ITRM20100310A1 - Modified snrnas for use in therapy - Google Patents

Description

snRNA MODIFICATI DA UTILIZZARE IN TERAPIA

Campo dell’invenzione

L'invenzione riguarda un acido nucleico che codifica un snRNA modificato e l'snRNA codificato dall'acido nucleico. L'invenzione riguarda anche un vettore che incorpora l'acido nucleico e le cellule che contengono l'acido nucleico, l'snRNA modificato e il vettore. L'invenzione riguarda inoltre un metodo per la preparazione di un vettore parvovirale di somministrazione genica e l'utilizzo dell'acido nucleico, dell'snRNA modificato e del vettore nei metodi della terapia.

Premessa all’invenzione

La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) à ̈ una delle malattie neuromuscolari più gravi che colpisce 1:3500 maschi. La DMD à ̈ un disordine monogenico causato da mutazioni nel gene più grande degli eucarioti superiori, il gene che codifica per la proteina distrofina. Circa il 98% del gene DMD di 2,4 Mb viene attribuito a sequenze introni che, mentre le restanti costituiscono 79 esoni e sette promotori differenti che dirigono l'espressione delle isoforme specifiche per i tessuti. Ulteriori isoforme vengono originate anche dallo splicing alternativo o dalla poliadenilazione.

Nei tessuti muscolari scheletrici, la distrofina si localizza sulla superficie interna del sarcolemma, la membrana plasmatica della fibra muscolare, dove interagisce con l'actina del citoscheletro tramite il proprio dominio N-terminale, e con un complesso di proteine localizzate sul sarcolemma, chiamato complesso proteico associato alla distrofina, per mezzo del proprio C-terminale. Queste interazioni permettono la trasduzione della forza muscolare e sono essenziali per l'integrità della fibra. Recentemente à ̈ emerso che molti altri aspetti cruciali della fisiologia della fibra muscolare, quali l'omeostasi del calcio e il controllo epigenetico dell'espressione genica, sono dipendenti dalla distrofina, e ciò spiega le drammatiche conseguenze osservate sul tessuto muscolare dei pazienti Duchenne dove à ̈ assente la distrofina.

A causa dell'alterazione genetica ben definita, molti studi sono stati incentrati sulla ricerca dei possibili approcci terapeutici per il trattamento della DMD. Salvo alcune eccezioni, tutte le mutazioni DMD (delezioni e duplicazioni) portano agli spostamenti di fase dando luogo alla formazione di un codone di terminazione prematuro che danneggia la traduzione della distrofina. Al contrario, quando le mutazioni non perturbano la fase di lettura corretta, come nel caso della distrofia muscolare di Becker (BMD), si verifica la traduzione della proteina che tuttavia à ̈ parzialmente funzionante. In particolare, i pazienti BMD che recano delezioni di circa la metà del gene DMD mostrano sintomi molto lievi. Queste osservazioni suggeriscono una nuova strategia terapeutica basata sulla possibilità di manipolare lo splicing dell'mRNA precursore della distrofina al fine d'indurre l'esclusione di specifici esoni (exon skipping) e ristabilire una fase di lettura corretta. Questo si può ottenere con molecole antisenso che, appaiandosi alle giunzioni di splicing o agli enhancer esonici per lo splicing (ESE, exonic splicing enhancer), impediscono il riconoscimento degli esoni da parte del meccanismo di splicing.

Diversi gruppi hanno sviluppato degli oligonucleotidi antisenso (AON, antisense oligonucleotide) modificati chimicamente diretti contro le giunzioni di splicing o gli ESE, e hanno scoperto che questa strategia potrebbe ristabilire efficacemente la distrofina sia in vitro che in vivo. La sicurezza e l'efficacia locale delle iniezioni intramuscolari degli AON sono state testate in sperimentazioni cliniche di fase I e in sperimentazioni sistemiche avviate di recente.

I piccoli RNA nucleari (snRNA, small nuclear RNA) sono stati anche utilizzati in qualità di vettori per l'espressione stabile degli antisenso allo scopo di aggirare la limitazione maggiore dell'approccio con gli AON che à ̈, data la stabilità limitata dell'oligo, la richiesta di somministrazioni ripetute. Le molecole antisenso derivate dagli snRNA U1 e U7 hanno mostrato di essere efficaci nell'indurre l'esclusione dell'esone e nel ripristino della distrofina sia nei mioblasti DMD umani che nel topo mdx. Inoltre, l'efficacia a lungo termine e in tutto l'organismo della terapia di esclusione dell'esone à ̈ stata ottenuta mediante l'iniezione sistemica di un vettore virale adeno-associato (AAV) che esprime le molecole antisenso derivate da U1 nei topi mdx.

Sussiste l'esigenza di molecole migliorate di questo tipo.

Breve descrizione dell'invenzione

È stato sviluppato un snRNA modificato che ha la capacità di intercettare le giunzioni di splicing sia in 5' che in 3' e un enhancer esonico per lo splicing di un esone di un gene (ad esempio un esone del gene della distrofina). Questo snRNA modificato media l'esclusione dell'esone in maniera estremamente efficiente. L'snRNA modificato può perciò essere utilizzato per escludere gli esoni, dando luogo alla rimozione degli esoni che recano mutazioni e/o alla riparazione della fase di lettura. In assenza di esclusione à ̈ possibile che venga costituita una proteina non funzionale oppure, più generalmente, che questa sia essere completamente assente. L'snRNA modificato può essere utilizzato per escludere tali esoni in modo che la proteina risultante così formata sia funzionale.

Secondo l'invenzione, viene fornito perciò un acido nucleico che codifica un piccolo RNA nucleare (snRNA), il quale snRNA à ̈ modificato in modo da contenere una sequenza in grado d'ibridarsi con le giunzioni del sito di splicing in 5' e 3' e con una sequenza dell'enhancer esonico per lo splicing di un esone di un pre-mRNA, in modo che la sequenza dell'esone sia esclusa durante il processo di splicing che converte il pre-mRNA a mRNA maturo. Il pre-mRNA può essere quello della distrofina. L'esone intercettato può essere l'esone 51 del gene della distrofina.

Tipicamente, un acido nucleico dell'invenzione à ̈ una singola molecola che contiene la sequenza antisenso in grado di intercettare le giunzioni del sito di splicing in 5' e 3', e una sequenza dell'enhancer esonico per lo splicing. Comunque, à ̈ possibile fornire due o tre acidi nucleici in modo che ciascun acido nucleico fornisca una o due delle sequenze antisenso. Tali acidi nucleici possono poi essere somministrati simultaneamente ad una cellula in modo che possa verificarsi l'esclusione di un esone.

L'invenzione fornisce anche un snRNA modificato codificato da un acido nucleico dell'invenzione e un vettore che incorpora un acido nucleico dell'invenzione. L'invenzione inoltre fornisce una cellula di mammifero o di insetto che contiene un acido nucleico, un snRNA modificato o un vettore dell'invenzione.

In aggiunta l'invenzione fornisce un metodo per la preparazione di un vettore parvovirale di somministrazione genica, il quale metodo comprende le fasi di:

(a) fornire una cellula di insetto che contiene uno o più costrutti di acido nucleico contenenti:

(i) un acido nucleico dell'invenzione che à ̈ fiancheggiato da almeno una sequenza nucleotidica ripetuta terminale invertita parvovirale;

(ii) una prima cassetta di espressione contenente una sequenza nucleotidica che codifica una o più proteine Rep parvovirali e che à ̈ legata operativamente ad un primo promotore in grado di condurre l'espressione della/e proteina/e Rep nella cellula di insetto;

(iii) una seconda cassetta di espressione contenente una sequenza nucleotidica che codifica una o più proteine del capside parvovirale e che à ̈ legata operativamente ad un secondo promotore in grado di condurre l'espressione della/e proteina/e del capside nella cellula di insetto;

(b) coltivare la cellula di insetto definita in (a) in condizioni che conducono all'espressione delle proteine Rep e del capside; e opzionalmente, (c) recuperare il vettore parvovirale di somministrazione genica.

L'invenzione fornisce anche:

- una composizione farmaceutica che contiene un acido nucleico, un snRNA modificato o un vettore dell'invenzione e un veicolante o diluente farmaceuticamente accettabile;

- un acido nucleico, un snRNA modificato o un vettore dell'invenzione da utilizzare a scopo terapeutico nel trattamento dell'organismo umano o animale; e

- un metodo di trattamento di una distrofia muscolare, il quale metodo comprende la fase di somministrazione di una quantità efficace di un acido nucleico, un snRNA modificato o un vettore dell'invenzione ad un soggetto che ne necessita.

Breve descrizione dei disegni

La figura 1 mostra la progettazione e il clonaggio delle molecole di RNA antisenso U1. (a) Rappresentazione schematica dell'snRNA antisenso U1 chimerico. Il riquadro in grigio indica la collocazione delle sequenze antisenso. (b) La tabella riassume i 7 diversi costrutti prodotti insieme alle corrispondenti regioni bersaglio sull'esone 51 e le sequenze introniche fiancheggianti (in maiuscolo – regioni esoniche; in minuscolo – sequenze degli introni).

La figura 2 mostra l'espressione dell'antisenso U1 nelle cellule HeLa. (a) Rappresentazione schematica dei costrutti pRRL/antisenso U1. Le cassette di espressione dell'antisenso U1 sono state clonate nella regione dU3 della LTR a valle della struttura lentivirale pRRLSIN.cPPT.PGK/GFP.WPRE. hPGK: promotore della fosfoglicerato chinasi umana; GFP: cDNA della proteina fluorescente verde. (b) Le cellule HeLa sono state trasfettate con costrutti antisenso differenti insieme al plasmide U16-RBE (che esprime uno snoRNA U16 modificato lungo 143 nucleotidi). L'analisi in northern blot à ̈ stata eseguita con le sonde per: snRNA U1 (pannello U1), RBE di U16 (pannello RBE) e snRNA U2 (pannello U2). Le ultime due ibridazioni sono state utilizzate rispettivamente per normalizzare l'efficienza di trasfezione e come controllo di caricamento. Il filtro à ̈ stato tagliato in modo da escludere l'ibridazione dell'snRNA U1 endogeno. A lato, sono riportate le dimensioni molecolari. (c) Gli estratti nucleari sono stati preparati dal campione 5’3’esx dell'esperimento (a) e immunoprecipitati con gli anticorpi anti-U1-70K. L'RNA, estratto dal pellet dell'immunoprecipitato, à ̈ stato analizzato per la presenza del trascritto 5’3’esx mediante RT-PCR con i primer mostrati nel pannello sulla destra.

La figura 3 mostra l'esclusione dell'esone 51 e il ripristino della distrofina nei mioblasti primari DMD ∆48-50 e la selezione del costrutto più performante con il saggio reporter per lo splicing basato sulla luciferasi. (a) in alto: rappresentazione schematica del cDNA della distrofina ∆48-50 tra gli esoni 46 e 54 insieme con le posizioni degli oligo per la RT-PCR (E46F e E54R - RT), e gli oligo per la PCR nested (E47F e E52Ro – nRT). in basso: RT-PCR nested sull'RNA estratto dalle cellule ∆48-50 infettate con i lentivirus che esprimono l'antisenso. I prodotti esclusi e non esclusi sono indicati sulla destra (mi: infettato mock; -: controllo negativo senza RNA). Le dimensioni molecolari sono indicate sulla sinistra. (b) Western blot rappresentativo delle proteine (50 µg) estratte dalle cellule ∆48-50 infettate, colorato con gli anticorpi anti-distrofina (Dys) e anti-tubulina (Tub) (WT: 2 µg di proteine derivate da cellule muscolari scheletriche di tipo selvatico; mi: 50 µg di proteine derivate da cellule infettate mock). L'istogramma in basso indica i livelli di distrofina normalizzati sui segnali della tubulina. I valori sono stati ottenuti da tre esperimenti indipendenti; barre di errore: medie DS. (c) in alto: rappresentazione schematica del costrutto pLuc-ex51. L'esone 51 e parte dei suoi introni fiancheggianti sono stati clonati tra gli esoni della luciferasi di lucciola. Con questo costrutto, si ottiene l'espressione della luciferasi soltanto in seguito all'esclusione dell'esone 51. in basso: istogramma che mostra le unità di luminescenza relativa (RLU) delle cellule mioblastiche C27 trasfettate con pLuc-ex51 e pTK (plasmide che esprime la luciferasi di Renilla), insieme ai costrutti 5’3’ o 5’3’esx. Come controllo (PGK) viene usato un vettore lentivirale vuoto.

La figura 4 mostra il transdifferenziamento dei fibroblasti DMD ∆45-50 a mioblasti e il ripristino della distrofina in seguito all'esclusione dell'esone 51. (a) Rappresentazione schematica dei costrutti MyoD e M-U1#51. hPGK: promotore della fosfoglicerato chinasi umana; MyoD: cDNA di MyoD; IRES: sito di entrata interna per il ribosoma; GFP: cDNA della proteina fluorescente verde. La cassetta U1 che esprime il costrutto 5’3’esx à ̈ stata clonata nella regione dU3. (b) Analisi in western blot con gli anticorpi anti-distrofina (Dys) e anti-tubulina (Tub) sulle proteine derivate da fibroblasti di tipo selvatico infettati con MyoD (Fb WT) raccolte nei giorni 0, 2, 4, 6 e 8 dopo l'induzione del differenziamento (C: proteine derivate da cellule muscolari scheletriche umane). I fibroblasti ∆45-50 sono stati infettati con MyoD o M-U1#51 e raccolti nei giorni 9 e 13 del differenziamento. I campioni sono stati analizzati con: western blot, per l'espressione di MyoD e GFP (c), northern blot, per l'espressione dell'RNA antisenso (d), RT-PCR nested per l'esclusione dell'esone (e) e western blot per il ripristino della distrofina (f) Il western blot con anticorpi anti-tubulina (Tub) à ̈ stato utilizzato come controllo di caricamento.

La figura 5 mostra: (a) sequenza dell'esone 51 e delle sue regioni fiancheggianti introniche - le sequenze intercettate dal costrutto antisenso 5’3’esx derivato da U1 sono indicate come regione ombreggiata; (b) sequenza 5’3’esx dell'snRNA U1 modificato – la sequenza antisenso à ̈ indicata come regione ombreggiata.

Breve descrizione dell'elenco delle sequenze

SEQ ID NO: 1 espone la sequenza della giunzione di splicing in 5' dell'esone 51 del pre-mRNA della distrofina (vedere anche Fig.1).

SEQ ID NO: 2 espone la sequenza della giunzione di splicing in 3' dell'esone 51 del pre-mRNA della distrofina (vedere anche Fig.1).

SEQ ID NO: 3 espone la sequenza dell'enhancer esonico per lo splicing entro l'esone 51 del gene della distrofina (vedere anche Fig.1).

SEQ ID NO: 4 espone una sequenza complementare alle giunzioni di splicing in 5' e 3' e a un enhancer esonico per lo splicing dell'esone 51 del pre-mRNA della distrofina (vedere anche Fig.5).

SEQ ID NO: 5 espone la sequenza che codifica un snRNA modificato (che contiene la sequenza esposta in SEQ ID NO: 4 - vedere anche Fig.5).

Descrizione dettagliata dell'invenzione

La presente invenzione riguarda le molecole dei piccoli RNA nucleari (snRNA) modificate (chimeriche) che recano le sequenze antisenso indirizzate verso le giunzioni di splicing e verso una sequenza dell'enhancer esonico per lo splicing di un pre-mRNA e gli acidi nucleici che codificano tali molecole di snRNA modificate. L'invenzione riguarda anche i vettori, in particolare i vettori per la terapia genica, contenenti gli acidi nucleici che codificano gli snRNA modificati e le applicazioni terapeutiche degli snRNA, degli acidi nucleici e dei vettori dell'invenzione.

In particolare, l'invenzione riguarda le molecole di snRNA chimeriche in grado di mascherare le giunzioni di splicing (sia in 5' che in 3') e una sequenza dell'enhancer esonico per lo splicing di un esone in un pre-mRNA in modo da indurre l'esclusione dell'esone (cioà ̈ l'esone viene eliminato con lo splicing del trascritto primario). Questo dà luogo a un mRNA maturo nel quale l'esone escluso à ̈ assente. Il trascritto che ne deriva darà origine dunque a una proteina più corta (rispetto alla proteina tradotta da un trascritto che include il relativo esone).

Questo approccio permette l'esclusione degli esoni che recano mutazioni che danno luogo alla produzione della proteina non funzionale o all'assenza della proteina (ad esempio se la mutazione introduce uno spostamento di fase). L'esclusione dell'esone permette di produrre una proteina funzionale, sebbene più corta. Pertanto, le molecole di snRNA modificate dell'invenzione possono essere utilizzate a scopo terapeutico, ad esempio nella terapia genica.

Tipicamente, un acido nucleico dell'invenzione à ̈ una singola molecola che contiene la sequenza antisenso in grado di intercettare le giunzioni del sito di splicing in 5' e 3', e una sequenza dell'enhancer esonico per lo splicing. Comunque, à ̈ possibile fornire due o tre acidi nucleici in modo che ciascun acido nucleico fornisca una o due delle sequenze antisenso. Tali acidi nucleici possono poi essere somministrati simultaneamente ad una cellula in modo che possa verificarsi l'esclusione di un esone. Si possono fornire tre acidi nucleici ciascuno contenente una delle sequenze antisenso oppure si possono fornire due acidi nucleici, uno contenente una delle sequenze antisenso e l'altro contenente due delle sequenze antisenso.

In particolare, le molecole di snRNA modificate dell'invenzione possono essere utilizzate per intercettare il pre-mRNA della distrofina per il trattamento delle distrofie muscolari come la distrofia muscolare di Duchenne (DMD).

La DMD à ̈ un disordine recessivo legato all'X che colpisce 1 maschio ogni 3500. È caratterizzata dall'assenza della distrofina citoscheletrica (proteina di 427 KDa) che a sua volta produce un deterioramento muscolare grave e progressivo. La maggior parte delle mutazioni DMD consistono in delezioni e mutazioni puntiformi nel gene della distrofina di 2,5 Mb che introducono codoni di stop e di conseguenza la terminazione prematura della traduzione. In una forma leggera di miopatia, la distrofia muscolare di Becker (BMD), le delezioni dentro il gene producono degli mRNA in fase e di conseguenza delle proteine distrofina più corte ma semifunzionali.

Gli approcci al trattamento della DMD includono il trapianto dei mioblasti normali nei tessuti muscolari mancanti di questa proteina, mentre altri hanno provato a ripristinare l'espressione corretta della distrofina attraverso l'approccio della terapia genica che somministra copie di cDNA di lunghezza completa o mini della distrofina nelle cellule che hanno il gene mutato. Tuttavia, rimangono ancora diversi problemi da risolvere per quanto riguarda l'ultimo approccio, quali la capienza e l'attività traduzionale del vettore e la risposta immunitaria al gene "terapeutico".

Un altro approccio si basa sul fatto che le delezioni interne in fase nella proteina distrofina producono solo dei sintomi miopatici lievi; quindi, dovrebbe essere possibile, prevenendo l'inclusione di un esone/i specifico/i (mutato/i) nell'mRNA della distrofina maturo, ristabilire un fenotipo parzialmente corretto. A questo riguardo, à ̈ interessante notare che il ripristino dei livelli di distrofina anche di solo il 30%, e anche significativamente meno, può essere sufficiente per un notevole beneficio terapeutico.

Il cosiddetto approccio di "esclusione specifica dell'esone" à ̈ stato realizzato mediante la somministrazione extracellulare di oligonucleotidi antisenso 2'-O-metilici sintetici prodotti contro le giunzioni specifiche di splicing o gli enhancer esonici. L'interazione dell'RNA antisenso con la corrispondente sequenza bersaglio dovrebbe mascherare l'utilizzo dei siti specifici di splicing o impedire il legame dei fattori sull'enhancer durante la reazione di splicing e determinare l'esclusione dell'esone/i mutato/i contiguo/i in modo da produrre un mRNA in fase della distrofina, ottenendo l'effetto finale della produzione di una proteina distrofina più corta ma funzionale. Un inconveniente significativo dell'approccio con gli oligonucleotidi sintetici à ̈ che non à ̈ chiaro se possono essere somministrati efficacemente in vivo. In aggiunta, il trattamento con gli oligonucleotidi richiede somministrazioni periodiche, cioà ̈ un trattamento protratto su periodi di tempo prolungati.

Per aggirare questo problema, nella presente vengono descritti gli acidi nucleici (e i vettori che contengono gli acidi nucleici) in grado di codificare gli snRNA chimerici (cioà ̈ snRNA modificati) contenenti sequenze antisenso che intercettano sequenze in modo da indurre l'esclusione dell'esone.

Grandi quantità di questi snRNA modificati possono essere espressi in vivo, in maniera stabile e continuativa. Questa strategia à ̈ stata testata per la delezione umana degli esoni 48-50 (e, in aggiunta, in cellule di un paziente con una delezione degli esoni 45-50). Comunque, questo approccio potrebbe essere applicato anche per altri esoni del gene della distrofina (e quindi per qualunque esone che si desidera escludere di qualunque gene). Nel caso della distrofina, lo spostamento della fase di lettura derivato dalla delezione viene ripristinato a una fase corretta mediante l'omissione dell'esone 51 nell'mRNA maturo; se si ottiene l'esclusione di questo esone, il risultato à ̈ un mRNA in cui l'esone 47 à ̈ legato all'esone 52, dando luogo a un mRNA in fase.

Le sequenze antisenso degli snRNA modificati codificati dagli acidi nucleici secondo l'invenzione sono progettate per appaiarsi a regioni specifiche di un pre-mRNA cellulare, vale a dire ad entrambe le giunzioni di splicing in 5' e 3', e a un enhancer esonico per lo splicing. Il mascheramento di queste regioni mediante le sequenze antisenso degli snRNA modificati interferisce con il normale processamento cellulare del trascritto, in modo da promuovere l'esclusione dell'esone intercettato.

Perciò, gli inventori hanno utilizzato diversi snRNA e le loro corrispondenti sequenze codificanti allo scopo di esprimere nel nucleo le molecole chimeriche che recano le sequenze antisenso in grado d'ibridarsi con le giunzioni di splicing dell'esone 51 e con la sequenza di un enhancer esonico per lo splicing e hanno testato la loro attività nei mioblasti di pazienti DMD con una delezione degli esoni 48-50 (o una delezione degli esoni da 45 a 50).

Pertanto, l'invenzione fornisce un acido nucleico che codifica un snRNA. L'snRNA viene modificato in modo da contenere la/e sequenza/e antisenso in grado d'ibridarsi (ad esempio complementare a) alle giunzioni del sito di splicing in 5' e 3' e alla sequenza di un enhancer esonico per lo splicing di un esone di un pre-mRNA. I siti vengono intercettati in modo che la sequenza dell'esone intercettata venga esclusa durante il processo di splicing che converte il pre-mRNA a mRNA maturo.

Vale a dire, secondo l'invenzione à ̈ fornito un acido nucleico che codifica per un snRNA modificato; modificato in modo da contenere la/e sequenza/e antisenso in grado d'ibridarsi a una sequenza bersaglio di un RNA cellulare, in cui queste sequenze bersaglio sono coinvolte nella maturazione o modificazione del detto RNA cellulare. La maturazione o modificazione dell'RNA include lo splicing, la formazione del 3'-terminale, l'editing, ecc. e, tipicamente, l'RNA cellulare codifica per una proteina di interesse terapeutico.

La/e sequenza/e antisenso (contenuta/e in un snRNA dell'invenzione) à ̈/sono in grado d'ibridarsi con, ad esempio à ̈/sono complementare/i a, le due giunzioni di splicing (5' e 3') e la sequenza di un enhancer esonico per lo splicing di un esone che codifica per una proteina d'interesse terapeutico. Le sequenze intercettate all'interno di un pre-mRNA sono tali che la sequenza dell'esone venga esclusa dal processo di maturazione del pre-mRNA a mRNA maturo. Preferibilmente, la/e sequenza/e antisenso contiene/contengono la sequenza complementare ad entrambe le giunzioni di splicing in 5' e 3' e alla sequenza dell'enhancer esonico per lo splicing dell'esone da escludere.

I piccoli acidi ribonucleici nucleari (snRNA) costituiscono una classe di piccole molecole di RNA che si trovano nel nucleo delle cellule eucariote. Vengono trascritti dalla RNA polimerasi II o dalla RNA polimerasi III e sono coinvolti in una varietà di processi importanti quali lo splicing dell'RNA (rimozione degli introni dall'hnRNA), la regolazione dei fattori di trascrizione (RNA 7SK) o della RNA polimerasi II (RNA B2), e il mantenimento dei telomeri. Sono già associati a proteine specifiche, e i complessi vengono denominati come piccole ribonucleoproteine nucleari (snRNP, small nuclear ribonucleoprotein). Questi elementi sono ricchi in contenuto di uridina. Poiché gli snRNA sono localizzati nel nucleo, essi possono influenzare solamente i processi nucleari.

La/e sequenza/e antisenso contenuta/e negli snRNA modificati codificati da un acido nucleico dell'invenzione influenza/influenzano lo splicing interagendo con due tipi di sequenze:

a) una giunzione di splicing (o sito di splicing); e

b) un enhancer esonico per lo splicing.

Questi due approcci sono stati in precedenza analizzati come strategie alternative. Nella presente si dimostra che una combinazione dei due approcci permette la generazione di acidi nucleici che codificano snRNA perfezionati.

Le sequenze antisenso in grado d'ibridarsi con i siti di splicing (sia 5' che 3') possono indurre, durante lo splicing, l'esclusione di uno specifico esone.

Una giunzione di splicing o sito di splicing à ̈ il limite tra un esone e un introne. Ve ne sono di due generi: il limite che va dall'esone all'introne à ̈ detto sito donatore o sito in 5'; il limite che separa l'introne dall'esone à ̈ detto sito accettore o sito in 3'. Quasi tutti i siti di splicing sono conformi a sequenze di consenso. Queste sequenze di consenso includono dei dinucleotidi quasi invariabili in ciascuna estremità dell'introne, GT nell'estremità 5' dell'introne, e AG nell'estremità 3' dell'introne (vedere Fig.5a, ad esempio). In oltre il 60% dei casi, la sequenza dell'esone à ̈ (A/C)AG nel sito donatore, e G nel sito accettore.

Pertanto, una sequenza antisenso in grado d'ibridarsi con i siti di splicing in 5' e in 3' sarà tipicamente in grado d'ibridarsi con i due limiti esone/introne dell'esone da escludere con l'adiacente. Le giunzioni di splicing o le sequenze del sito di splicing idonee possono essere facilmente identificate dalla persona esperta.

Un acido nucleico preferito dell'invenzione à ̈ quello in cui la sequenza che intercetta la giunzione di splicing in 5' dell'esone 51 del pre-mRNA della distrofina contiene la sequenza in grado d'ibridarsi con SEQ ID NO: 1.

Un acido nucleico preferito dell'invenzione à ̈ quello in cui la sequenza che intercetta la giunzione di splicing in 3' dell'esone 51 del pre-mRNA della distrofina contiene la sequenza in grado d'ibridarsi con SEQ ID NO: 2.

La sequenza in grado d'ibridarsi con SEQ ID NO: 1 o 2 può essere complementare a tutta o a parte di queste sequenze.

Molti esoni umani, di grandi dimensioni o con siti di splicing fiancheggianti relativamente deboli, contengono delle sequenze che promuovono la loro inclusione nell'mRNA, i cosiddetti enhancer esonici per lo splicing (ESE). Tali sequenze vengono riconosciute da proteine ricche in serina/arginina (SR) che promuovono l'utilizzo dell'esone nei tessuti dove esse vengono espresse. Tipicamente, un enhancer esonico per lo splicing (ESE) Ã ̈ un motivo della sequenza di DNA costituito da 6 basi entro un esone che dirige, o potenzia, lo splicing accurato dell'RNA eteronucleare o pre-mRNA a mRNA. Di nuovo, le giunzioni di splicing o le sequenze del sito si splicing idonee possono essere facilmente identificate dalla persona esperta.

Le sequenze antisenso entro gli snRNA dell'invenzione in grado d'ibridarsi con un ESE saranno tipicamente in grado d'ibridarsi con una tale sequenza.

Un altro acido nucleico preferito secondo l'invenzione à ̈ quello in cui la sequenza che intercetta l'enhancer esonico per lo splicing dell'esone 51 del pre-mRNA della distrofina contiene la sequenza in grado d'ibridarsi con SEQ ID NO: 3.

La/e sequenza/e antisenso contenuta/e in un snRNA dell'invenzione à ̈/sono in grado d'ibridarsi con le sequenze sopra specificate. Tale/i sequenza/e antisenso sarà/saranno tipicamente in grado d'ibridarsi a tutta o a parte della sequenza bersaglio specifica. Generalmente, quindi la/e sequenza/e sarà/saranno complementare/i a tutta o a parte di tale sequenza bersaglio. Ad esempio, una sequenza antisenso può essere il complemento esatto della sua sequenza bersaglio. Comunque, non à ̈ richiesta la complementarietà assoluta e una sequenza antisenso preferita à ̈ quella che ha una complementarietà sufficiente (cioà ̈, complementarietà importante) a formare un duplex con la sua sequenza bersaglio avente una temperatura di fusione maggiore di 40 °C nelle condizioni fisiologiche.

In alternativa, una sequenza antisenso avrà una complementarietà sufficiente in modo che s'ibriderà con la sequenza bersaglio in modo che la sequenza bersaglio non possa interagire con il meccanismo di splicing nella maniera in cui potrebbe in assenza della sequenza antisenso. La copertura in questa maniera della sequenza bersaglio permette che si verifichi l'esclusione dell'esone.

La sequenza antisenso può essere una sequenza antisenso che si ibrida alla sequenza bersaglio specifica nelle condizioni di stringenza media o alta, come in cloruro di sodio 0,03 M e citrato di sodio 0,03 M da circa 45 °C a circa 65 °C.

In alternativa, le condizioni d'ibridazione possono essere definite come le condizioni che permettono a una sequenza di acido nucleico di almeno 15 nucleotidi di lunghezza d'ibridarsi ad una temperatura di circa 65 °C in una soluzione contenente sale a circa 1 M, preferibilmente SSC 6x (cloruro di sodio, citrato di sodio) o qualunque altra soluzione avente una stringenza ionica paragonabile, e il lavaggio a 65 °C in una soluzione contenente sale a circa 0,1 M, o meno, preferibilmente SSC 0,2x o qualunque altra soluzione avente una stringenza ionica paragonabile. Queste condizioni possono permettere l'ibridazione specifica delle sequenze aventi circa il 90% o più d'identità di sequenza.

Le condizioni moderate possono essere definite come le condizioni che permettono a una sequenza di acido nucleico di almeno 15 nucleotidi di lunghezza d'ibridarsi ad una temperatura di circa 45 °C in una soluzione contenente sale a circa 1 M, preferibilmente SSC 6x o qualunque altra soluzione avente una stringenza ionica paragonabile, e il lavaggio a temperatura ambiente in una soluzione contenente sale a circa 1 M, preferibilmente SSC 6x o qualunque altra soluzione avente una stringenza ionica paragonabile. Queste condizioni permetteranno di solito l'ibridazione specifica delle sequenze aventi fino al 50% d'identità di sequenza. La persona esperta nell'arte sarà in grado di modificare queste condizioni d'ibridazione allo scopo d'identificare specificamente le sequenze che variano tra il 50% e il 90% di identità.

Una sequenza antisenso può essere definita in riferimento a una identità di sequenza specifica con il complemento inverso della sequenza che s'intende intercettare. Perciò, un snRNA modificato dell'invenzione conterrà le sequenze antisenso aventi almeno il 70% circa d'identità di sequenza con i complementi inversi delle sequenze delle giunzioni di splicing in 5' e 3' e con una sequenza dell'enhancer esonico per lo splicing dell'esone bersaglio) ad esempio i complementi inversi di SEQ ID NO: 1, 2 o 3). Le sequenze antisenso avranno tipicamente almeno il 75% circa, preferibilmente almeno l'80% circa, almeno l'85% circa, almeno il 90% circa, almeno il 92% circa, almeno il 93% circa, almeno il 94% circa, almeno il 95% circa, almeno il 96% circa, almeno il 97% circa, almeno il 98% circa o almeno il 99% circa oppure almeno il 75%, almeno l'80%, almeno l'85%, almeno il 90%, almeno il 92%, almeno il 93%, almeno il 94%, almeno il 95%, almeno il 96%, almeno il 97%, almeno il 98% o almeno il 99% d'identità di sequenza con i complementi inversi delle loro sequenze bersaglio (cioà ̈ i complementi inversi delle giunzioni di splicing in 5' e 3' e di un enhancer esonico per lo splicing dell'esone bersaglio, ad esempio i complementi inversi di SEQ ID NO: 1, 2 o 3).

In un acido nucleico dell'invenzione la porzione che codifica la sequenza antisenso (che intercetta i siti di splicing in 5' e 3' e un enhancer esonico per lo splicing di un esone) può avere almeno il 75% circa, preferibilmente almeno l'80% circa, almeno l'85% circa, almeno il 90% circa, almeno il 92% circa, almeno il 93% circa, almeno il 94% circa, almeno il 95% circa, almeno il 96% circa, almeno il 97% circa, almeno il 98% circa o almeno il 99% circa oppure almeno il 75%, almeno l'80%, almeno l'85%, almeno il 90%, almeno il 92%, almeno il 93%, almeno il 94%, almeno il 95%, almeno il 96%, almeno il 97%, almeno il 98% o almeno il 99% d'identità con la sequenza esposta in SEQ ID NO: 4.

L'identità di sequenza (o similarità di sequenza) viene definita nella presente come la relazione tra due o più sequenze di acido nucleico (polinucleotidi), determinata dal confronto delle sequenze. In genere, le identità o similarità di sequenza vengono confrontate, tipicamente sulla lunghezza intera delle sequenze confrontate. Tuttavia, le sequenze possono essere confrontate su finestre di confronto più brevi. Nell'arte, con "identità" s'intende anche il grado di correlazione tra sequenze di acido nucleico, come nel caso, determinato dalla corrispondenza tra le stringhe di tali sequenze.

I metodi preferiti per determinare l'identità sono progettati per fornire la corrispondenza più grande tra le sequenze testate. I metodi per determinare l'identità e la similarità sono codificati nei programmi per computer disponibili pubblicamente. I metodi dei programmi per computer preferiti per determinare l'identità e la similarità tra due sequenze includono ad es. BestFit, BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul, S. F. et al., J. MoI. Biol.215: 403-410 (1990), resi disponibili pubblicamente dalla NCBI e da altre fonti. I parametri preferiti per il confronto delle sequenze di acido nucleico utilizzando BLASTP sono gap open 11.0, gap extend 1, DNA full matrix (matrice d'identità del DNA).

I risultati descritti nella presente dimostrano che la combinazione di sequenze antisenso che intercettano la giunzione di splicing in 5' e in 3' di un esone e una sequenza dell'enhancer esonico per lo splicing di questo esone può indurre l'esclusione efficiente di un esone e il ripristino della sintesi della proteina.

L'intercettamento dei siti di splicing e di un enhancer esonico per lo splicing può essere applicato in tutti quei casi in cui l'esclusione di uno specifico esone mutato può ripristinare la funzionalità dell'mRNA (come nel caso delle mutazioni della distrofina). Vale a dire, un acido nucleico dell'invenzione à ̈ tipicamente tale che l'esclusione dell'esone intercettato mediante l'snRNA modificato conduca alla produzione di una proteina funzionale.

Poiché più della metà dei geni umani codificano trascritti che subiscono splicing alternativo, l'acido nucleico dell'invenzione fornisce un metodo generale per controllare l'espressione delle isoforme derivate da splicing alternativo di geni specifici e può perciò essere utile in un ampia varietà di applicazioni. Gli snRNA codificati dagli acidi nucleici dell'invenzione possono essere utilizzati per controllare il tipo di mRNA prodotto dallo splicing alternativo e della corrispondente proteina.

Un acido nucleico dell'invenzione può essere tale che l'esone da escludere sia un esone del pre-mRNA della distrofina. Vale a dire che, in un aspetto preferito, la proteina di interesse terapeutico contenente un esone da eliminare à ̈ la distrofina. Preferibilmente, l'esclusione dell'esone mutato conduce alla produzione di una proteina distrofina funzionale (l'esone mutato à ̈ tale da contenere, o da determinare la formazione di, uno stop prematuro e/o uno spostamento di fase). In particolare, l'acido nucleico dell'invenzione può essere tale che l'esone 51 del pre-mRNA della distrofina venga escluso.

Un acido nucleico dell'invenzione contiene la/e sequenza/e in grado d'ibridarsi con, ad esempio complementare a, le giunzioni del sito di splicing in 5' e 3' e con un enhancer esonico per lo splicing di un esone. La sequenza complementare alle giunzioni del sito di splicing in 5' e 3' e all'enhancer esonico per lo splicing di un esone può essere contenuta nella regione in 5' dell'snRNA. Le sequenze antisenso possono rappresentare la maggior parte delle sequenze in 5' dell'snRNA o possono essere situate ad almeno uno, due, tre, quattro, cinque, sei, sette, otto, nove o dieci nucleotidi in 3' dall'estremità 5' dell'snRNA modificato.

Le sequenze antisenso di un snRNA modificato possono modificare l'snRNA per mezzo dell'aggiunta e/o per mezzo della sostituzione. Vale a dire, le sequenze antisenso possono semplicemente essere aggiunte ad un snRNA oppure, in alternativa, possono sostituire la/e sequenza/e entro un snRNA. Se le sequenze antisenso vengono aggiunte per mezzo della sostituzione, l'snRNA modificato può essere della stessa lunghezza dell'snRNA di tipo selvatico. Naturalmente, le sequenze sostituite dalle sequenze antisenso possono essere più corte o più lunghe delle sequenze antisenso.

La/e sequenza/e complementare/i alle giunzioni del sito di splicing in 5' e 3' e all'enhancer esonico per lo splicing di un esone possono essere disposte in posizione adiacente l'una all'altra in un snRNA modificato dell'invenzione (cioà ̈ poste adiacenti l'una all'altra senza nucleotidi interposti). In alternativa le sequenze antisenso possono essere separate da uno o più nucleotidi, ad esempio da uno, due, tre, quattro, cinque, sei, sette, otto, nove o dieci o più nucleotidi. Due delle sequenze antisenso possono essere poste adiacenti l'una all'altra (cioà ̈ senza nucleotidi interposti) con la terza sequenza antisenso separata da queste due mediante uno o più nucleotidi interposti come appena descritto.

Perciò, un ulteriore acido nucleico preferito dell'invenzione à ̈ quello in cui la sequenza complementare alle giunzioni di splicing in 5' e 3' e all'enhancer esonico per lo splicing dell'esone 51 del pre-mRNA della distrofina contiene la sequenza esposta in SEQ ID NO: 4.

Un acido nucleico dell'invenzione può preferibilmente contenere la sequenza esposta in SEQ ID NO: 5.

Un acido nucleico dell'invenzione può codificare un snRNA modificato che à ̈ un snRNA U1, U2, U3, U4, U5, U6 o U7 modificato. Preferibilmente, l'acido nucleico codifica per un snRNA U1, U2 o U7 modificato.

Se l'snRNA Ã ̈ basato sull'snRNA U1, esso viene tipicamente modificato in modo che un frammento in 5' dell'acido nucleico che codifica un snRNA modificato sia sostituito dalle sequenze antisenso descritte nella presente.

Se l'snRNA Ã ̈ basato sull'snRNA U2, esso viene tipicamente modificato in modo che la regione U2 complementare al sito di ramificazione dell'introne sia sostituita dalle sequenze antisenso descritte nella presente.

In un aspetto alternativo preferito, un snRNA basato su U2 viene ulteriormente modificato in modo che non interagisca con l'snRNA U6, ad esempio pur mantenendo la sua struttura secondaria e terziaria.

L'snRNA modificato codificato da un acido nucleico dell'invenzione, in particolare nel caso di un snRNA U1, può mantenere la capacità di interagire con la proteina 70K associata a U1.

L'invenzione fornisce un snRNA modificato codificato da un acido nucleico secondo una qualunque delle precedenti rivendicazioni.

L'invenzione fornisce anche un vettore che contiene un acido nucleico dell'invenzione. Vale a dire, un acido nucleico che codifica un snRNA modificato come descritto nella presente può essere espresso in una cellula da un vettore idoneo. Un vettore idoneo à ̈ tipicamente un vettore replicabile ricombinante che contiene una sequenza che, qualora trascritta, origina un snRNA modificato dell'invenzione.

Tipicamente, la sequenza che codifica il polinucleotide à ̈ legata operativamente ad una sequenza di controllo che à ̈ in grado di provvedere alla trascrizione della sequenza originando un snRNA modificato. Il termine "legato operativamente" si riferisce ad una giustapposizione in cui i componenti descritti sono in un rapporto che gli consente di funzionare nel loro modo previsto. Una sequenza di controllo "legata operativamente" ad una sequenza che origina un snRNA à ̈ legata in maniera tale che la trascrizione della sequenza venga ottenuta nelle condizioni compatibili per le sequenze di controllo.

Un vettore da utilizzare nell'invenzione può essere, ad esempio, un plasmide o un vettore virale. Sarà compreso da coloro con esperienza nell'arte che l'acido nucleico dell'invenzione può essere legato operativamente alle sequenze di controllo appropriate. Ad esempio, l'acido nucleico dell'invenzione può essere associato operativamente agli elementi di controllo dell'espressione, quali i segnali di controllo della trascrizione/traduzione, le origini di replicazione, i segnali di poliadenilazione e i siti di entrata interni per il ribosoma (IRES), i promotori, i regolatori del promotore (come l'enhancer), e simili.

Un vettore può contenere uno o più geni marcatori selezionabili, ad esempio un gene di resistenza all'ampicillina nel caso del plasmide batterico oppure un gene di resistenza alla neomicina in un vettore per mammiferi.

Un vettore dell'invenzione può essere utilizzato in vitro o ex vivo, ad esempio per la produzione di RNA antisenso, oppure utilizzato per trasfettare o trasformare una cellula ospite. Il vettore può anche essere idoneo a oppure adattato all'utilizzo in vivo, ad esempio in un metodo di terapia genica.

Si possono selezionare quei promotori/enhancer e altri segnali di regolazione dell'espressione che sono compatibili con la cellula ospite per la quale viene progettato il vettore.

In un vettore dell'invenzione, almeno una sequenza di acido nucleico che codifica un snRNA modificato per l'espressione in una cellula di mammifero, à ̈/sono preferibilmente legata/e ad almeno una sequenza di controllo dell'espressione compatibile con la cellula di mammifero, ad es. un promotore. Il promotore utilizzato può essere quello che tipicamente dirige l'espressione dell'snRNA sul quale si basa l'snRNA modificato dell'invenzione.

Molti di tali promotori sono noti nell'arte (si veda, Sambrook and Russel, 2001, supra). Possono essere utilizzati i promotori costitutivi che vengono ampiamente espressi in molti tipi cellulari, quali il promotore di CMV o il promotore della b-actina. Comunque, i più preferiti saranno quelli che sono inducibili, specifici dei tessuti, specifici del tipo cellulare o specifici del ciclo cellulare. Ad esempio, per l'espressione epatica si può selezionare un promotore tra il promotore della α1-antitripsina, il promotore della globulina legante l'ormone tiroideo, il promotore dell'albumina, il promotore LPS (globulina legante la tiroxina), il promotore ibrido HCR-ApoCII, il promotore ibrido HCR-hAAT e il promotore della apolipoproteina E. Altri esempi includono il promotore di E2F per l'espressione selettiva nei tumori, e in particolare, selettiva nelle cellule di tumori neurologici (Parr et al., 1997, Nat. Med. 3: 1145-9) oppure il promotore della IL-2 da utilizzarsi nelle cellule mononucleate del sangue (Hagenbaugh et al., 1997, J Exp Med; 185: 2101-10).

Si possono anche utilizzare i promotori virali, ad esempio le lunghe sequenze ripetute terminali del virus della leucemia murina di Moloney (MMLV LTR), il promotore LTR del virus del sarcoma di Rous (RSV), il promotore di SV40, il promotore IE del citomegalovirus umano (CMV), i promotori del virus herpes simplex, i promotori di adenovirus o i promotori dei virus adeno-associati. Tutti questi promotori sono facilmente disponibili nell'arte. I promotori preferiti possono essere i promotori specifici dei tessuti, ad esempio i promotori che dirigono l'espressione specificatamente nelle cellule muscolari.

Gli esperti nell'arte si renderanno conto che può essere utilizzata una varietà di elementi promotore/enhancer in base al livello e alla specificità tissutale di espressione desiderati. Il promotore/enhancer può essere costitutivo o inducibile, in base al profilo di espressione desiderato. Il promotore/enhancer può essere nativo o estraneo e può essere una sequenza naturale o sintetica. Con estraneo, s'intende che la regione d'inizio della trascrizione non si ritrova nell'ospite di tipo selvatico nel quale viene introdotta la regione d'inizio della trascrizione.

Quelli maggiormente preferiti sono gli elementi promotore/enhancer che sono nativi per la cellula bersaglio o per il soggetto da trattare. Sono preferibili anche gli elementi promotore/enhancer che sono nativi per l'acido nucleico dell'invenzione. L'elemento promotore/enhancer viene scelto in modo che potrà funzionare nella/e cellula/e bersaglio d'interesse. Tipicamente si preferiscono gli elementi promotore/enhancer di mammifero. L'elemento promotore/enhancer può essere costitutivo o inducibile.

Un vettore dell'invenzione può inoltre includere sequenze supplementari, ad esempio le sequenze supplementari fiancheggianti la sequenza che origina l'snRNA modificato. Ad esempio, un vettore può contenere le sequenze omologhe alle sequenze genomiche eucariotiche, preferibilmente sequenze genomiche di mammifero, oppure sequenze genomiche virali. Questo permetterà l'introduzione di un acido nucleico dell'invenzione nel genoma di una cellula eucariota o di un virus mediante la ricombinazione omologa.

Tipicamente, un tale vettore permetterà l'espressione stabile ed efficiente in una cellula bersaglio di uno o più acidi nucleici secondo l'invenzione (cioà ̈ l'espressione di uno o più snRNA modificati come descritto nella presente).

La cellula bersaglio può essere di qualunque tipo cellulare desiderato, quale una cellula muscolare, ad esempio una fibra cellulare o una cellula muscolare satellite. Un vettore dell'invenzione può essere idoneo per il trasferimento in una cellula staminale.

Allo scopo di ottenere le molecole di snRNA "terapeutiche" efficaci in vivo, può essere necessario considerare diversi parametri. Un acido nucleico (che codifica un snRNA modificato) non deve solamente essere legato operativamente ad un promotore efficiente in grado di produrre un alto livello di espressione ma, in aggiunta, il contesto dell'RNA in cui l'RNA terapeutico viene inserito dovrebbe fornire stabilità e/o localizzazione subcellulare specifica.

L'ultimo punto può essere critico poiché, nella cellula, gli RNA vengono smistati verso posizioni cellulari specifiche (nucleo, nucleolo, citoplasma, RNP libere e legate ai polisomi, ecc.) e l'attività efficiente della molecola terapeutica può essere ottenuta solo se viene garantita la co-localizzazione con il bersaglio.

Gli RNA cellulari piccoli sono stati vantaggiosamente utilizzati in qualità di vettori poiché vengono normalmente trascritti dai promotori forti (Pol-I o Pol-II) e perché consentono la somministrazione dei costrutti chimerici in compartimenti cellulari specifici.

Un vettore secondo l'invenzione può contenere due o più, ad esempio tre, quattro o cinque o più acidi nucleici dell'invenzione, ciascuno codificante un snRNA modificato. Ciascun snRNA può essere progettato per intercettare un esone differente entro lo stesso gene o può essere progettato per intercettare gli esoni in geni differenti (o una combinazione di ciò).

Un vettore secondo l'invenzione può essere un vettore di somministrazione genica. Un tale vettore di somministrazione genica può essere un vettore virale di somministrazione genica o un vettore non virale di somministrazione genica.

La somministrazione genica non virale può essere condotta utilizzando il DNA nudo, che rappresenta il metodo più semplice di trasfezione non virale. Può essere possibile, ad esempio, somministrare un acido nucleico dell'invenzione utilizzando il DNA plasmidico nudo. In alternativa, possono essere utilizzati metodi quali l'elettroporazione, la sonoporazione o l'utilizzo di un "cannone genico", che spara le particelle d'oro ricoperte di DNA dentro la cellula utilizzando, ad esempio, del gas ad alta pressione o una pistola calibro 0,22 convertita.

Per migliorare la somministrazione di un acido nucleico nella cellula, può essere necessario proteggerlo dal danneggiamento e può essere facilitata la sua entrata nella cellula. A tal fine, possono essere utilizzati i lipoplex e i polyplex che sono in grado di proteggere un acido nucleico dalla degradazione indesiderata durante il processo di trasfezione.

Il DNA plasmidico può essere ricoperto con lipidi in una struttura organizzata quale una micella o un liposoma. Quando la struttura organizzata à ̈ complessata con il DNA viene detta lipoplex. Per la costruzione dei lipoplex per i vettori sintetici si possono utilizzare lipidi anionici e neutri. Preferibilmente, comunque, per condensare le molecole di DNA cariche negativamente possono essere utilizzati i lipidi cationici, per la loro carica positiva, in modo da facilitare l'incapsulazione del DNA nei liposomi. Può essere necessario aggiungere dei lipidi adiuvanti (in genere lipidi elettroneutri, quale la DOPE) ai lipidi cationici in modo da formare i lipoplex.

I complessi di polimeri con DNA, detti polyplex, possono essere utilizzati per somministrare un acido nucleico dell'invenzione. La maggior parte dei polyplex à ̈ costituita da polimeri cationici e la loro produzione viene regolata dalle interazioni ioniche. Tipicamente, i polyplex non possono rilasciare il loro carico di DNA nel citoplasma. Perciò, può essere necessaria la co-trasfezione con agenti di lisi endosomiale (per lisare l'endosoma che viene creato durante l'endocitosi, processo con il quale il polyplex entra nella cellula), quali l'adenovirus inattivato.

Per somministrare un acido nucleico dell'invenzione, si possono utilizzare dei metodi ibridi che combinano due o più tecniche. Ne sono un esempio i virosomi; questi combinano i liposomi con un virus HIV o dell'influenza inattivato. Altri metodi coinvolgono le miscele di altri vettori virali con i lipidi cationici o virus ibridi e possono essere utilizzati per somministrare un acido nucleico dell'invenzione.

Per somministrare un acido nucleico dell'invenzione può essere utilizzato un dendrimero, in particolare, un dendrimero cationico, cioà ̈ quello con una carica di superficie positiva. Quando à ̈ in presenza di materiale genetico come DNA o RNA, la complementarietà di carica porta ad una associazione temporanea dell'acido nucleico con il dendrimero cationico. Per giungere a destinazione il complesso dendrimero-acido nucleico viene incluso nella cellula mediante l'endocitosi.

Più tipicamente, si può utilizzare un vettore virale idoneo di somministrazione genica per somministrare un acido nucleico dell'invenzione. I vettori virali idonei da utilizzarsi nell'invenzione possono essere un parvovirus, un adenovirus, un retrovirus, un lentivirus o un virus herpes simplex. Il parvovirus può essere un virus adeno-associato (AAV).

Come utilizzato nella presente, nel contesto di somministrazione genica, il termine "vettore" o "vettore di somministrazione genica" può riferirsi ad una particella che funziona da veicolo di somministrazione genica, e che contiene l'acido nucleico (cioà ̈, il genoma del vettore) impaccato nel suo interno, ad esempio in un involucro o capside. In alternativa, in alcuni contesti, il termine "vettore" può essere utilizzato per riferirsi solamente al genoma del vettore.

Pertanto, la presente invenzione fornisce i vettori di somministrazione genica (contenenti un acido nucleico dell'invenzione) basati sui parvovirus animali, in particolare i dependovirus quale l'AAV infettivo per l'uomo o per la scimmia, e i loro componenti (ad es. un genoma di parvovirus animale) da utilizzarsi in qualità di vettori per l'introduzione e/o l'espressione di un snRNA modificato in una cellula di mammifero.

I virus della famiglia Parvoviridae sono piccoli virus animali a DNA. La famiglia Parvoviridae può essere suddivisa in due sottofamiglie: Parvovirinae, che infetta i vertebrati, e Densovirinae, che infetta gli insetti. I membri della sottofamiglia Parvovirinae vengono nella presente riportati come parvovirus e includono il genere Dependovirus. Come si può dedurre dal nome del loro genere, i membri del Dependovirus sono singolari in quanto di solito richiedono la co-infezione con un virus adiuvante quale l'adenovirus o il virus herpes per un'infezione fruttuosa nella coltura cellulare. Il genere Dependovirus include AAV, che normalmente infetta l'uomo (ad es. i sierotipi 1, 2, 3A, 3B, 4, 5 e 6) o i primati (ad es. i sierotipi 1 e 4), e i virus correlati che infettano altri animali a sangue caldo (ad es. i virus adeno-associati bovini, canini, equini e ovini). Ulteriori informazioni sui parvovirus e sugli altri membri della Parvoviridae sono descritte in Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication," capitolo 69 in Fields Virology (3a Ed.

1996). Per convenienza la presente invenzione à ̈ ulteriormente esemplificata e descritta nella presente con riferimento a AAV. È tuttavia inteso che l'invenzione non à ̈ limitata a AAV ma può ugualmente essere applicata ad altri parvovirus.

L'organizzazione genomica di tutti i sierotipi di AAV à ̈ molto simile. Il genoma di AAV à ̈ una molecola di DNA lineare, a singolo filamento che in lunghezza à ̈ inferiore a circa 5.000 nucleotidi (nt). Le sequenze ripetute terminali invertite (ITR) fiancheggiano le singole sequenze nucleotidiche che codificano per le proteine non strutturali di replicazione (Rep) e per le proteine strutturali (VP). Le proteine VP (VP1, -2 e -3) formano il capside. I 145 nt terminali sono auto-complementari e sono organizzati in modo che possa essere formata un'ansa a forma di T che forma un duplex intramolecolare energeticamente stabile. Queste strutture a forcella funzionano da origine per la replicazione del DNA virale, servendo da primer per il complesso della DNA polimerasi cellulare. In seguito all'infezione con wtAAV, nelle cellule di mammifero i geni Rep (cioà ̈ Rep78 e Rep52) vengono espressi rispettivamente dal promotore P5 e dal promotore P19, ed entrambe le proteine Rep hanno una funzione nella replicazione del genoma virale. Un evento di splicing nella ORF di Rep dà luogo in realtà all'espressione di quattro proteine Rep (cioà ̈ Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40). Comunque, nelle cellule di mammifero à ̈ stato mostrato che le proteine Rep78 e Rep52 codificate dall'mRNA che non ha subito splicing, sono sufficienti per la produzione del vettore AAV. Anche nelle cellule di insetto le proteine Rep78 e Rep52 sono adeguate alla produzione del vettore AAV.

In un vettore AAV idoneo da utilizzarsi in qualità di vettore per la terapia genica, il genoma del vettore contiene tipicamente un acido nucleico dell'invenzione (come descritto nella presente) da impaccare per la somministrazione ad una cellula bersaglio. Secondo questa particolare forma di realizzazione, la sequenza nucleotidica eterologa à ̈ situata tra le ITR virali in entrambe le estremità del genoma del vettore. In ulteriori forme di realizzazione preferite, i geni cap del parvovirus (ad es. AAV) e i geni rep del parvovirus (ad es. AAV) vengono eliminati dal genoma di origine (e quindi dal DNA del virione prodotto da questo). Questa configurazione massimizza la dimensione della/e sequenza/e di acido nucleico che può essere portata dal capside del parvovirus.

Secondo questa particolare forma di realizzazione, l'acido nucleico dell'invenzione à ̈ situato tra le ITR virali in entrambe le estremità del substrato. È possibile che il genoma parvovirale funzioni con solo una ITR. Perciò, in un vettore di terapia genica dell'invenzione basato su un parvovirus, il genoma del vettore à ̈ fiancheggiato da almeno una ITR, ma più tipicamente, da due ITR di AAV (generalmente una ad ogni estremità del genoma del vettore, cioà ̈ una nell'estremità 5' e una nell'estremità 3'). Ci possono essere delle sequenze interposte tra l'acido nucleico dell'invenzione nel genoma del vettore e una o più ITR.

Preferibilmente, l'acido nucleico che codifica un snRNA modificato (per l'espressione nella cellula di mammifero) verrà incorporato in un genoma parvovirale collocato tra due ITR regolari o collocato in entrambi i lati di una ITR ingegnerizzata con due regioni D.

Le sequenze di AAV che possono essere utilizzate nella presente invenzione per la produzione dei vettori per la terapia genica possono derivare dal genoma di qualunque sierotipo di AAV. Generalmente, i sierotipi di AAV hanno sequenze genomiche con omologia significativa a livello aminoacidico e dell'acido nucleico, forniscono un insieme identico di funzioni genetiche, producono virioni che sono essenzialmente equivalenti fisicamente e funzionalmente, e si replicano e si assemblano praticamente mediante meccanismi identici. Per la sequenza genomica dei vari sierotipi di AAV e per una panoramica sulle similarità genomiche, si veda ad es. numero di accesso GenBank U89790; numero di accesso GenBank J01901; numero di accesso GenBank AF043303; numero di accesso GenBank AF085716; Chlorini et al. (1997, J. Vir. 71: 6823-33); Srivastava et al. (1983, J. Vir. 45: 555-64); Chlorini et al. (1999, J. Vir. 73: 1309-1319); Rutledge et al. (1998, J. Vir. 72: 309-319); e Wu et al. (2000, J. Vir. 74: 8635-47). Nella presente invenzione possono essere usati i sierotipi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 di AAV. Tuttavia, i sierotipi 1 e 6 di AAV rappresentano le fonti preferite delle sequenze di AAV da utilizzare nel contesto della presente invenzione.

Preferibilmente, le sequenze ITR di AAV da utilizzare nel contesto della presente invenzione sono derivate da AAV1, AAV2, AAV4 e/o AAV6. Similmente, le sequenze che codificano Rep (Rep78 e Rep52) sono preferibilmente derivate da AAV1, AAV2, AAV4 e/o AAV6. Le sequenze che codificano per le proteine del capside VP1, VP2 e VP3 da utilizzare nel contesto della presente invenzione possono comunque essere prelevate da uno qualunque dei 42 sierotipi noti, più preferibilmente da AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 o AAV9 oppure dalle particelle di tipo AAV sviluppate di recente ottenute ad es. con le tecniche di rimescolamento dei capsidi e con le librerie capsidiche di AAV.

Rep di AAV e le sequenze ITR sono particolarmente conservate tra la maggior parte dei sierotipi. Le proteine Rep78 dei diversi sierotipi di AAV sono ad es. identiche per più dell'89% e l'identità di sequenza nucleotidica totale a livello genomico tra AAV2, AAV3A, AAV3B e AAV6 à ̈ circa l'82% (Bantel-Schaal et al., 1999, J. Virol., 73(2): 939-947). Inoltre, le sequenze di Rep e le ITR di molti sierotipi di AAV sono note per complementare efficientemente (cioà ̈, sostituire funzionalmente) le sequenze corrispondenti di altri sierotipi per la produzione di particelle di AAV nelle cellule di mammifero. US2003148506 riporta che anche le sequenze di Rep di AAV e delle ITR complementano efficientemente altre sequenze di Rep di AAV e delle ITR nelle cellule di insetto.

Le proteine VP di AAV sono note per determinare la tropicità cellulare del virione di AAV. Le sequenze che codificano la proteina VP sono significativamente meno conservate delle proteine Rep e dei geni tra i differenti sierotipi di AAV. La capacità delle sequenze di Rep e delle ITR di complementare le corrispondenti sequenze di altri sierotipi consente la produzione di particelle pseudotipiche di AAV che contengono le proteine del capside di un sierotipo (ad es. AAV1 o 6) e le sequenze di Rep e/o delle ITR di un altro sierotipo di AAV (ad es. AAV2). Tali particelle rAAV pseudotipiche rappresentano una parte della presente invenzione.

Anche le sequenze modificate "AAV" possono essere utilizzate nel contesto della presente invenzione, ad es. per la produzione dei vettori AAV per la terapia genica. Tali sequenze modificate che ad es. includono le sequenze aventi una identità di sequenza nucleotidica e/o aminoacidica di almeno il 70% circa, almeno il 75% circa, almeno l'80% circa, almeno l'85% circa, almeno il 90% circa, almeno il 95% circa o più (ad es. una sequenza avente una identità di sequenza nucleotidica del 75-99% circa) rispetto a ITR, Rep o VP di AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 o AAV9, possono essere utilizzate al posto delle sequenze ITR, Rep o VP di AAV di tipo selvatico.

Sebbene simile agli altri sierotipi di AAV in molti aspetti, AAV5 differisce dagli altri sierotipi di AAV umani e di scimmia molto più degli altri sierotipi umani e di scimmia. In considerazione di ciò, nelle cellule di insetto la produzione di rAAV5 può differire dalla produzione di altri sierotipi. Se i metodi dell'invenzione vengano impiegati per produrre rAAV5, si preferisce che uno o più costrutti contenenti, collettivamente nel caso di più di un costrutto, una sequenza nucleotidica che contiene una ITR di AAV5, una sequenza nucleotidica che contiene una sequenza codificante per Rep di AAV5 (cioà ̈, la sequenza nucleotidica contiene la Rep78 di AAV5). Tali sequenze ITR e Rep possono essere modificate come desiderato al fine di ottenere una produzione efficiente dei vettori AAV5 o pseudotipici di AAV5. Ad es., il codone d'inizio delle sequenze Rep può essere modificato, i siti di splicing di VP possono essere modificati o eliminati, e/o il codone d'inizio di VP1 e i nucleotidi vicini possono essere modificati per migliorare la produzione dei vettori AAV5.

Perciò, il capside virale utilizzato nell'invenzione può derivare da qualunque parvovirus, sia un parvovirus autonomo che un dependovirus, come sopra descritto. Preferibilmente, il capside virale à ̈ un capside di AAV (ad es. il capside di AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 o AAV6). In generale, si preferiscono il capside di AAV1 e il capside di AAV6. La scelta del capside di parvovirus può essere basata su una serie di considerazioni note nell'arte, ad es. il tipo di cellula bersaglio, il livello desiderato di espressione, la natura della sequenza nucleotidica eterologa da esprimere, i problemi connessi con la produzione virale, e simili. Ad esempio, il capside di AAV1 e AAV6 può essere vantaggiosamente impiegato per il muscolo scheletrico; AAV1, AAV5 e AAV8 per il fegato e le cellule del sistema nervoso centrale (ad es. cervello); AAV5 per le cellule delle vie respiratorie e polmonari o cerebrali; AAV3 per le cellule del midollo osseo; e AAV4 per particolari cellule del cervello (ad es. le cellule ependimali).

La scelta del virus o sottotipo di virus più appropriato dipende dalle competenze tecniche della persona esperta. Per un certo tipo di tessuto alcuni sottotipi possono essere più adatti di altri.

Ad esempio, l'espressione specifica per il muscolo di un snRNA modificato dell'invenzione destinata all'esclusione di un esone del gene della distrofina può vantaggiosamente essere indotta con la trasduzione delle cellule muscolari mediata da AAV. Il muscolo à ̈ suscettibile alla trasduzione mediata da AAV, e possono essere utilizzati diversi sierotipi (AAV1, AAV6, AAV7, AAVB). La trasduzione del muscolo può essere realizzata mediante l'iniezione intramuscolare in più siti di un AAV che codifica un snRNA dell'invenzione. Tuttavia, à ̈ anche applicabile la somministrazione endovenosa o endoarteriosa (AAV1, AAV6, AAVB) e può essere la più idonea per ottenere la somministrazione a tutti i gruppi muscolari.

Un vettore parvovirale per la terapia genica preparato secondo l'invenzione può essere una particella "ibrida" in cui le TR virali e il capside virale provengono da parvovirus differenti. Preferibilmente, le TR e il capside virali provengono da differenti sierotipi di AAV. Allo stesso modo, il parvovirus può avere un capside "chimerico" (ad es. che contiene sequenze di differenti parvovirus, preferibilmente di sierotipi differenti di AAV) o un capside "mirato" (ad es. un tropismo diretto).

Nel contesto dell'invenzione con "almeno una sequenza ITR nucleotidica parvovirale" si intende una sequenza palindromica, contenente sequenze in massima parte complementari, disposte simmetricamente anche riportate come regioni "A", "B" e "C". La ITR funziona come origine di replicazione, un sito avente un ruolo "cis" nella replicazione, cioà ̈ à ̈ un sito di riconoscimento per le proteine della replicazione che agiscono in trans quali ad es. Rep 78 (o Rep68) che riconoscono il palindromo e le sequenze specifiche interne al palindromo. Una eccezione alla simmetria della sequenza ITR à ̈ la regione "D" della ITR. Essa à ̈ unica (non avendo complemento all'interno di una ITR). Il nicking del DNA a singolo filamento si verifica nella giunzione tra le regioni A e D. È la regione dove inizia la nuova sintesi di DNA. La regione D normalmente si trova su un lato del palindromo e fornisce la direzionalità alla fase di replicazione dell'acido nucleico. Un parvovirus che si replica in una cellula di mammifero ha tipicamente due sequenze ITR. È possibile, tuttavia, ingegnerizzare una ITR in modo che i siti di legame che si trovano su entrambi i filamenti delle regioni A e D siano posizionati simmetricamente, uno su ciascun lato del palindromo. Su un DNA circolare, a doppio filamento, di origine (ad es. un plasmide), la replicazione dell'acido nucleico assistita da Rep78 o da Rep68 procede quindi in entrambe le direzioni e una singola ITR à ̈ sufficiente per la replicazione di un vettore circolare. Perciò, nel contesto della presente invenzione si può utilizzare una sequenza nucleotidica ITR. Preferibilmente, tuttavia, vengono utilizzate due o un altro numero pari di ITR regolari. Più preferibilmente, vengono usate due sequenze ITR. Una ITR parvovirale preferita à ̈ una ITR di AAV. Per motivi di sicurezza può essere desiderabile costruire un vettore parvovirale (AAV) che non sia in grado di propagarsi ulteriormente dopo l'introduzione iniziale in una cellula. Un tale meccanismo di sicurezza che limita la propagazione indesiderata del vettore in un ricevente può essere fornito utilizzando AAV con una ITR chimerica come descritto in US2003148506.

Gli esperti nell'arte si renderanno conto che la/e proteina/e virale Rep utilizzata/e per la produzione di un vettore AAV dell'invenzione può/possono essere scelta/e prendendo in considerazione l'origine delle ITR virali. Ad esempio, la ITR di AAV5 interagisce in genere più efficientemente con la proteina Rep di AAV5, anche se non à ̈ necessario che il sierotipo della ITR corrisponda alla/e proteina/e Rep.

La/e ITR utilizzata/e nell'invenzione à ̈/sono tipicamente funzionale/i, cioà ̈ possono essere pienamente risolvibili e sono preferibilmente sequenze di AAV dei sierotipi preferiti 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Le ITR risolvibili di AAV secondo la presente invenzione non necessitano di avere una sequenza ITR di tipo selvatico (ad es. una sequenza di tipo selvatico può venire alterata per inserimento, delezione, troncamento o mutazioni di senso errato), purché la ITR ottemperi alle funzioni desiderate, ad es. l'impacchettamento del virus, l'integrazione e/o la liberazione del provirus, e simili.

Vantaggiosamente, l'utilizzo di un vettore per terapia genica fornisce delle caratteristiche che le cellule trasdotte acquistano definitivamente, quali quelle dei precedenti approcci che utilizzano gli oligonucleotidi antisenso, l'esclusione dell'esone mutato e il ripristino della sintesi della proteina (ad esempio la sintesi della distrofina) evitando così la necessità della somministrazione continua per l'ottenimento dell'effetto terapeutico.

Pertanto, i vettori dell'invenzione rappresentano quindi uno strumento per lo sviluppo di strategie per la somministrazione in vivo degli snRNA terapeutici, mediante l'ingegnerizzazione dell'snRNA codificante all'interno di un vettore per la terapia genica che trasduce in modo efficiente un tipo cellulare appropriato, come le cellule della fibra muscolare.

L'invenzione fornisce una cellula ospite, quale una cellula di mammifero o di insetto, che contiene un acido nucleico, un snRNA modificato o un vettore secondo l'invenzione. Un acido nucleico, un snRNA modificato o un vettore dell'invenzione possono essere introdotti in una cellula ospite idonea con qualsiasi tecnica di trasformazione o di trasfezione appropriata.

Preferibilmente, la cellula ospite permetterà l'espressione dell'snRNA modificato. Perciò, la cellula ospite può essere, ad esempio, una cellula batterica, di lievito, di insetto o di mammifero.

Qualunque cellula di insetto che consenta la replicazione di un vettore parvovirale ricombinante (rAAV) e che possa essere mantenuta in coltura può essere utilizzata conformemente alla presente invenzione. Ad esempio, la linea cellulare utilizzata può derivare da Spodoptera frugiperda, da linee cellulari di drosophila, o da linee cellulari di zanzara, ad es. le linee cellulari derivate da Aedes albopictus. Le cellule o le linee cellulari di insetto preferite sono cellule derivate da specie di insetti che sono sensibili all'infezione di baculovirus, tra cui ad esempio Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf9, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, Ha2302, Hz2E5, High Five (Invitrogen, CA, USA) e expresSF+<®>(US 6.103.526; Protein Sciences Corp., CT, USA).

Le cellule di mammifero idonee da utilizzare nell'invenzione possono essere di origine umana o non umana.

In aggiunta, l'invenzione fornisce un metodo per la preparazione di un vettore parvovirale di somministrazione genica il quale metodo comprende le fasi di:

(a) fornire una cellula di insetto che contiene uno o più costrutti di acido nucleico contenenti:

(i) un acido nucleico dell'invenzione che à ̈ fiancheggiato da almeno una sequenza nucleotidica ripetuta terminale invertita parvovirale;

(ii) una prima cassetta di espressione contenente una sequenza nucleotidica che codifica una o più proteine Rep parvovirali e che à ̈ legata operativamente ad un primo promotore in grado di condurre l'espressione della/e proteina/e Rep nella cellula di insetto;

(iii) una seconda cassetta di espressione contenente una sequenza nucleotidica che codifica una o più proteine del capside parvovirale e che à ̈ legata operativamente ad un secondo promotore in grado di condurre l'espressione della/e proteina/e del capside nella cellula di insetto;

(b) coltivare la cellula di insetto definita in (a) in condizioni che conducono all'espressione delle proteine Rep e del capside; e opzionalmente, (c) recuperare il vettore parvovirale di somministrazione genica.

In generale, dunque, il metodo dell'invenzione consente la produzione di un vettore parvovirale di somministrazione genica (contenente un acido nucleico dell'invenzione) in una cellula di insetto. Preferibilmente, il metodo comprende le fasi di: (a) coltivare una cellula di insetto come sopra definito in condizioni tali che venga prodotto il vettore parvovirale (ad es. AAV); e, (b) recuperare il vettore parvovirale ricombinante (ad es. AAV).

Resta inteso qui che il vettore (AAV) prodotto in un tale metodo à ̈ preferibilmente un virione infettivo parvovirale o di AAV che contiene un genoma parvovirale, il quale contiene un acido nucleico dell'invenzione. Le condizioni di crescita delle cellule di insetto in coltura e la produzione dei prodotti eterologhi nelle cellule di insetto in coltura sono ben note nell'arte e descritte ad es. nei riferimenti sopra citati relativi all'ingegneria molecolare delle cellule di insetti.

In un metodo dell'invenzione, viene fornito un acido nucleico dell'invenzione che à ̈ fiancheggiato da almeno una sequenza ITR parvovirale. Questo tipo di sequenza à ̈ descritta sopra in dettaglio. Preferibilmente, l'acido nucleico dell'invenzione à ̈ la sequenza che si trova tra due sequenze ITR parvovirali.

La prima cassetta di espressione contiene una sequenza nucleotidica che codifica una o più proteine Rep parvovirali che à ̈ legata operativamente ad un primo promotore che à ̈ in grado di condurre l'espressione della/e proteina/e Rep nella cellula di insetto.

Una sequenza nucleotidica che codifica le proteine Rep dei parvovirus animali, à ̈ qui intesa come una sequenza nucleotidica che codifica le proteine Rep non strutturali che sono necessarie e sufficienti per la produzione del vettore parvovirale nelle cellule di insetto quali le proteine Rep78 e Rep52, o le proteine Rep68 e Rep40, oppure la combinazione di due o più di queste.

La sequenza nucleotidica del parvovirus animale deriva preferibilmente da un dependovirus, più preferibilmente da un virus adeno-associato (AAV) umano o di scimmia e più preferibilmente da un AAV che normalmente infetta l'uomo (ad es. i sierotipi 1, 2, 3A, 3B, 4, 5 e 6) o i primati (ad es. i sierotipi 1 e 4). Le sequenze che codificano Rep sono ben note a coloro con esperienza nell'arte e le sequenze idonee sono riportate e descritte in dettaglio in WO2007/148971 e anche in WO2009/014445.

Preferibilmente, la sequenza nucleotidica codifica le proteine Rep dei parvovirus animali che sono necessarie e sufficienti per la produzione del vettore parvovirale nelle cellule di insetto.

La seconda cassetta di espressione contiene una sequenza nucleotidica che codifica una o più proteine del capside parvovirale che à ̈ legata operativamente ad un promotore che à ̈ in grado di condurre l'espressione della/e proteina/e del capside nella cellula di insetto. La/e proteina/e del capside espressa/e può/possono essere una o più di quelle sopra descritte.

Preferibilmente, la sequenza nucleotidica codifica le proteine cap dei parvovirus animali che sono necessarie e sufficienti per la produzione del vettore parvovirale nelle cellule di insetto.

Queste tre sequenze (genoma, codificante rep e codificante cap) vengono fornite in una cellula di insetto mediante uno o più costrutti di acido nucleico, ad esempio uno, due o tre costrutti di acido nucleico. Preferibilmente dunque, uno o i costrutti di acido nucleico per il genoma del vettore e l'espressione delle proteine parvovirali Rep e cap nelle cellule di insetto à ̈ un vettore compatibile con le cellule di insetto. Con "vettore compatibile con le cellule di insetto" o "vettore" si intende una molecola di acido nucleico in grado di compiere una trasformazione o trasfezione fruttuosa di un insetto o di una cellula di insetto. I vettori biologici esemplari includono plasmidi, molecole di acido nucleico lineari e virus ricombinanti. Qualunque vettore può essere impiegato purché sia compatibile con la cellula di insetto. Il vettore può integrarsi nel genoma delle cellule di insetto, ma non à ̈ necessario che la presenza del vettore nelle cellule di insetto sia permanente e sono anche inclusi i vettori episomici transienti. I vettori possono essere introdotti con qualsiasi mezzo noto, ad esempio mediante trattamento chimico delle cellule, elettroporazione o infezione. In una forma di realizzazione preferita, il vettore à ̈ un baculovirus, un vettore virale o un plasmide. In una forma di realizzazione maggiormente preferita, il vettore à ̈ un baculovirus, cioà ̈ il costrutto à ̈ un vettore baculovirale. I vettori baculovirali e i metodi per il loro utilizzo sono ben noti a coloro con esperienza nell'arte.

Tipicamente quindi, un metodo dell'invenzione per produrre un vettore parvovirale di somministrazione genica comprende: fornire a una cellula che permette la replicazione del parvovirus (a) una sequenza nucleotidica che codifica uno stampo per la produzione del genoma del vettore dell'invenzione (come descritto in dettaglio nella presente), (b) le sequenze nucleotidiche sufficienti alla replicazione dello stampo per produrre un genoma del vettore (la prima cassetta di espressione sopra definita); (c) le sequenze nucleotidiche sufficienti all'impacchettamento del genoma del vettore in un capside di parvovirus (la seconda cassetta di espressione sopra definita), in condizioni sufficienti alla replicazione e all'impacchettamento del genoma del vettore nel capside del parvovirus, per cui le particelle di parvovirus che contengono il genoma del vettore incapsidato dentro il capside del parvovirus vengono prodotte nella cellula. Preferibilmente, la replicazione del parvovirus e/o le sequenze che codificano il capside sono sequenze di AAV.

Un metodo dell'invenzione può preferibilmente comprendere la fase di purificazione per affinità del (virione che contiene il) vettore parvovirale ricombinante (rAAV) utilizzando un anticorpo anti-AAV, preferibilmente un anticorpo immobilizzato. L'anticorpo anti-AAV à ̈ preferibilmente un anticorpo monoclonale. Un anticorpo particolarmente adatto à ̈ un anticorpo a singola catena di cammello o un suo frammento come ad es. ottenibile da cammelli o lama (vedere ad es. Muyldermans, 2001, Biotechnol.

74: 277-302). L'anticorpo della purificazione per affinità di rAAV à ̈ preferibilmente un anticorpo che si lega specificamente a un epitopo su una proteina del capside di AAV, per cui preferibilmente l'epitopo à ̈ un epitopo che à ̈ presente sulla proteina del capside di più di un sierotipo di AAV. Ad es., l'anticorpo può essere prodotto o selezionato sulla base del legame specifico al capside di AAV2 ma al tempo stesso può anche legarsi specificatamente ai capsidi di AAV1, AAV3, AAV5, AAV6 o AAV8.

L'invenzione fornisce anche un mezzo per somministrare un acido nucleico dell'invenzione in una vasta gamma di cellule, incluse le cellule che si dividono e che non si dividono. La presente invenzione può essere impiegata per somministrare un acido nucleico dell'invenzione ad una cellula in vitro, ad es. per produrre un snRNA modificato in vitro o per la terapia genica ex vivo.

Le cellule, le formulazioni farmaceutiche e i metodi della presente invenzione sono inoltre utili in un metodo di somministrazione di un acido nucleico dell'invenzione in un ospite che ne necessita, cioà ̈ un acido nucleico che codifica un snRNA modificato per indurre così l'esclusione dell'esone. In questo modo, una versione funzionale di un polipeptide bersaglio può quindi essere prodotta in vivo nel soggetto.

La presente invenzione trova impiego sia in veterinaria che nelle applicazioni mediche. I soggetti idonei per i metodi di somministrazione genica come descritto nella presente includono sia aviari che mammiferi, con preferenza per i mammiferi. Il termine "aviario" come utilizzato nella presente include, ma non à ̈ limitato a, polli, anatre, oche, quaglie, tacchini e fagiani. Il termine "mammifero"come utilizzato nella presente include, ma non à ̈ limitato a, gli esseri umani, bovini, ovini, caprini, equini, felini, canini, lagomorfi, ecc. I soggetti umani sono quelli maggiormente preferiti. I soggetti umani includono neonati, bambini, giovani e adulti.

L'invenzione perciò fornisce una composizione farmaceutica che contiene un acido nucleico, un snRNA modificato o un vettore dell'invenzione e un veicolante o diluente accettabile farmaceuticamente e/o un'altra sostanza medicinale, agente farmaceutico o adiuvante, ecc.

Per l'iniezione, il veicolante sarà tipicamente un liquido. Per gli altri metodi di somministrazione, il veicolante può essere solido o liquido. Per la somministrazione per inalazione, il veicolante sarà respirabile, e sarà preferibilmente sotto forma di particolato solido o liquido. Quale mezzo di iniezione, à ̈ preferibile utilizzare l'acqua che contiene gli additivi consueti per le soluzioni da iniezione, come gli agenti stabilizzanti, i sali o la soluzione salina e/o i tamponi.

In generale, un "vettore farmaceuticamente accettabile" à ̈ quello che non à ̈ tossico o eccessivamente dannoso per le cellule. I vettori farmaceuticamente accettabili esemplari includono l'acqua sterile, apirogena e la soluzione salina tamponata con fosfato sterile, apirogena. I veicolanti farmaceuticamente accettabili includono i veicolanti fisiologicamente accettabili. Il termine "veicolante farmaceuticamente accettabile" include tutti i solventi, i mezzi di dispersione, i rivestimenti, gli agenti antibatterici e antifungini, gli agenti isotonici e ritardanti l'assorbimento, e simili, che sono fisiologicamente compatibili.

Con "farmaceuticamente accettabile" si intende un materiale che non à ̈ biologicamente o diversamente indesiderato, cioà ̈ il materiale può essere somministrato a un soggetto senza causare effetti biologici indesiderati. Perciò, ad esempio una composizione farmaceutica può essere utilizzata nella trasfezione di una cellula ex vivo o nella somministrazione di una particella virale o di una cellula direttamente in un soggetto.

Un veicolante può essere adatto per la somministrazione parenterale, che include la somministrazione endovenosa, intraperitoneale o intramuscolare. In alternativa, il veicolante può essere adatto per la somministrazione sublinguale o orale. I veicolanti farmaceuticamente accettabili includono le soluzioni acquose o le dispersioni sterili e le polveri sterili per la preparazione estemporanea di soluzioni o dispersioni sterili iniettabili. L'uso di tali mezzi e agenti per le sostanze farmaceuticamente attive à ̈ ben noto nell'arte. Ad eccezione di quando un qualunque mezzo o agente convenzionale sia incompatibile con il principio attivo, il suo utilizzo viene contemplato nelle composizioni farmaceutiche dell'invenzione.

Le composizioni farmaceutiche sono tipicamente sterili e stabili nelle condizioni di produzione e di stoccaggio. Le composizioni farmaceutiche possono essere formulate come soluzione, microemulsione, liposoma o altra struttura ordinata adatta ad accogliere un'alta concentrazione di farmaco. Il veicolante può essere un solvente o un mezzo di dispersione contenente, ad esempio, acqua, etanolo, poliolo (ad esempio, glicerolo, glicole propilenico e glicole polietilenico liquido, e simili) e le loro miscele idonee. La fluidità appropriata può essere mantenuta, ad esempio, con l'utilizzo di un rivestimento quale la lecitina, con il mantenimento della grandezza richiesta delle particelle nel caso della dispersione e con l'utilizzo dei surfactanti. In molti casi, sarà preferibile includere nella composizione gli agenti isotonici, ad esempio, zuccheri, polialcoli quali mannitolo, sorbitolo, o cloruro di sodio. L'assorbimento prolungato delle composizioni iniettabili può essere provocato dall'inclusione nella composizione di un agente che ritarda l'assorbimento, ad esempio, sali monostearati e gelatina. Un acido nucleico, un snRNA o un vettore dell'invenzione può essere somministrato in una formulazione a tempo o a rilascio controllato, ad esempio in una composizione che include un polimero a rilascio lento o altri veicolanti che proteggeranno il composto dal rilascio rapido, compresi gli impianti e i sistemi di somministrazione microincapsulati. Si possono anche utilizzare i polimeri biodegradabili, biocompatibili, quali il vinilacetato di etilene, le polianidridi, l'acido poliglicolico, il collagene, i poliortoesteri, l'acido polilattico e i copolimeri polilattici, poliglicolici (PLG).

Il vettore parvovirale dell'invenzione, ad esempio AAV, può essere utile nel trasferimento di materiale genetico in una cellula. Tale trasferimento può aver luogo in vitro, ex vivo o in vivo.

Pertanto, l'invenzione comprende un metodo per la somministrazione di una sequenza nucleotidica in una cellula, il quale metodo comprende la messa a contatto di una composizione o di una composizione farmaceutica, come descritto nella presente, in condizioni tali che l'acido nucleico, l'snRNA o il vettore dell'invenzione entri nella cellula.

L'invenzione fornisce anche un metodo per somministrare una sequenza nucleotidica ad un soggetto, il quale metodo comprende la somministrazione al detto soggetto di una composizione o di una composizione farmaceutica come descritto nella presente. In particolare, la presente invenzione fornisce un metodo di somministrazione di un acido nucleico dell'invenzione ad un soggetto, che comprende la somministrazione al oggetto di un vettore parvovirale per la terapia genica secondo l'invenzione insieme ad un veicolante farmaceuticamente accettabile. Preferibilmente, il vettore parvovirale per la terapia genica viene somministrato in quantità terapeuticamente efficace a un soggetto che ne necessita.

L'invenzione fornisce anche un acido nucleico, un snRNA modificato o un vettore dell'invenzione da utilizzare a scopo terapeutico nel trattamento dell'organismo umano o animale. In particolare, viene fornito un acido nucleico, un snRNA modificato o un vettore dell'invenzione da utilizzare nel trattamento di una distrofia muscolare, in particolare la distrofia muscolare di Duchenne. Viene fornito un acido nucleico, un snRNA modificato o un vettore dell'invenzione da utilizzare per migliorare uno o più sintomi della distrofia muscolare, in particolare la distrofia muscolare di Duchenne, ad esempio aumentando la formazione delle fibre di distrofina.

L'invenzione fornisce inoltre un metodo per l'esclusione dell'esone in un soggetto, il quale metodo comprende la fase di somministrazione di una quantità efficace di un acido nucleico, un snRNA modificato o un vettore dell'invenzione ad un soggetto.

L'invenzione fornisce inoltre un metodo di trattamento di una distrofia muscolare, in particolare la distrofia muscolare di Duchenne, il quale metodo comprende la fase di somministrazione di una quantità efficace di un acido nucleico, un snRNA modificato o un vettore dell'invenzione ad un soggetto che ne necessita.

Pertanto, l'invenzione fornisce inoltre l'utilizzo di un acido nucleico, un snRNA o un vettore, come descritto nella presente per la fabbricazione di un medicamento da utilizzare nella somministrazione di nucleotidi ad un soggetto o per indurre l'esclusione di un esone in un soggetto. Inoltre, l'invenzione fornisce un acido nucleico, un snRNA o un vettore, come descritto nella presente per la fabbricazione di un medicamento da utilizzare nel trattamento di una distrofia muscolare, in particolare da utilizzare nel trattamento della distrofia muscolare di Duchenne.

Tipicamente, un acido nucleico, un snRNA o un vettore dell'invenzione può essere somministrato ad un soggetto con la terapia genica, in particolare mediante l'utilizzo di un vettore parvovirale per la terapia genica quale AAV. I metodi generali per la terapia genica sono noti nell'arte. Il vettore, la composizione o la composizione farmaceutica possono essere somministrati ad una cellula in vitro o ex vivo o ad un soggetto in vivo con qualsiasi metodo idoneo conosciuto nell'arte. In alternativa, il vettore può essere somministrato ad una cellula ex vivo, e la cellula somministrata ad un soggetto, come noto nell'arte. In generale, la presente invenzione può essere impiegata per somministrare qualunque acido nucleico dell'invenzione ad una cellula in vitro, ex vivo o in vivo.

La presente invenzione fornisce inoltre un metodo per somministrare un acido nucleico ad una cellula. Tipicamente, per i metodi in vitro, il virus può essere introdotto nella cellula mediante i normali metodi di trasduzione virale, che sono noti nell'arte.

Preferibilmente, le particelle del virus vengono aggiunte alle cellule con una molteplicità di infezione appropriata in base ai metodi di trasduzione standard appropriati per le specifiche cellule bersaglio. I titoli di virus da somministrare possono variare, a seconda del tipo di cellula bersaglio e del particolare vettore virale, e possono essere determinati da coloro con esperienza nell'arte senza una sperimentazione eccessiva.

Le cellule possono essere rimosse da un soggetto, il vettore di parvovirus viene introdotto in queste, e le cellule vengono poi riposte nel soggetto. I metodi di prelievo delle cellule da un soggetto per il trattamento ex vivo, seguito dalla reintroduzione nel soggetto, sono noti nell'arte. In alternativa, un vettore di AAV può essere introdotto nelle cellule di un altro soggetto, in cellule in coltura, o in cellule di qualsiasi altra origine idonea, e le cellule vengono somministrate ad un soggetto che ne necessita.

Un ulteriore aspetto dell’invenzione à ̈ un metodo di trattamento di soggetti in vivo con un acido nucleico, un snRNA o un vettore dell'invenzione. La somministrazione di un acido nucleico, di un snRNA o di un vettore della presente invenzione a un soggetto umano o a un animale che ne necessita può avvenire con qualsiasi mezzo noto nell'arte per somministrare i vettori virali.

Un acido nucleico, un snRNA o un vettore dell'invenzione sarà tipicamente incluso in una composizione farmaceutica come esposto in precedenza. Tali composizioni comprendono l'acido nucleico, l'snRNA o il vettore in una quantità efficace, sufficiente a fornire un effetto terapeutico o profilattico desiderato, e un veicolante o eccipiente farmaceuticamente accettabile. Una "quantità efficace" include una quantità terapeuticamente efficace o una quantità profilatticamente efficace.

Una "quantità terapeuticamente efficace" si riferisce ad una quantità efficace, ai dosaggi e ai periodi di tempo necessari ad ottenere il risultato terapeutico desiderato, quale l'esclusione dell'esone (in modo da indurre la produzione della proteina ad un livello sufficiente a migliorare i sintomi della malattia associata alla mancanza di tale proteina).

Una quantità terapeuticamente efficace di un acido nucleico, di un snRNA o di un vettore dell'invenzione può variare in base a fattori quali lo stadio della malattia, l'età, il sesso e il peso dell'individuo e alla capacità dell'acido nucleico, dell'snRNA o del vettore di evocare la risposta desiderata nell'individuo. I regimi di dosaggio possono essere aggiustati per fornire una risposta terapeutica ottimale. Una quantità terapeuticamente efficace à ̈ anche tipicamente quella in cui qualunque effetto tossico o dannoso dell'acido nucleico, dell'snRNA o del vettore viene controbilanciato dagli effetti benefici terapeutici.

I vettori virali per la terapia genica possono essere somministrati ad una cellula o ad un ospite in una quantità biologicamente efficace. Una "quantità biologicamente efficace" del vettore virale à ̈ una quantità che à ̈ sufficiente a determinare l'infezione (o trasduzione) e l'espressione della sequenza di acido nucleico eterologa nella cellula. Se il virus viene somministrato ad una cellula in vivo (ad es. il virus viene somministrato ad un soggetto), una quantità "biologicamente efficace" del vettore virale à ̈ una quantità sufficiente a determinare la trasduzione e l'espressione di un acido nucleico secondo l'invenzione in una cellula bersaglio.

Per un acido nucleico, un snRNA o un vettore dell'invenzione, quale un vettore per la terapia genica, la dose da somministrare può dipendere in larga misura dalle condizioni e dimensioni del soggetto da trattare così come dalla formulazione terapeutica, dalla frequenza di trattamento e dalla via di somministrazione. I regimi per la terapia continuativa, inclusi il dosaggio, la formulazione e la frequenza, possono essere guidati dalla risposta iniziale e dal giudizio clinico. Può essere preferita la via parenterale di iniezione nello spazio interstiziale del tessuto, anche se altre via parenterali, quale l'inalazione di una formulazione aerosol, possono essere richieste per la specifica somministrazione. In alcuni protocolli, una formulazione che comprende il gene e il sistema di somministrazione del gene in un veicolante acquoso viene iniettata nel tessuto in quantità appropriate.

Le modalità di somministrazione esemplari includono la somministrazione orale, rettale, transmucosa, topica, transdermica, inalazione, parenterale (ad es. endovenosa, sottocutanea, intradermica, intramuscolare e intra-articolare) e simili, così come l'iniezione diretta nel tessuto o organo, o in alternativa l'iniezione intratecale, intramuscolare diretta, intraventricolare, endovenosa, intraperitoneale, intranasale o intraoculare. Gli iniettabili possono essere preparati nelle forme convenzionali, sia come soluzioni liquide che sospensioni, forme solide idonee alla soluzione o sospensione nel liquido prima dell'iniezione, oppure come emulsioni. In alternativa si può somministrare il virus con modalità locale piuttosto che sistemica, ad esempio come deposito o formulazione a rilascio sostenuto.

Il tipo di tessuto/cellula in cui somministrare un acido nucleico, un snRNA o un vettore dell'invenzione può essere di qualsiasi tipo, comprese, ma non limitato a, le cellule neurali (comprese le cellule del sistema nervoso centrale e periferico, in particolare, le cellule cerebrali), cellule polmonari, cellule della retina, cellule epiteliali (ad es. vascolari, intestinali e cellule epiteliali delle vie respiratorie), cellule muscolari, quali del muscolo scheletrico o del muscolo cardiaco, cellule dendritiche, cellule pancreatiche (comprese le cellule insulari), cellule epatiche, cellule renali, cellule miocardiche, cellule ossee (ad es. cellule staminali del midollo osseo), cellule staminali ematopoietiche, cellule spleniche, cheratinociti, fibroblasti, cellule endoteliali, cellule della prostata, depositi adiposi, cellule germinali e simili. In alternativa, la cellula può essere qualunque cellula progenitrice. Come ulteriore alternativa, la cellula può essere una cellula staminale (ad es. cellule staminali neurali, cellule staminali epatiche). Il tessuto bersaglio può essere specifico o può essere una combinazione di diversi tessuti, ad esempio il tessuto muscolare ed epatico.

Nel caso di un vettore per la terapia genica, il range di dose efficace per piccoli animali (topi), a seguito dell'iniezione intramuscolare, può essere compreso tra circa 1x10<11>e circa 1x10<12>copie del genoma (gc)/kg, e per gli animali più grandi (gatti) e, eventualmente, soggetti umani, tra circa 1x10<10>e circa 1x10<13>gc/kg. I dosaggi del vettore parvovirale per la terapia genica dell'invenzione dipenderanno dalla modalità di somministrazione, dalla malattia o condizione da trattare, dalla condizione del singolo soggetto, dal particolare vettore virale, e dal gene da somministrare, e possono essere determinati in una maniera di routine. Tipicamente, può essere appropriata una quantità compresa tra circa 10<3>e circa 10<16>particelle virali per dose.

La quantità di principio attivo nelle composizioni dell'invenzione può variare in base a fattori come lo stadio della malattia, l'età, il sesso e il peso dell'individuo. I regimi di dosaggio possono essere aggiustati per fornire una risposta terapeutica ottimale. Ad esempio, può essere somministrato un singolo bolo, possono essere somministrate molte dosi separate nel tempo oppure la dose può essere proporzionalmente ridotta o aumentata, come indicato dalle esigenze della situazione terapeutica.

Può essere vantaggioso formulare le composizioni parenterali nella forma di dosi unitarie per la facilità di somministrazione e l'uniformità di dosaggio. "Forma di dose unitaria" come usato nella presente si riferisce a unità fisicamente distinte adatte a dosaggi unitari per il soggetto da trattare; ciascuna unità contiene una quantità predeterminata del principio attivo calcolata per produrre l'effetto terapeutico desiderato insieme al veicolante farmaceutico richiesto. Le specifiche delle forme di dosaggio unitario dell'invenzione possono essere dettate dalle singole caratteristiche del principio attivo e dal particolare effetto terapeutico da ottenere, e dalle limitazioni inerenti nell'arte della composizione di un tale principio attivo per il trattamento di una condizione negli individui.

Molti metodi per la preparazione di tali formulazioni sono brevettati o generalmente noti a coloro con esperienza nell'arte.

Le pubblicazioni, le domande di brevetto, i brevetti, e gli altri riferimenti citati nella presente sono incorporati per riferimento nella loro interezza.

Se non diversamente specificato, tutti i termini tecnici e scientifici utilizzati nella presente hanno lo stesso significato di quelli comunemente compresi da ciascuno con esperienza ordinaria nell'arte alla quale appartiene questa invenzione. La terminologia utilizzata nella descrizione dell'invenzione nella presente ha il solo scopo di descrivere le particolari forme di realizzazione e non à ̈ destinata ad essere limitante per l'invenzione.

In questo documento e nelle sue rivendicazioni, il verbo "contenere" e le sue coniugazioni viene utilizzato in senso non limitativo ad indicare che sono inclusi gli elementi che seguono la parola, ma che non sono esclusi gli elementi non citati espressamente. Inoltre, il riferimento a un elemento con l'articolo indeterminativo "un/uno" o "una" non esclude la possibilità che sia presente più di un elemento, a meno che il contesto non richieda chiaramente che ci sia uno e solo uno degli elementi. L'articolo indeterminativo "un/uno" o "una" di solito significa quindi "almeno uno".

Tutti i brevetti ed i riferimenti alla letteratura citata nella presente specifica sono incorporati per riferimento nella loro interezza.

I seguenti esempi illustrano l'invenzione:

Esempi

Esempio 1

MATERIALI E METODI

Costruzione dei cloni antisenso

U1#51 5’3’: il primo clone era un derivato di PCR dal precedentemente descritto U1-5’ [De Angelis et al. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99: 9456-9461] e la doppia cassetta antisenso à ̈ stata inserita nella cassetta U1 già utilizzata per U1#23. I cloni U1#51 sono stati ottenuti mediante PCR inversa sul costrutto pRRL-5'3'.

U1#51 ESE A:

U1#51AON1R

(5’AGAAATGCCATCTTCCTTGAATGAGATCTTGGGCCTCTGC-3’);

U1F2 (5’-GGCAGGGGAGATACCATGATC- 3’).

U1#51ESEA*:

U1#51ESEA*F

(5’-AGATGGCATTTCTAGGGCAGGGGAGATACCATGATC-3’);

U1#51ESEA*R

(5’-TCCTTGATGTTGGAGATGAGATCTTGGGCCTCTGC-3’)

U1#51ESEA+B:

U1#51AON1F

(5’ TCAAGGAAGATGGCATTTCTGGCAGGGGAGATACCATGATC-3') U1#51AON2R

(5’-ATCAAGTTATAAAATCACAGAGGATGAGATCTTGGGCCTCTGC-3’).

U1#513’ESEA:

U1#51-3’F

(5’-GTCTGAGTAGGAGCTAAAATATTTTGGGGGCAGGGGAGATACCATGATC-3’);

U1#51 AON1R

(5’-AGAAATGCCATCTTCCTTGAATGAGATCTTGGGCCTCTGC-3’) U1#515’ESEB:

U1#51ESEBF

(5’-CCTCTGTGATTTTATAACTTGATGGCAGGGGAGATACCATGATC-3’);

U1#515R

(5’-ATCAAGCAGAAGGTATGAGAAAAAATGAGATCTTGGGCCTCTGC-3’) U1#515’3’Esx:

U1#515’3’sxF

(5’-TCAAGGAAGATGGGTCTGAGTAGGAGCTGGCAGGGGAGATACCATGATC-3’);

U1#515’3’sxR

(5’-TGTTGGAGCATCAAGCAGAAGGTATGAGATGAGATCTTGGGCCTCTGC-3’) I frammenti di PCR sono stati digeriti con NheI e inseriti nella struttura lentivirale pRRLSIN.cPPT.PGK/GFP.WPRE digerita con NheI [Bonci et al. (2003) Gene Ther 10: 630-6]. Il clone pCCL-MyoD/5'3'esx à ̈ stata ricavato dal pRRL-5'3'ESX con una reazione di digestione utilizzando le endonucleasi SalI e ScaI, e clonando il risultante inserto escisso nel pCCL-MyoD (fornito da Maurizia Caruso) digerito con SalI-ScaI.

Colture cellulari

Le colture di mioblasti primari sono state dapprima pre-piastrate al fine di separare i fibroblasti dalla linea primaria, seminate in Human Skeletal Muscle Growth Medium (PromoCell, Heidelberg, Germania) e fatte crescere in un incubatore umidificato, in 5% di CO2e 37 ºC.

Le colture di fibroblasti primari sono state stabilite dalla crescita esterna alle biopsie di pelle umana sia DMD che sana in RPMI con il 15% di siero fetale di vitello, 1% di penicillina–streptomicina e 1% di glutammina (GIBCO/BRL Life Technologies, Grand Island, NY, USA). I fibroblasti sono stati poi mantenuti come sopra descritto.

Preparazione del virus e trasduzione cellulare

Le cellule 293T sono state piastrate su piastre di 25 cm di diametro (3 piastre per virus) e co-trasfettate con i costrutti lentivirali e i plasmidi da impacchettamento Plp1, Plp2 e PlpV/SVG (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), secondo il metodo di trasfezione transiente a quattro plasmidi descritto in precedenza [Bonci et al. (2003) Gene Ther 10: 630-6].

Il sovranatante à ̈ stato raccolto per i successivi due giorni dopo la trasfezione e poi centrifugato in una ultracentrifuga Beckmann a 20.000 G per due ore. I pellet sono stati risospesi nel tampone HBSS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

L'efficienza di trasduzione à ̈ stata testata infettando le cellule HeLa: le cellule sono state poi raccolte per l'estrazione dell'RNA e delle proteine, al fine di testare rispettivamente l'espressione dell'antisenso e della GFP.

Il giorno prima della trasduzione, i mioblasti o i fibroblasti sono stati seminati in Growth Medium, su piastre di 60 mm di diametro (almeno due per ciascun virus diverso) ad una densità di 5 x 10<5>cellule per piastra.

Nei successivi due giorni sono stati infettati per due volte con i lentivirus e polibrene (4 mg/ml).

Il secondo giorno dall'ultima infezione, le cellule sono state indotte a differenziarsi con Human Skeletal Muscle Differentiation Medium (PromoCell, Heidelberg, Germania). Dopo 7 giorni (per i mioblasti) o 9 e 13 giorni (per i fibroblasti) di differenziamento, le cellule sono state lavate due volte con il tampone PBS completo (PromoCell, Heidelberg, Germania) e raccolte con l'ausilio di una spatola di gomma con 300 microlitri di tampone per le proteine (Tris-HCl 100 mM pH 7.4, EDTA 1 mM, 2% SDS, 1x Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail (Roche)) per l'estrazione delle proteine, o con 1 ml di TRIZOL Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) per l'estrazione dell'RNA.

Estrazione e analisi delle proteine

Le proteine sono state estratte dalle piastre delle cellule con Tris-HCl 100 mM (pH 7.4), EDTA 1 mM, 2% dodecilsolfato di sodio (SDS) e un cocktail inibitore delle proteasi (Roche Applied Science, Mannheim, Germania). I campioni sono stati messi su un agitatore rotante a 4 °C per 30 minuti, centrifugati a 13.200 giri/min per 20 minuti a 4 ºC ed à ̈ stato raccolto il sovranatante contenente gli estratti proteici. La concentrazione à ̈ stata valutata con il BCA assay (PIERCE, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) secondo le istruzioni del produttore.

Western blot

50 microgrammi di estratti proteici (per la distrofina e la tubulina) sono stati caricati su un NuPAGE Tris-Acetate Minigel al 3-8% di 1 mm (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA); 15 microgrammi (per la GFP e la MyoD) sono stati fatti correre su un NuPAGE Bis-Tris minigel al 10% di 1 mm (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

La corsa e il blotting sono stati eseguiti in un SureLock XCellâ„¢ Minicell (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), secondo le istruzioni del fabbricante e le proteine sono state trasferite ad una membrana di nitrocellulosa da trasferimento (Protran; Schleicher & Schuell BioScience, Keene, NH, USA).

Le membrane sono state bloccate con il 10% di latte magro in polvere (Difcoâ„¢Skim Milk, Becton & Dickinson, Le Pont de Claix, Francia), incubate per 1 h con l'anticorpo primario (per la distrofina: NCL-DYS1 (Novocastra, Newcastle upon Tyne, UK) diluito 1:40 in 3% di latte; per la tubulina: AA12 anti-tubulina (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA) diluito 1:200 in TBST; per la GFP: ab290 anti-GFP (AbCAM, Cambridge, UK) diluito 1:2500 in TBST; per la MyoD: 5.8 A anti-MyoD (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA), diluito 1:500 in 2% di latte), lavate in (TBST) soluzione salina tamponata con Tris e Tween 20 (Sigma Aldrich®, St. Louis, MO, USA) e incubate con l'anticorpo secondario IgG di capra anti-topo (H+L) coniugato con la perossidasi di ravanello (HRP) (diluito 1:5000 in 3% di latte) per la distrofina, la tubulina e la MyoD, oppure con ImmunoPure®Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugated (PIERCE, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) per la GFP per 1 ora. La rilevazione delle proteine à ̈ stata effettuata con il substrato chemiluminescente SuperSignal (PIERCE, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA).

Preparazione e analisi dell'RNA

Le cellule sono state raccolte con 1 ml di Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e l'RNA à ̈ stato estratto secondo le istruzioni del fabbricante; la concentrazione à ̈ stata valutata con lo spettrofotometro NanoDrop ND-1000 (CELBIO, Italia).

RT-PCR

L'mRNA della distrofina à ̈ stato analizzato mediante RT-PCR su 200 ng di RNA totale con gli oligo E46F (5’-GCTAGAAGAACAAAAGAATAT-3’) per la delezione 48-50 o l'oligo E43F (5’-CTACAACAAAGCTCAGGTCG-3’) per la delezione 45-50 e E54R (5’-CTTTTATGAATGCTTCTCCAAG- 3’), per 40 cicli con Access RT-PCR system (Promega, Madison, WI, USA). Sono stati poi utilizzati quattro microlitri dei prodotti della RT-PCR come stampo per la reazione nested eseguita con l'oligo E47F (5’-TTACTGGTGGAAGAGTTGCC-3’) e E52Ro (5’-TTCGATCCGTAATGATTGTTCTAGCC-3’) per 30 cicli.

10 microlitri delle reazioni sono stati fatti correre su agarosio al 2% con bromuro di etidio e i segnali sono stati rilevati con un transilluminatore a UV.

Northern blot

L'analisi in northern à ̈ stata eseguita come già descritto [Rivera et al. (2005) Blood 105: 1424-30]. Brevemente, 10 microgrammi di RNA totale sono stati caricati in un gel di poliacrilammide al 6%, fatti correre a 17 mA e trasferiti in una membrana di nitrocellulosa Hybondâ„¢ - N<+>(Amersham, GE Healthcare Life sciences, Buckinghamshire, UK ) per 16 h a 10 volt e 4 ºC. Le membrane sono state ibridate con la sonda α-U1 (5’-CAGGGGAAAGCGCGAACGCAGTCCCCCA-3’) e rilevate con l'utilizzo di Typhoon TRIO Variable Mode Imager system (Amersham, GE Healthcare Life sciences, Buckinghamshire, UK), con il programma ImageQuant TL.I.

Costruzione di pLuc-ex51

L'inserto ex51 Ã ̈ stato ottenuto mediante PCR del DNA genomico utilizzando gli oligo:

5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGAGAATGAGCAAAATCGT-3’ e

5’-CCTTAATTAAGAGACAACTATTCTTGTAAG-3’.

I siti di restrizione NotI e PacI sono sottolineati.

Ex51 Ã ̈ composto dall'esone 51 intero fiancheggiato da 268 pb dell'introne 50 e 263 pb dell'introne 51. I frammenti di PCR sono stati digeriti con gli enzimi NotI e PacI e inseriti nel vettore pcDNA3.1-Luc digerito con NotI e PacI [Bian et al. (2009) Hum Mol Genet 18: 1229-37].

Trasfezioni di C27

I mioblasti C2.7 [Pinset et al. (1988) Differentiation 38: 28-34] sono una linea cellulare miogenica murina derivata dalle cellule C2, isolate dalle cellule satellite attivate murine [Yaffe and Saxel (1977) Nature 270: 725-7]. Le cellule C27 sono state piastrate in piastre con diametro di 35 mm; sono state co-trasfettate con 2 µg di pLuc-ex51, 2 µg del vettore lentivirale che reca la cassetta di espressione dell'antisenso e 50 ng del costrutto che esprime la luciferasi di Renilla, utilizzato come controllo di efficienza della trasfezione. La trasfezione à ̈ stata eseguita secondo il protocollo di Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Le cellule sono state fatte crescere in DMEM con il 10% di FBS per 36 ore.

Saggio della luciferasi

Le cellule C27 sono state raccolte utilizzando 250 µl di Passive Lysis Buffer e il saggio à ̈ stato eseguito secondo il protocollo di Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA).

Progettazione e analisi dell'espressione delle molecole antisenso contro l'esone 51 del gene DMD

L'snRNA U1 à ̈ stato utilizzato come carrier per esprimere le sette diverse molecole antisenso per l'esclusione dell'esone 51. I nucleotidi dalla posizione 3 alla 10 nell'estremità 5' dell'snRNA U1, richiesti per il riconoscimento del sito di splicing in 5', sono stati sostituiti con le sequenze antisenso complementari alle diverse porzioni dell'esone 51 e ai suoi siti di splicing (Fig. 1a). Poiché abbiamo precedentemente osservato che entrambi i siti di splicing devono essere intercettati al fine di indurre una efficiente esclusione dell'esone [De Angelis et al. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99: 9456-9461], i primi costrutti prodotti contenevano le sequenze antisenso contro entrambe le giunzioni di splicing (costrutti 5’3’ - Fig. 1b). Inoltre, poiché à ̈ stato mostrato che gli enhancer esonici per lo splicing (ESE) rappresentano dei substrati bersaglio efficaci per una efficiente esclusione dell'esone [Aartsma-Rus et al. (2005) Oligonucleotides 15: 284-297; Aartsma et al. (2006) Ann N Y Acad Sci 1082: 74-6] abbiamo anche prodotto dei costrutti chimerici contenenti le sequenze antisenso o solo contro gli elementi ESE putativi [Cartegni et al. (2003) Nucleic Acids Res 31: 3568-3571], o in combinazione con le giunzioni di splicing (Fig. 1b).

Le sequenze del promotore forte del gene dell'snRNA U1 dipendente dalla polimerasi II e di terminazione sono state utilizzate per ricavare le cassette di espressione dell'antisenso, che sono state clonate nella porzione dU3 della regione in 3' con sequenze ripetute terminali (LTR) del vettore lentivirale pRRLSIN.cPPT.PGK/GFP.WPRE [Bonci et al. (2003) Gene Ther 10: 630-6] (Fig. 2a). Dal momento che i differenti costrutti ampliano notevolmente la lunghezza dell'snRNA U1 (in alcuni casi fino a 58 nucleotidi), abbiamo prima controllato la loro espressione e stabilità in esperimenti di trasfezione delle HeLa. L'attività di espressione relativa à ̈ stata testata mediante la co-trasfezione con il plasmide U16RBE [Buonomo et al. (1999) RNA 5: 993-1002] e normalizzata per l'snRNA U2 endogeno. L'analisi in northern blot indicava che tutte le molecole chimeriche si accumulavano a livelli piuttosto simili (Fig. 2b). Inoltre, le immunoprecipitazioni degli estratti nucleari con anticorpi anti-U1-70K seguite dalla RT-PCR (Fig.2c), indicavano che gli snRNA U1 chimerici sono ancora in grado di formare le snRNP [Lerner and Steitz (1979) Proc Natl Acad Sci U S A 76: 5495-9].

RISULTATI

Studio dell'attività di esclusione dell'esone nei mioblasti DMD umani

Le particelle lentivirali per ognuno dei costrutti sono state prodotte nelle cellule 293T e utilizzate per infettare i mioblasti DMD (∆48-50) che recano la delezione degli esoni 48-50 (forniti dalla Telethon Neuromuscular Biobank). In questo caso, l'esclusione dell'esone 51 permette il ripristino della fase di lettura corretta e la produzione di una proteina distrofina di 210 aminoacidi più corta rispetto al tipo selvatico. Le cellule ∆48-50 sono state infettate con quantità comparabili dei differenti lentivirus ricombinanti. Dopo l'infezione, sono state indotte a differenziarsi e dopo 7 giorni sono stati raccolti i campioni per l'analisi dell'RNA e delle proteine. L'esclusione dell'esone 51 à ̈ stata valutata mediante RT-PCR nested effettuata su 200 ng di RNA totale (Fig.3a), mentre il western blot à ̈ stata effettuato su 50 µg di proteine totali (Fig. 3b). I livelli di distrofina, misurati in tre esperimenti indipendenti, sono stati normalizzati per il segnale della tubulina; i valori relativi sono riportati nell'istogramma della Fig. 3b. Ad eccezione dei costrutti 5'ESE B e ESE A+B, tutti i campioni hanno rivelato l'attività dell'esclusione e, tra questi, il 5'3' e il 5'3'esx erano i più efficaci. In particolare, l'attività dell'esclusione era veramente molto simile all'efficienza del ripristino della distrofina (Fig. 3b), e i costrutti 5'3' e 5'3'esx mostravano l'attività più alta.

Il confronto tra i costrutti 5'3' e 5'3'esx costrutti à ̈ stato ulteriormente testato utilizzando un saggio reporter per lo splicing basato sulla luciferasi [Bian et al. (2009) Hum Mol Genet 18: 1229-37] in cui la luciferasi viene prodotta solo quando si verifica l'esclusione dell'esone 51 inserito (Fig. 3c, pannello superiore – costrutto pLuc-ex51). I plasmidi che esprimono 5'3' e 5'3'esx sono stati co-trasfettati con il pLuc-ex51 e con il reporter Renilla. I saggi di attività della luciferasi (Fig. 3c, pannello inferiore) indicavano che 5'3'esx induce un livello più alto di esclusione dell'esone rispetto al 5'3', confermando i dati ottenuti nelle cellule DMD. Questi risultati indicavano che la regione bersaglio ESE presente nel costrutto 5'3'esx, svolge un ruolo importante nello splicing dell'esone 51 e che essa à ̈ in grado di migliorare l'efficienza dell'esclusione se combinata alle sequenze antisenso contro le giunzioni di splicing.

Esclusione dell'esone nei fibroblasti DMD transdifferenziati in mioblasti

Al fine di disporre di una procedura semplificata di screening per la verifica dell'attività dei costrutti antisenso sui campioni di pazienti, abbiamo istituito un protocollo per il transdifferenziamento dei fibroblasti in mioblasti. L'infezione dei fibroblasti WT con il lentivirus MyoD (Fig. 4a) produceva un’efficiente conversione in mioblasti e miotubi, come dimostrato dalla sintesi della distrofina (Fig. 4b) e dall'analisi morfologica (non mostrato). La distrofina comincia ad essere prodotta 4 giorni dopo il passaggio nel terreno di differenziamento e il suo accumulo aumenta con la progressione del programma miogenico (8 giorni). Abbiamo quindi applicato il protocollo di transdifferenziamento ai fibroblasti DMD per verificare l'attività del costrutto 5'3'esx sull'esclusione. Una biopsia cutanea con un contesto genetico diverso, (delezione degli esoni 45-50 - ∆45-50), anche trattabile con l'esclusione dell'esone 51, à ̈ stata infettata con il lentivirus M-U1#51 che reca le cassette di espressione MyoD e 5'3'esx (Fig. 4a). Il differenziamento muscolare à ̈ stato indotto due giorni dopo l'infezione e al giorno 9 e 13, i campioni sono stati raccolti per l'analisi dell'RNA e delle proteine. La Fig. 4c mostra l'espressione di MyoD e di GFP che sono codificate sul vettore stesso. La Fig. 4d mostra che l'espressione dell'RNA antisenso persisteva nei giorni 9 e 13 e corrispondeva ad una efficienza molto alta di esclusione (quasi il 50%, Fig.4e) e di ripristino della sintesi di distrofina (Fig.4f).

DISCUSSIONE

L'esclusione dell'esone à ̈ uno degli approcci più promettenti della terapia genica per il trattamento della DMD. Due studi clinici di fase I sono stati conclusi utilizzando diversi tipi di oligonucleotidi antisenso modificati somministrati ai pazienti con iniezioni intramuscolari locali. In entrambi gli studi, le analisi eseguite 3-4 settimane dopo il trattamento rivelavano un'alta percentuale di fibre valide di distrofina e si sono rivelate sicure e ben tollerate.

Una strategia parallela all'uso degli oligonucleotidi sintetici à ̈ rappresentata da un approccio di terapia genica in cui la molecola antisenso viene continuamente espressa come parte di un RNA cellulare. Diversi gruppi hanno infatti dimostrato la fattibilità di questo approccio attraverso l'utilizzo di cassette di espressione per le molecole antisenso basate sugli snRNA somministrati alle cellule muscolari di topi mdx mediante vettori AAV. Ulteriori studi nel modello mdx hanno anche dimostrato che una singola iniezione sistemica negli animali giovani (di 6 settimane di età) dei costrutti per gli RNA antisenso AAV1-U1 era efficace nel mantenere i benefici fisiologici e molecolari per l'intera durata di vita degli animali. Questi risultati hanno incoraggiato l'idea che un singolo trattamento potesse essere efficace a fornire un beneficio a lungo termine e ha fornito la base per la progettazione di protocolli con potenziali applicazioni di terapia genica nell'uomo mediata da AAV.

L'obiettivo del presente lavoro à ̈ stato la selezione degli RNA antisenso più efficaci per l'esclusione dell'esone 51 del gene DMD umano.

Sette diversi costrutti basati sull'snRNA U1 che combinano sequenze antisenso dirette contro le giunzione di splicing e gli enhancer esonici per lo splicing sono stati progettati, clonati e testati per la stabilità in vivo e per l'attività di esclusione dell'esone 51. Tutti questi hanno mostrato di accumularsi stabilmente nella cellula nonostante il fatto che la dimensione dell'snRNA U1 fosse talvolta notevolmente modificata dall'aggiunta delle sequenze antisenso. In particolare, queste molecole erano ancora in grado di legare la proteina U1-70K che rappresenta un marchio di garanzia per l'assemblaggio di particelle snRNP U1 stabili, spiegando così il motivo del loro accumulo stabile nella cellula.

Il comportamento riguardo l'esclusione dell'esone 51 di ogni molecola antisenso à ̈ stato testato infettando i mioblasti derivati da biopsie di pazienti con la delezione degli esoni 48-50. Questo ci ha permesso di selezionare le due molecole più performanti (5'3' e 5'3'esx), che differiscono solo per un elemento antisenso aggiuntivo contro un putativo ESE nel costrutto 5'3'esx. Successivamente, la loro attività à ̈ stata ulteriormente confrontata utilizzando un saggio reporter per lo splicing basato sulla luciferasi che confermava l'attività più alta del costrutto 5'3'esx. Questi dati indicavano che la regione bersaglio ESE presente nel costrutto 5'3'esx svolge un ruolo importante nello splicing dell'esone 51 e che, nel contesto dell'snRNA U1, à ̈ in grado di migliorare l'efficienza dell'esclusione se combinata alle sequenze antisenso contro le giunzioni di splicing. Questi risultati, unitamente al fatto che i costrutti di U1 contenenti solo l'antisenso anti-ESE hanno attività molto debole, ci ha permesso di concludere che l'snRNA U1 funziona efficientemente in primo luogo attraverso il riconoscimento delle giunzioni di splicing. Questa sembra una differenza rilevante rispetto agli oligo sintetici che agiscono indipendentemente da qualsiasi RNA carrier.

L'attività del costrutto vincitore à ̈ stata infine testata su un contesto genetico diverso (delezione 45-50) utilizzando fibroblasti transdifferenziati di pazienti. La possibilità di sperimentare l'attività di esclusione dell'esone nei fibroblasti derivati da biopsie cutanee à ̈ molto importante, considerando che le biopsie muscolari rappresentano interventi chirurgici invasivi e che i pazienti DMD sono fondamentalmente dei bambini, già indeboliti dal corso della loro patologia.

In conclusione, i risultati di questi studi hanno indicato che il costrutto 5'3'esx à ̈ molto attivo nell'indurre l'esclusione dell'esone 51 in due diversi contesti DMD mutati e in due diversi sistemi cellulari.

Claims (23)

1. Rivendicazioni 1. Acido nucleico che codifica un piccolo RNA nucleare (snRNA), il quale snRNA Ã ̈ modificato in modo da contenere una sequenza in grado d'ibridarsi con le giunzioni del sito di splicing in 5' e 3' e con una sequenza dell'enhancer esonico per lo splicing di un esone di un pre-mRNA, in modo che la sequenza dell'esone sia esclusa durante il processo di splicing che converte il pre-mRNA a mRNA maturo.
2. 2. Acido nucleico secondo la rivendicazione 1, in cui l'esone à ̈ un esone del pre-mRNA della distrofina.
3. 3. Acido nucleico secondo la rivendicazione 2, in cui l'esone à ̈ l'esone 51 del pre-mRNA della distrofina.
4. 4. Acido nucleico secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti, in cui la sequenza in grado d'ibridarsi con le giunzioni di splicing in 5' e 3' e con una sequenza dell'enhancer esonico per lo splicing di un esone del pre-mRNA della distrofina à ̈ contenuta nella regione 5' dell'snRNA.
5. 5. Acido nucleico secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti, in cui l'snRNA modificato à ̈ un snRNA U1 modificato.
6. 6. Acido nucleico secondo la rivendicazione 5, in cui l'snRNA modificato conserva la capacità di interagire con la proteina 70K associata a U1.
7. 7. Acido nucleico secondo una qualunque delle rivendicazioni da 3 a 6, in cui la sequenza in grado d'ibridarsi con la giunzione di splicing in 5' dell'esone 51 del premRNA della distrofina contiene la sequenza in grado d'ibridarsi con SEQ ID NO: 1.
8. 8. Acido nucleico secondo una qualunque delle rivendicazioni da 3 a 7, in cui la sequenza in grado d'ibridarsi con la giunzione di splicing in 3' dell'esone 51 del premRNA della distrofina contiene la sequenza in grado d'ibridarsi con SEQ ID NO: 2.
9. 9. Acido nucleico secondo una qualunque delle rivendicazioni da 3 a 8, in cui la sequenza in grado d'ibridarsi con l'enhancer esonico per lo splicing dell'esone 51 del premRNA della distrofina contiene la sequenza in grado d'ibridarsi con SEQ ID NO: 3.
10. 10. Acido nucleico secondo una qualunque delle rivendicazioni da 3 a 9, in cui la sequenza in grado d'ibridarsi con le giunzioni di splicing in 5' e 3' e con un enhancer esonico per lo splicing dell'esone 51 del pre-mRNA della distrofina contiene la sequenza esposta in SEQ ID NO: 4.
11. 11. Acido nucleico secondo una qualunque delle precedenti rivendicazioni che contiene la sequenza esposta in SEQ ID NO: 5.
12. 12. Acido nucleico secondo una qualunque delle precedenti rivendicazioni in cui l'esclusione dell'esone mediante l'snRNA modificato conduce alla produzione di una proteina funzionale.
13. 13. snRNA modificato codificato da un acido nucleico secondo una qualunque delle precedenti rivendicazioni.
14. 14. Vettore che incorpora un acido nucleico secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 12.
15. 15. Vettore secondo la rivendicazione 14, che à ̈ un vettore di somministrazione genica.
16. 16. Vettore secondo la rivendicazione 15, che à ̈ un vettore virale di somministrazione genica o un vettore non virale di somministrazione genica.
17. 17. Vettore secondo la rivendicazione 16, in cui il vettore virale di somministrazione genica si basa su un parvovirus, un adenovirus, un retrovirus, un lentivirus o un virus herpes simplex.
18. 18. Vettore secondo la rivendicazione 17, in cui il vettore virale di somministrazione genica basato su un parvovirus à ̈ un virus adeno-associato.
19. 19. Cellula di mammifero o di insetto che contiene un acido nucleico secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 12, un snRNA modificato secondo la rivendicazione 13 o un vettore secondo una qualunque delle rivendicazioni da 14 a 18.
20. 20. Metodo per la preparazione di un vettore parvovirale di somministrazione genica, il quale metodo comprende le fasi di: (a) fornire una cellula di insetto che contiene uno o più costrutti di acido nucleico contenenti: (i) un acido nucleico secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 12 che à ̈ fiancheggiato da almeno una sequenza nucleotidica ripetuta terminale invertita parvovirale; (ii) una prima cassetta di espressione contenente una sequenza nucleotidica che codifica una o più proteine Rep parvovirali e che à ̈ legata operativamente ad un primo promotore in grado di condurre l'espressione della/e proteina/e Rep nella cellula di insetto; (iii) una seconda cassetta di espressione contenente una sequenza nucleotidica che codifica una o più proteine del capside parvovirale e che à ̈ legata operativamente ad un secondo promotore in grado di condurre l'espressione della/e proteina/e del capside nella cellula di insetto; (b) coltivare la cellula di insetto definita in (a) in condizioni che conducono all'espressione delle proteine Rep e del capside; e opzionalmente, (c) recuperare il vettore parvovirale di somministrazione genica.
21. 21. Composizione farmaceutica contenente un acido nucleico secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 12, un snRNA modificato secondo la rivendicazione 13 o un vettore secondo una qualunque delle rivendicazioni da 14 a 18 e un veicolante o diluente farmaceuticamente accettabile.
22. 22. Acido nucleico secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 12, snRNA modificato secondo la rivendicazione 13 o vettore secondo una qualunque delle rivendicazioni da 14 a 18 da utilizzare a scopo terapeutico nel trattamento dell'organismo umano o animale.
23. 23. Metodo di trattamento di una distrofia muscolare, ad esempio la distrofia muscolare di Duchenne, il quale metodo comprende la fase di somministrazione di una quantità efficace di un acido nucleico secondo una qualunque delle rivendicazioni da 2 a 12, un snRNA modificato secondo la rivendicazione 13 o un vettore secondo una qualunque delle rivendicazioni da 14 a 18 ad un soggetto con tale esigenza.