazione viene generalmente realizzata a pressione atmosferica, ma, quando necessario, può venire realizzata sotto pressione elevata. La temperatura di reazione è generalmente tra -20°C e 110°C e preferibilmente tra 0°C e 80°C. Il tempo di reazione dipende dalla temperatura di reazione, concentrazione dei reagenti, quantità di composto fenolico, quantità di catalizzatore acido, ecc., ma è generalmente tra 0,1 e 24 ore e preferibilmente tra 0,5 e 8 ore.

In questa reazione non vi sono particolari limitazioni sul modo di miscelare il composto (II) ed il composto fenolico, ed il catalizzatore acido, quando viene usato. Per esempio, il composto (II) viene aggiunto al composto fenolico oppure ad una soluzione del composto fenolico in detto solvente, che può opzionalmente contenere detto catalizzatore acido. Si comprenderà che il composto (II) e l'acido non devono necessariamente essere completamente disciolti. Il sistema di reazione può essere un sistema omogeneo o un sistema eterogeneo. Questa reazione può venire realizzata in un reattore chiuso oppure in un reattore aperto. Completata la reazione, il composto (III) formato viene estratto con una soluzione acquosa alcalina. La soluzione acquosa alcalina deve essere una soluzione acquosa di uno tra bicarbonati, carbonati e idrossidi di metalli alcalini, come bicarbonato di sodio, bicarbonato di potassio, carbonato di sodio, carbonato di potassio, idrossido di sodio, idrossido di potassio, ecc., ammoniaca, ammine secondarie o terziarie sostituite da gruppi alchilici inferiori come metile, etile, propile, isopropile, t-butile, ecc., particolarmente di- oppure tri (C1-C4 alchil) animine, ed i loro corrispondenti sali di ammo-nio quaternario. La concentrazione della soluzione è preferibilmente da circa 1 a circa 10% in peso ma non è limitata a questo campo.

Si aggiunge quindi un acido all'estratto acquoso fino a quando il suo pH raggiunge un valore al quale si verifica la precipitazione di cristalli. L'acido può essere opportunamente scelto tra una varietà di sostanze acide, e può per esempio essere un acido minerale come acido cloridrico, acido solforico, acido nitrico, ecc. oppure un aci-do organico come acido formico, acido acetico, acido propionico, ecc. I cristalli precipitati vengono raccolti per filtrazione, con il che si ottiene il desiderato composto (III) con elevata efficienza e con buona purezza.

Tuttavia, l'estratto acquoso precedente del composto (III), dopo essere purificato con un as-sorbente sintetico oppure una resina a scambio ionico, può venire sottoposto direttamente alla fase di reazione successiva.

L'assorbente sintetico o la resina a scambio ionico che può venire usata per detta purificazione comprende una varietà di assorbenti sintetici o resine a.scambio ionico che può eliminare il composto fenolico ed il solvente usato in questa seconda fase e lasciare nell'estratto acquoso solo quantità in tracce.

Esempi tipici di detti assorbenti sintetici sono polimeri reticolati porosi ottenuti mediante polimerizzazione in soluzione di stirene, un estere di acido metacrilico, vinil piridina o simili con un monomero reticolante come divinil benzene.

Le resine a scambio ionico che possono venire usate comprendono non soltanto le resine a scambio ionico basiche menzionate nella descrizione della prima fase, ma anche resine a scambio ionico acide. Tipiche resine a scambio ionico acide sono quelle ottenibili con l'introduzione di gruppi di acido solfonico, carbossilico o fosforico in una matrice polimerica con reticolo tridimensionale. Esempi di dette matrici polimeriche con reticolo tridimensionale comprendono un copolimero di stirene con un monomero reticolante come divinil benzene, un polimero acrilico oppure un polimero metacrilico.

Gli assorbenti sintetici e le resine a scambio ionico summenzionate sono notI e descritti, tra l'altro, in Saishin Kobunshi Zairyo-Gi jutsu Soran (Manual of Up-to-Date Polymer Materials and Technology), December 9, 1988, Tekku Shuppan Kabushiki Kaisha, pp. 301-306.

Inoltre, tali assorbenti sintetici e resine a scambio ionico sono commercialmente disponibili presso vari produttori. Come prodotti commercialmente disponibili che possono venire usati con vantaggio nella realizzazione della presente invenzione, si possono menzionare Diaion<® >tipo HP, SP, WK (WK-10, WK-11, WK-20), WA (WA-10, WA-11, WA-20, WA-21, WA-30) (tutti della Mitsubishi Chemical Corp.), Amberlite<® >AXT ,fAXT-33, ORGANO CORP.), IRA (IRA-35, IRA-93ZU, IRA-94S) (ORGANO CORP.), e Lewatit<® >MP-62, MP-64, AP-49 e CA-9222 (Mitsui Toatsu Chemicals, Ine.).

Altri assorbenti sintetici generalmente usati e resine a scambio ionico possono pure venire impiegati.

Quando si usa un tale assorbente sintetico oppure una resina a scambio ionico> è vantaggioso caricarlo nella colonna e far passare detto estratto acquoso attraverso la colonna.

Terza fase

Si effettua ora la conversione del composto (III) ad acido 7-ammino-3-(2-metil-l,3,4-tiadiazol-5-il)tiometil-3-cefem-4-carbossilico di formula (IV) (indicato in seguito come "composto (IV)") mediante reazione di deacilazione per staccare il gruppo fedii acetilico con l'uso di una penicillina G amidasi immobilizzata.

La penicillina G-amidasi immobilizzata per l'uso in questa reazione enzimatica può essere derivata da qualsiasi microorganismo. Sono per esempio impiegabili enzimi derivati da un microorganismo del genere Escherichia come Escherichia coli (ATCC-9367, ATCC-11105 e NCIB-6743), il genere Bacillus; come Bacillus gaterium (ATCC-14945), il genere Alcaligenes come Alcaliqenes faecalis (MB-10), il genere Arthrobactor come Arthrobactor viscosus ATCC-15294), il genere Nocardia come Nocardia sp (ATCC-13655), il genere Streptomyces come Streptomyces ambofaclens (SPSL-15), ed il genere Kluyvera come Kluyvera citrophila (KY-7844), tra vari altri. Indipendentemente dagli enzimi suddetti, si può anche impiegare qualsiasi altro enzima avente attività di penicillina G-amidasi. Questi enzimi sono noti e descritti, tra l'altro, nella pubblicazione di brevetto giapponese non esaminata (Kokai) n. H2-138188 (138188/1990).

La penicillina G-amidasi immobilizzata da usare nella presente invenzione è un enzima immobilizzato preparato immobilizzando detta penicillina G-amidasi su qualsiasi veicolo insolubile noto, come resina, che viene comunemente usata nella tecnica con il metodo convenzionalmente noto.

La penicillina G-amidasi immobilizzata da usare nella presente invenzione può essere un prodotto disponibile in commercio. Come esempi di tali prodotti disponibili in commercio, sono facilmente disponibili penicillina G-amidasi fissata su supporto venduta con il marchio "PGA-450" e "PGA-150", ambedue prodotte dalla Boehringer-Mannheim.

La quantità di detta penicillina G-amidasi immobilizzata può venire opportunamente scelta in un ampio campo e non deve necessariamente essere controllata criticamente, ma è generalmente di circa 1U a circa lOOkU, preferibilmente circa 10U a circa lkU, per g di composto (III).

Il campo di pH per questa reazione è tra 6 e 10 e preferibilmente tra 7 e 8. La base che può venire usata per il controllo del pH comprende resine basiche a scambio ionico, bicarbonati, carbonati e idrossidi di metalli alcalini, come bicarbonato di sodio, bicarbonato di potassio, carbonato di sodio, carbonato di potassio, idrossido di sodio, idrossido di potassio, ecc., ammoniaca, ammine secondarie o terziarie sostituite da gruppi alchilici inferiori come metile, etile, propile, isopropile, tbutile, ecc., particolarmente di- o tri (C1-C4 alchil) ammine, ed i corrispondenti loro sali di ammonio quaternario, ecc. Queste basi possono venire usate singolarmente oppure in una opportuna combinazione.

Le resine basiche a scambio ionico possono essere quelle menzionate con riferimento alla prima fase .

La concentrazione della base per il controllo del pH non è limitata, purché la reazione non subisca interferenze.

La temperatura di reazione non deve essere così alta da inattivare l'enzima, ed è generalmente tra circa 10°C e circa 40°C, e preferibilmente tra circa 20°C e circa 35°C.

Generalmente il solvente di reazione è preferibilmente acqua, ma purché l'enzima, il composto (III) ed il composto ottenuto (IV) non siano influenzati negativamente, si può, al caso, aggiungere un solvente organico come esteri di acidi grassi inferiori, per esempio acetato di etile, acetato di butile, ecc. e alcoli alifatici inferiori, come metanolo, etanolo, alcole isopropilico, ecc. La quantità di acqua o di miscela di acqua con il solvente organico non deve necessariamente essere controllata in modo critico, e può essere scelta opportunamente in un ampio campo. Così, essa è generalmente da circa 1 a circa 10.000 parti in peso, preferibilmente da circa 10 a circa 100 parti in peso, per parte in peso di composto (III).

Il modo in cui il composto di partenza (III), l'enzima ed il solvente vengono miscelati non è critico, a meno che interferisca con la reazione. Generalmente, il composto (III) e l'enzima vengono aggiunti al solvente come acqua, e la miscela viene agitata, regolando temperatura e pH all'interno dei rispettivi limiti summenzionati. Questa reazione viene generalmente realizzata a pressione atmosferica, ma, quando necessario, può venire realizzata sotto pressione elevata. Il reattore può essere un reattore chiuso oppure un reattore aperto.

Il tempo di reazione dipende dalla temperatura di reazione, concentrazione dei reagenti e quantità di enzima rispetto al composto (III), tra l'altro, ma è generalmente da circa 0,1 a circa 24 ore, e preferibilmente tra circa 0,1 e circa 8 ore.

Completata la reazione, il catalizzatore viene separato per filtrazione ed il filtrato viene portato al punto isoelettrico (pH 3,8) con un acido, in modo da consentire la precipitazione del composto (IV). I cristalli vengono raccolti per filtrazione ottenendo il composto (IV) con elevata purezza e con resa quantitativa. Come si è detto prima, il procedimento convenzionale per la produzione del composto (IV) che comprende l'introduzione di un gruppo 2-metil-l,3,4-tiadiazol-5-mercapto nel gruppo metilico nella posizione 3 di un derivato dell'acido 7-ammino cefalosporanico ha una efficienza di reazione bassa, e la purezza del composto (IV) e l'economia del procedimento sono insoddisfacenti.

Al contrario, secondo il procedimento della presente invenzione che comporta le suddette prima, seconda e terza fase, il composto intermedio (IV) può venire ottenuto con alte rese ed elevata purezza.

Quarta fase

Per ottenere il composto desiderato di formula (V) dal composto (IV), si impiega il cosiddetto metodo all'anidride mista, nel quale si fa reagire il composto (IV) con una anidride acida mista.

(a) Preparazione dell'anidride acida mista L'anidride acida mista da impiegare nella presente Invenzione può venire preparata, per esempio, con la procedura seguente. Si fa reagire acido 1H-tetrazol-l-acetico di formula (VI)

in presenza di una base, in un solvente organico, con un alogenuro acido oppure alchil alocarbonato di formula (VII)

in cui Y rappresenta un atomo-di alogeno come cloro, bromo o iodio, e .R<2 >rappresenta un gruppo alchilico inferiore avente da 1 a 7, preferibilmente da 2 a 5, atomi di carbonio, che viene opzionalmente sostituito con uno o più atomi di alogeno, oppure R<2 >rappresenta un gruppo alcossilico inferiore avente da 1 a 7, preferibilmente da 2 a 5, atomi di carbonio che viene opzionalmente sostituito con uno o più atomi di alogeno.

Con riferimento alla suddetta formula (VII), il gruppo rappresentato da R<2 >è un alchile Ci-C7, preferibilmente C1-C5 oppure un gruppo alcossilico o alo alchilico o un gruppo alo alcossilico corrispondente a detto gruppo alchilico o alcossilico sostituito con da 1 a 14, preferibilmente da 1 a 5, più preferibilmente da 1 a 2, atomi di alogeno. L'atomo di alogeno può essere per esempio cloro, bromo o iodio.

Tra i composti di formula (VII) (indicati nel seguito come "composto (VII)"), che possono venire usati per la preparazione di detta anidride acida mista con acido lH-tetrazol-l-acetico di formula (VI), si possono menzionare alogenuri acidi di acidi grassi inferiori contenenti da 2 a 8 atomi di carbonio, preferibilmente da 3 a 6 atomi di carbonio. Specifreamente, si possono menzionare alogenuri acidi (cloruri, bromuri, ioduri, ecc.) di acido acetico, acido propionico, acido pivalico, acido valerico, acido isovalerico, ecc., cloruro di bromoacetile, cloruro di 2-cloropropionile, cloruro di 3-cloropropionile, cloruro di 4-clorobutirrile, ecc.

L'alchil alocarbonato che è pure rappresentato dalla formula (VII) comprende i composti in cui il gruppo alcossilico rappresentato da R<2 >è un gruppo alcossilico C1-C7, preferibilmente C1-C4, come metossile, etossile, propilossile, isopropilossile, butilossile o t-butilossile, e l'atomo di alogeno rappresentato da Y è cloro, bromo o iodio.

Per la preparazione dell'anidride acida mista suddetta, si impiega generalmente il composto (VII) in una quantità da circa 1 a circa 50 moli, preferibilmente da circa 1 a circa 10 moli, per mole di acido lH-tetrazol-l-acetico di formula (VI).

La base che può venire usata per questa reazione comprende resine basiche a scambio ionico, bicarbonati, carbonati e idrossidi di metalli alcalini, come bicarbonato di sodio, bicarbonato di potassio, carbonato di sodio, carbonato di potassio, idrossido di sodio, idrossido di potassio, ecc., ammine secondarie o terziarie sostituite da gruppi alchilici inferiori come metile, etile, propile, isopropile, t-butile, ecc., particolarmente di- o tri (Ci-C-j alchil)ammine, e i corrispondenti sali di ammonio quaternari.

Le resine basiche a scambio ionico possono essere quelle menzionate con riferimento alla prima fase.

La quantità di base è generalmente da circa 0,1 a circa 50 moli, preferibilmente da circa 0,5 a circa 10 moli, per mole di composto (VI). (Nel caso di una resina basica a scambio ionico, la resina viene usata in una quantità corrispondente ad una capacità operativa da circa 0,1 a circa 50 moli, preferibilmente da circa 0,5 a circa 10 moli, per mole del composto (VI)..)

Nella preparazione di detta anidride acida mista, è più preferibile che il composto (VI), il composto (VII) e la base vengano impiegati in quantità equimolari o sostanzialmente equimolari.

Il solvente organico che può venire usato nella preparazione di detta anidride acida mista comprende vari chetoni come acetone, metil etil chetone, dietil chetone, metil isobutil chetone, ecc., esteri come formiato di metile, formiato di etile, formiato di propile, acetato di metile, acetato di etile, acetato di propile, propionato di metile, propionato di etile, -ecc., alcoli alifatici come metanolo, etanolo, propanolo, ecc., eteri come dietil etere, dipropil etere, dibutil etere, tetraidrofurano, diossano, ecc., idrocarburi alogenati come diclorometano, dibromometano, cloroformio, bromoformio, tetracloruro di carbonio, ecc., nitroalcani come nitrometano, nitroetano, nitropropano, ecc., e nitrili come acetonitrile, propionitrile, butirronitrile, valeronitrile, ecc., questi solventi possono venire usati da soli o in miscela. Solventi particolarmente preferiti, tra i solventi summenzionati, sono idrocarburi alogenati ed eteri.

La quantità di detto solvente organico è da circa 1 a circa 1000 parti in peso, preferibilmente da circa 5 a circa 100 parti in peso per parte in peso di composto (VI).

Le condizioni di reazione possono venire opportunamente scelte in accordo con quelle convenzionalmente usate.

Generalmente, la temperatura di reazione è da circa -50°C a circa 50°C e preferibilmente da circa -30°C a circa 10°C. Il tempo di reazione è da circa 0,1 a circa 24 ore e preferibilmente da circa 0,1 a circa 8 ore.

Completata la reazione, è preferibile che la miscela di reazione venga mantenuta a circa 0°C per un tempo da 0 a circa 8 ore per stagionare l'anidride acida mista.

(b) Reazione dell'anidride acida mista con il composto (IV)

La corrispondente anidride acida mista così preparata viene fatta reagire con l'acido 7-ammino-3-(2-metil-l,3,4-tiadiazol-5-il)tiometil-3-cefem-4-carbossilico di formula (IV) in presenza di una base in un solvente organico, ottenendo il prodotto desiderato, cioè l'acido 7-(lH-tetrazol-l-il) acetammido-3- (2-metil-l,3,4-tiadiazol-5-il)tiometil-3cefem-4-carbossilico di formula (V).

In questa reazione, l'anidride acida mista viene usata in una quantità tra circa 1 e circa 50 moli, preferibilmente da circa 1 a circa 10 moli, per mole di composto (IV).

Come anidride acida mista, la miscela di reazione ottenuta nella precedente fase (a) viene usata come tale. Poiché questa miscela di reazióne contiene l'anidride acida mista ottenuta generalmente con una resa da circa il 60 a circa l'80%, di ciò si tiene conto nel fissare le quantità di anidride acida mista e di composto (IV) dal campo summenzionato .

La base che può venire usata per questa reazione comprende le basi menzionate nella descrizione di "(a) preparazione di una anidride acida mista" precedente. La quantità di base è generalmente da circa 1 a circa 100 moli, preferibilmente da circa 1 a circa 30 moli, per mole di composto (IV) . Quando come base si impiega una resina a scambio ionico, essa viene usata in una quantità corrispondente ad una capacità-operativa da circa 1 a circa 100 moli, preferibilmente da circa 1 a circa 30 moli, per mole di composto (IV).) In un rapporto adatto si può usare più di un tipo di base

Il solvente organico da usare per questa reazione può essere qualsiasi tipo di solvente organico, oppure una miscela di solventi, in cui il composto (IV) e l'anidride acida mista siano solubili almeno parzialmente e che non interferisca con la reazione. Esempi di solventi comprendono chetoni come acetone, metil etil chetone, dietil chetone, metil isobutil chetone, ecc., esteri come formiato di metile, formiato di etile, formiato di propile, acetato di metile, acetato di etile, acetato di propile, propionato di metile, propionato di etile, ecc., alcoli alifatici come metanolo, etanolo, propanolo, ecc., eteri come dietil etere, dipropil etere, dibutil etere, tetràidrofurano, diossano, ecc., idrocarburi alogenati come diclorometano, dibromometano, cloroformio, bromoformio, tetracloruro di carbonio, ecc., nitroalcani come nitrometano, nitroetano, nitropropano, ecc., nitrili come acetonitrile, propionitrile, butirronitrile, valeronitrile, ecci,.tra gli altri solventi organici. Particolarmente preferiti sono gli idrocarburi alogenati e gli eteri.

La quantità di solvente è da 1 a 100 parti in peso, preferibilmente da circa 5 a 20 parti in peso per parte in peso di composto (IV).

Questa reazione viene generalmente realizzata a pressione atmosferica, ma quando necessario, può venire realizzata sotto pressione elevata. La temperatura di reazione è generalmente tra -50°C e 110°C e preferibilmente tra -30°C e 10°C. Il tempo di reazione dipende dalla temperatura di reazione, la concentrazione dei reagenti e la quantità di anidride acida mista, ma è generalmente da 0,1 a 24 ore e preferibilmente da 1 a 8 ore.

Il modo in cui il composto (IV), l'anidride acida mista e la base vengono miscelate in questa quarta fase non è critico. Così, per esempio, una soluzione omogenea di -composto (IV) in detto solvente organico viene aggiunta gradualmente alla soluzione di anidride acida mista precedentemente preparata. Il tempo dell'addizione della base non è critico soltanto se la base viene aggiunta prima di detta soluzione di composto (IV) e l'anidride acida mista non viene miscelata.

Il composto (V) desiderato così ottenuto, cioè la cefazolina, può venire isolato e purificato in modo convenzionale. Un procedimento di purificazione preferito comprende l'aggiunta di acqua alla miscela di reazione in modo da estrarre la cefazolina nello strato acquoso regolando il pH dal lato acido, con successiva ricristallizzazione. Se desiderato, lo strato acquoso ottenuto effettuando

l'estrazione suddetta può venire sottoposto, in

modo convenzionale, ad un trattamento con carbone

attivato o ad un trattamento con un assorbente sintetico o resina a scambio ionico che sono esemplificati con riferimento alla terza fase.

Quindi, partendo dal composto (I) e realizzando le suddette prima, seconda, terza e quarta fase

secondo la presente invenzione, si può ottenere cefazolina di elevata purezza e con alte rese.

Inoltre, effettuando detta prima, seconda e JU terza fase, l'intermedio utile per la preparazione o della cefazolina, e precisamente l'acido 7-ammino-3- (2-metil-l,3,4-tiadiazol-5-il) tiometil-3-cefem-4-carbossilico di formula (IV), può venire prodotto

con alta resa ed elevata purezza senza ricorrere ad

alcuna purificazione, con il risultato che il prodotto finale, cioè la cefazolina, può anche essere

ottenuto con elevata resa ed elevata purezza.

ESEMPI

I seguenti esempi intendono semplicemente descrivere la presente invenzione in modo più dettagliato e non devono in alcun modo essere considerati come limitativi dello scopo dell'invenzione. Si comprenderà che il composto intermedio ottenuto in ciascuna delle prima, seconda e terza fasi e la cefazolina, come ottenuta nella quarta fase, sono tutti composti noti. Questi composti intermedi e la cefazolina vengono sottoposti ad analisi spettrometrica, precisamente IR, NMR e spettrometria di massa, come pure la cromatografia ad alta risoluzione (HPLC), e che le loro strutture vengono identificate dal fatto che i dati ottenuti concordano con i corrispondenti dati di campioni autentici .

Esempio 1

(1) Prima fase

Preparazione di p-metossibenzil 7-fenilacetammido-3- (2-metil-l,3,4-tiadiazol-5 il) tiometil-3-cefem-4-carbossilato.

In un pallone a 4 colli da 200 mi si caricano 10 g di p-metossibenzil 7-fenilacetammido-3-clorometil-3-cefem-4-carbossilato (indicato nel seguito per brevità "GCLE") e 100 mi di acetone, e la miscela viene riscaldata a 35°C sotto agitazione. Con questo procedimento, la parte principale di GCLE non si discioglie completamente ma forma una poltiglia.·

Parallelamente, 3,3 g di 5-metil-2-mercapto-1,3, 4-tiadiazolo vengono disciolti in 22,6 mi di soluzione acquosa IN di idrossido di sodio. Questa soluzione viene aggiunta goccia a goccia alla poltiglia suddetta nel tempo di 20-30 minuti. Mentre si completa l'aggiunta goccia a goccia, la poltiglia diventa una soluzione omogenea, ma dopo pochi minuti cominciano a formarsi cristalli.

10 minuti dopo il completamento dell'aggiunta goccia a goccia, si aggiungono 4,2 mi di acido cloridrico 0,5 N e la miscela viene agitata per 10 minuti. Quindi, aggiungendo goccia a goccia 89 mi di acqua, si raffredda la miscela di reazione a 5°C o meno per la cristallizzazione e la si lascia -riposare per 1 ora.

Dopo il riposo, i cristalli di p-metossibenzil 7-f enilacetammido-3- (2-metil-l,3,4-tiadiazol-5-il) tiometil-3-cefem-4-carbossilato (indicato nel seguito per brevità "GTDE") vengono raccolti filtrando per aspirazione e lavando con 10 mi di acetone freddo. L'essiccamento dei cristalli di GTDE così ottenuti sotto vuoto e ad una temperatura fino a 40°C, consente di ottenere 11,64 g (resa 97%) di GDTE secco.

(2) Seconda fase

Preparazione dell'acido 7-fenilacetammido-3-(2-metil-l,3,4-tiadiazol-5-iì) tiometil-3-cefem-4-carbossilico .

In un pallone a 4 colli da 200 mi di capacità, si caricano 60 mi di m-cresolo e 0,24 mi di acido solforico concentrato e si riscalda a 35°C. Si aggiungono quindi 10 g di GTDE secco e si fa reagire. Controllando la temperatura nel campo tra 30 e 40°C, la reazione viene condotta sotto controllo per circa 2-3 ore.

Completata la reazione, si aggiungono 200 mi di acetato di butile e si raffredda la miscela a 5°C o meno. A questa miscela di reazione raffreddata si aggiungono 65 mi di una soluzione acquosa al 4% di bicarbonato di sodio in modo da estrarre 1'acido 7-fenilacetammido-3- (2-metil-l,3,4-tiadiazol-5-il)tiometil-3-cefem-4-carbossilico (indicato nel seguito per brevità "GTDA") nello strato acquoso, che viene poi separato. Si aggiungono altri 10 mi di acqua allo strato di acetato di butile/mcresolo ed il GTDA rimanente in questa fase viene ulteriormente estratto nella fase acquosa. I due estratti acquosi di GTDA vengono riuniti e lavati con 30 mi di acetato di butile, quindi lo strato di acetato di butile viene scartato.

La soluzione acquosa risultante di GTDA sodico viene caricata in una colonna di perline di resina ad alta porosità (25 mi di resina AXT-33, prodotta dalla ORGANO CORP.). La colonna viene quindi lavata con 75 mi di acqua.

(3) Terza fase

Preparazione dell'acido 7-ammino-3-(2-metil-1,3,4-tiadiazol-5-il )tiometil-3-cefem-4-carbossilico

L'estratto acquoso di GTDA (in soluzione acquosa di bicarbonato sodico) ed i lavaggi della colonna della seconda fase vengono riuniti, e quindi trasferiti in un reattore enzimatico contenente 4 g di penicillina G-amidasi fissata su supporto (denominazione commerciale "PGA-450", prodotta dalla Boehringer-Mannheim) e si effettua la deacilazione enzimatica sotto agitazione, mantenendo la temperatura di reazione a 28°C ed il pH tra 7,7 e 8,1.

Per controllare il pH si impiega ammoniaca in soluzione acquosa IN. Quando cessa il consumo di ammoniaca, è segno che la reazione ha raggiunto il suo punto finale. Quando la reazione è completa, l'enzima viene separato per filtrazione e lavato con acqua distillata. La soluzione di acido 7ammino-3- (2-metil-l,3,4-tiadiazol-5-il)tiometil-3-cefem-4-carbossilico (indicato nel seguito per brevità "ATDA"( così prodotta pressoché quantitativamente, viene raffreddata a 5°C o meno, e portata a pH 3,8 con acido cloridrico 3N. Dopo aver regolato il pH la soluzione viene lasciata riposare a 5°C o meno per 1 ora. I cristalli di ATDA che precipitano vengono raccolti per filtrazione e lavati con 20 mi di acqua fredda, quindi con 20 mi di acetone. Essiccando i cristalli di ATDA così ottenuti sotto vuoto ad una temperatura non superiore a 40°C, si ottengono 5,55 g di ATDA secco. (Resa 94%, resa totale per la seconda e terza fase combinate, in base a GTDE).

(4) Quarta fase

Sintesi di cefazolina

(i) Preparazione di una anidride acida mista In un pallone a 4 colli da 100 mi si caricano 3,72 g di acido ΙΗ-tetrazol-l-acetico e 40 mi di cloruro di metilene, quindi si aggiungono 2,94 g di trietilammina e la miscela viene raffreddata a -10°C. Ad una temperatura di -10°C o meno, si aggiungono 3,32 g di cloruro di pivaloile. La temperatura viene poi regolata a 0°C e la miscela viene lasciata riposare a tale temperatura per 1 ora.

(ii) Preparazione di una soluzione di ATDA in cloruro di metilene

In un pallone a 4 colli da 100 mi si caricano 4,3 g di diisopropilammina e 30 mi di cloruro di metilene. In questa soluzione di cloruro di metilene si disciolgono 2,94 g di ATDA e la soluzione viene raffreddata a -20°C o meno.

(iii) Reazione per la sintesi della cefazolina.

Alla soluzione di anidride acida mista preparata in (i) precedente si aggiunge goccia a goccia la soluzione in cloruro di metilene di ATDA preparata in (ii) nel tempo di 20-30 minuti, ad una temperatura di -20°C o meno.

Completata l'aggiunta goccia a goccia, si interrompe il raffreddamento e la miscela viene agitata a temperatura ambiente per 30 minuti. Confermato il punto finale della reazione si aggiungono 60 mi di acqua alla miscela di reazione per estrarre la cefazolina, e lo strato acquoso viene separato. Si aggiungono ancora 40 mi di acqua allo strato di cloruro di metilene per estrarre altra cefazolina. I due estratti di cefazolina vengono combinati e portati a pH 4,5.

L'estratto acquoso di cefazolina viene poi lavato con 30 mi di diclorometano..La miscela viene agitata, le fasi vengono lasciate separare e la fase di diclorometano viene scartata. Allo strato acquoso si aggiungono 1,5 g di carbone attivato e la miscela viene agitata per 15 minuti. Si separa per filtrazione il carbone attivato ed il filtrato si porta a pH 2 con acido cloridrico 3 N per la cristallizzazione, lasciando riposare a 5°C o meno per 1 ora.

Dopo riposo, i cristalli di cefazolina vengono raccolti per filtrazione e lavati con 20 mi di acqua fredda. I cristalli vengono essiccati sotto vuoto ad una temperatura di 40°C o meno, ottenendo così 6/07 g (resa 92%) di cristalli di cefazolina.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la produzione di acido 7-(IH-tetrazol-l-il )acetammido-3- (2-metil-l,3, 4-tiadiazol-5-il) tiometil-3-cefem-4- carbossilico di formula (V)

che comprende le fasi di: (i) far reagire un composto di formula (I)

in cui X rappresenta un atomo di alogeno e R<1 >rappresenta un gruppo protettore del carbossile, con 2-metil-5-mercapto-l, 3,4-tiadiazolo di formula (Vili)

in presenza di una base in almeno un solvente scelto dal gruppo costituito da solventi organici ed acqua,, o far reagire il composto di formula (I) con un sale basico del composto di formula (Vili) in almeno un solvente scelto dal gruppo costituito da solventi organici ed acqua, per ottenere un composto di formula (II)

in cui R<1 >rappresenta un gruppo protettore del carbossile, (ii) sottoporre il composto di formula (II) a reazione di de-esterif icazione in presenza di un composto fenolico per ottenere l'acido 7-fenilacetammido-3- (2-metil-l, 3,4-tiadiazol-5-il ) tiometil-3-cefem-4-carbossilico di formula (III)

(iii) sottoporre il composto di formula (III) a reazione di deacilazione per separare il gruppo fenil acetilico con una penicillina G-amidasi immobilizzata per ottenere l'acido 7-ammino-3- (2-metil

(iv) far reagire il composto di formula (IV) con una anidride acida mista in presenza di una base in un solvente organico, in cui detta anidride acida mista viene preparata facendo reagire acido lH-tetrazol-l-acetico di formula (VI)

con un alogenuro acido oppure un alchil alocarbonat di f l (VII)

in cui Y rappresenta un atomo di alogeno e R<z >rappresenta un gruppo alchilico inferiore avente da 1 a 7 atomi di carbonio che può essere sostituito con uno o più atomi di alogeno oppure R<2 >rappresenta un gruppo alcossilico inferiore avente da 1 a 7 atomi di carbonio che può essere sostituito con uno o più atomi di alogeno in presenza di una base in un solvente organico.
2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui X nella formula (I) rappresenta un atomo di cloro, un atomo di bromo o un atomo di iodio, e R<1 >nella formula (I) e nella formula (II) rappresenta p-metossibenzile, difenilmetile o t-butile.
3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui la base da impiegare nella fase (i) è un prodotto scelto dal gruppo costituito da bicarbonati di metalli alcalini, carbonati di metalli alcalini, idrossidi di metalli alcalini, ammoniaca, dio tri-(Ci-C4 alchil) ammine, i corrispondenti sali di ammonio quaternario e resine a scambio ionico basiche.
4. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui il composto fenolico da impiegare nella fase (ii) è fenolo, m-cresolo, o-cresolo o p-cresolo.
5. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui la reazione di de-esterif icazione del composto di formula (II) in un composto fenolico nella fase (ii) viene realizzata in presenza di un acido.
6. Procedimento secondo la rivendicazione 1, che comprende inoltre la fase di estrazione della miscela di reazione ottenuta dopo la deesterificazione nella fase (ii) con una soluzione acquosa alcalina, la purificazione dell'estratto acquoso con un assorbente sintetico oppure una resina a scambio ionico e quindi la reazione di deacilazione sull'estratto purificato per distaccare il gruppo fenil acetilico nella fase (iii).
7. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui la penicillina G-amidasi immobilizzata per l'uso nella fase (iii) è un enzima avente una attività di penicillina G-amidasi.
8. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui R<2 >nella formula (VII) è un gruppo alchilico o alcossilico Ci-Cs oppure un gruppo alchilico o alcossilico C1-C5 sostituito con da 1 a 5 atomi di alogeno.
9. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui la base da impiegare nella fase (iv) è almeno un composto scelto dal gruppo costituito da resine basiche a scambio ionico, idrossidi di metallo alcalino, bicarbonati di metallo alcalino, carbonati di metallo alcalino, di- o tri(Ci-C4 alchil)animine ed i corrispondenti sali di ammonio quaternario .