CN117813091A - 预防或治疗皮肤疾病和状况的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供以酪蛋白激酶1抑制剂预防、改善或治疗皮肤病症、疾病或状况的方法。本公开另提供通过抑制酪蛋白激酶以增加真黑色素浓度和黑色素细胞数量的方法。本公开还提供通过抑制酪蛋白激酶1以增加皮肤色素沉着、保护晒伤、及再生与自体免疫疾病相关的黑色素细胞损失的方法。

Description

预防或治疗皮肤疾病和状况的方法
技术领域
本公开涉及以酪蛋白激酶1抑制剂预防、改善或治疗皮肤病症、疾病或状况的方法。本公开还提供一种通过抑制酪蛋白激酶以增加皮肤真黑色素(eumelanin)的方法。
背景技术
紫外线(UV)可通过经活性含氧物(ROS)产生的间接细胞损伤及通过对DNA中核苷酸结构的直接损伤而伤害皮肤，从而引起急性晒伤反应。因此，紫外线辐射与皮肤癌及其他皮肤疾病及状况的发展高度相关。
表皮主要由角质细胞和黑色素细胞所组成，并作为一种高度复杂的屏障组织，可保护身体免受如紫外线辐射等持续的外部伤害。角质细胞对紫外线敏感，为皮肤中的主要反应者。该细胞因应紫外线而产生各种旁分泌因子，影响其微环境并活化相邻的黑色素细胞，以形成角质细胞-黑色素细胞功能单元。皮肤色素增加或变黑为人体对抗紫外线的生物反应之一，这是由于黑色素细胞中真黑色素合成增加，随后真黑色素再分布到邻近的角质细胞而引起的。
因此，真黑色素作为可直接防止紫外线和可见光辐射穿透到增殖细胞所在的深层皮肤层之天然防晒剂，并作为一种有效的抗氧化剂和自由基清除剂。肤色较深的人患紫外线引起的皮肤癌的发生率较低，而肤色较浅的人更容易受到紫外线引起的损伤和肿瘤形成，且晒黑反应较弱。事实上，黑色素细胞会产生两种不同类型的黑色素，即黑褐色真黑色素及黄红色伪黑色素。虽然两种黑色素都可以在不同肤色的人群中找到，但黑褐色真黑色素在黑色及/或褐色头发的个体中占主导地位，而黄红色伪黑色素主要在红头发和雀斑的个体中产生。然而，黑色素的有益作用主要来自于真黑色素的存在，其吸收大部分紫外线并清除紫外线所产生的自由基，而已知伪黑色素具有致癌性。因此，应谨慎实施黑色素的操作，以选择性地增加真黑色素的浓度，而非提高伪黑色素的浓度。
自体免疫疾病被定义为免疫系统错误地攻击健康细胞。自体免疫疾病为一种病理生理状态，其中已提出超过80种类型。自体免疫疾病的病因仍未被发现。此外，白斑已被证明为一种自体免疫疾病。此外，在患有白斑的个体中，皮肤中的色素细胞、黑色素细胞受到免疫系统的攻击，导致真黑色素或黑色素细胞数量减少。
因此，亟需一种有效的方法来选择性地增加真黑色素或黑色素细胞数量的有益浓度，以预防紫外线所引起的DNA损伤、自体免疫疾病相关的皮肤状况及皮肤癌。
发明内容
本公开提供一种在有其需要的个体中用于预防、改善或治疗皮肤病症、疾病或状况的方法，包括向个体施用有效量的酪蛋白激酶1抑制剂(CKI)。在至少一实施例中，该皮肤病症、疾病或状况是由紫外线过度照射及自体免疫疾病导致。在至少一实施例中，该皮肤病症、疾病或状况为急性晒伤。在至少一实施例中，该皮肤病症、疾病或状况为白斑。在其他实施例中，该皮肤病症、疾病或状况为异位性皮肤炎样疹、荨麻疹或牛皮癣。在至少一实施例中，该皮肤病症、疾病或状况为色素减退、光化性角化病、非典型痣、基底细胞癌、黑素瘤、默克尔细胞癌、鳞状细胞癌或皮肤恶性黑素瘤。在一些实施例中，该皮肤病症、疾病或状况由涉及前脑啡黑细胞促素皮促素(pro-opiomelanocortin，POMC)、α-黑色素细胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)、黑皮质素1受体(melanocortin 1receptor，MC1R)和小眼病相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor，MITF)中的至少一种的信息传递路径缺陷引起的。
本公开另提供一种保护个体免受紫外线辐射伤害的方法，包括向个体施用有效量的酪蛋白激酶1抑制剂。
本公开还提供一种用于增加有其需要的个体中皮肤色素沉着的方法，包括向个体施用有效量的酪蛋白激酶1抑制剂。
本公开另提供一种用于提高有其需要的个体中真黑色素浓度的方法，包括向个体施用有效量的酪蛋白激酶1抑制剂。在一些实施例中，该增加真黑色素浓度涉及增加KitL浓度。在一些实施例中，该增加表皮中的KitL浓度诱导黑色素细胞从个体的真皮向表皮的移动。在至少一实施例中，该真黑色素浓度选择性地增加超过褐黑色素浓度。在一些实施例中，该个体表皮中的真黑色素浓度增加。
在至少一实施例中，本公开所提供的方法涉及增加黑色素细胞再生。在至少一实施例中，本公开所提供的方法涉及黑色素细胞数量的增加或从真皮到表皮的黑色素细胞迁移。
在至少一实施例中，本公开所提供的方法涉及酪蛋白激酶1抑制剂的局部施用。
本公开另提供一种抑制皮肤细胞中酪蛋白激酶1活性的方法，包括使皮肤细胞与有效量的酪蛋白激酶1抑制剂接触。
本公开提供一种增加皮肤细胞中真黑色素浓度的方法，包括使皮肤细胞与有效量的酪蛋白激酶1抑制剂接触。
在至少一实施例中，使皮肤细胞与有效量的酪蛋白激酶1抑制剂接触以调整有其需要之个体的肤色。在至少一实施例中，使皮肤细胞与有效量的酪蛋白激酶1抑制剂接触会使有其需要之个体的皮肤晒黑。
附图说明
通过阅读以下实施例的描述并参考附图，可以更全面地理解本公开。
图1A至图1H说明CKI(A51)局部治疗对野生型(WT)小鼠的紫外线防护效果。图1A显示CKI于C57BL/6小鼠耳朵上每隔一天局部施用4周的治疗方案，且每次施用的量为0.1mg/cm2，总共施用1.2mg的CKI。第6周的箭头显示用于组织分析的耳朵样品的采集时间点(N＝10)。图1B显示耳组织的免疫组织化学(IHC)分析的耳表现型、Fontana-Masson染色、c-Kit染色和Trp1染色的照片。图中还显示表皮厚度、黑色素强度及从染色中定量并以直方图显示的c-Kit+和Trp1+细胞的数量。通过数位显微镜(UPG650，Upmost TechnologyCo.)拍摄详细的皮肤色素沉着。第6周时在表皮中观察到黑色素细胞数量增加。Fontana-Masson染色表明表皮中真黑色素量增加及表皮厚度增加。c-Kit染色显示角质细胞和黑色素细胞上的Kit表现增加。Trp1染色显示表皮中黑色素细胞数量增加。图1C显示局部CKI施用后全层皮肤中真黑色素(EM)/伪黑色素(PM)的比率显著增加，且增加的真黑色素比率主要位于表皮而非真皮。NS：不显著。图1D和图1E显示对野生型小鼠(对照)按照1mg/cm2 1次、0.5mg/cm26次、0.2mg/cm2 5次，隔日局部涂于小鼠耳部，处理4周，共5mg CKI的紫外线防护效果的结果。在图1F中，产生Tyr-CreERT2；FusionRed小鼠，并通过来自由黑色素细胞特异性酪胺酸酶启动子驱动的Cre重组的FusionRed荧光追踪黑色素细胞。在他莫昔芬(tamoxifen)诱导后，黑色素细胞在组织中的绿色荧光(GFP)细胞中的膜上特异性表现红色荧光(Fusion Red)。在他莫昔芬诱导后，采集耳皮并修剪成15μm的部分。切片封固在含DAPI的封固溶液，并在荧光显微镜下观察。在对照小鼠中，耳表皮上有罕见的FusionRed标记的黑色素细胞(N＝3)。在小鼠耳上局部施用1.2mg CKI后，表皮中FusionRed标记的黑色素细胞(箭头所示)增加(N＝3)。计算表皮中黑色素细胞的数量并显示在直方图中。图1G通过对耳背皮肤组织的西方墨点法(Western blotting)分析显示KitL/c-Kit路径和黑色素生成相关靶标中的蛋白质表现浓度。浅灰色条代表对照组，而深灰色条代表接受1.2mg CKI治疗的组。n.s.：不显著。图1H显示局部CKI治疗对UVB照射诱导的短期角质细胞DNA损伤的保护作用的治疗方案和结果。在总共0.6毫克CKI治疗后，每隔一天局部施用0.1毫克CKI，总共6次，小鼠在第21天暴露于750mJ/cm2 UVB(N＝6)维持24小时。采集的样品固定在4％多聚甲醛(PFA)中并嵌入石蜡或冷冻最佳切割温度(OCT)。UVB暴露引起的DNA损伤通过环丁烷嘧啶二聚体(CPD)的量进行检查，CPD为UVB辐射影响的特定标志物。CKI治疗后CPD染色的减少表明，在使用较高CKI剂量(1.2mg或5mg)治疗可见的较深皮肤之前，局部CKI的紫外线防护效果在较低的CKI剂量(0.6mg)下是有效的。信号均由ImageJ软件量化，统计结果由非配对t检验分析确定，并显示为平均值±SD。其中，星号***显示显著差异，P<0.001。
图2A至图2S显示在Tg(K14-CreER)-CK1αfl/fl；Mc1r549del小鼠，CK1α剔除增加真黑色素保护以及局部CKI保护Mc1r549del小鼠免受紫外线诱导的DNA损伤。图2A显示C57BL/6和C57BL/6J-Mc1r549del小鼠的表现型以及C57BL/6J-Mc1r549del小鼠角质细胞中CK1α剔除的产生，图2B显示小鼠杂交获得诱导型Mc1r549del小鼠的方案。图2C显示他莫昔芬诱导方案和第14、28和42天的皮肤样品采集。图2D显示在皮肤尾部表现型中，在腹膜内(IP)三苯氧胺(TAM)诱导的CK1α剔除的第28天，皮肤色素沉着明显增加。图2E显示在CK1α-/-；Mc1r549del小鼠皮肤的角质细胞中CK1α剔除后第14天、第28天和第42天进行Fontana-Masson染色的时间进程分析。图2F显示全层皮肤、表皮和真皮中Fontana-Masson染色细胞的定量数量，表明表皮、真皮和全层皮肤中真黑色素的增加。图2G显示在诱导后第14天(N＝4)及第28天(N＝3)CK1α-/-；Mc1r549del小鼠对比Mc1r549del小鼠的尾部皮肤真黑色素分析。图2H显示TRP1染色(红色)的共轭焦荧光图像表明在IP TAM诱导的CK1α剔除后第28天，黑色素细胞的数量显著增加。图2I显示诱导后CK1-/-Mc1r549del小鼠与Mc1r549del小鼠相比，尾部皮肤的定量实时PCR，其中观察到CK1α降低，而观察到p53、Kit-L、c-Kit和黑色素基因Tyr的增加。图2J显示了在本公开中使用的实验设计，其中局部4-OHT诱导用在Tg(K14-CreER)-CK1αfl/fl；Mc1r549del小鼠的CK1α剔除。在第42天进行15次0.75J/cm2的UVB照射，24小时后采集皮肤样本。在图2K显示了紫外线照射后，表皮或全层皮肤的HE染色或Masson Fontana染色，并表明CK1α-/-；Mc1r549del小鼠与Mc1r549del小鼠相比中，尾部肿胀和环丁烯嘧啶二聚体(CPD)染色显著增加，该CPD为一种DNA损伤的生物标志物。图2L显示了在CK1α-/-；Mc1r549del小鼠与Mc1r549del小鼠相比中，尾部皮肤暴露于紫外线后，促发炎细胞激素IL-6和IL-1β的定量实时PCR。2M显示在第42天，尾部皮肤表现型显示可见色素沉着。HE染色显示表皮厚度增加；Fontana Masson染色显示全层皮肤中的真黑色素显著增加，尤其在表皮中。FIG.2N显示局部CKI给药的治疗方案，其中，该CKI以0.1毫克/次和0.3毫克/周的剂量局部给药4周，总共施用1.2mg的CKI，并在第6周采集皮肤用于组织分析(N＝6)。图2H显示在局部CKI治疗6周后采集的耳朵样品，进行组织分析。图2O显示了在局部CKI处理后6周采集的耳朵样本，分别进行Fontana-Masson染色以个别观察表皮厚度和真黑色素量。图2P显示在局部治疗1.2mg CKI的Mc1r549del1小鼠中，通过蛋白质点墨分析耳朵样品KitL/c-Kit路径中蛋白质和黑色素细胞相关靶点的表现浓度，表明KitL、c-Kit、MITF、酪胺酸酶和p53的表现量均显著增加。与局部赋形剂治疗的小鼠相比。图2Q显示局部施用总共2.6mg CKI的Mc1r549del小鼠的EM/PM比率增加。图2R显示750mJ/cm2的UVB照射对具有或不具有CKI处理的Mc1r549del小鼠的影响。皮肤样品按照方案中的说明进行处理，并在第21天进行750mJ/cm2的UVB照射24小时后采集，并使用抗CPD抗体染色以检查DNA损伤。以总共0.6mg的CKI处理的突变小鼠显示表皮和真皮(皮脂上皮、毛囊上皮、成纤维细胞)中的环丁烯嘧啶二聚体(CPD)染色减少，表明局部CKI治疗的紫外线防护效果。直方图分别显示对照和CKI治疗组表皮和真皮中CPD阳性细胞的数量。图2S比较从或没有局部CKI治疗的野生型(WT)小鼠和Mc1r549del小鼠获得的CPD染色，并表明局部CKI治疗可防止WT和Mc1r549del小鼠的皮肤受到紫外线损伤。
图3A至图3E显示局部CKI施用发挥紫外线保护作用，防止人体皮肤外植体中UVB诱导的DNA损伤。图3A显示使用人类包皮标本进行CKI治疗的方案。标本在12孔板(N＝5)中培养。外植体培养24小时后，以0.01mg的CKI处理标本，两天后再次进行0.01mg的CKI处理，如时间线所示。在第5天，将样品暴露在1J/cm2的UVB光下。6小时后采集样品。皮肤标本的照片显示局部CKI治疗后皮肤较黑。图3B显示局部CKI总共0.02mg治疗后，EM/PM的比率增加，。图3C显示用于直接观察的组织照片，这些组织以4％的PFA固定，接着以石蜡包埋，通过Fontana-Masson染色观察黑色素分布。此外，还进行OCT中的冷冻包埋，用于Melan-A和Trp-1标记的IHC分析。在直方图中量化Melan-A+细胞和Trip-1+细胞的数量以及对照组或CKI治疗组中的相对黑色素强度。图3D显示从表皮中提取的总蛋白质的西方点墨法结果和相应的定量直方图，以检查p53和色素沉着相关蛋白质的表现浓度。图3E显示CPD表现和Image J软件在UVB照射样品中，使用或不使用CKI处理的CPD+细胞数量的量化。统计结果由非配对t检验分析确定，并显示为平均值±SD。其中，星号***表示P<0.001的显著差异。
图4A至图4G显示CKI处理对初代人源角质细胞和黑色素细胞的影响。图4A显示CKI治疗的实验设计。在图4B中，当细胞汇合率为90％时，以指定浓度的CKI处理初代人源角质细胞。细胞裂解物通过西方墨点法分析，证明p53的活化并以剂量依赖性方式增加KitL和c-Kit表现。在图4C中，处理72小时后收集培养基并进行ELISA测定，结果显示KitL的浓度因CKI处理而增加。来自总共3个独立实验的统计结果由未配对t检验分析确定，并显示为平均值±SD。***表示P<0.001的显著差异。在图4D和图4E中，初代黑色素细胞在条件培养基中培养，角质细胞培养了3天，并使用或不使用CKI处理。图4D显示抗-HMB45抗体染色黑色素体的结果；通过台盼蓝(trypan blue)染色计算细胞数，并在HMB45染色的细胞上测量树突长度。在图4E中，以条件培养基培养的黑色素细胞显示黑色素细胞特异性调节剂、酪胺酸酶和MITF的表现浓度增加，其中该条件培养基来自以各种CKI浓度处理的角质细胞。在图4F中，当细胞汇合率为90％时，以不同浓度的CKI处理初代人类黑色素细胞。处理72小时后提取总蛋白，并检查黑色素细胞成熟标记物的表现，包括c-Kit受体、MITF、酪胺酸酶和磷酸化MKK6。西方墨点法结果显示MITF、酪胺酸酶和p-MKK6的表现以剂量依赖性方式增加。在图4G中，对初代黑色素细胞进行迁移测定。在黑色素细胞附着后，将培养基更换为具有溶剂对照或50nM CKI的培养基。在24小时后取出插入物，并在0、24和48小时拍摄照片。数据显示CKI增强黑色素细胞迁移。
图5A和图5B显示D4476和IC261处理对Mc1r549del小鼠的影响。图5A说明实验设计，图5B显示KitL/c-Kit路径和黑色素细胞相关靶标中蛋白质表现浓度的西方墨点法分析。
图6A至图6E显示另一种CKI(D4476)的局部处理对人体皮肤外植体的紫外线防护效果。图6A显示D4476局部施用方案的实验设计，包括0.04mg两次，总共0.08mg或0.05mg两次，分别在三个外植体上总共0.1mg。图6B显示D4476处理皮肤的Fontana-Masson染色结果的组织学分析。图6C和图6D分别显示c-Kit路径中蛋白质和黑色素生成相关蛋白表现浓度的西方墨点法分析结果和定量。图6E显示接受总共0.08mg的局部D4476之皮肤样品的CPD染色结果，直方图显示经CPD染色的细胞的定量数量(CPD+细胞的数量)。
图7A至图7C显示其他酪蛋白激酶1抑制剂(包括A51、CKI7、D4476和IC261)对人角质细胞的Kit路径和黑色素生成相关蛋白表现浓度的影响。
具体实施方式
以下通过特定的实施例说明本公开的实施方式。基于说明书所揭示的内容，所属技术领域中具有通常知识者可轻易地了解本公开的优点及功效。本公开亦可通过其它不同的实施方式加以施行或应用。本说明书中的各项细节亦可基于不同观点与应用，在不悖离本公开所揭示的范围下赋予不同的修饰与变更。
一般而言，本公开使用的命名法和本公开描述的有机化学、药物化学、生物化学、生物学和药理学中的实验室程序为本领域习知和常用的。除非另有定义，本公开使用的所有技术和科学术语通常具有与本公开所属技术领域中具有通常知识者理解的相同的含义。然而，根据所属技术领域中具有通常知识者的意图、案例先例或新技术的出现，这些术语可能具有不同的含义。此外，一些术语可以由申请人任意选择，在这种情况下，将在本公开的描述中详细描述所选术语的含义。因此，在此使用的术语必须基于术语的含义以及通过整个说明书的描述来定义。
进一步注意，如在本公开中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”除非明确地限于一个指代物，否则包括复数指代物。除非上下文另有明确指示，否则术语“或”与术语“及/或”可互换使用。
此外，当一个部件“包括(include)”或“包含(comprise)”一个部件或一个步骤时，除非有与之相反的特定描述，该部件还可以包括其他部件或其他步骤，但不排除其他部件或其他步骤。
术语“个体”、“患者”和“个体”在本公开中可互换使用，是指温血动物，包括但不限于灵长类动物(例如人)、牛、猪、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、大鼠(rat)或小鼠(mouse)。术语“个体(subject)”和“患者(patient)”在本公开中可互换使用，例如指哺乳动物个体，例如人类个体。在一些实施例中，个体为人。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”旨在包括减轻或消除病症、疾病或状况，或与病症、疾病或状况相关的一种或多种症状；或减轻或根除病症、疾病或状况本身的原因。
术语“预防(preventnt)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”意在包括延迟及/或阻止病症、疾病或状况及/或其伴随症状的发作的方法；禁止个体患上病症、疾病或状况；或降低个体患上病症、疾病或状况的风险。
术语“减轻(alleviate)”和“减轻(alleviating)”是指减轻或减轻病症、疾病或状况的一种或多种症状(例如，疼痛)。这些术语还可以指减少与活性成分相关的副作用。在一些实施例中，个体从预防剂或治疗剂中获得的有益效果不会导致病症、疾病或状况的治愈。
术语“接触(contacting)”或“接触(contact)”指将美容剂或治疗剂与细胞或组织结合在一起，从而由于这种接触而发生生理及/或化学效应。接触可以在体外、离体或体内发生。在一些实施例中，美容剂或治疗剂与细胞培养物(体外)中的细胞接触以确定美容剂或治疗剂对细胞的影响。在一些实施例中，美容剂或治疗剂与细胞或组织的接触包括向具有待接触的细胞或组织的个体施用美容剂或治疗剂。
术语“治疗有效量”或“有效量”意在包括化合物的量，该量在施用时足以预防病症、疾病的一种或多种症状的发展或在一定程度上减轻，或正在治疗的情况。术语“治疗有效量”或“有效量”还指足以引发生物分子(例如蛋白质、酶、RNA或DNA)、细胞、组织、系统、动物或人的生物学或医学反应的化合物量，且该化合物量为研究人员、兽医、医生或临床医生所正寻找的。
术语“药学上可接受的赋形剂”、“药学上可接受的赋形剂”、“生理学上可接受的赋形剂”或“生理学上可接受的赋形剂”指化妆品或药学上可接受的材料、组合物或赋形剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂，或封装材料。在一些实施例中，每个组分在与化妆品或药物制剂的其他成分兼容的意义上为“药学上可接受的”，且适用于与个体(例如，人或动物)的组织或器官接触)没有过度的毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其他问题或并发症，具有相称之合理收益/风险比。参见Remington：药学的科学与实践，第22版；Allen编：Philadelphia，PA，2012年；药用赋形剂手册，第7版；Rowe等人编；制药出版社和美国制药协会：2012年；药物添加剂手册，第3版；Ash和Ash编；高尔出版公司：2007年；药物预制剂和制剂，第2版；Gibson编；CRC Press LLC：Boca Raton，FL，2009年。
术语“大约(about)”或“大约(approximately)”指由所属技术领域中具有通常知识者确定的特定值的可接受误差，这部分取决于如何测量或确定该值。在一些实施例中，术语“大约(about)”或“大约(approximately)”指在1、2、3或4个标准偏差内。在一些实施例中，术语“大约(about)”或“大约(approximately)”指在给定值的50％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.05％范围以内。
术语“活性成分(active ingredient)”和“活性物质(active substance)”指单独或与一种或多种美容或药学上可接受的赋形剂组合向个体施用以预防、改善或治疗病症的一种或多种症状的化合物、疾病或状况。如本公开所使用，“活性成分”和“活性物质”可为本公开所述化合物的旋光异构体。
术语“药物(drug)”、“美容剂(cosmetic agent)”和“治疗剂(therapeuticagent)”指化合物或其美容或医药组合物，施用于个体以预防、改善或治疗病症、疾病或状况的一种或多种症状。
酪蛋白激酶lα(CK1α)由Csnklal基因编码，为β-catenin降解复合物的组成部分，亦为Wnt信息传递路径的调节剂，其剔除诱导Wnt和p53活化。CK1α在Ser45位点磷酸化β-catenin，从而准备被GSK-313的后续磷酸化。GSK-313通过在Ser33、Ser37和Thr4l处磷酸化β-catenin而使其不稳定，从而标记β-catenin以通过SCFβ-TrCP E3的泛素化和蛋白酶体降解。这种CK1α依赖性磷酸化作为Wnt路径的分子开关而发挥作用。CK1α的纯合缺陷导致胚胎致死性，表明CK1α在胚胎发育中的基本作用。于对小鼠肠道上皮细胞的研究中，发现CK1α缺陷会诱导Wnt活化、细胞衰老和DNA损伤反应，在包括组织干细胞在内的多种组织中具有强烈的p53活化和细胞衰老。这些事实表明CK1α参与各种组织的细胞过程，此至少部分地与p53协调。
众所周知的肿瘤抑制蛋白p53为一种转录因子，参与细胞对基因毒性应激和DNA损伤的反应。在皮肤中，p53还可以对抗紫外线损伤。紫外线辐射导致p53活化，而p53刺激前脑啡黑细胞促素皮促素(POMC)基因的转录上调，该基因于翻译后加工成促肾上腺皮质激素(ACTH)、α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)和β-内啡肽。分泌的α-MSH与黑色素细胞上的黑皮质素1受体(MC1R)结合，导致黑色素的产生。黑色素被包裹在黑色素体内并被运送回角质细胞，在那里其定位在细胞核上，作为对紫外线辐射的保护性晒黑反应的一部分。角质细胞分泌的α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)与黑色素细胞上的黑皮质素1受体(MC1R)结合，导致cAMP上调，从而刺激小眼畸形相关转录因子(MITF)的表现。接着，MITF转录活化酶机制的表现，包括酪胺酸酶和酪胺酸酶相关蛋白1(Tyrp1)。因此，在皮肤中，p53还通过p53/POMC/α-MSH/MC1R/MITF皮肤晒黑路径和DNA修复/细胞周期停滞/凋亡路径对抗紫外线损伤。
紫外线照射被认为是皮肤癌的主要外在因素。皮肤中的黑色素可能参与防止光老化和光致癌作用。真黑色素为在阳光照射期间产生的天然防晒剂。人类黑色素细胞合成真黑色素(黑色素的深棕色形式)和褐黑色素(呈红黄色)。黑色素细胞合成真黑色素和褐黑色素的相对速率决定皮肤颜色和皮肤对太阳紫外线剧烈影响的敏感性。真黑色素比褐黑色素更稳定且不易发生光降解。真黑色素为有效的ROS清除剂，而非褐黑色素。褐黑色素的色素路径通过氧化损伤机制对黑色素瘤产生不依赖于紫外线辐射的致癌作用。真黑色素含量与环丁烷嘧啶二聚体(CPD)(DNA光产物的主要形式)的生成之间存在反比关系。
MC1R、其促效剂和所涉及的信息传递路径在调节真黑色素合成中发挥作用。信号缺失MC1R多态性常见于皮肤白皙、阳光敏感和皮肤癌易发人群(例如北欧人)，他们可以合成褐黑色素和非常稀少的真黑色素。最普遍的MC1R突变(D84E、R151C、R160W和D294H)通常被称为“RHC”(红头发颜色)等位基因，因为其等与红头发颜色、雀斑和紫外线照射后的灼伤倾向有关。信号缺失的MC1R等位基因(如RHC变体)与黑色素瘤和其他皮肤癌的终生风险增加多达四倍有关。
如本公开所公开，去除β-catenin降解复合物的组分CK1α导致p53稳定，并诱导角质细胞中p53依赖性KitL表现。KitL是一种作用于黑色素细胞上的受体c-kit的旁分泌因子，以启动黑色素生成过程并增加真黑色素的产生和皮肤色素沉着。CK1α抑制诱导的真黑色素可有效保护皮肤免受急性晒伤，减少角质细胞的凋亡，并减少小鼠模型中促炎细胞因子的产生。抑制角质细胞中的CK1α会活化不同的路径，p53/KitL/Kit，并诱导保护性真黑色素的产生，而不含致癌性褐黑色素。因此，抑制CK1α有望成为保护皮肤免受阳光照射和挽救MC1R受损或涉及MC1R的信息传递路径受损的人群中真黑色素形成的紫外线保护策略。CK1α的抑制不仅证明增加真黑色素的潜力，而且显示黑色素细胞数量的增加，并提供一种治疗脱色疾病(如白斑症)的方法。
在至少一实施例中，本公开提供一种用于增加个体中真黑色素浓度的方法，包括向个体施用治疗有效量的酪蛋白激酶1抑制剂(CKI)。在一些实施例中，CKI被局部施用于个体。在一些实施例中，CKI被局部施用于个体的皮肤。在一些实施例中，本公开所提供用于增加真黑色素浓度的方法为选择性地增加真黑色素浓度超过褐黑色素浓度。在一些实施例中，本公开所提供用于提高真黑色素浓度的方法为将真黑色素浓度提高至比褐黑色素浓度高至少十倍或更多倍。在一些实施例中，将CKI局部施用于个体皮肤的选定区域，以增加个体目标身体部位的真黑色素浓度。
在至少一实施例中，本公开提供一种用于预防、改善或治疗个体的皮肤病症、疾病或状况的方法，包括向个体施用美容或治疗有效量的酪蛋白激酶1抑制剂(CKI)。在一些实施例中，美容或治疗有效量的CKI的施用为局部施用给个体的。
在至少一实施例中，皮肤病症、疾病或状况由UV过度暴露引起。在一些实施例中，皮肤病症、疾病或状况为日光性红斑、日光性过敏、日光性荨麻疹、日光性弹性组织变性、光老化或晒伤。在一些实施例中，皮肤病症、疾病或状况为晒伤。在一些实施例中，皮肤病症、疾病或状况为急性晒伤。在一些实施例中，皮肤病症、疾病或状况为色素沉着不足、炎症后色素沉着不足或受伤后色素沉着过度。在一些实施例中，皮肤病症、疾病或状况为黑色素减少症、特发性点滴状黑色素减少症、花斑症、白糠疹、花斑癣、进行性黄斑部黑色素减少症、白斑或华氏综合症(Waardenburg syndrome)。在一些实施例中，皮肤病症、疾病或状况为白斑。在一些实施例中，皮肤病症、疾病或状况为皮肤癌。在一些实施例中，皮肤病症、疾病或状况为光化性角化病、非典型痣、基底细胞癌(BCC)、黑色素瘤、Merkel氏细胞癌(MCC)、鳞状细胞癌(SCC)或皮肤恶性黑色素瘤。
在本公开的一些实施例中，本公开提供的方法包括治疗个体而不管患者的年龄，尽管一些疾病或病症在某些年龄组中更为常见。
在本公开的一些实施例中，本公开提供保护个体免受紫外线辐射的方法，包括向个体施用有效量的酪蛋白激酶1抑制剂。在一些实施例中，本公开提供用于增加个体的皮肤色素沉着的方法，包括向个体施用美容或治疗有效量的酪蛋白激酶1抑制剂。在一些实施例中，保护个体免受紫外线辐射和增加皮肤色素分布的方法包括向个体局部施用美容或治疗有效量的CKI。在一些实施例中，将CKI局部施用于个体皮肤的选定区域以作用于个体的目标身体部位。
本公开中的预防或治疗方法为通过接触/施用能够抑制CK1的药剂来实现。CK1为一个很好保留的Ser/Thr激酶家族，保留于从酵母到人类的所有测试生物体中。在哺乳动物中，CK1家族由7个基因(α、β、γ1、γ2、γ3、δ和ε)组成，编码11种选择性剪接的异构体。CK1家族的成员共享一个保守的催化域和ATP结合位点，使其等与其他激酶家族有所区分。CK1为一种普遍存在于所有细胞中的酶，占据不同的亚细胞定位并参与除Wnt信号之外的各种细胞过程。
在一些实施例中，CK1抑制剂(CKI)增加p53的表现及/或活性(至少2倍)及/或活化DNA损伤反应(DDR)。
与调节细胞周期的其他激酶例如细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)相比，本公开的CK1抑制剂(CKI)对CK1的抑制剂活性可达到至少两倍、至少5倍或至少10倍(例如，Cdk2、Cdk4和Cdk6)。此外，与蛋白激酶C(PKC)、PKA、HER2、raf-1、MEK1、MAP激酶、EGF受体、PDGF受体、IGF受体、PI3激酶、Wee1激酶、Src及/或Abl相比，CK1抑制剂对CK1的抑制剂活性为其至少两倍、至少5倍或至少10倍。
在部分实施例中，CKIs对CK1α有选择性(CSNK1A；在基因体、mRNA或蛋白质浓度，GenBank登录号NP_001020276、NM_001025105和NM_001020276)。在本公开的一些实施例中，CKI还对其他CK同工酶如CK1δ、CK1ε等具有抑制活性。在本发明公开的至少一实施例中，CKI对CK1α、CK1δ、CK1ε或其中各者之任何组合具有抑制活性。
在至少一实施例中，酪蛋白激酶1抑制剂具有通式I，包括其任何立体异构体或盐：
其中：
R1和R2各自独立地选自由H、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C1-C5烷氧基、直链或支链C1-C5酰基、C5-C15芳基和C3-C7杂芳基所组成的群组，每个任选地经卤化物、羟基、酯、醚、C5-C15芳基、C3-C7杂芳基和酰胺中的至少一种所取代；或R1和R2与其等连接的氮原子一起形成任选地包括N、O、NH、C＝N、C＝O和SO2中的至少一种，且任选地经直链或支链的C1-C5烷基、C5-C15芳基、C3-C7杂芳基、羟基、卤化物和氰基中的至少一种所取代的4至7元饱和、不饱和或芳香的环；
R3和R4各自独立地选自由H、任选地经卤化物、羟基、烷氧基、C5-C15芳基、C3-C7杂芳基、酯和酰胺中的至少一种取代的直链或支链C1-C8烷基所组成的群组；或者
R1或R2与R3及其等各自连接的碳和氮原子一起形成4至7元饱和、不饱和或芳香的环，其任选地包括N、NH、O、C＝N、C＝O和SO2中的至少一种，并且任选地经直链或支链C1-C5烷基、C5-C15芳基、C3-C7杂芳基、羟基、羰基和卤化物中的至少一种取代；
R5和R8各自独立地选自由H、卤化物、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C2-C8烯基和任选地经至少一种卤化物取代的直链或支链C2-C8炔基所组成的群组；
R6选自由直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C2-C8烯基、直链或支链C2-C8炔基、C5-C10环烷基及任选地经直链或支链C1-C8烷基、C3-C7环烷基、4至6元杂环、C5-C15芳基、C3-C7杂芳基、卤化物、羟基和C1-C5烷基卤化物中的至少一种所取代的饱和或不饱和4至6元杂环所组成的群组；
R7选自由直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C2-C8烯基及任选地经C3-C7环烷基、4至6元杂环、C5-C15芳基、C3-C7杂芳基、卤化物、羟基和C1-C5烷基卤化物中的至少一种所取代的直链或支链C2-C8炔基所组成的群组。
其他酪蛋白激酶I抑制剂包括在国际公开号WO 2017/021969中描述的；其公开内容通过引用整体并入本公开。
在一些实施例中，酪蛋白激酶1抑制剂选自由CKI7、D4476、IC261和由式I至VII显示的化合物所组成的群组：
其中：
R1和R2各自独立地选自由H、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C1-C5烷氧基、直链或支链C1-C5酰基、C5-C15芳基和C3-C7杂芳基所组成的群组，每个任选地经卤化物、羟基、酯、醚、C5-C15芳基、C3-C7杂芳基和酰胺中的至少一种取代；或R1和R2与其等连接的氮原子一起形成任选地包括N、O、NH、C＝N、C＝O和SO2中的至少一种，且任选地经直链或支链的C1-C5烷基、C5-C15芳基、C3-C7杂芳基、羟基、卤化物和氰基中的至少一种所取代的4至7元饱和、不饱和或芳香的环；
R3和R4各自独立地选自由H、任选地经卤化物、羟基、烷氧基、C5-C15芳基、C3-C7杂芳基、酯和酰胺中的至少一种取代的直链或支链C1-C8烷基所组成的群组；或者
R1或R2与R3其等各自连接的碳和氮原子一起形成4至7元饱和、不饱和或芳香的环，其任选地包括N、NH、O、C＝N、C＝O和SO2中的至少一种，并任选地经直链或支链C1-C5烷基、C5-C15芳基、C3-C7杂芳基、羟基、羰基和卤化物中的至少一种取代；
R5和R8各自独立地选自由H、卤化物、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C2-C8烯基及任选地经至少一种卤化物取代的直链或支链C2-C8炔基所组成的群组；
R6选自由直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C2-C8烯基、直链或支链C2-C8炔基、C5-C10环烷基及任选地经直链或支链C1-C8烷基、C3-C7环烷基、4至6元杂环、C5-C15芳基、C3-C7杂芳基、卤化物、羟基和C1-C5烷基卤化物中的至少一种取代的饱和或不饱和4至6元杂环所组成的群组；
R7选自由直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C2-C8烯基，及任选地经C3-C7环烷基、4至6元杂环、C5-C15芳基、C3-C7杂芳基、卤化物、羟基和C1-C5烷基卤化物中的至少一种所取代的直链或支链C2-C8炔基所组成的群组；
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如本公开所使用，局部给药包括(内)皮、结膜、角膜内、眼内、眼、耳、经皮、鼻、阴道、尿道、呼吸和直肠给药。
本公开提供的美容或医药组合物可以配制成适合局部或全身作用的局部给药的任何剂型，包括乳液、溶液、悬浮液、乳膏、凝胶、水凝胶、软膏、散粉、敷料、酏剂、洗剂(lotions)、悬浮液、酊剂(tinctures)、糊剂、泡沫、薄膜、气凝胶、冲洗液(irrigations)、喷雾剂、栓剂、绷带和皮肤贴片。本公开提供的化妆品或医药组合物的局部制剂还可包含脂质体、胶束、微球、纳米系统及其中各者的任何混合物。
适用于本公开提供的局部制剂的化妆品或药学上可接受的赋形剂和赋形剂包括但不限于水性赋形剂、水混溶性赋形剂、非水性赋形剂、抗微生物剂、防腐剂、稳定剂、溶解性增强剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂、分散剂、润湿剂、乳化剂、络合剂、螯合剂(sequestering agents)、螯合剂(chelating agents)、渗透促进剂、冷冻保护剂、冻干保护剂、增稠剂和惰性气体。
化妆品或医药组合物也可以通过电穿孔、离子电渗、声波导入、超音波导入、微针或无针注射局部给药，例如PowderTect(Chiron Corp.,Emeryville,CA)和Bioject(Bioject Medical Technologies Inc.,Tualatin,OR)。
本公开提供的化妆品或医药组合物可以软膏、乳膏和凝胶的形式提供。合适的软膏赋形剂包括含油或烃赋形剂，包括豚脂(lard)、苯甲酸化豚脂、橄榄油、棉籽油和其他油、白凡士林；可乳化或吸收的赋形剂，如亲水性凡士林、羟基硬脂硫酸酯和无水羊毛脂；可水去除的赋形剂，例如亲水性软膏；水溶性软膏赋形剂，包括不同分子量的聚乙二醇；乳剂赋形剂，油中水(W/O)乳剂或水中油(O/W)乳剂，包括鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂和硬脂酸(参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy)。这些赋形剂为润肤剂，但通常需要添加抗氧化剂和防腐剂。
合适的乳霜基质可为水中油或油中水。合适的乳膏赋形剂可为可水洗的，并且含有油相、乳化剂和水相。油相也称为“内”相，其通常由凡士林和脂肪醇如鲸蜡醇或硬脂醇组成。尽管非必须，水相通常在体积上超过油相，并且通常含有湿润剂。乳膏制剂中的乳化剂可为非离子、阴离子、阳离子或两性表面活性剂。
凝胶为半固体悬浮型系统。单相凝胶含有在整个液体赋形剂中基本均匀分布的有机大分子。合适的胶凝剂包括但不限于交联的丙烯酸聚合物，例如卡波姆(carbomer)、羧基聚亚烷基和Carbopol；亲水性聚合物，例如聚环氧乙烷、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；纤维素聚合物，例如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素和甲基纤维素；树胶，如黄蓍胶和黄原胶；海藻酸钠；和明胶。为了制备均匀的凝胶，可以加入分散剂如醇或甘油，或者可以通过研磨、机械混合及/或搅拌来分散胶凝剂。
实施例
在以下实施例中进一步描述了本公开的例示性实施例，其不应限制本公开的范围。
一般而言，本公开中使用的命名法和本公开中使用的实验室程序包括分子、生化和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽的解释。例如，参见“Molecular Cloning:Alaboratory Manual,”Sambrook et al.,(1989)；“Current Protocols in MolecularBiology,”Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；“APractical Guide to MolecularCloning,”John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,“Recombinant DNA,”Scientific American Books,New York；Birren etal.(eds)“Cell Biology:ALaboratory Handbook,”Volumes I-IIICellis,J.E.,ed.(1994)；“Culture of AnimalCells—A Manual of Basic Technique”by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),ThirdEdition；“Transcription and Translation,”Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1984)；“Animal Cell Culture,”Freshney,R.I.,ed.(1986)；“Immobilized Cells andEnzymes,”IRL Press,(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning,”Perbal,B.,(1984)and“Methods in Enzymology,”Vol.1-317,Academic Press；“PCR Protocols:AGuide To Methods and Applications,”Academic Press,San Diego,Calif.(1990)；Marshak et al.,“Strategies for Protein Purification and Characterization—ALaboratory Course Manual,”CSHL Press(1996)；所有这些都以引用方式如同于本文中完整阐述并入本文中。本公开提供其他一般参考，其中的程序被认为为本领域公知的并且是为了读者的方便而提供的，包含的所有信息均通过引用并入本公开。
材料和方法
实验小鼠
Tyr-CreER/FusionRed小鼠设计用于通过来自由黑色素细胞特异性酪胺酸酶启动子驱动的Cre重组的FusionRed荧光追踪黑色素细胞干细胞。使用CRISPR-Cas9系统生成C57BL/6J-Mc1r549del小鼠，其具有突变的Mc1r基因，在第549位缺失一个单核苷酸导致12个胺基酸框外突变。然后，将黄色毛色Mc1r549del小鼠与K14-CreER-CK1αf/f小鼠杂交，生成K14-CreER-CK1αf/f；Mc1r549del小鼠。突变小鼠和野生型C57BL/6J小鼠在台湾台南实验动物中心产生。实验和动物护理在台湾花莲慈济大学实验动物中心进行。
CKI及其局部使用制备
本公开中使用的靶向CK1α(CKI)的小分子抑制剂为由Yinon Ben-Nerian博士开发和赠送的。CKI的详细资料已发表(Minzel W.,Venkatachalam A.,Fink A.等人发表的“Small Molecules Co-targeting CK1αand the Transcriptional Kinases CDK7/9Control AML in Preclinical Models.”Cell.2018；175(1):171-185)。
对于本公开中小鼠皮肤的局部施用，将1mg的CKI溶解在6μL二甲基亚砜(DMSO)中并与54μL含有60％白蜡和40％石蜡油的赋形剂混合。
对于人皮肤外植体的局部使用，在6μL DMSO中含有1毫克的CKI溶液以594μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释以供进一步使用。最终工作浓度为0.01mg/6μL。
此外，本公开还测试了具有已知酪蛋白激酶1抑制活性的其他化合物，包括D4476和IC261。D4476最早由Rena G.等人在期刊文章报导“D4476,a cell-permeant inhibitorof CK1,suppresses the site-specific phosphorylation and nuclear exclusion ofFOXO1a.”EMBO Rep.2004Jan；5(1):60-5，而IC261由Mashhoon N.等人在期刊文章中发表的“Crystal structure of a conformation-selective casein kinase-1inhibitor.”J.Biol.Chem.2000Jun 30；275(26):20052-60，两种分子都可市售取得。
人体皮肤外植体
人包皮用于体外外植体培养实验。IRB经花莲慈济医院研究伦理委员会批准(IRB107-51-A)。去除脂肪后，将标本转移到预先涂有0.1％明胶的平板上。包皮外植体以加有20％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)在37℃下培养，在加湿培养箱中添加5％CO2。24小时后，将0.01mg CKI滴在培养的皮肤上，间隔1天2次，共施用0.02mg的CKI。CKI给药后5天，组织以4％多聚甲醛(PFA)固定，然后以石蜡包埋进行组织学检查。此外，表皮和真皮被嗜热菌蛋白酶隔开。采用T-PER组织蛋白提取试剂(78510，ThermoFisher)提取表皮总蛋白进行西方墨点法分析。
Fontana-Masson与苏木精和伊红染色
皮肤活检以4％甲醛水溶液或多聚甲醛固定并包埋在石蜡中。切片以切片机修整至5μm厚。
根据制造商的说明，使用ScyTek Laboratories,Inc.的试剂盒进行Fontana-Masson与苏木精和伊红染色。
对于Fontana-Masson染色，简单地说，将含氨银溶液在58至60℃的水浴中预热。将切片脱蜡并以蒸馏水水合，在温热的氨银溶液中培育30分钟直到黄色出现。接着，将载玻片在氯化金溶液(0.2％)中培育30秒，然后在此步骤中可以清楚地观察到黑色素染色为黑色。最后，载玻片以核固红溶液处理5分钟，然后以无水酒精脱水。
免疫组织化学
使用抗原修复溶液(柠檬酸盐，pH 6.0，Dako S236984)在95℃下进行30分钟的免疫组织化学验证，使用ddH2O中的3％过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性。一级抗体于4℃过夜，二级抗体于室温培育30分钟。信号由AEC+基质-色原(K346111，Dako)或Dako REALEnVDetectSys Perox/DAB+，Rb/M(K500711，Dako)检测，以苏木精对比染色(counterstain)，并以水性或有机介质固定。
对于荧光染色，经二级抗体培育后，以4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(ChemCruzBiochemicals)擦拭几滴水性封固剂，接着盖上盖玻片，于4℃保存用于分析。使用荧光显微镜(Nikon Eclipse Ti2)获得成像。
西方墨点法
对于涉及组织的实验，将组织匀浆并在含有蛋白酶抑制剂(Millipore)的1x组织蛋白提取试剂(Thermo Fisher)中裂解并保存在冰上；对于涉及细胞的实验，收集细胞沉淀并在含有蛋白酶抑制剂(Millipore)的1x放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解缓冲液中裂解并保存在冰上。按照制造商的说明使用酶标仪并以蛋白质测定染料试剂浓缩物(Bio-Rad)确定总蛋白质浓度。样品在SDS-PAGE样品缓冲液(Bio-Rad)中稀释并在95℃下加热5分钟。接着，将蛋白质样品在SDS-PAGE凝胶(TGX FastCast丙烯酰胺溶液，Bio-Rad)上解析并转移到聚(偏二氟乙烯)(PVDF)膜(Millipore)上。使用5％BSA，并将膜与一级抗体在4℃下培育过夜。然后以含有Tween 20(TBST)的Tris缓冲盐水洗涤膜，并在室温下以二级抗体培育1小时。使用Thermo Fisher Scientific的iBright FL1000成像系统检测信号。
抗体
本公开的免疫组织化学(IHC)和西方墨点法(WB)中使用的抗体列于下表1中，其中提供了制造商、目录号和所使用的稀释比。
UVB照射
在UVB照射之前，将小鼠的毛剃光和修剪。750mJ/cm2至1,000mJ/cm2的UVB照射通过微处理器控制UV照射系统-321nm(Witec AG的BLX-312)进行。照射后24小时，采集小鼠皮肤并进行分析。
真黑色素和伪黑色素分析
获得完成CKI治疗的小鼠的尾部皮肤用于表皮层分离。测量皮肤样品并以不含Ca2 +、Mg2+的PBS(pH 7.4)冲洗以去除血液污染物，接着以0.25％胰蛋白酶(Difco；BectonDickinson Microbiology Systems)在PBS(pH 7.2)中于28℃处理16至18小时。将表皮和真皮分离并储存在-80℃直至使用。
为了测定黑色素含量，将组织以剪刀切碎并于28℃下在10倍体积的PBS中匀浆。
对表皮和真皮样品进行处理，通过检测特定降解产物吡咯-2,3,5-三羧酸(PTCA)对真黑色素进行化学分析，并通过检测特定降解产物4-胺基-3-羟基苯丙胺酸(4-AHP)。1奈克PTCA或4-AHP对应于50ng真黑色素或9ng褐黑色素。真黑色素和褐黑色素含量差异的统计显著性通过Student’s t检验通过相等大小的组的比较来确定。
细胞培养
从人包皮培养人角质细胞和黑色素细胞。角质细胞以角质细胞无血清培养基(SFM)或K-SFM进行培养，K-SFM为一种完全无血清培养基，并在使用的时候辅以人重组表皮生长因子(rEGF)和牛垂体提取物(BPE)(Gibco,17005042)。以含有人类黑色素细胞生长补充剂(HMGS)(Gibco,M254500)的培养基254培养黑色素细胞。将培养物维持在37℃和5％CO2中。角质细胞试剂盒配体分泌通过人SCF ELISA试剂盒(Abcam，ab176109)检测。所有程序均遵循制造商的说明。
黑色素细胞迁移试验
采用伤口愈合试验来检测细胞迁移。具体而言，将黑色素细胞以每孔103个细胞的密度接种在培养插入物中。使细胞贴壁过夜后，取出培养插入物，并以PBS洗涤细胞并去除未贴壁的细胞。加入不含或含CKI的新鲜培养基，并培育24小时。通过光学显微镜(Olympus,CKX53)在每个孔的三个视野中手动计数迁移到伤口空间的细胞数量。接着，使用Image J分析来量化区域。
统计分析
本公开中的统计分析将分析结果呈现为平均值±标准偏差。Student t检验用于组间比较。小于0.05的P值被认为具有统计学意义。
实施例1：局部施用CKI对野生型小鼠的紫外线防护效果
以C57BL/6小鼠作为测试局部CKI安全剂量的实验模型。CKI在C57BL/6小鼠的耳朵上以每次施用0.1毫克的量以每隔一天(Q.O.D.)的频率局部施用4周。因此，CKI每周局部施用3次，每周共施用0.3mg的CKI，4周共施用1.2mg的CKI。
每周记录小鼠的表现型。如图1A所示，在12次局部CKI施用后，在第6周结束时采集耳朵样品用于组织分析，总共1.2mg的CKI。
如图1B和图1D所示，表现型照片显示，与对照组相比，CKI局部治疗后小鼠耳朵的皮肤颜色明显变深；治疗的CKI总剂量为1.2毫克(图1B)或5毫克(图1D)。同样在图1B和图1D中，Fontana-Masson染色表明表皮中黑色素的量在1.2mg的CKI处理后已经显著增加，并且在5mg的CKI处理后更加强烈。此外，c-Kit染色显示表皮角质细胞和黑色素细胞中的受体KIT也显著增加。这些结果表明，局部CKI以与紫外线晒黑相同的方式增加皮肤色素沉着和表皮厚度。
在小鼠皮肤中，黑色素细胞主要存在于真皮中。真黑色素和褐黑色素分析表明，局部使用1.2mg的CKI后，皮肤中真黑色素含量显著增加，且增加的真黑色素主要位于表皮而非真皮，真黑色素与褐黑色素比值显著升高，如图1C所示。因此，局部施用CKI可能会诱导旁分泌因子，导致黑色素细胞从真皮迁移到表皮。在以总共5mg CKI治疗的小鼠中也观察到真黑色素与褐黑色素的比率显著增加，如图1E所示。
为了研究黑色素细胞干细胞的行为，产生报告小鼠Tyr::CreERT2；G/mR。报告小鼠中的他莫昔芬(tamoxifen)诱导可导致黑色素细胞在其膜上特异性表现红色荧光(FusionRed)，以及组织中表现绿色荧光(GFP)的其他细胞。因此，报告小鼠被用来追踪黑色素细胞的迁移。如图1F所示，发现局部CKI治疗前，黑色素细胞主要局限在真皮层，很少在表皮层(如左图)；然而，在总共1.2mg CKI的局部治疗后，表皮中的黑色素细胞数量显著增加(如右图所示)，表明局部CKI诱导黑色素细胞从真皮迁移到表皮。此外，皮肤组织的西方墨点法分析显示Kit配体(Kit-Ligand，KitL)，一种已知的黑色素细胞迁移和存活因子，在局部CKI治疗后增加，如图1G所示。此外，从图1G可见，主要的黑色素细胞调节转录因子MITF和酪胺酸酶(限速黑色素生成酶)均显著上调。这些结果证实局部CKI诱导Kit配体产生，从而促进黑色素细胞迁移到表皮并刺激黑色素生成。
此外，通过测量UVB暴露后皮肤中环丁烯嘧啶二聚体(CPD)的量来检查局部CKI治疗的光保护作用。在750mJ/cm2的UVB照射后24小时采集小鼠皮肤，对总共0.6mg CKI的CKI处理组皮肤的免疫组织化学分析显示，与对照组相比，代表紫外线照射损伤的CPD+细胞更少未经CKI处理，如图1H所示。这表明外用CKI对皮肤具有紫外线防护功能。
实施例2：Mc1r549del小鼠的CK1α抑制和局部CKI施用诱导黑色素生成并保护Mc1r549del小鼠免受UVB诱导的DNA损伤
黑皮质素受体(MCR)属于G蛋白偶联受体家族，根据其功能和组织表现分为5个成员，包括MC1R、MC2R、MC3R、MC4R和MC5R。在紫外线防护的作用中，MC1R被称为黑皮质素的肽激素活化，该激素源自阿片黑皮质素原(POMC)。α-MSH为角质细胞分泌的一种黑色素皮质素，负责人体皮肤色素沉着。因此，POMC/α-MSH/MC1R路径参与真黑色素的产生。如上所示，CK1α抑制与CKI的局部施用活化了KitL/Kit路径，并进一步研究了CK1α抑制对携带MC1R突变的小鼠的影响。
已经报导具有突变的MC1R基因的Mc1r549del小鼠，在第549位缺失单个核苷酸，导致12个胺基酸框外突变(Mountjoy，Robbins等人，1992)。为了表明KitL/Kit信息传递路径为CKI在黑色素生成中的一个替代靶点，产生了C57BL/6J-Mc1r549del小鼠，其通过CRISPR/Cas9系统在MC1R基因的第549位删除了一个核苷酸。缺失造成移码突变并导致MC1R蛋白功能丧失，进而导至小鼠毛色变黄，这是由于黑色素的专有合成和黑色素细胞无法合成真黑色素，如图2A所示。
如图2B所示，C57BL/6J-Mc1rem1小鼠与K14-CreER-CK1αf/f小鼠杂交以产生K14-CreER-CK1αf/f；MC1RKI/KI小鼠并获得诱导型Mc1r549del小鼠。图2C显示用于在诱导型K14-CreER-CK1αf/f；Mc1r549del小鼠的角质细胞中剔除CK1α的方案。具体而言，在箭头所示的天数内，通过腹腔注射100mg/kg他莫昔芬共6次诱导7周龄小鼠角质细胞中的CK1α剔除。在第14、28和42天收集皮肤样品用于分析。图2D显示角质细胞中CK1α剔除的Mc1r549del小鼠的皮肤表现型，发现与角质细胞中没有CK1α剔除的Mc1r549del小鼠相比，第28天尾巴上的色素沉着增加。此外，Fontana-Masson染色显示表皮厚度增加，以及表皮、真皮或全层皮肤中真黑色素色素沉着增加，对整质细胞中CK1α剔除后第14、28和42天的时间过程进行分析，如图2E所示，并对全层皮肤、表皮和真皮中Fontana-Masson染色的细胞数量进行定量，并显示在图2F的直方图中。如图2G所示，在CK1α剔除后第5天、第14天和第28天，真黑色素分析显示Mc1r549del小鼠皮肤中真黑色素增加。如图2H所示，TRP1染色(红色)的共轭焦荧光图像表明，IP TAM诱导的CK1α剔除第28天黑素细胞数量显著增加。图2I显示尾部皮肤的定量实时PCR呈现CK1α浓度降低，但p53、Kit-L、c-Kit和黑色素基因Tyr浓度升高，表明CK1α剔除通过活化p53/KitL/c-Kit路径，在Tg(K14-CreER)-CK1αfl/fl；Mc1r549del小鼠中增加真黑色素生成。
为了在Mc1549del小鼠进一步研究局部CK1α剔除对皮肤真黑色素生成和保护免受此紫外线照射的影响，按照图2J所示的实验设计，其中局部4-OHT诱导Tg(K14-CreER)-CK1αfl/fl；Mc1r549del小鼠中的CK1α剔除。在第42天，进行0.75J/cm2的UVB照射，并在24小时后采集皮肤样本。此外，在第42天，尾部皮肤的表现型显示出可见的色素沉着，如图2K所示。此外，HE染色显示表皮厚度增加，而Fontana Masson染色显示整个皮肤，尤其表皮中的真黑色素显著增加。另一方面，在图2K显示，0.75 20J/cm2 UVB照射(模拟急性晒伤)24h后，尾部肿胀显示CK1α剔除后肿胀减轻；与Mc1r549del小鼠相比，CPD染色显示CK1α剔除的Mc1r549del小鼠的CPD浓度显著降低。此外，如图2L所示，与Mc1r549del小鼠相比，在CK1α剔除的Mc1r549del小鼠中，在紫外线暴露后，尾部皮肤的定量实时PCR显示促发炎细胞激素IL-6和IL-1β减少。如图2M所示，在第42天，尾部皮肤表现型显示可见色素沉着。HE染色显示表皮厚度增加；FontanaMasson染色显示在全层皮肤中，尤其表皮中的真黑色素显著增加。
为了研究局部CKI施用对黑色素产生和保护免受UVB诱导的DNA损伤的影响，C57BL/6J-Mc1r549del小鼠按照图2N所示的方案接受局部CKI治疗，该方案与用于实施例1中的野生型小鼠方案相同。如图2O所示，Fontana-Masson染色表明在C57BL/6J-Mc1r549del小鼠上总共1.2mg的CKI处理后，表皮厚度增加，且表皮中黑色素增加。此外，皮肤组织的西方墨点法分析表明，CKI治疗组中Kit配体(KitL)、c-Kit、MITF、酪胺酸酶和p53的蛋白质浓度升高，如图2P所示。在局部施用总共2.6mg的CKI治疗的C57BL/6J-Mc1r549del小鼠中也发现了EM/PM的比率增加，如图2Q所示。此外，在对使用总共0.6mg局部CKI处理的MC1R突变小鼠施加750mJ/cm2的UVB照射后，局部CKI还减少了Mc1r549del小鼠的CPD形成，如图2R所示。更多的CPD染色结果显示在图2S中，发现局部CKI降低了Mc1r549del和野生型小鼠的表皮、皮脂腺和毛囊上皮细胞上UVB诱导的CPD。结果表明，局部CKI以与正常野生型小鼠相同的方式活化Mc1r549del小鼠的p53/Kit配体/c-kit路径，局部CKI处理增强黑色素生成，并保护皮肤免受紫外线照射伤害。
实施例3：局部施用CKI增加黑色素生成并防止人类皮肤外植体中UVB暴露造成的DNA损伤
与小鼠耳部皮肤不同，人的皮肤表皮较厚，黑色素细胞主要存在于表皮中。为了研究局部CKI对人体皮肤的影响，使用包皮建立体外人体皮肤外植体培养模型。依照图3A所示的治疗方案，将总共0.02毫克的CKI局部施用于人体皮肤，与实施例1和2中用于小鼠的剂量相比，该剂量低得多，CKI处理的人类皮肤外植体变得明显与仅用溶剂处理的对照组相比颜色更深。图3B显示在使用总共0.02mg的局部CKI治疗后，EM/PM的比率增加。在图3C所示的免疫组织化学分析中，发现黑色素细胞标记物Melan-A和Trp-1在染色中增加。这些结果表明局部CKI治疗后表皮中黑色素细胞数量增加。此外，Fontana-Masson染色还显示表皮中的黑色素量显著增加。图3D展示人外植体组织的西方墨点法分析结果，发现CK1α下游蛋白包括p53和β-catenin以及色素沉着相关蛋白如Kit配体、c-kit受体、MITF和酪胺酸酶在局部CKI治疗后均升高。此外，将局部CKI治疗后的人体皮肤外植体暴露于1J/cm2的UVB辐射，并在6小时后收集以用于CPD分析。CPD分析结果显示CKI治疗组与仅施用溶剂的对照组相比，CPD浓度降低，如图3E所示，表明局部CKI治疗保护人类皮肤免受紫外线诱导的DNA损伤。
实施例4：CKI对人角质细胞和黑色素细胞的处理增加KitL的产生和黑色素细胞的增殖、成熟和迁移
在皮肤中，角质细胞通过旁分泌生长因子和细胞-细胞黏附连接系统与黑色素细胞相互作用，以实现稳定的皮肤稳态平衡。在该实施方案中，角质细胞和黑色素细胞的初代培养物由人包皮制备。初代人角质细胞以指定浓度的CKI处理3天，采集该条件培养基并用于处理黑色素细胞3天。
分别在角质细胞中以10、20和50nM的CKI处理3天后，西方墨点法分析显示p53、β-catenin、KitL和c-Kit的表现均呈剂量依赖性增加，如图4B所示。此外，收集角质细胞培养物的培养基随后用于KitL的ELISA分析。发现在50和75nM的CKI处理后，角质细胞培养基中的KitL浓度均增加，如图4C所示。
再者，以来自培养的角质细胞的条件培养基处理人黑色素细胞，并检验黑色素细胞的细胞行为。HMB45为黑色素转运蛋白黑色素体的标志物，且该HMB45抗体染色表明，CKI处理的条件培养基增强黑色素体强度、黑色素细胞数量和黑色素细胞树突长度，如图4D所示。西方墨点法分析显示黑色素细胞中酪胺酸酶和MITF表现以剂量依赖性方式增加，如图4E所示，表明角质细胞衍生的KitL的旁分泌作用。
另检视CKI对黑色素细胞的影响。将不同浓度的CKI添加到初代黑色素细胞培养物中。如图4F所示，在CKI存在下，参与黑色素细胞成熟的因子如MITF、酪胺酸酶和磷酸化MKK6均以剂量依赖性方式增加。此外，亦通过迁移试验研究黑色素细胞的迁移能力，如图4G所示，CKI处理显著增加黑色素细胞的迁移。这些结果表明，CKI处理不仅通过角质细胞衍生的KitL影响黑色素细胞的行为，而且直接影响黑色素细胞的功能。
实施例5：其他酪蛋白激酶1抑制剂的紫外线防护效果
除了在之前的实施方案中使用的CKI之外，亦检验其他如D4476和IC261之已知酪蛋白激酶1抑制剂对小鼠皮肤、人皮肤外植体和人角质细胞的紫外线防护作用。
如图5A所示，D4476和IC261以0.04毫克/次和0.12毫克/周的剂量局部施用于C57BL/6J-Mc1r549del小鼠，持续2周，总共施用0.24毫克，并在第3周采集耳部皮肤以用于组织分析。
图5B显示在0.24mg处理D4476和IC261后KitL、c-Kit和酪胺酸酶的表现增加，类似于实施例2中所示的结果。
D4476在人皮肤外植体上的局部施用也显示出与实施例3中的CKI相似的紫外线防护效果。如图6A中的处理方案所示，人包皮在12孔板中培养24小时，然后以0.04或0.05mg的CKI，分2次，共施用0.08或0.1mg的CKI。在第5天，接受上述CKI处理的样品暴露于1,000mJ/cm2的UVB辐射。在紫外线照射后6小时收集样品用于后续分析。
样品的Fontana-Masson染色的组织学显示，在使用总共0.1毫克D4476处理的表皮中黑色素强度增加，如图6B所示。如图6C中所示的西方墨点法分析和如图6D中所示的定量相对表现浓度显示p53和β-catenin的稳定，类似于图3中先前的CKI中所示者，且在含有0.1mg D4476处理的样品中与对照相比增加了KitL、c-Kit和酪胺酸酶。此外，图6E中的CPD染色结果显示，在使用0.08毫克D4476处理的样品中CPD降低，表明在人体皮肤上局部使用0.08毫克的D4476可以预防和保护免受紫外线诱导的DNA损伤。
其他酪蛋白激酶1抑制剂用于检视其对人类角质细胞培养物产生KitL的影响。如图7A所示，除了A51，使用包括不同浓度的CKI7、D4476和IC261之三种另外的酪蛋白激酶1抑制剂处理人角质细胞并测试KitL的表现浓度。A51为由Yinon Ben-Neriah博士赠送的CKI，D4474(Sigma-Aldrich D1944)和IC261(Sigma-Aldrich 400090)可商购并且溶解在DMSO中。CKI7为另一种可商购的CKI(Sigma-Aldrich C0742)并溶解在ddH2O中。所有测试的酪蛋白激酶1抑制剂均表明CKI处理稳定β-catenin的表现。与DMSO或模拟物相比，处理72小时后，KitL在CKI、CKI7、D4476和IC261中的表现增加。模拟物为实验中的对照，其于角质细胞既没有使用DMSO，也没有以任何CKI处理。在图7B中，进一步显示，D4476以500nM至5,000nM的浓度对人角质细胞进行处理，在72小时后增加了处理的角质细胞中p53和KitL的表现，且剂量依赖性地增加。在图7C中，还显示IC261以500nM至5,000nM的浓度对人角质细胞的在72小时的处理后，于处理的角质细胞中以剂量依赖性方式增加p53和KitL的表现。这些数据表明，除了实施例1至4中使用的CKI外，其他酪蛋白激酶1抑制剂在诱导Kit路径和随后的黑色素生成方面也具有相似的能力。
已经结合本公开的实施例描述了本公开，应当理解，在不脱离本公开范围的情况下，可根据本公开的实施例进行各种修改。因此，所描述的实施例旨在涵盖在本公开范围内的修改，而不对本公开的限制。因此，应广泛地解释本公开的申请专利范围，以涵盖所有此类修改。

Claims (21)

1.一种在有需要的个体中预防、改善或治疗皮肤病症、疾病或状况的方法，包括向该个体施用有效量的酪蛋白激酶1抑制剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中，该皮肤病症、疾病或状况由UV过度暴露或自体免疫疾病所引起。
3.如权利要求2所述的方法，其中，该皮肤病症、疾病或状况为日光性红斑、日光性过敏、日光性荨麻疹、日光性弹性增生、光老化、晒伤、急性晒伤、皮肤癌、白斑、特应性皮炎、荨麻疹、牛皮癣或其中各者的任何组合。
4.如权利要求1所述的方法，其中，该皮肤病症、疾病或状况为受伤后色素减退、光化性角化病、非典型痣、基底细胞癌、黑色素瘤、Merkel细胞癌、鳞状细胞癌、皮肤恶性黑色素瘤或其中各者的任何组合。
5.如权利要求1所述的方法，其中，该皮肤病症、疾病或状况为由涉及前脑啡黑细胞促素皮促素(POMC)、α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)、黑皮质素1受体(MC1R)及小眼畸形相关转录因子(MITF)中的至少一种的信息传递路径缺陷引起的。
6.如权利要求1所述的方法，其中，该酪蛋白激酶1抑制剂局部施用于该个体。
7.一种用于提高有需要的个体中真黑色素浓度的方法，包括向该个体施用有效量的酪蛋白激酶1抑制剂，以使该真黑色素浓度选择性地增加超过该个体的皮肤中的伪黑色素浓度。
8.如权利要求7所述的方法，其中，提高该真黑色素浓度增加该个体的皮肤色素沉着。
9.如权利要求8所述的方法，其中，该皮肤色素沉着保护该个体免受紫外线伤害。
10.如权利要求7所述的方法，其中，该个体的表皮中的该真黑色素浓度增加。
11.如权利要求7所述的方法，其中，增加该真黑色素浓度包括增加该个体的表皮中的KitL浓度。
12.如权利要求11所述的方法，其中，增加该表皮中的KitL浓度诱导黑色素细胞从该个体的真皮向该表皮移动。
13.如权利要求7所述的方法，其中，该酪蛋白激酶1抑制剂局部施用于该个体。
14.如权利要求7所述的方法，其中，该个体为人类。
15.一种抑制皮肤细胞中酪蛋白激酶1活性的方法，包括使该皮肤细胞接触有效量的酪蛋白激酶1抑制剂。
16.如权利要求15所述的方法，其中，使该皮肤细胞接触有效量的该酪蛋白激酶1抑制剂以增加该皮肤细胞中的真黑色素浓度。
17.如权利要求15所述的方法，其中，使该皮肤与有效量的酪蛋白激酶1抑制剂接触以增加皮肤中的黑色素细胞数量。
18.如权利要求15所述的方法，其中，使该皮肤与有效量的酪蛋白激酶1抑制剂接触以调节皮肤颜色或使皮肤晒黑。
19.如权利要求15所述的方法，其中，该皮肤细胞为表皮细胞。
20.如权利要求15所述的方法，其中，该酪蛋白激酶1抑制剂为酪蛋白激酶1α抑制剂。
21.如权利要求15所述的方法，其中，该酪蛋白激酶1抑制剂选自由CKI7、D4476、IC261及由式I至VII显示的化合物所组成的群组中的至少一者：
其中：
R1和R2各自独立地选自由H、各自任选地经卤化物、羟基、酯、醚、C5-C15芳基、C3-C7杂芳基和酰胺中的至少一种取代的直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C1-C5烷氧基、直链或支链C1-C5酰基、C5-C15芳基和C3-C7杂芳基所组成的群组；或R1和R2与其等连接的氮原子连接形成任选地包括N、O、NH、C＝N、C＝O和SO2中的至少一种，且任选地经直链或支链C1-C5烷基、C5-C15芳基、C3-C7杂芳基、羟基、卤化物和氰基中的至少一种所取代的4至7元饱和、不饱和或芳香的环；
R3和R4各自独立地选自由H、任选地经卤化物、羟基、烷氧基、C5-C15芳基、C3-C7杂芳基、酯及酰胺中的至少一种取代的直链或支链C1-C8烷基所组成的群组；或者
R1或R2与R3及其等各自连接的碳和氮原子一并形成4至7元饱和、不饱和或芳香的环，其任选地包括N、NH、O、C＝N、C＝O和SO2中的至少一种，且任选地经直链或支链C1-C5烷基、C5-C15芳基、C3-C7杂芳基、羟基、羰基和卤化物中的至少一种所取代；
R5和R8各自独立地选自由H、卤化物、直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C2-C8烯基及任选地经至少一种卤化物取代的直链或支链C2-C8炔基所组成的群组；
R6选自由直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C2-C8烯基、直链或支链C2-C8炔基、C5-C10环烷基及任选地经以下直链或支链C1-C8烷基、C3-C7环烷基、4至6元杂环、C5-C15芳基、C3-C7杂芳基、卤化物、羟基和C1-C5烷基卤化物中的至少一种取代的饱和或不饱和4至6元杂环所组成的群组；
R7选自由直链或支链C1-C8烷基、直链或支链C2-C8烯基及任选地经C3-C7环烷基、4至6元杂环、C5-C15芳基、C3-C7杂芳基、卤化物、羟基和C1-C5烷基卤化物中的至少一者取代的直链或支链C2-C8炔基所组成的群组；
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