ITRM20130253A1 - Metodo per la determinazione del rame libero - Google Patents

Metodo per la determinazione del rame libero

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ITRM20130253A1
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Nicola Antonio Colabufo
Marcello Leopoldo
Roberto Perrone
Rosanna Squitti
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Description

"METODO PER LA DETERMINAZIONE DEL RAME LIBERO"
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda un nuovo metodo per la determinazione della concentrazione di rame 'libero' nel siero, cioà ̈ la porzione di rame nel siero strutturalmente non legato alla ceruloplasmina. La presente invenzione si riferisce anche a un metodo con un alto grado di sensibilità e precisione per la determinazione del rame libero in campioni di siero di pazienti con malattia di Alzheimer.
STATO DELLA TECNICA ANTERIORE
La determinazione del rame nel siero à ̈ di primaria importanza in un gran numero di malattie, come ad esempio nella malattia di Alzheimer (AD). La malattia di Alzheimer à ̈ una malattia neurologica caratterizzata da perdita di memoria e demenza progressiva. La causa della malattia appare strettamente correlata all’aggregazione all'interno del cervello della proteina beta-amiloide (Ap) e dei peptidi tau. Inoltre, à ̈ stato dimostrato che l’allele epsilon 4 del gene dell’apolipoproteina E (APOE) aumenta il rischio della malattia di Alzheimer. Sulla 'cascata amiloide', che à ̈ riconosciuta come l’ipotesi più popolare per l’insorgenza dell’Alzheimer, sono emersi recentemente nuovi dettagli. In effetti, sono state teorizzati diversi percorsi patogenetici che contribuiscono all’insorgenza della malattia di Alzheimer e alla sua progressione. Ci sono molti dati sperimentali che provano che lo stress ossidativo, principalmente attraverso reazioni di ossido-riduzione di metalli, può causare danni al cervello nei malati di Alzheimer. Specificamente, à ̈ stato proposto che l’iper metallizzazione della proteina beta-amiloide può essere alla base di cicli redox di stress ossidativo e produzione di H2O2, determinando la formazione di oligomeri di proteina beta amiloide e loro precipitazione. Uno squilibrio dell'omeostasi dei metalli porta alla formazione di rame libero che può alimentare il serbatoio di rame nel cervello ed entrare in cicli di stress ossidativo della proteina beta amiloide, generando effetti pleiotropici sulla malattia di Alzheimer. Questa tesi à ̈ ora sostenuta da diversi dati sperimentali che dimostrano che il rame libero à ̈ leggermente ma significativamente aumentato nel siero di pazienti con malattia di Alzheimer.
La ceruloplasmina à ̈ la principale proteina che trasporta il rame nel sangue e si lega strutturalmente a 6 atomi di rame, per formare una forma attiva della proteina, che può rappresentare circa l’85-95% del rame in circolazione nel sangue, il restante rame à ̈ definito libero. In studi precedenti gli inventori hanno determinato la concentrazione di rame libero nel siero a partire da misure di rame e ceruloplasmina, con il seguente calcolo: la concentrazione di rame nel siero à ̈ stata controllata sia con la tecnica di assorbimento atomico utilizzando lo spettrofotometro ad assorbimento atomico A Aanalyst 300 Perkin Elmer dotato di un forno di grafite con piattaforma HGA 800, o secondo il metodo colorimetrico di Abe et al. Clin Chem 1989 (Randox Laboratories, Crumlin, UK); la concentrazione di ceruloplasmina à ̈ stata analizzata mediante saggio in immunoturbidimetria (Horiba ABX, Montpellier, Francia secondo Crit Lupo Pl Rev Clin Lab Sci 1982), per ogni coppia di rame sierico e ceruloplasmina à ̈ stata calcolata la quantità di rame legato alla ceruloplasmina (CB) e la quantità di rame non legato alla ceruloplasmina (rame 'libero') a seguito di procedure standard descritte in Walsh et al. Ann Clin Biochem 2003. Questo calcolo esprime il rame 'libero' in µmol/L e si basa sul dato che la ceruloplasmina contiene 0,3% di rame. Inoltre, gli inventori hanno recentemente descritto una procedura per misurare l'attività ossidasi ceruloplasmina che utilizza o-diansidine dicloridrato come substrato.
Precedentemente sono stati descritti metodi per determinare la quantità di ceruloplasmina a partire dall’attività ossidasica della proteina con uno standard commerciale (siero umano ceruloplasmina, Sigma-Aldrich), ma l’analisi spettroscopica ha rivelato un decadimento nel picco di assorbanza della proteina, diminuendo la sicurezza nell'uso della rilevazione enzimatica per quantificare la quantità di proteine, necessario a stimare il valore di rame libero.
La quantificazione del rame e della ceruloplasmina basata sui metodi enzimatici decritti nello stato della tecnica presenta numerosi svantaggi quali ad esempio un costo elevato, la purezza variabile della ceruloplasmina commercialmente disponibile, la raccomandazione generale di riferire enzimi sierici in unità internazionali (UI) e un basso grado di accuratezza della concentrazione determinata.
Hyo Jung Sung et al. (J. Am. Chem. Soc..2009) descrive la sintesi e l'utilizzo di sonde cumariniche per la determinazione del rame libero in sistemi biologici.
Scopo della presente invenzione à ̈ quello di fornire nuovi metodi e kit per misurare il rame libero nel siero che non presentano gli svantaggi della tecnica nota.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
Oggetto della presente invenzione à ̈ un metodo in vitro per determinare la concentrazione di rame libero in un campione di siero comprendente i seguenti passaggi:
a) caricare detto campione di siero su una resina per estrazione su fase solida ottenendo una frazione legata a detta resina, e una frazione eluita contenente il rame libero;
b) determinare la concentrazione di rame libero nella frazione eluita nel passaggio a) utilizzando una sonda fluorescente cumarinica.
Un ulteriore oggetto dell'invenzione à ̈ un metodo in vitro per determinare la concentrazione di rame per la diagnosi della malattia di Alzheimer in un paziente comprendente gli stessi passaggi a), b) ed un ulteriore passaggio c) in cui si confronta il valore determinato nel passaggio b) con un valore di soglia (cut-off), in cui una maggiore concentrazione di rame conferma la diagnosi clinica di malattia di Alzheimer. Un ulteriore oggetto dell'invenzione à ̈ un metodo in vitro per determinare la concentrazione di rame per la prognosi della malattia di Alzheimer in un paziente in cui i passaggi a) e b) del metodo vengono ripetuti su campioni di siero di detto paziente raccolti in momenti successivi ed à ̈ valutata la variazione nel tempo della concentrazione di rame libero in detti campioni.
Un ulteriore oggetto dell'invenzione à ̈ un metodo in vitro per determinare la concentrazione di rame per la valutazione della predisposizione alla conversione da uno stato di decadimento cognitivo lieve (MCI o anche decadimento cognitivo lieve) a malattia di Alzheimer in un paziente sofferente di decadimento cognitivo lieve comprendente un ulteriore passaggio c) in cui si confronta il valore determinato nel passaggio b) con un valore di soglia (cut-off), in cui una più alta concentrazione di rame indica la conversione da decadimento cognitivo lieve a malattia di Alzheimer. Un ulteriore oggetto dell'invenzione à ̈ un kit per la rivelazione di rame libero nel siero comprendente uno o più dispositivi per cromatografia di estrazione su fase solida e uno o più sonde fluorescenti cumariniche.
Gli inventori hanno osservato che la concentrazione di rame libero nel siero à ̈ stimata in modo non accurato per la presenza delle proteine ematiche, inoltre hanno anche osservato che diversi metodi di separazione di elementi chimici a basso peso molecolare dalle proteine ematiche, ad esempio mediante dispositivi di filtrazione con membrane, non permettono di determinare in modo accurato la concentrazione di rame libero. L’invenzione qui descritta si base sulla selezione di un passaggio di separazione del rame libero dalle proteine ematiche e sulla selezione di una specifica classe di sonde fluorescenti.
Il metodo della presente invenzione presenta numerosi vantaggi rispetto ai metodi di determinazione dello stato della tecnica:
-permette di determinare la concentrazione di rame libero nel siero con elevata precisione ed accuratezza;
-consente di determinare la concentrazione di rame libero nel siero con costi e tempi molti ridotti;
-Ã ̈ un metodo facilmente automatizzabile.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1. Curva di calibrazione della sonda fluorescente cumarinica 7 - (dietilammino)-2-osso-N-((piridin-2-il) metil)-2H-cromen-3-carbossammide in presenza di Cu<++>(10<-4>M) in HEPES: DMSO 9:1 (λex = 430 nm, 490 nm λem).
Figura 2. Curva di calibrazione della sonda fluorescente cumarinica 7 - (dietilammino)-2-osso-N-((piridin-2-il) metil)-2H-cromen-3-carbossammide in presenza di Cu<++>(10<-5>M) in HEPES: DMSO 9:1 (λex = 430 nm, 490 nm λem).
Figura 3. Curva Receiver operating characteristic (ROC), 702 campioni sono stati analizzati secondo una forma di realizzazione della presente invenzione. La curva mostra che utilizzando la presente invenzione una diagnosi del morbo di Alzheimer può essere ottenuta con alta specificità (80%) e sensibilità discrete (60%).
Figura 4. Modello per predire la probabilità (Mini-Mental State Examination) di peggioramento nei pazienti affetti da malattia di Alzheimer secondo i livelli di rame nel siero. I cerchi rappresentano il valore di rame senza siero dei pazienti. La linea rappresenta il modello della probabilità predetta nel mini-mental test di peggioramento. I pazienti dal pannello di studio che avevano un z-score superiore a -0,138, corrispondente ad un valore di rame di 2,1 µmol/L, avevano una maggiore probabilità di peggiorare rispetto ai pazienti che avevano i loro valori di rame "libero" al di sotto di tali livelli .
Figura 5. La concentrazione di rame libero può anche essere usata per prevedere la percentuale di soggetti affetti da decadimento cognitivo lieve, che svilupperanno la malattia di Alzheimer. Soggetti affetti da decadimento cognitivo lieve con concentrazione di rame libero superiore a 1,6 µM hanno una più alta percentuale di conversione al morbo di Alzheimer.
Figura 6. La figura 6 Ã ̈ una foto di un apparecchiatura per eseguire il metodo della presente invenzione secondo una forma di realizzazione.
Figura 7. Analisi spettrofotometrica di un campione di siero separato mediante estrazione su fase solida. L’analisi spettrofotometrica permette di verificare la presenza di proteine nel filtrato, maggiore à ̈ la presenza di proteine e peggiore à ̈ il rendimento in termini di recupero del rame libero in quanto queste proteine mascherano la lettura del rame. Man mano che la curva si riduce in ampiezza diminuisce la composizione di proteina e migliora di conseguenza il recupero di rame libero.
Figura 8A e 8B. Analisi spettrofotometrica di un campione di siero separato mediante filtrazione su membrana.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
Come precedentemente indicato, la presente invenzione riguarda un metodo in vitro per la determinazione della concentrazione del rame in un campione di siero. Nella presente descrizione il termine "rame libero" significa rame nella circolazione generale che non à ̈ strutturalmente legato alla ceruloplasmina. E' anche recentemente nominato rame 'labile', facendo riferimento alle sue proprietà di essere legato in modo labile all’albumina, a piccoli peptidi, amminoacidi e altri micro-nutrienti e di essere facilmente intercambiabile tra di loro. Il rame libero à ̈ un rame a piccolo peso molecolare che può facilmente raggiungere i tessuti del cervello, attraversando la barriera emato-encefalica.
Per separare il rame libero dalle proteine ematiche di un campione di siero il metodo comprende un primo passaggio (a) di cromatografia ad estrazione su fase solida (SPE). Il campione di siero potrà essere ottenuto dal sangue intero secondo le procedure note al tecnico del settore, ad esempio mediante centrifugazione. Il siero prima di essere sottoposto a separazione potrà essere opportunamente diluito preferibilmente secondo un fattore di diluizione compreso tra 1 e 10. Il siero potrà ad esempio essere diluito in soluzione fisiologica (0,9% NaCl) che potrà essere usata anche come fase mobile nella cromatografia.
Il campione di siero à ̈ caricato (seminato) su una fase solida (una resina in grado di legare le proteine ematiche), generalmente in piccole colonnine cromatografiche ad esempio da 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg. Le proteine ematiche presenti nel campione di siero, compresa la ceruloplasmina sono adsorbite sulla fase solida, mentre la frazione eluita dalla fase solida contenente il rame à ̈ raccolta e sottoposta al secondo passaggio b) del metodo. Nella presente descrizione quindi con frazione eluita s’intende la frazione non adsorbita sulla resina utilizzata nella cromatografia ad estrazione su fase solida.
Il campione potrà essere caricato sulla fase solida mediante un pompa peristaltica con una velocità di flusso compresa ad esempio tra 100 µl/min e 1 ml/ml, ad esempio 200, 300, 400500 µl/min.
Nel passaggio a) potrà essere utilizzata come fase solida una poliolefina preferibilmente una poliolefina termoplastica scelta ad esempio tra polietilene (PE), polipropilene (PP), polimetilpentene (PMP), polibutene-1 (PB-19). Detta fase solida potrà avere ad esempio un grado di cristallinità compreso tra il 35 ed il 75%.
Secondo una forma di realizzazione dell’invenzione come fase solida sarà utilizzata una resina di polietilene ad altissimo peso molecolare (i.e. con una massa atomica compresa tra 3 e 6 MDa) ad esempio disponibile commercialmente da Sigma-Aldrich con il numero di catalogo cat. # 434264-1KG (Ultra-high molecular weight polyethylene (UHMPE) e ogni altra resina commerciale equivalente). L’intero passaggio a) risulta quindi estremamente veloce e facilmente automatizzabile, inoltre una volta rigenerata la fase solida con opportuno solvente come ad esempio metanolo si potrà riutilizzare la resina per altre separazioni con vantaggi in termini economici. Il metodo comprende un secondo passaggio (b) di determinazione del rame nella frazione eluita nel passaggio a) utilizzando una sonda fluorescente cumarinica. Le sonde fluorescenti cumariniche sono sonde fluorescenti chelanti per il quale un decadimento delle emissioni di fluorescenza possono essere registrate quando si lega [Cu<++>]. Le sonde fluorescenti cumariniche possono essere scelte ad esempio tra i composti aventi la seguente formula di struttura generale:
in cui
R<1>Ã ̈ N[(CH2)nCH3]2con n da 0 a 5;
R<2>Ã ̈ H, F, Cl, Br, NO2, OCH3, cicloesil.
Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione detta sonda fluorescente cumarinica à ̈ selezionata dal gruppo sopra in cui R<1>à ̈ N[(CH2)nCH3]2con n =1 e R<2>à ̈ H, F, Cl, Br, NO2, OCH3, cicloesil sia in posizione orto-, para- o meta-.
Secondo un’altra forma di realizzazione della presente invenzione detta sonda fluorescente cumarinica à ̈ selezionata dal gruppo in cui R<1>à ̈ N[(CH2)nCH3]2con n =2 e R<2>à ̈ H, F, Cl, Br, NO2, OCH3, cicloesil sia in posizione orto-, para- o meta-.
Secondo un’altra forma di realizzazione della presente invenzione detta sonda fluorescente cumarinica à ̈ selezionata dal gruppo in cui R<1>à ̈ N[(CH2)nCH3]2con n =3 e R<2>à ̈ H, F, Cl, Br, NO2, OCH3, cicloesil sia in posizione orto-, para- o meta-.
Secondo un’altra forma di realizzazione della presente invenzione detta sonda fluorescente cumarinica à ̈ selezionata dal gruppo in cui R<1>à ̈ N[(CH2)nCH3]2con n =4 e R<2>à ̈ H, F, Cl, Br, NO2, OCH3, cicloesil sia in posizione orto-, para- o meta-.
Secondo un’altra forma di realizzazione della presente invenzione detta sonda fluorescente cumarinica à ̈ selezionata dal gruppo in cui R<1>à ̈ N[(CH2)nCH3]2con n =5 e R<2>à ̈ H, F, Cl, Br, NO2, OCH3, cicloesil sia in posizione orto-, para- o meta-.
Secondo un’altra forma di realizzazione della presente invenzione detta sonda fluorescente cumarinica à ̈ 7-(Dietilamino)-2-osso-N-((piridin-2-il)meill)-2H-cromene-3-carbossammide avente la seguente formula strutturale:
La sonda fluorescente cumarina può essere utilizzata ad esempio in solventi organici come EtOH, MeOH, DMSO miscelati a soluzioni tampone come PBS o Hepes. In una forma di realizzazione la sonda fluorescente cumarinica à ̈ utilizzata in una soluzione di HEPES:DMSO.
Le sonde fluorescenti cumariniche saranno utilizzate nella reazione con il campione preferibilmente in un intervallo di concentrazione tra 0,1 e 10 µM, ad esempio 1, 2,5, 5,0, 9 µM. Gli inventori hanno trovato che in questo intervallo vi à ̈ una correlazione diretta tra la concentrazione di rame libero nel campione e l'emissione di fluorescenza, la lunghezza d'onda di eccitazione (λex) à ̈ per esempio 430 nm e la lunghezza d'onda di assorbimento (λem) 490 nm.
Per determinare la concentrazione del rame libero il passaggio b) può comprendere una ulteriore fase di preparazione di una curva di calibrazione. Per preparare la curva di calibrazione potranno essere utilizzate più aliquote ad una concentrazione nota di rame. Preferibilmente questa curva sarà nell’intervallo tra 0,1 e 10 µM (vedi fig.1). Come già riportato, in pazienti affetti da morbo di Alzheimer, rame sierico non legato alla ceruloplasmina (rame 'libero') appare elevato e l'aumento, anche se lieve à ̈ normalmente sufficiente a distinguere i malati di Alzheimer malattia da soggetti anziani sani (anche nelle fasi iniziali della malattia).
È dunque un oggetto della presente invenzione un metodo in vitro per la diagnosi della malattia di Alzheimer in un paziente sospettato di avere il morbo di Alzheimer comprendente un ulteriore passaggio c) in cui si confronta il valore determinato nel passaggio b) con un valore di soglia (cut-off), in cui una più alta concentrazione di rame libero conferma la diagnosi clinica di malattia di Alzheimer.
Con l’espressione “metodo in vitro per la diagnosi della malattia di Alzheimer†s’intende un metodo per confermare la diagnosi clinica della malattia di Alzheimer in un paziente sospettato di avere il morbo di Alzheimer.
E’ evidente che se il siero prima di essere caricato sulla cromatografia à ̈ stato diluito secondo un determinato fattore di diluizione nel passaggio c) di confronto con il valore soglia, la concentrazione di rame libero determinata nel passaggio b) andrà moltiplicata per il fattore di diluizione.
Il valore di soglia (cut-off) di rame può essere determinato ad esempio mediante curve ROC (Receiver Operating Characteristic) ottenute elaborando le concentrazioni di un insieme di campioni statisticamente significativo di individui sani e individui con malattia di Alzheimer. Attraverso tale trattamento sono stati ottenuti valori soglia tra 0,5 e 50 µm, preferibilmente tra 0,5 e 3 µm, per esempio 1, 1,5 , 2, 2,5 , 3 µm.
Preferibilmente detto metodo di diagnosi sarà utilizzato come test di conferma per una diagnosi clinica di malattia di Alzheimer in un paziente sospettato di avere il morbo di Alzheimer con una 'disfunzione del fenotipo di rame’.
Come mostrato da Squitti et al., Neurology (2009) per monitorare la prognosi della malattia di Alzheimer in un paziente nonché per prevedere il passaggio da decadimento cognitivo lieve (Impairment forma Mild conversione Cognitive) alla malattia di Alzheimer à ̈ importante determinare la concentrazione di rame libero nel siero di detto paziente (Figura 5).
La condizione clinica del decadimento cognitivo lieve à ̈ caratterizzata da deficit di memoria, verificabile attraverso misure oggettive, non ancora determinando la definizione di demenza. L'importanza di una diagnosi accurata sta nel fatto che, nonostante la mitezza della condizione, il decadimento cognitivo lieve à ̈ generalmente considerato un precursore della malattia di Alzheimer. Ciò à ̈ dovuto dall’elevato tasso di progressione da decadimento cognitivo lieve a malattia di Alzheimer.
Di norma, il tasso di conversione annuale da una condizione di buona salute alla malattia di Alzheimer va dallo 0,17% al 3,86%. Il tasso di conversione da decadimento cognitivo lieve a malattia di Alzheimer à ̈ notevolmente superiore, va dallo 6% al 40%. In alcuni casi, il decadimento cognitivo lieve può essere una condizione benigna, senza progressione nella demenza. La concentrazione di rame libero discrimina i soggetti da decadimento cognitivo lieve a individui sani di controllo, come rivelato confrontando le medie dei due gruppi (Figura 5). La concentrazione di rame libero può anche essere usata per prevedere la percentuale di soggetti con decadimento cognitivo lieve, che svilupperanno la mallattia di Alzheimer. Soggetti con decadimento cognitivo lieve con concentrazione di rame libero > 1,6 µM hanno una più alta percentuale di conversione a malattia di Alzheimer, che à ̈ del 17% l'anno, nei confronti di tali soggetti il decadimento cognitivo lieve con rame ≤ 1,6 µM, che à ̈ del 10% annuo. Analisi statistica di Kaplan-Meier conferma che i soggetti con decadimento cognitivo lieve con rame > 1,6 µM hanno un più alto tasso di conversione per il morbo di Alzheimer rispetto a quelli con rame ≤ 1,6 µM, essendo la percentuale di conversione in malattia di Alzheimer tra il 24-35% entro il primi due anni, rispetto al 25-30% dei soggetti con decadimento cognitivo lieve e rame ≤ 1,6 µM con una percentuale di conversione entro 3 anni e mezzo. Limitando l'analisi a cinque anni di follow-up, la percentuale di conversione a malattia di Alzheimer nei soggetti di decadimento cognitivo lieve con rame ≤ 1,6 µM à ̈ inferiore al 50%, mentre nella coorte di decadimento cognitivo lieve con rame > 1,6 µM il 50% dei pazienti converte entro 4-6 anni (Figura 5).
In una forma di realizzazione il metodo della presente invenzione à ̈ usato per la valutazione della conversione da uno stato di decadimento cognitivo lieve (MCI) a malattia di Alzheimer in un paziente sofferente di decadimento cognitivo lieve comprendente un passaggio c) di confrontare il valore determinato nel passaggio b) con un valore di soglia (cut-off), in cui una più alta concentrazione di rame indica la conversione da decadimento cognitivo lieve a malattia di Alzheimer. Questo valore di soglia à ̈ per esempio tra 0,5 e 3 µM, preferibilmente 1,6 µM. I passaggi a) e b) del metodo di predizione possono essere eseguiti secondo le forme di realizzazione dei passaggi a) e b) sopra descritti.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ un metodo in vitro per la prognosi della malattia di Alzheimer in un paziente in cui i passaggi a) e b) del metodo secondo le forme di realizzazione dei passaggi a) e b) sopra descritti sono effettuati su più campioni di detto paziente raccolti in momenti differenti e la quantificazione dei dati ottenuti da ciascun campione vengono confrontati tra loro costruendo quindi una progressione nel tempo della concentrazione di rame nei campioni di siero di detto paziente.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ un kit per la rivelazione di rame libero nel siero comprendente mezzi ed istruzioni per eseguire cromatografia di estrazione su fase solida e uno o più sonde fluorescenti cumariniche. I mezzi per eseguire cromatografia di estrazione su fase solida sono ad esempio colonnine cromatografiche contenenti resina in fase solida. In una forma di realizzazione detti mezzi comprendono come fase solida di polietilene ad altissimo peso molecolare. In un ulteriore forma di realizzazione detta sonda fluorescente cumarinica à ̈ scelta tra i composti aventi le formule di struttura descritte sopra.
In una forma di realizzazione il kit comprende inoltre uno o più aliquote di controlli aventi titolo noto di rame, i controlli possono essere utilizzati per preparare una curva di calibrazione.
Sono di sotto riportati esempi che hanno lo scopo di illustrare alcune forme di realizzazione della presente invenzione, tali esempi non sono in alcun modo da considerare come una limitazione della precedente descrizione e delle successive rivendicazioni.
ESEMPI
ESEMPIO 1
Per la separazione delle proteine ematiche à ̈ stato messo appunto il metodo cromatografico di estrazione su fase solida (SPE). Come fase solida à ̈ stata utilizzata la resina Ultra-high molecular weight polyethylene (UHMPE) (Sigma-Aldrich cat. # 434264-1KG) capace di interagire e ritenere le proteine sieriche. Come fase mobile à ̈ stata utilizzata la soluzione fisiologica (0,9% NaCl) piuttosto che acqua pura, per evitare il rilascio del rame legato alle proteine (ceruloplasmina), aspirata con una pompa peristaltica per mantenere un flusso costante di eluizione (velocità di flusso: 400 µl/min). Colonnine cromatografiche di 1 ml sono state impaccate con 500 mg di resina (Fig.6) e condizionate utilizzando due diverse strategie:
- 500 mg di resina messi in colonna sono stati condizionati con 6 ml di soluzione fisiologica.
- 500 mg di resina sono stati sospesi in circa 3 ml di metanolo, poi utilizzati per caricare la colonna. Successivamente 6 ml acqua distillata sono stati fatti eluire attraverso la colonnina per rimuovere completamente il metanolo seguiti da 6 ml di soluzione fisiologica. Successivamente in entrambi i casi, sono stati caricati 50 µl di siero ed eluito con soluzione fisiologica. Sono stati raccolti separatamente i primi 250 µl di eluato e successive aliquote di 500 µl. L’analisi spettrofotometrica ha rilevato assenza di proteine nelle aliquote di 250 µl (aliquota 1 di Fig. 7), mentre presenza di proteine si osserva nelle successive aliquote da 500 µl (aliquota 2 e 3 di Fig. 7). Per eventuali esigenze di laboratorio, al fine di ridurre i tempi per la raccolta delle aliquote di interesse, à ̈ possibile migliorare il protocollo riducendo i volumi di fase mobile necessari per il condizionamento della colonna. Un vantaggio di tale tecnica à ̈ dato dalla possibilità di rigenerare le colonnine eluendo le proteine adsorbite con il metanolo (circa 2 ml). Colonnine rigenerate e utilizzate per 3 separazioni successive hanno confermato i risultati attesi: l’analisi spettrofotometrica rileva assenza di proteine nelle aliquote di 250 µl. L’intero protocollo si sviluppa in un massimo di 30 minuti. Il metodo ottimizzato diminuisce i tempi a 20 o 15 o 10 minuti fino a 6 cicli/ora.
ESPERIMENTI COMPARATIVI
E’ stata determinata la concentrazione di rame libero in diversi campioni di siero con concentrazioni note di rame libero. La lista dei campioni analizzati e della loro concentrazione à ̈ riportata nella tabella 1. La concentrazione di rame libero nei campioni à ̈ stata determinata mediante il metodo della presente invenzione, in particolare secondo la forma di realizzazione descritta in dettaglio nell’esempio 1 e in parallelo utilizzando nel passaggio di separazione membrane di filtrazione invece della cromatografica di estrazione su fase solida (SPE).
I risultati ottenuti indicano che utilizzando diversi tipi di membrane di filtrazione si ha comunque una riduzione dal 35 al 77% del recupero del rame libero contenuto nel campione. In particolare gli esperimenti indicano che i dispositivi a membrana non permettono di allontanare proteine dai campioni di siero diluiti 1:10 (massima diluizione ammessa per un saggio di Cu).
Al contrario la resa di filtrazione utilizzando cromatografica di estrazione su fase solida (SPE) à ̈ proporzionale alla quantità di siero seminata. Inoltre nell’eluito in MeOH si ottiene una quantità di proteine che à ̈ all’incirca inversamente proporzionale alla quantità filtrata a confermare l’accuratezza del metodo (le proteine trattenute dopo filtrazione di 10 µl in 1mL sono ˃ 25 µl in 2,5 mL ˃ 50 µl in 5mL).
La frazione proteica, seminando 50 µl, à ̈ raccolta nelle prime 2 frazioni da 500 µl. Quindi tutto il siero à ̈ raccolto in 1mL. Anche escludendo una frazione iniziale di 250 µl, le altre due frazioni sono quelle contenenti proteine.
In conclusione la filtrazione con dispositivi a membrana non à ̈ efficiente, mentre la filtrazione con cromatografica di estrazione su fase solida à ̈ più accurata e rapida Tabella 1
Sieri di pazienti e controlli selezionati in ambito clinico dal reparto di neurologia del Fatebenefratelli Roma
Concentrazione classificazione
ID micromolare
1647 0,1 controllo
1650 0,2 controllo
1665 0,1 controllo
1666 0.2 controllo
1667 0.5 controllo
1780 3.2 Alzheimer
1794 3.8 Alzheimer
1796 4.5 Alzheimer
1799 3.55 Alzheimer
1802 6.2 Alzheimer
1818 3.3 Alzheimer
1839 5.6 Alzheimer
1848 3.3 Alzheimer
1855 3.8 Alzheimer
1856 1.6 Alzheimer
1876 2.2 Alzheimer
1890 2.8 Alzheimer
1899 4.2 Alzheimer
1901 0.8 controllo
1926 2.0 Alzheimer

Claims (18)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo in vitro per determinare la concentrazione di rame libero in un campione di siero comprendente i seguenti passaggi: a) caricare detto campione di siero su una resina per estrazione su fase solida ottenendo una frazione legata a detta resina, e una frazione eluita contenente il rame libero; b) determinare la concentrazione di rame libero nella frazione eluita nel passaggio a) utilizzando una sonda fluorescente cumarinica.
  2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui detta resina à ̈ una poliolefina.
  3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui in detta resina à ̈ polietilene ad altissimo peso molecolare.
  4. 4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 in cui in detto passaggio di caricamento a) come fase mobile à ̈ utilizzata una soluzione fisiologica.
  5. 5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 in cui detta sonda fluorescente cumarina viene utilizzata in un intervallo di concentrazione tra 0,1 e 10 µM.
  6. 6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 in cui detta sonda fluorescente cumarinica à ̈ utilizzata in una soluzione di HEPES: DMSO.
  7. 7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 in cui detta fase b) comprende una fase di preparazione di una curva di calibrazione.
  8. 8. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 in cui la determinazione della concentrazione di rame libero in detto passaggio b) à ̈ ottenuta mediante la lettura della fluorescenza di detta sonda cumarinica ad una lunghezza d'onda di eccitazione (λex) di 430 nm e una lunghezza d'onda di assorbimento (λem) di 490 nm.
  9. 9. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8 in cui detta sonda fluorescente cumarinica à ̈ scelta tra i composti aventi la seguente formula di struttura generale: in cui R<1>à ̈ N[(CH2)nCH3]2con n da 0 a 5; R<2>à ̈ H, F, Cl, Br, NO2, OCH3, cicloesil.
  10. 10. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9 in cui detta sonda fluorescente cumarinica à ̈ scelta tra i composti aventi la seguente formula di struttura generale:
  11. 11. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10 per la diagnosi della malattia di Alzheimer in un paziente comprendente un passaggio c) di confrontare il valore determinato nel passaggio b) con un valore di soglia (cut-off), in cui una più alta concentrazione di rame libero conferma la diagnosi clinica di malattia di Alzheimer.
  12. 12. Metodo secondo la rivendicazione 11 in cui detto valore di soglia à ̈ compreso tra 0,5 e 50 µM.
  13. 13. Metodo secondo la rivendicazione 11 o 12 per la prognosi della malattia di Alzheimer in un paziente in cui i passaggi a) e b) del metodo vengono ripetuti su campioni di siero di detto paziente raccolti in momenti successivi ed à ̈ valutata la progressione nel tempo della concentrazione di rame libero in detti campioni.
  14. 14. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10 per la valutazione della predisposizione alla conversione da uno stato di decadimento cognitivo lieve (MCI) a malattia di Alzheimer in un paziente sofferente di decadimento cognitivo lieve comprendente un passaggio c) di confrontare il valore determinato nel passaggio b) con un valore di soglia (cut-off), in cui una più alta concentrazione di rame indica la conversione da decadimento cognitivo lieve a malattia di Alzheimer.
  15. 15. Metodo secondo la rivendicazione 14 in cui detto valore di soglia à ̈ compreso tra 0,5 e 3 µM.
  16. 16. Kit per la rivelazione di rame libero nel siero comprendente uno o più mezzi per eseguire una cromatografia di estrazione su fase solida e uno o più sonde fluorescenti cumariniche.
  17. 17. Kit secondo la rivendicazione 16 in detti mezzi comprendono come fase solida polietilene ad altissimo peso molecolare.
  18. 18. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15 a 17, in cui detta sonda fluorescente cumarina à ̈ scelto tra i composti aventi la seguente formula di struttura generale: in cui R<1>à ̈ N[(CH2)nCH3]2con n da 0 a 5; R<2>à ̈ H, F, Cl, Br, NO2, OCH3, cicloesil.
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