ITRM20130063A1 - Metodo di screening per identificare sostanze per contrastare l'invecchiamento. - Google Patents
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Description
"METODO DI SCREENING PER IDENTIFICARE SOSTANZE PER CONTRASTARE
L’INVECCHIAMENTO”
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce a un nuovo metodo in vitro per rivelare l’attività anti-senescenza o pro-senescenza di un composto e a composti con attività anti-senescenza rivelati con tale metodo, in particolare ad estratti di Salvia Henkei e a composizioni che comprendono detti estratti.
STATO DELLA TECNICA ANTERIORE
La senescenza cellulare è un arresto irreversibile della crescita cellulare che avviene in tutte le cellule dell'organismo umano durante l'invecchiamento. La maggior parte delle cellule non possono dividersi infinitamente a causa della riduzione progressiva dei loro telomeri. Infatti dopo soli 50-60 divisioni cellulari (limite di Haflick) le cellule fermano la crescita, anche se continuano a metabolizzare e produrre ATP.
Le cellule possono diventare senescenti prematuramente come risultato di insulti stressanti come oncogeni, delezione dei geni soppressori del tumore e danni al DNA (indotti da radiazioni UV o da stress ossidativo e l’accumulo di ROS). Questo fenomeno è indicato come senescenza prematura poiché si verifica rapidamente dopo l'evento di causa.
Studi recenti hanno identificato un nuovo tipo di risposta di senescenza cellulare, che si verifica acutamente dopo inattivazione del soppressore tumorale PTEN, un regolatore essenziale del pathway PI3K nel topo e cellule primarie umane. È importante sottolineare che la senescenza si può verificare anche in cellule tumorali, che hanno PTEN completamente annullato o può essere indotta in cellule tumorali umane dopo l’inibizione farmacologica di PTEN (Alimonti et al. J Clin Invest. 2010, 681-93 e Lin HK et al. Nature, 2010, 464(7287):374-9).
Per questo motivo i geni PTEN e ulteriori geni rilevanti per la senescenza possono essere oggetto di terapia pro-senescente per il cancro.
Il pathway PI3K/AKT è anche implicato nella senescenza replicativa e nell’invecchiamento. Infatti, l'inibizione di mTOR, un componente fondamentale di questo pathway, può impedire senescenza tramite il blocco di p53 e diminuire l'invecchiamento nel modello murino (Alimonti et al. J Clin Invest. 2010). Questo è confermato in un recente studio, in cui la rapamicina un inibitore di mTOR, se somministrata in tarda età, prolunga la durata della vita dei topi trattati. Il pathway PI3K/AKT è anche implicato in senescenza cellulare indotta con irradiazione UV (fotoinvecchiamento). In effetti, i risultati recenti indicano che l'irradiazione UV può attivare AKT e mTOR, aumentando così la senescenza.
Il foto-invecchiamento della pelle è in gran parte la conseguenza dell’esposizione ai raggi UV durante la vita, ed è caratterizzata da rughe, alterazioni della pigmentazione, screpolatura e perdita di elasticità della pelle.
Similmente, l'esposizione della pelle alle radiazioni diverse dai raggi UV, ad esempio raggi-X (durante trattamenti di radioterapia per il cancro), può provocare gravi effetti collaterali che potrebbero comportare una limitazione del trattamento. In genere la pelle comincia a diventare rosa e dolente in trattamento con radiazioni. La reazione può diventare più grave durante il trattamento, anche dopo la fine della radioterapia, per un massimo di circa una settimana.
Poiché si ritiene che la senescenza cellulare sia un elemento essenziale nell’invecchiamento, la ricerca scientifica si sta concentrando sullo sviluppo di terapie efficaci per prevenirla e ritardarla. Tuttavia, solo pochi composti hanno mostrato potenti effetti anti-senescenti in vivo, e molti sforzi sono stati fatti per sviluppare saggi per l'identificazione di nuovi composti anti-senescenza.
Data la rilevanza della senescenza cellulare in patologie come il cancro e nell'invecchiamento, è molto sentita l’esigenza di un metodo che consenta l’identificazione di nuovi composti pro ed anti-senescenti in modo rapido ed efficiente.
Nella domanda di brevetto internazionale WO2009046436 (Alimonti et al.) 06/10/2008 è descritto un metodo di screening per valutare la capacità di un composto di alterare lo stato di senescenza di una cellula basato su cellule MEF Pten null (Pten -/-). Il metodo descritto risulta molto costoso, con tempi di esecuzione lunghi e complessi. Infatti per la valutazione dei composti candidati le cellule MEFs Pten Lx/Lx devono essere infettate con vettori retro virali Cre, successivamente selezionate per 2 giorni e infine piastrate per l’esperimento. La possibilità che l’infezione sia ottimale sono in genere del 50% dei casi e molto spesso la percentuale delle cellule infettate è molto bassa. Questo riduce notevolmente il numero di composti candidati che possono essere testati nel saggio. Inoltre le cellule MEFs Pten Lx/Lx devono essere continuamente rigenerate incrociando topi Pten Lx/Lx fra di loro. Questi topi vengono successivamente sacrificati per ottenere le cellule Mefs necessarie per il saggio.
Scopo della presente invenzione è fornire un metodo per rivelare l’attività antisenescenza o pro-senescenza di un composto che risolva i sopra citati svantaggi.
SOMMARIO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce a un nuovo metodo in vitro per rivelare l’attività anti-senescenza o pro-senescenza di un composto e ai composti con attività anti-senescenza rivelati con tale metodo. Il metodo dell’invenzione offre il vantaggio di uno screening in vitro rapido, poco costoso e facilmente automatizzabile in quanto sono utilizzate linee cellulari ingegnerizzate che oltre ad essere mancanti di un gene funzionale Pten sono immortalizzate reversibilmente.
Pertanto, un primo oggetto della presente invenzione è un metodo per rivelare l’attività anti-senescenza o pro-senescenza di un composto candidato comprendente i seguenti passaggi:
a) fornire una linea cellulare ingegnerizzata immortalizzata reversibilmente e mancante di un gene funzionale Pten;
b) riportare detta linea cellulare in uno stato non immortalizzato;
c) mettere in contatto dette cellule non più immortalizzate con detto composto candidato;
d) valutare la proliferazione cellulare di dette cellule in seguito al contatto con detto composto, per cui un aumento della proliferazione cellulare indica un’attività antisenescenza e una riduzione della proliferazione cellulare indica un’attività prosenescenza.
Un secondo oggetto dell’invenzione è l’uso cosmetico di un estratto di Salvia Henkei come sostanza anti-invecchiamento.
Un terzo oggetto dell’invenzione è una composizione cosmetica comprendente un estratto di Salvia Henkei e uno o più veicolanti cosmeticamente accettabili.
Un quarto oggetto dell’invenzione è un estratto di Salvia Henkei per uso nel trattamento di malattie associate all’invecchiamento cellulare.
Ulteriori vantaggi, così come le caratteristiche e le modalità di impiego della presente invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata di alcune forme di realizzazione preferite.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE
La figura 1 è una rappresentazione schematica di una forma di realizzazione del metodo seconda la presente invenzione.
La figura 2 è un diagramma che mostra i composti risultati positivi. In totale, sono stati testati 1465 composti di cui 1000 sostanze chimiche, 313 estratti delle piante e 152 estratti marini. In contrasto ai composti chimici che hanno mostrato una percentuale molto bassa di principi attivi anti-senescenza (da 8 a 1000), i composti naturali hanno dimostrato di essere una preziosa fonte di principi attivi anti-senescenza (18 estratti attivi hanno un effetto statisticamente significativo su uno o più dei parametri utilizzati nel saggio di screening, come rappresentato nella figura 2). Il criterio diindividuazione dei composti anti-senescenza è basato sulla valutazione della crescita delle cellule a contatto con quel determinato composto e sulla percentuale di cellule positive al β-gal Le cellule che non subiscono l’ induzione della senescenza a causa dell’annullamento di gene Pten, continuano a proliferare nella cultura e il loro numero è più alto rispetto alle cellule che entrano in senescenza e fermano la proliferazione. (controllo) L’aumento del 40% o più della crescita in cellule trattate rispetto al controllo non trattato è considerato un indicatore significativo di un potenziale effetto anti-senescenza dei composti. Nella Figura 2 sono rappresentati 18 composti in grado di incrementare in modo statisticamente significativo la crescita delle cllule Pten -/- (aumento della crescita del 40% o più ) Questi composti sono stati poi testati per l'espressione di β-Galactosidase, un marcatore di induzione della senescenza, l’estratto di Salvia Henkei ha confermato la sua attività anti-senescenza, perciò è stato analizzato in ulteriori test di foto-invecchiamento e inmodelli di senescenza replicativa.
Fig. 3 Senescenza replicativa (protocollo 3T3) in fibroblasti WI38 trattati con l’estratto di Salvia Henkei.
FIG 4 Senescenza e morte cellulare in colture cellulari di fibroblasti WI38 (Codice coltura cellulare CCL-75tm) trattati con l’estratto di Salvia Henkei a diversi passaggi. Fig. 5 Proliferazione in modello di senescenza indotta con irradiazione UV in colture di cellule primarie umane (Codice coltura cellulare CCL-75tm) trattate con l’estratto di Salvia Henkei e Nutlin-3 (controllo positivo).
Fig. 6 Senescenza in colture di cellule primarie umane (Codice coltura cellulare CCL-75tm) UV trattate in presenza di estratto di Salvia Henkei.
Fig. 7 Percentuale di morte cellulare in cellule (Codice coltura cellulare CCL-75tm) non irradiate e cellule irradiate con UV in presenza di differenti concentrazioni dell’estratto di Salvia Henkei.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
La presente invenzione si compone dei seguenti aspetti, descritti in dettaglio di seguito.
Il metodo in vitro permette di rivelare l’attività anti-senescenza o pro-senescenza di un composto candidato come ad esempio un estratto naturale o un composto di sintesi.
Il metodo comprende un primo passaggio a) in cui è fornita una linea cellulare ingegnerizzata in modo da poter essere immortalizzata reversibilmente, mancante di un gene funzionale Pten (pten null (-/-)). In una forma di realizzazione preferita dette cellule sono ottenute da cellule MEF (Mouse Embryonic Fibroblast) isolate e coltivate da feti di topi omozigoti PTEN lxP/lxP prelevati da topi femina in cinta al 13 giorno (topi di questo tipo sono identificati ad esempio con il codice di riferimento Jax Lab B6.129S4-Pten tm1Hwu /J- Homozygous for Ptentm1Hwu) Le cellule isolate possono essere rese Pten null con un vettore Cre retro-virale, esempi di vettori idonei sono i vettori Cre-ricombinasi. Le cellule possono essere immortalizzate reversibilmente mediante trasfezione con idonei vettori, preferibilmente potrà essere usato un vettore retro-virale doxociclina inducibile come ad esempio il vettore lenti-virale TRIPZI-shp53 (Doxociclina (DOXO) inducibile). Stessa risultato può essere ottenuto se PTEN lxP/lxP MEFs vengono prima infettate con TRIPZI-shp53 e successivamente con vettori Crericombinasi
Nel secondo passaggio b) la linea cellulare fornita al passaggio a) viene riportata in uno stato non immortalizzato. In una forma di realizzazione le cellule saranno rese non immortalizzate mediante la riattivazione del gene p53 in seguito a rimozione della doxociclina dal terreno di cultura. Pertanto non c’è necessita di infettare continuamente le cellule MEFs primarie Pten Lx/Lx e di sacrificare inutilmente animali. Inoltre dal momento che le cellule MEFs in presenza di doxociclina sono immortalizzate si possono facilmente piastrare milioni di cellule su cui testare migliaia di composti e estratti piastrando quante più cellule è necessario per lo screening. La riattivazione di p53 fa si che le cellule rientrino in senescenza dal secondo giorno 2. Al giorno nono giorno dopo la rimozione della doxociclina si ha il massimo di cellule β-galactosidase positive e arrestate.
Nel terzo passaggio c) del metodo il composto candidato, di cui si vuole rivelare l’eventuale attività anti o pro-senescenza, è messo in contatto con le cellule predisposte al punto b). Composti e estratti possono ad esempio essere somministrati alle cellule da 1-3 gorni dopo la rimozione della DOXO
Nel quarto passaggio d) del metodo è valutata la proliferazione cellulare delle cellule in seguito al contatto con il composto candidato d’analizzare. La valutazione dell’effetto pro o anti-senescenza del composto candidato potrà essere effettuata in base alla proliferazione cellulare valutata ad esempio con un saggio di colorazione citologica utilizzando il colorante cristal violetto e/o determinando allo stesso tempo l’espressione della β-galattosidasi delle cellule in seguito al contatto con il composto candidato. I composti che aumentano la proliferazione delle cellule PTEN -/- (valutata ad esempio usando il saggio standard di colorazione con cristal violetto) e/o diminuiscono l'attività della β-galattosidasi sono considerati anti-senescenti, mentre i composti che riducono la proliferazione delle cellule PTEN -/- e/o aumentano l’attività della β-galattosidasi, sono considerati pro-senescenti.
In una forma di realizzazione il metodo comprende un ulteriore passaggio e) in cui il composto candidato è messo a contatto con cellule ingegnerizzate Pten -/- e cellule ingegnerizzate Pten /+ (wild type) e un passaggio ottenute come descritto in precedenza f) in cui è valutata la proliferazione cellulare di dette cellule in seguito al contatto con detto composto. Questi ulteriori passaggi permettono di valutare la specificità dei composti/estratti selezionati. In una forma di realizzazione i composti candidati sono successivamenti testati per la loro efficacia a diversi dosaggi (ad esempio cinque diverse concentrazioni crescenti).
In una forma di realizzazione i composti anti-senescenza sono poi testati per la loro efficacia nel prevenire ulteriori tipi di senescenza, in 3 modelli in vitro noti: 1) senescenza replicativa in cellule umane primarie di fibroblasti; 2) senescenza indotta con i raggi UV in cellule primarie umane; 3) Episkin model.
In una forma di realizzazione i composti selezionati come pro-senescenti vengono testati anche per la loro efficacia nell’indurre senescenza in: 1) linee cellulari tumorali umane; 2) cellule staminali tumorali proveniente da tumori murini e umani; 3) validazione in vivo in modelli murini pre-clinici.
Gli inventori utilizzando il metodo della presente descrizione hanno sorprendentemente scoperto che l’estratto della pianta Salvia Haenkei (anche nota come Prawn Sage o Prawn Chorus e indicata nella presente descrizione anche con l’abbreviazione HAEN) è particolarmente efficace come composto anti. Le proprietà anti-invecchiamento dell’estratto di Salvia Haenkei sono state ulteriormente confermate anche in altri saggi in vitro come decritto in dettaglio nella sezione sperimentale della presente descrizione.
E’ quindi oggetto della presente invenzione l’uso cosmetico di un estratto di Salvia Henkei come sostanza anti-invecchiamento e composizioni cosmetiche comprendenti un estratto di Salvia Haenkei e uno o più veicolanti cosmeticamente accettabili. L’estratto potrà essere preparato secondo le metodiche note al tecnico del settore ad esempio mediante pre-estrazione del materiale vegetale con esano seguita da estrazione con metanolo oppure con estrazione etanolica con pre-estrazione meccanica. Per l’estrazione si usano generalmente le seguenti parti della pianta: fusto, foglie, fiori o loro miscele.
Veicolanti cosmeticamente accettabili sono ben noti nella tecnica e potranno essere selezionati in base all'uso finale dell'applicazione. Per esempio, i veicolanti della presente invenzione comprendono, ma non sono limitati a quelli adatti per l'applicazione sulla pelle. Tali veicolanti sono ben noti agli esperti del settore e possono includere uno o più diluenti adatti per l'applicazione sulla pelle. La quantità esatta di veicolante potrà dipendere dalla quantità di altri ingredienti opzionali compresi nella composizione. Ad esempio nelle composizioni della presente invenzione il veicolante può essere da circa il 75 a circa 99,99% in peso della composizione.
Le composizioni potranno essere formulate in un certo numero di modi, incluso ma non limitato a emulsioni. Per esempio, emulsioni adatte includono emulsioni olio-inacqua, acqua-in-olio, acqua-in-olio-in-acqua, olio-in-acqua-in-olio e olio-in-acqua-insilicone emulsioni. Composizioni preferite comprendono emulsioni olio-in-acqua.
Le composizioni della presente invenzione possono essere formulate in una varietà di tipi di prodotti, compresi shampoo, creme, cere, paste, lozioni, latti, mousse, gel, oli, emulsioni e spray. Composizioni preferite sono formulate in sospensione, emulsione, crema, spray, unguento, polvere, gel o liquido. Queste forme di prodotto possono essere utilizzate per un numero di applicazioni, incluse ma non limitato a, lozioni per le mani e il corpo, creme idratanti per il viso, anti-acne, ombretti, rossetti, creme solari e simili. Eventuali componenti aggiuntivi necessari per formulare tali prodotti variano con il tipo di prodotto e possono essere scelti dal tecnico del ramo sulla base della tecnica nota. Le composizioni potranno comprendere agenti idratanti, emollienti e umettanti ad esempio oli, grassi, cere, esteri, alcoli, acidi grassi etossilati di acidi grassi, glicoli, zuccheri, acido ialuronico, ciclometicone, e simili. Ulteriori esempi si possono trovare nel Dizionario Internazionale Cosmetic Ingredient, CTFA. Le composizioni della presente invenzione potranno essere formulate sia per la somministrazione topica che sistemica (ad esempio orale) a seconda dell’applicazione finale. Composizioni in forma orale sono ad esempio capsule, compresse, pasticche, polveri, granuli.
Le composizioni secondo la presente invenzione, comprenderanno ad esempio tra lo 0,01 e il 4%.
La formulazione può anche comprendere componenti che vengono scelti a seconda del veicolante e/o dell'utilizzazione prevista dalla formulazione. Ulteriori componenti includono, ma non sono limitati a antiossidanti, agenti chelanti, stabilizzanti di emulsione, conservanti, profumi, agenti aromatizzanti, umettanti, agenti impermeabilizzanti, polimeri cationici, polimeri anionici, vitamine, e simili. Le composizioni possono comprendere uno o più componenti attivi addizionali, per rendere sia una composizione cosmetica o farmaceutica.
Secondo una forma di realizzazione preferita le composizioni dell’invenzione potranno ulteriormente comprendere estratti di Salvia, Rosmarino, Galega officinalis, Lavanda, e/o Olea europaea.
L’estratto di Salvia Henkei e le composizioni della presente invenzione potranno essere usate come cosmetici per prevenire e/o rallentare l’invecchiamento cellulare non legato a condizioni patologiche o per uso nel trattamento (inteso anche come prevenzione) di malattie associate all’invecchiamento cellulare.
L’uso cosmetico comprende ad esempio il miglioramento e/o la prevenzione dei segni dell'invecchiamento cutaneo come rughe, diminuzione della morbidezza e/o della luminosità della pelle e simili.
Esempi di malattie associate all’invecchiamento cellulare che possono essere trattate con l’estratto e le composizioni della presente invenzione sono ad esempio, osteoartrite, aterosclerosi, demenza senile e tumori come ad es tumori gastrointestinali, della prostata,
Nella presente descrizione con l’espressione malattie associate all’invecchiamento cellulare s’intendono anche malattie il cui trattamento implica un invecchiamento cellulare come effetto collaterale, come ad esempio il trattamento di malattie tumorali con raggi-X che provoca il foto-invecchiamento.
Sono di sotto riportati esempi che hanno lo scopo di illustrare meglio le metodologie rivelate nella presente descrizione, tali esempi non sono in alcun modo da considerare come una limitazione della precedente descrizione e delle successive rivendicazioni.
ESEMPI
Esempio 1 Metodo di screening per identificare composti con attività pro o antisenescenza
Passaggio 1
Nel primo passaggio i composti di cui si vuole determinare l’attività pro o antisenescenza sono aggiunti in concentrazione singola (0,01 mg/ml) a cellule MEF Pten null (Pten-/-) immortalizzate. Queste cellule sono ottenute da topi omozigoti PTEN lxP/lxP. I topi PTEN LxP/LxP vengono incrociati fra loro e feti raccolti a 13,5 dpc. Le cellule MEF individuali sono prodotte e coltivate seguendo i protocolli standard descritti ad esempio in Alimonti et al. J Clin Invest.2010.
Le cellule MEF PTEN loxP / loxP sono successivamente infettate da un vettore retrovirale Cre-ricombinasi (Adgene Plasmid 21654: pMSCV PIG Cre (Puro IRES Cre vettore)). Questo vettore è prodotto nelle cellule Phoenix sia Eco e Ampho, provenienti da Life Technology. Di seguito viene descritto il protocollo:
Le cellule Phoenix sono trasfettate a confluenza di 70-80% con il retro-Cre vettore usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Contemporaneamente le cellule MEF PTEN lx/lx sono preparate in modo tale da raggiungere la confluenza del 70% dopo 48 ore.
48 ore dopo la trasfezione delle cellule Phoenix, viene usato il loro sopranatante per infettare le cellule MEF PTEN lx/lx. Per aumentare l’efficacia dell’infezione viene utilizzato Polybrene (Santa Cruz) in concentrazione 5 µg/ml. 12 ore dopo la prima infezione, si infettano le cellule MEF PTEN lx/lx per la seconda volta. 24 ore dopo, le cellule MEF PTEN lx/lx infettate vengono trattate con 3 µg/ml di puromicina come fattore di selezione.48 ore dopo l’incubazione con puromicina, vengono selezionate le cellule MEF lx/lx che perdono PTEN tramite Cre-ricombinasi e diventano Pten null (Pten-/-). Le caratteristiche precedentemente descritte del vettore usato permettono la rapida e efficace selezione di cellule Pten-/-.
Per ottenere l’immortalizzazione le cellule MEF PTEN -/- sono infettate con il vettore TRIPZI-shp53 lentivector che è Doxociclina (DOXO) inducibile. Questa variante permette l'immortalizzazione delle MEF per facilitare le procedure di screening, costi e tempi. In presenza di DOXO queste cellule sono immortali e quindi possono essere divise indefinitamente in vitro. Tuttavia, quando dal terreno di coltura si elimina la DOXO queste cellule sono sottoposte a senescenza a causa della riattivazione di p53. Nel dettaglio, le cellule MEF Pten LxP/LxP prodotte e coltivate come sopra indicato, sono prima infettate da un lvettore-shp53 TRIPZI che è Doxociclina (DOXO) inducibile.
Due giorni dopo l’infezione le cellule sono selezionate con l'aggiunta di puromicina e divise per diversi passaggi prima di essere infettate con pMSCV igro-Cre (Addgene Plasmid 34565). Le cellule sono poi selezionate con Hygromacyn per 48h. Dopo la selezione le cellule diventano Pten-/ -; p53 -/- in presenza di DOXO. Dopo la rimozione di DOXO le MEF diventano Pten-/ -; p53 /+ e vanno in senescenza tra il 4° e il 6° giorno. I composti e gli estratti da saggiare (HITs) sono aggiunti al 2° giorno per valutare il loro potenziale nell’aumentare o bloccare la senescenza.
L'esperimento si conclude cinque giorni dopo la somministrazione dei composti da testare. I composti positivi che aumentano la proliferazione delle MEF PTEN-/ - (viene valutata usando il saggio standard di colorazione con Crystal violet) e diminuiscono l'attività di β-galattosidasi (viene valutata usando Senescence Detection Kit di Calbiochem) sono considerati anti-senescenti e sono selezionati per la fase successiva del saggio. Composti positivi che riducono la proliferazione delle MEF PTEN-/- e aumentano l’attività di β-galattosidasi, sono considerati pro-senescenti e sono anche selezionati per la fase successiva del saggio.
In particolare, il saggio di colorazione con Crystal violet viene usato poiché considerato un test semplice, veloce ed efficace per ottenere informazioni quantitative sulla densità relativa di cellule aderenti, come i fibroblasti usati in questo metodo di invenzione. Il colorante in questo saggio (Crystal violet allo 0,1%) si incorpora nel DNA delle cellule precedentemente fissate con 4% formaldeide. Dopo la solubilizzazione in acido acetico al 10%, la quantità di colorante ripresa dal monostrato viene quantificata in ELISA reader a λ=570nm. La senescenza cellulare invece viene visualizzata come l’aumento nelle dimensioni delle cellule e l’espressione di β-galattosidasi (β-Gal.) pH-dipendente. Per quantificare la senescenza presente nelle MEF analizzate viene usato Calbiochem Senescence Detection Kit che è stato progettato per poter istochimicamente rivelare l'attività β-Gal in cellule in coltura a pH 6.0. Questa è una caratteristica nota di cellule senescenti. β-Gal a pH 6.0 è presente solo nelle cellule senescenti e non si trova né in pre-senescenza, né in stato di arresto della crescita reversibile (quiescenza) o di stato immortale. Il meccanismo di questo saggio si basa sul maggiore contenuto lisosomiale di cellule senescenti, determinando un aumento dell'enzima β-galattosidasi.
Passaggio 2
Nel secondo passaggio del metodo di screening, i composti positivi selezionati al passaggio 1 sono aggiunti in singola concentrazione (0,01mg/ml) in duplicato. Questo passaggio è necessario per valutare la specificità dei composti/estratti selezionati, ed è molto importante soprattutto per i composti pro-senescenti che verranno poi utilizzati per il trattamento del cancro. Le cellule tumorali hanno il livello di PTEN basso, mentre le cellule primarie hanno livelli normali di PTEN. I composti selezionati pro-senescenti devono non avere effetto sulle cellule primarie, ma solo nelle cellule tumorali. Le cellule MEF Pten lx/lx sono infettate con un vettore retrovirale che contiene pMSCV PIG (vettore Puro IRES GFP) per ottenere le cellule MEF Pten wt resistenti alla puromicina e con pMSCV PIG Cre per ottenere le cellule MEF Pten-/- anch’esse resistenti, come descritto in precedenza. Tutti e due tipi di cellule vengono selezionati con puromicina per 2 giorni. I composti positivi nel passaggio 1 sono aggiunti alle cellule un giorno dopo la selezione. L'esperimento si conclude cinque giorni dopo la somministrazione dei composti da testare. Composti positivi per i quali si è confermato l'effetto sulla proliferazione cellulare nelle cellule Pten -/-, ma non nelle cellule Pten wt sono considerati "HIT selettivi" cioè composti selettivi per il pathway Pten e sono eventualmente analizzati nel passaggio successivo.
Passaggio 3
I composti positivi al passaggio 2 sono testati per la loro efficacia sulla proliferazione e attività β-Gal a diversi dosaggi (cinque diverse concentrazioni dalla bassa verso l'alta) in cellule MEF Pten-/- infettate e selezionate come descritto precedentemente.
Esempio 2 identificazione ed efficacia dell’estratto di Salvia Henkei come composto anti-senescenza
Tra i numerosi estratti naturali che sono stati testati secondo il metodo descritto nell’esempio 1 (circa 500), l’estratto di Salvia Henkei ha mostrato effetti sulla proliferazione cellulare nel primo e secondo passaggio del metodo con un aumento statisticamente significativo della crescita cellulare superiore al 40% o (Fig. 1). Il materiale vegetale di Salvia Henkei viene raccolto e le parti della pianta: fusto, foglie, fiori vengono essiccati in stufa ventilata a 45°C p er 24 ore, e successivamente macinati come polvere fina usando un miscelatore IKA universale M20. Una quantità di 20,0 g di polvere di pianta essiccata viene pesata in una beuta da 100 ml a cui si aggiungono 70 ml di esano (grado di purezza 99%) per pre-estrazione. La beuta viene posta in un bagno sonicatore-(Branson 8210 o qualche altro tipo) e sonicata alla temperatura di 40° C per 30 minuti. La miscela vien e filtrata con carta da filtro, seguita da lavaggio con 20 ml di esano e poi con 50 ml di esano. Il filtrato è versato in un pallone e il solvente viene concentrato sotto vuoto (a circa 11 mm Hg) fino a 5-10 ml mediante rotavapor, utilizzando un bagno d’acqua a 40°C. Questo residuo viene portato in un vaso seguito da evaporazione del solvente. Il vaso viene lasciato aperto durante la notte in una cappa ben ventilata per evaporare le ultime tracce di solvente nel pre-estratto. I solidi raccolti sul filtro, vengono suddivisi e asciugati all'aria durante la notte nella cappa. Il materiale essiccato viene estratto nello stesso modo con metanolo-acqua (90:10). Il materiale essiccato dai filtri posti in una beuta da 100 ml a cui si aggiunge 70 ml di metanolo al 90%. La miscela viene sonicata a 40° C per 30 minuti, dopo essere stata filtrata, poi lavata con 20 ml di metanolo al 90%. Il filtrato è versato in un pallone e il solvente viene evaporato sotto vuoto completamente. L'estratto secco in 90% metanolo viene disciolto nella minor quantità possibile di metanolo assoluto, utilizzando il sonicatore e versato in un vaso da 30 ml per farlo evaporare durante la notte nella cappa.
In alternativa, viene usata l’estrazione etanolica per i materiali vegetali: la pianta di Salvia Henkei viene essiccata in ombra, e la polvere prodotta in una smerigliatrice meccanica. La polvere di materiale vegetale viene inizialmente sgrassata con petrolio benzene (60-80° C) seguito da 1000 ml di etanolo us ando un apparecchio di estrazione Soxhlet per 72 ore ad una temperatura non superiore al punto di ebollizione del solvente [Lin et al., 1999]. L'estratto viene filtrato utilizzando filtro di carta Whattman e poi concentrato sotto vuoto ed essiccato a 45 °C per la rimozione dell'etanolo. L’estratto viene conservato in bottiglie sterili sotto condizioni di refrigerazione fino al momento della ricostituzione.
L’estratto grezzo di HAEN viene ricostituito in DMSO puro nella concentrazione di 10 um/ml per poi diluirlo fino a concentrazione specifica usata nel terreno per le colture cellulari.
Successivamente, l’estratto di Salvia Henkei è stato testato nel protocollo 3T3 in cellule primarie umane (WI38-CCL75, ATCC) per convalidare l’effetto anti-senescente nel modello di senescenza replicativa. In dettaglio 3x105 cellule sono state piastrate in piastre da 10 cm e successivamente passate e ri-piastrate nello stesso numero ogni 3 giorni per un totale di 24 passaggi fino al punto in cui il trattamento con l’estratto di Salvia Henkei è stato iniziato. Al passaggio 25, le cellule sono state piastrate ugualmente a 3x105 cellule per piastra e trattate con l’estratto di Salvia Henkei in singola concentrazione (0, 01 mg/ml). Ogni 3 giorni è stato rivelato il numero di cellule presenti, dopo di che, le cellule sono state ri-piastrate alla densità di 3x105 per piastra e ripetuto il trattamento con l’estratto di Salvia Henkei a 0,01mg/ml. Al passaggio 30, è stato osservato l’arresto della crescita a causa di senescenza replicativa nel gruppo di controllo non trattato invece le cellule trattate con l’estratto di Salvia Henkei hanno continuato di replicarsi (Fig.2).
In corrispondenza dei punti temporali a 28, 29 e 30 ore le cellule sopra descritte sono state analizzate per l'espressione di β-galattosidasi. Le cellule trattate con l’estratto di Salvia Henkei hanno mostrato una riduzione significativa del numero di cellule positive per il marcatore senescente β-Gal. rispetto al controllo non trattato (Fig.3).
L’estratto di Salvia Henkei è stato testato anche per la capacità di prevenire senescenza in un modello di senescenza causata da irradiazione UVB nei fibroblasti umani primari (WI38-CCL75, ATCC). In sintesi, le cellule WI38 sono state irradiate con la dose ottimale di irradiazione UV che provoca senescenza prematura, sei ore dopo l'irradiazione, l’estratto di Salvia Henkei è stato aggiunto in concentrazione singola (0,01mg/ml), contemporaneamente con il controllo positivo trattato con Nutlin-3 (0,01mg/ml). La proliferazione cellulare è stata determinata nei punti temporali a 24, 48 e 72 ore dopo il trattamento tramite saggio di colorazione con Crystal violet, dove l'intensità di colore letta al spettrometro corrisponde al numero di cellule vive presenti nella cultura. Ai punti temporali a 48 e 72 ore dopo il trattamento, è stato eseguito il saggio β-Gal. per valutare la presenza di cellule senescenti in coltura. Il trattamento con l’estratto di Salvia Henkei era in grado di prevenire l'arresto della crescita e senescenza causati dal trattamento UV rispetto alle cellule non trattate e trattate con Nutlin-3. (Fig.4, 5).
Per evitare ogni possibilità di eventuale effetto tossico dell’estratto di Salvia Henkei e per verificare se la dose efficace è inferiore alla dose utilizzata (0,01mg/ml) nel saggio precedente, le cellule WI38 sono state trattate con cinque concentrazioni diverse di estratto di Salvia Henkei nella presenza e in assenza di irradiazioni UV. Le cellule sono state irradiate e analizzate per la presenza di morte cellulare mediante esclusione con Trypan blu e livelli di proliferazione valutati mediante la colorazione con Crystal violet in punti temporali a 24, 48 e 72 ore. L’estratto di Salvia Henkei non ha mostrato nessun effetto tossico quando somministrato anche in concentrazioni 10 volte superiori a quella effettiva 0,01 mg/ml (Fig. 6). Infatti, il numero di cellule morte contate usando colorazione Trypan blu è stato più basso nei gruppi trattati estratto di Salvia Henkei rispetto ai gruppi di controllo non trattato (Fig.6).
Gli esperimenti precedentemente descritti suggeriscono che l’estratto di Salvia Henkei mostra di essere efficace come composto anti-senescenza nei modelli sia di senescenza replicativa sia quella prematura (foto-senescenza).
Esempio 3 composizioni comprendenti estratto Salvia Henkei
Specifica formulazione contenente:
olio ottenuto da Olea europaea (96% in peso);
olio essenziale da foglie di Salvia officinalis (2% in peso);
olio essenziale da foglie di lavandula hybrida (2% in peso);
estratto di Salvia Haenkeii (preparato come descritto nell’esempio 2) (0,01% in peso); La percentuale in peso è definita rispetto al peso totale della composizione.
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Metodo per rivelare l’attività anti-senescenza o pro-senescenza di un composto candidato comprendente i seguenti passaggi: a) fornire una linea cellulare ingegnerizzata immortalizzata reversibilmente e mancante di un gene funzionale Pten; b) riportare detta linea cellulare in uno stato non immortalizzato; c) mettere in contatto dette cellule non più immortalizzate con detto composto candidato; d) valutare la proliferazione cellulare di dette cellule in seguito al contatto con detto composto, per cui un aumento della proliferazione cellulare indica un’attività antisenescenza e una riduzione della proliferazione cellulare indica un’attività prosenescenza.
- 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui detta linea cellulare al passaggio a) è ottenuta con un vettore retro-virale doxiciclina inducibile.
- 3. Metodo secondo la rivendicazione 2 in cui dette cellule sono riportate in uno stato non immortalizzato eliminando la doxociclina dal terreno di coltura.
- 4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 in cui detta valutazione della proliferazione cellulare comprende un saggio di colorazione citologica utilizzando il colorante cristal violetto.
- 5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti comprendente un ulteriore passaggio e) in cui è valutata l’espressione della β-galattosidasi di dette cellule in seguito al contatto con detto composto.
- 6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti comprendente un ulteriore passaggio f) in cui detto composto è messo a contatto con cellule ingegnerizzate Pten -/- e cellule ingegnerizzate Pten selvatiche (wild type) e un passaggio g) in cui è valutata la proliferazione cellulare e l’espressione della βgalattosidasi di dette cellule in seguito al contatto con detto composto.
- 7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui l’attivazione e disattivazione di Pten è ottenuta mediante l’introduzione del gene della ricombinasi in dette cellule ingegnerizzate.
- 8. Composizione cosmetica comprendente un estratto di Salvia Henkei e uno o più veicolanti cosmeticamente accettabili.
- 9. Composizione cosmetica secondo la rivendicazione 8 in forma di sospensione, emulsione, crema, spray, unguento, polvere, gel, liquido, capsula, compressa, pasticca.
- 10. Estratto di Salvia Henkei per uso nel trattamento di malattie associate all’invecchiamento cellulare.
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