ITMI20121248A1 - Film idrosolubile ad attivita' cicatrizzante. - Google Patents
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Description
“FILM IDROSOLUBILE AD ATTIVITA’ CICATRIZZANTE.â€
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione riguarda un film idrosolubile ed il dispositivo per uso medico contenente detto film idrosolubile ad attività cicatrizzante, in particolare adatto come coadiuvante nella terapia farmacologica sistemica delle piaghe o ferite.
STATO DELLA TECNICA
I proteoglicani ed i glicosaminoglicani sono componenti della matrice extracellulare e della superficie cellulare.
In particolare i proteoglicani sono costituiti da una proteina nucleo ed una o più catene di glicosaminoglicani. I glicosaminoglicani (GAG) sono polisaccaridi lineari con due unità ripetitive disaccaridiche costituite rispettivamente da due famiglie di ammino zuccheri : glucosamina solfato (GlcNS, GlcNS,6S, GlcN,6S) glucosamina acetato (GlcNAc, GlcNAc,6S) e galattosamminoacetato (GalNAc, GalNAc,4S; GalNAc,6S; GalNAc,4S,6S) e da un acido uronico scelto tra acido glucuronico (GlcA) ed acido iduronico (IdoA, IdoA2S).
Virtualmente tutte le cellule dei mammiferi producono proteoglicani e/o li secernono nella matrice extracellulare, li inseriscono nella membrana plasmatica o li immagazzinano nei granuli secretori.
In seguito ad un ferita o lesione della cute, molti meccanismi di stimolo (induzione) di proteoglicani vengono attivati secondo un comportamento specifico cellulare. Ad esempio il sindecano (proteoglicano del dermatan solfato) aumenta di parecchie volte la propria concentrazione sia nelle cellule endoteliali che nei cheratinociti iperproliferativi (Elnius K. et al., J. Cell. Biol. 1991; 114: 585-595. Gallo et al. J. Invest. Dermatol. 1996; 107: 676-683.
L'analisi dei proteglicani solubili, estratti dall'essudato di ferite e/o lesioni, mostra che il galattosaminoglicano solfato presente in maggiori quantità à ̈ il dermatan solfato (DS) . Il dermatan solfato à ̈ un potente promotore di fattori di crescita dei fibroblasti (FGF-2)(Penc et al., J. Biol. Chem. 1998; 273(43) : 28116-28121). Cellule endoteliali umane in coltura, esposte a soluzioni di dermatan solfato, rispondevano con la produzione di NF-KB e aumentavano l'adesione cellulare di tipo 1 (ICAM-1) dei leucociti endoteliali, mentre questa proteina contribuiva all'azione di riparo delle lesioni(Penc SF et al., J. Clin. Invest.1999; 103(9):1329-1335).
I DSPGs, ovvero i proteoglicani del dermatan solfato, quali decorina e biglicano, sono potenti promotori dei fattori di crescita FGF2 e sono stati associati all'organizzazione e alla crescita delle cicatrici delle ferite (Garg et al. "Chemistry of Scarring" in "Scarless Wound Repair" Marcel Dekker New York 2000, pagg.
1-2.).
Le ferite e le piaghe croniche contengono un'alta concentrazione di proteasi e minori concentrazioni di fattori di crescita, elevata presenza di cellule senescenti con ridotta attività mitogenica ed elevate concentrazioni di citochine infiammatorie. Le proteasi provocano la degradazione dei fattori di crescita endogeni, della fibronectina e laminina, inibendo o rallentando la regressione spontanea delle lesioni(Traversa B. et al. Primary Intention 20019(4): 161-167).
Lo stadio successivo à ̈ stato quello di verificare se glicosaminoglicani esogeni quindi non più in forma di proteglicani potessero svolgere un ruolo determinante per il trattamento di tali piaghe e ferite croniche.
E' stato dimostrato, in seguito ad esperimenti condotti in vitro in matrici di collagene progettate per stimolare l'ingegneria tissutale, che i fibroblasti ed i cheratinociti mostravano una più elevata capacità di proliferazione su matrici di eparina/ collagene o dermatan solfato/ collagene rispetto alla sola matrice di collagene. Questo effetto era tanto più marcato quanto maggiore era il peso molecolare dei GAG. La presenza di dermatan solfato nelle membrane di collagene favoriva l'attrazione, la crescita e la proliferazione dei fibroblasti e cheratinociti, mentre la presenza di eparina non frazionata favoriva prevalentemente la proliferazione dei fibroblasti (Ruozi B. et al., Int J. Pharmaceutics 2009 ; 738 (1-2) :108-115).
Tuttavia per tutti i dispositivi per uso topico descritti nello stato della tecnica sembra indispensabile associare i suddetti GAG al collagene, per ottenere risultati apprezzabili.
US 4837024 descrive polveri di collagene ed almeno un glicosaminoglicano da applicarsi su ferite.
In questa anteriorità si descrive l'abilità dei vari GAG ad attrarre fibroblasti ed a promuovere la neovascolarizzazione. Infatti entrambe queste attività sono parametri importanti per valutare l'abilità dei GAG nel promuovere la guarigione delle ferite. L'abilità dei GAG in entrambe tali attività à ̈ imprescindibile dalla presenza del collagene.
Anche per US 5,929,050 che descrive una composizione per trattare le ferite costituita da una soluzione acquosa contenente condroitin solfato e da un bendaggio sterile, sembra molto importante la presenza del collagene per velocizzare la guarigione in quanto quest'ultimo fornisce tutte quelle sostanze nutritive alla crescita cellulare.
Infine citiamo WO03034993 che descrive alcune composizioni per promuovere la crescita cellulare per proteggere i tessuti e per favorire la guarigione delle ferite a base di
a) collagene idrolizzato, come componente principale,
b) un GAG polisolfato.
c) un sale di acido ialuronico
d) un sale glucosamminico
Queste composizioni possono essere anche in forma di film,in questo caso il collagene ha la funzione di sostanza filmogena principale.
Come à ̈ noto il collagene disponibile in commercio à ̈ essenzialmente di origine bovina ed equina; in alcuni soggetti può indurre una risposta antigenica, risposta che può essere sostanzialmente ridotta se nei processi di estrazione e purificazione del collagene vengono utilizzati adatti enzimi proteolitici idonei a distruggerne il telopeptide C-terminale.
Inoltre il collagene à ̈ una sostanza piuttosto costosa e quindi sconsigliata per il prezzo risultante,se impiegata in grosse quantità come ad esempio quella necessaria per film atti a ricoprire ferite estese.
Prova ne à ̈ il fatto che la anteriorità sopra citata WO03034993 prevede l'impiego di tali tipi di film solamente per ferite di piccole dimensioni quali quelle dentali. E' quindi sentita l'esigenza di disporre di un dispositivo per la cicatrizzazione anche di lesioni estese quali ad esempio ulcere da vasculopatie e piede diabetico che nel contempo protegga la ferita e rilasci in maniera continua ed uniforme i GAG in situ nella lesione senza gli inconvenienti dello stato della tecnica.
US2010/002790 descrive film idrosolubili contenenti
a) tra 25 e 60% in peso di sodio alginato
b) tra 0,1 e 20% in peso di cellulosa microcristallina sul peso totale del film, c)tra 0,1 e 25% in peso di proteine vegetali.
Quando impiegati per uso topico sulla pelle possono essere utilizzati per la cura di piccole ferite della cute e non contengono principi attivi ad attività cicatrizzante.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
La richiedente ha ora inaspettatamente trovato che à ̈ possibile superare gli inconvenienti dei dispositivi per uso topico contenenti GAG con il dispositivo della presente invenzione comprendente un film idrosolubile o gel solido ad attività cicatrizzante secondo la presente invenzione.
Pertanto oggetto della presente invenzione à ̈ un film idrosolubile comprendente: a) tra 25 e 60% in peso di sodio alginato, come sostanza filmogena principale, b) tra 0,1 e 20% in peso di cellulosa microcristallina sul peso totale del film, c)tra 0,1 e 25% in peso di proteine vegetali ,
d) almeno un glicosamminoglicano solfato di tipo naturale, come principio attivo ad attività cicatrizzante.
Ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ un dispositivo per uso medico contenente il film idrosolubile secondo la presente invenzione.
Questo dispositivo à ̈ in particolare adatto a ricoprire piaghe e ferite anche estese proteggendole dall'ambiente esterno, rendendo disponibile con continuità nella zona del derma leso il glicosaminoglicano solfato di tipo naturale, in quanto svolge un'azione di cessione lenta del principio attivo nella zona richiesta e contemporaneamente protegge il sito della lesione da agenti batterici, inquinanti, esterni.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLA PRESENTE INVENZIONE
Per gli scopi della presente invenzione con la definizione generale di “glicosaminoglicani solfati e/o galattosamminoglicani solfati (GAG)†si intendono sia glicosammino glicani solfati e/o galattosammino glicani solfato che si trovano in natura ad esempio nei tessuti ed in particolare nella matrice extracellulare come componenti dei cosiddetti proteoglicani quali ad esempio condroitin solfato, dermatan solfato, eparansolfato, eparina a basso, relativamente basso e/o alto peso molecolare, cheratan solfato e relative miscele di almeno due dei suddetti componenti.
Per gli scopi della presente invenzione per eparina a basso peso molecolare si intende eparina con peso molecolare medio ponderale (Mw) compreso tra: 4000 e 6500 e con il 60% delle molecole con peso molecolare medio inferiori a 8000 Da. Per eparina relativamente a basso peso molecolare si intende: eparina a peso molecolare medio (Mw) compreso tra : 6500 e 10500 e con almeno il 60% delle molecole caratterizzate da un peso molecolare medio inferiore a 12000 Da.
Per eparina ad alto peso molecolare si intende la convenzionale eparina non frazionata (UFH) a peso molecolare medio compreso tra: 12000 e 18000 e con valori anche fino a 40000 Da
Per gli scopi della presente invenzione con la definizione di “condroitin solfato†, laddove non espressamente specificato si intende almeno uno dei seguenti isomeri: condroitin-4-solfato (Ch-S-A) condroitin-6-solfato(Ch-S-C), condroitin-2,6-di-solfato(Ch-S-D), condroitin-4,6-disolfato(Ch-S-E)
Secondo una soluzione preferita i dispositivi medici secondo la presente invenzione contengono una miscela di almeno 2 dei suddetti galattosaminoglicani solfati di tipo naturale.
Secondo una soluzione preferita tali dispositivi medici contengono preferibilmente le seguenti miscele:
Miscela (A), comprendente prevalentemente:
α) eparina relativamente a basso peso molecolare, con possibili tracce di eparina contenente glucosamina N-desolfata,(GlcN, GlcN,6S)
β) dermatan solfato
γ) condroitin solfato ;
Miscela (B), comprendente
α') eparina a relativamente basso peso molecolare,
β') dermatan solfato,
Miscela (C) comprendente i seguenti glicosaminoglicani di basso peso molecolare:
α") eparan solfato,
β") condroitin solfato
γ") dermatan solfato
Miscela (D) comprende i seguenti componenti:
α†’)dermatan solfato con tracce di eparina a relativamente basso peso molecolare e
β’’’) condroitin solfato,
Alla famiglia della miscela (A) appartiene in particolare il prodotto disponibile in commercio con il marchio Mesoglicano<®>. Preferibilmente la miscela di Mesoglicano à ̈ costituita per:
· il 55-60% da una miscela di eparina a relativamente basso peso molecolare di cui il 2-8% à ̈ eparina ad alto peso molecolare (slow moving heparin) e per il 47-58% da eparina ( così detta fast moving heparin).
· 25-35% da dermatan solfato,
· 4-8% da condroitin solfato (prevalentemente Ch-S-A e minor quantità di Ch-S-C.
Alla famiglia delle miscele (B) appartiene in particolare il prodotto noto con il nome Sulodexide contenente l'80% di eparina a relativamente basso peso molecolare e per il 20% dermatan solfato.
Alla famiglia (C) appartiene in particolare il prodotto meglio noto con il nome Danaparoid costituito per 75-85% da eparan solfato, per non più dell'8,5% in peso di condroitin solfati (Ch-S-A) e (Ch-S-C), e dall'8 al 16% di dermatan solfato. Alla famiglia (C) appartiene anche il prodotto noto con il nome Mistral.
Il film idrosolubile secondo la presente invenzione viene preferibilmente preparato come descritto in US2010/002790.
Per gli scopi della presente invenzione si intende come peso secco del film idrosolubile il peso delle componenti nel film finale diverse dall'acqua.
Per gli scopi della presente invenzione si considera come sostanza filmogena principale la sostanza che rappresenta tra 90 e 100% in peso di sostanza filmogena sul peso totale della sostanze filmogene, preferibilmente tra il 95 ed 99,9% in peso sul peso totale. Preferibilmente il dispositivo secondo la presente invenzione contiene Mesoglicano sodico, a concentrazioni comprese tra 0,1 e 10% in peso, più preferibilmente tra 1 e 7% in peso ancor più preferibilmente tra 3 e 6% in peso sul peso secco del film idrosolubile. Secondo una soluzione particolarmente preferita à ̈ contenuto in quantità del 4,5 e 4,8% in peso calcolato sul peso secco del film idrosolubile.
Il dispositivo secondo la presente invenzione può contenere anche dermatan solfato con tracce di eparina a relativamente basso peso molecolare e di condroitin solfati, a concentrazioni comprese tra 0,1 e 10% in peso, più preferibilmente tra 1 e 7% in peso ancor più preferibilmente tra 3 e 6% in peso sul peso secco del film idrosolubile. Secondo una soluzione particolarmente preferita à ̈ contenuto in quantità del 4,5 e 4,8% in peso calcolato sul peso secco del film idrosolubile. Preferibilmente l'alginato di sodio o componente (a) del film idrosolubile, con proprietà filmanti secondo la presente invenzione à ̈ contenuto in quantità comprese tra il 28 ed il 40% in peso, più preferibilmente tra il 30 ed il 38% in peso ancor più preferibilmente tra il 35 ed il 37% e secondo una soluzione particolarmente preferita tra il 36,1 e il 36,9 % in peso calcolato sul peso totale secco del film idrosolubile.
La cellulosa microcristallina o componente (b) utilizzata come addensante nel film idrosolubile dell'invenzione à ̈ contenuta in quantità preferibilmente comprese tra 2,5 e 11% in peso più preferibilmente comprese tra 5 e 8% in peso calcolato sul peso secco totale del film.
Le proteine vegetali o componente (c) del film idrosolubile della presente invenzione sono contenute nel film idrosolubile con proprietà emulsionanti ed in grado di aumentare la consistenza sono contenute in quantità comprese tra 5 e 15%, ancor più preferibilmente tra 10 e 14 % in peso sul peso totale secco del film.
Il film può eventualmente contenere anche altri additivi quali derivati poliossietilenici ed in particolare il polisorbato 80, preferibilmente in concentrazioni comprese tra 5 e 12%, agenti plastificanti ed umettanti quali polioli ed in particolare la glicerina preferibilmente in concentrazioni comprese tra 15 e 30%, ulteriori agenti addensanti quali il polivinilpirrolidone a concentrazioni preferibilmente comprese tra 1 e 5% in peso sul peso secco del film.
Come sostanza opzionale filmogena o filmante può essere utilizzato l'acido ialuronico in ogni caso in quantitativi non superiori allo 0,2% in peso sul peso secco totale del polimero.
Il film contiene umidità residua che in ogni caso non supera il 15% in peso sul peso totale del film idrosolubile ed in maniera tale che l'attività dell’acqua Aw intesa come rapporto tra la tensione di vapore dell'acqua nel film e la tensione di vapore dell'acqua pura, alla stessa temperatura, sia compresa tra 0,1 e 0,3.
La Richiedente ha in particolare trovato che il film idrosolubile secondo la presente invenzione presenta una velocità di cicatrizzazione delle ferite superiore rispetto al controllo già dopo 2 e 4 ore dalla somministrazione.
Inoltre la Richiedente ha inaspettatamente trovato che il dispositivo biomedicale sottoposto a sterilizzazione mediante raggi gamma à ̈ stabile non si altera ed inoltre presenta un'azione tamponante,come dimostrato dagli esperimenti in vitro riportati negli esempi 2 e 5. Infatti la matrice del film idrosolubile può essere preparata in modo tale da garantire un pH finale,cioà ̈ quando il film à ̈ in presenza di soluzione acquosa, compreso negli intervalli 6,0 ± 0,4 fino a pH 7,0 ± 0,5 e tale da essere mantenuto sia per aggiunta di acido cloridrico che di idrossido di sodio a concentrazioni 0,01 N e con volumi compresi tra 20 mL e 1000mL, al sistema costituito da una membrana intera sospesa in 20 mL di acqua distillata.
Dalla letteratura si desumono le seguenti informazioni.
Il pH della cute integra à ̈ circa 5,5; il pH della maggioranza delle cellule à ̈ compreso fra 6,5 e 8,5; anche le ferite e lesioni presentano questo intervallo di pH, con la tendenza a raggiungere il valore 9,0. Il pH del sangue venoso à ̈ 7,35. In presenza di lesioni croniche il pH del letto della ferita à ̈ di fondamentale importanza ai fini del processo di guarigione; à ̈ stato infatti osservato che un’†acidificazione†del letto della lesione conduce ad un aumento del tasso di guarigione in pazienti affetti da ulcere venose degli arti inferiori.
Una delle ragioni à ̈ l’aumentata disponibilità di ossigeno per i tessuti. L’altra deriva dagli elevati livelli di proteasi associati a pH alcalini del letto della lesione. L’eccessiva espressione di proteasi à ̈ un fattore che contribuisce al rallentamento del processo di guarigione, bloccando in alcuni casi la lesione in un ciclo di cronicità . La riduzione del pH o il mantenimento in zona tendenzialmente “acida†, dei fluidi della lesione à ̈ invece un metodo per controllare l’attività delle proteasi, senza peraltro causarne un’inattivazione irreversibile, che determinerebbe la denaturazione anche di proteine utili nei fluidi della ferita, come i fattori di crescita.
C’à ̈ l’evidenza che valori tendenzialmente acidi dell’essudato della lesione possano favorire la guarigione. Infatti in ambienti tendenzialmente alcalini con pH compresi fra 7,0 e 9,0 le proteasi mostrano il picco di massima attività . Catepsina G, elastasi, plasmina, metallo-proteinasi della matrice (MMP-1) possono degradare il tessuto della matrice cellulare appena ricostruito (laminina, fibronectina, collagene ecc.) e così rallentare la guarigione. (Greener B et al. J of Wound Care 2005; 14 (2): 59 – 61. Vedi anche: Rushton I. Ruolo delle proteasi e del pH nel wound healing. Nurs Stand 2007;21(32): 68, 70, 72. PubMed).
Le ulcere e lesioni croniche sono caratterizzate da valori di pH anche superiori a 9.
E’ quindi sentita la necessità di disporre di un dispositivo medico capace di inibire l’alcalinità delle lesioni e mantenerne il pH intorno a valori di 6,7 – 6,9.
Una casistica di 50 pazienti portatori di lesioni acute e croniche à ̈ stata esaminata in un ospedale universitario (Varanasi - India). Sono stati monitorati i valori di pH, rilevati nell’essudato della ferita: all’inizio oltre il 50% dei casi presentava un pH superiore a 9,0 e nessun caso presentava pH inferiore a 7,5. Durante l’evoluzione verso la guarigione i valori di pH sono scesi al di sotto di 7,5 (14% dei casi) e altri sono rimasti compresi fra 7,5 – 8,0 (34% dei casi). L’evoluzione del pH verso valori prossimi alla neutralità era indice della guarigione, per di più essudati con valori di pH superiori a 8.0 rappresentavano un buon terreno di coltura per Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus (V.K. Shukla et al. J of Wound Care 2007; 16 (7): 291-294. PubMed) Ian A.I. Wilson et al. (in VASA 1979;8 (4): 339 – 342 attraverso: www.scirus.com) nel rapporto intitolato “Relazione fra il pH della superficie delle ulcere varicose e guarigione†riporta i risultati di una sperimentazione su 29 pazienti affetti da ulcere varicose. Il pH medio degli essudati delle ulcere era circa 7,7 ± 0,3. Veniva fatto un trattamento terapeutico con unguento tamponato a pH 6.0 contro un controllo costituto dallo stesso unguento a pH 7,3. Il trattamento con unguento tamponato a pH 6,0 manteneva l’†acidità †delle ulcere venose più a lungo con significativo vantaggio nella velocità di guarigione misurata mediante un “quoziente di guarigione†rappresentato dall’area della parte coperta dall’epitelio, in mm<2>/giorno. I valori riportati sono 22.6 mm<2>/giorno per i trattati e 3.3 mm<2>/giorno per i controlli.
Alexander L et al. (nella monografia riportata in Arch Dermatol Res 2007; 298: 413-420. PubMed) razionalizza le condizioni di influenza del pH nella guarigione delle lesioni come una nuova prospettiva di terapia.
Un'ulteriore proprietà mostrata dal film idrosolubilie dell’invenzione à ̈ l'elevata stabilità allo stoccaggio.
Il dispositivo per uso medico costituito dal film secondo la presente invenzione à ̈ in particolare adatto per il trattamento di lesioni secondarie ad eventi patologici, quali ad esempio ulcere degli arti inferiori in soggetti con insufficienza venosa cronicae ulcere del piede diabetico,ulcere di origine arteriosa, lesioni secondarie ad eventi traumatici quali ad esempio piaghe da decubito lesioni da escoriazioni, lesioni secondarie ad eventi ambientali quali ad esempio lesioni da scottature,ustioni, tutte queste lesioni essendo anche estese.
Si riportano a scopo illustrativo ma non limitativo alcuni esempi di composizione del dispositivo per uso medico costituito dal film idrosolubile secondo la presente invenzione.
ESEMPIO 1
Preparazione del biofilm mesoglicano
In un miscelatore contenente acqua distillata quanto basta a 100 parti, preriscaldata tra 50°C e 70°C si disperdono: sorbitolo parti 2,5,glicerina parti 5, polisorbato 80 parti 2 fino a completa solubilizzazione. Si aggiungono a pioggia sodio alginato parti 8,7, cellulosa microcristallina parti 1,7, proteina vegetale parti 3, polivinilpirrolidone parti 0,5, mesoglicano sodico parti 1,1, sodio ialuronato parti 0,025. Si agita lentamente per 30 minuti fino a completa dispersione ed omogeneizzazione del gel. Si inizia un lento raffreddamento fino a 25°C sotto lenta agitazione. Si controlla il pH della massa gelatinosa che deve risultare 7,0 ± 0,5; in questo caso à ̈ risultato pH 7,0.
La massa à ̈ lasciata a riposo per una notte per la disaerazione, poi à ̈ trasferita, sotto agitazione e mediante pompa peristaltica in opportuno contenitore della macchina spalmatrice e successivamente stratificata in film su supporto a nastro di polietilene siliconato. Il nastro viene fatto passare in un forno a tunnel ventilato e dotato di quattro stazioni successive di riscaldamento con temperature crescenti fino a 120°C. All’uscita dal tunnel si ottiene una bobina costituita da supporto di poliossitilentereftalato (PET)siliconato e da una pellicola solida di gel. Il prodotto viene fatto stagionare per almeno 24 ore. La bobina viene tagliata in bobine di fascia più piccola in rapporto alla pezzatura desiderata.
Si ottiene così un film idrosolubile di 8 x 12 cm il cui peso medio à ̈ 650 mg e la cui composizione espressa sulla sostanza secca à ̈ riportata nella seguente tabella Ingredienti Ingredienti Composizione mg/film nome commerciale Nome chimico
Protanal GP 2650 Alginato sodico 237,86
Avicel PH 105 Cellulosa microcristallina 46,48
Pisane M9 Proteina vegetale (piselli) 82,01
Sorbitolo 70% Sorbitolo 47,84
Pricerina 9095 Glicerina 99,95% 136,70
Tween 80 Polysorbate 80 54,68
Kollidon 90 F Polyvinylpyrrolidone 13,67
Mesoglicano sodico Mesoglicano sodico 30,10
Crystal Hyal Sodio Ialuronato 0,68
Il film ha un contenuto di acqua, misurato con la tecnica Karl Fischer di 12% ÷ 15%.
ESEMPIO 2
Prove dell'effetto tamponante del film idrosolubile dell'invenzione.
Il film idrosolubile preparato come descritto nell'esempio 1 à ̈ stato sminuzzato in pezzetti ed à ̈ stata sospeso in 20 mL di acqua distillata, sotto agitazione. Dopo 5 – 10 minuti si à ̈ formata una “soluzione†con modesta quantità di materiale in sospensione. Il pH di tale sistema à ̈ risultato essere mediamente 6.75. Contemporaneamente sono stati preparati due beakers contenenti 20 mL di acqua distillata, in ciascuno dei quali si à ̈ misurato il valore di pH ed ai quali, separatamente sono stati aggiunti progressivamente 0.1, 0.2, 0.4, 1.0 mL rispettivamente, di sodio idrossido o acido cloridrico 0.01 M. In parallelo a questa prova su acqua distillata sono state effettuale le stesse aggiunte, separatamente, su due sospensioni di altrettante membrane di film in 20 mL di acqua distillata. Per ogni aggiunta sono stati misurati i valori di pH.
I risultati sono riportati nelle seguenti tabelle 1a e 1b:
Tabella 1a
pH biofilm (*)
pH H2O (**) (20 mL) NaOH 0.01N
Lot. Lot. Lot.
aggiunta
P1251A0 P1270C0 P1271C0
(µL)
_ 6.7 6.7 6.7 N.D.
20 6.8 6.7 6.8 6.6
100 6.8 6.8 6.8 8.6
200 6.9 6.8 6.9 9.1
400 7.0 7.0 7.1 9.5
1000 7.5 7.4 7.7 10.0
Tabella 1b
pH biofilm (*)
pH H2O (**) (20 mL) HCl 0.01
Lot. Lot. Lot. P1271C0
aggiunto
P1251A0 P1270C0
(µL)
_ 6.9 6.8 6.8 N.D.
20 6.8 6.8 6.8 6.2
100 6.8 6.7 6.7 4.6
200 6.7 6.6 6.6 4.2
400 6.6 6.5 6.5 3.8
1000 6.3 6.2 6.2 3.4
(*) biofilm dissolto in 20 mL di H2O
(**) media di tre determinazioni
N.D. = non determinabile (dopo 30 minuti la lettura non à ̈ ancora stabile)
Da questo modello sperimentale à ̈ risultato che il film disciolto/sospeso in acqua ha un pH di circa 6.75. Il suo effetto tamponante consentirebbe di mantenere il pH del “sistema lesione†intorno a questo valore o al massimo compreso fra 6.1 e 7.5; come à ̈ stato dimostrato da quei sistemi, solamente acquosi, che se non tamponati, arriverebbero a pH 3.4 e 10.0 rispettivamente.
ESEMPIO 3
Studio di stabilitÃ
Scopo di questo esperimento à ̈ stato valutare il contenuto di Mesoglicano nel tempo avvalendosi della sua attività anti fattore Xa attivato (anti-Xa).
3.1 Materiali
I seguenti lotti sperimentali di dispositivo sono stati sottoposti allo studio di stabilità :
Film lotto P1251A0 prodotto con Mesoglicano lotto 08-O-041
Film lotto P1270C0 prodotto con Mesoglicano lotto 08-O-023
Film lotto P1271C0 prodotto con Mesoglicano lotto 09-O-051
ciascuno di dimensioni 8x12 cm, peso teorico 650 mg ± 10% (585 -715 mg) e contenuto teorico 30.10 mg di Mesoglicano.
3.2 Programma stabilitÃ
Le condizioni di conservazione ed i tempi a cui sono state effettuate leanalisi sono i seguenti:
25°C – 60% UR
0 mesi, 1 mese, 3 mesi, 6 mesi e 12 mesi
30°C – 65% UR
1 mese, 3 mesi, 6 mesi, 9 mesi e 12 mesi
40°C – 75% UR
1 mese, 3 mesi e 6 mesi
3.3 Metodo-determinazione del contenuto di mesoglicano nel biofilm valutato mediante la sua attivita’ anti fattore Xa attivato (anti-Xa)
Come à ̈ noto, l’eparina à ̈ in grado di inibire il fattore X attivato (FXa), attraverso l’interazione con la serinproteasi Antitrombina III (ATIII).
Il metodo per la determinazione dell’attività anti-Xa, sviluppato per determinare l’attività dell’eparina, se applicato al Mesoglicano à ̈ in grado di indicare l’attività del prodotto in quanto un suo componente à ̈ l’eparina.
Il test viene condotto in sistema purificato.
Nel sistema in vitro, ad un campione contenente quantità note di Mesoglicano e ATIII, viene aggiunto un eccesso di FXa. Il FXa residuo viene misurato grazie alla sua attività amidolitica sul substrato cromogenico. La quantità di FXa residuo à ̈ inversamente proporzionale alla quantità di Mesoglicano presente nel campione.
3.3.1 Reattivi
- Kit Stachrom Heparin DIAGNOSTICA STAGO cod.00906 costituito da:
· Tampone Tris EDTA pH 8.4 concentrato (normalmente diluire 10 mL a 100 mL con acqua deionizzata)
· Substrato cromogenico CBS 31.39 (da ricostituire con 4 mL di acqua deionizzata)
· ATIII bovina (da ricostituire con 2 mL di tampone diluito)
· FXa bovino (da ricostituire con 4 mL di acqua deionizzata)da prepararsi almeno 30 minuti prima dell’utilizzo.
Eparina Working Standard lotto 2247 a cui à ̈ stato attribuito il titolo 196 Unità Internazionali di attività anti-Xa (UIanti-Xa/mg) contro Reference Standard Internazionale 3.1 a titolo 1010 Unità Internazionali di attività anticoagulante (UI/mL), secondo il metodo da EP paragrafo 2.7.5.
biofilm di dimensioni 8x12 cm, peso 650 mg e contenuto 30.10 mg di Mesoglicano
Mesoglicano sodico lotto utilizzato per la preparazione del biofilm
Emulsione di riferimento codice 9756904 Instrumentation Laboratory
3.3.2- Apparecchiature
Coagulometro Instrumentation Laboratory mod. ACL 300R o equivalente Rotori codice 68000 Instrumentation Laboratory
Cuvette codice 67992 Instrumentation Laboratory
Bilancia AX 105DR fissata a 4 cifre decimali
Vetreria e strumenti convenzionali di laboratorio
3.4 Preparazione delle soluzioni per la costruzione della retta standard di Eparina Preparare una soluzione di eparina Working Standard, alla concentrazione di 10 mg/mL pari a 1960 UI/mL) in acqua distillata. Da questa soluzione preparare, per diluizione con tampone Tris-EDTA a pH 8.4, altre soluzioni alle concentrazioni di:
0,15 UI/mL,
0,125 UI/mL,
0,1 UI/mL,
0,075 UI/mL,0,05 UI/mL.
3.5 Preparazione delle soluzioni per il calcolo dell’attività di Mesoglicano Preparare una soluzione di Mesoglicano sodico, lotto utilizzato per la preparazione del biofilm, alla concentrazione di 10 mg/mL.
Diluire con tampone Tris-EDTA a pH 8.4, detta soluzione alle concentrazioni di 4 Î1⁄4g/mL,
3 Î1⁄4g/mL, 25 Î1⁄4g/mL,
2 Î1⁄4g/mL,
1,25 Î1⁄4g /mL,
3.5.1 Dissoluzione del film e preparazione del campione
Si stacca il film dal supporto plastificato, lo si pesa, lo si taglia a piccoli pezzi e lo si trasferisce in un becker da 600 mL. Si aggiungono 300 mL di acqua deionizzata e si lascia in agitazione sostenuta per circa 5 minuti fino a disgregazione completa. La soluzione ottenuta si presenta torbida ma non particolarmente densa (concentrazione teorica: 30.10 mg/300 mL cioà ̈ 100.33 µg/mL).
Preparare una soluzione con concentrazione finale di 3.01 µg/mL).
3.5.2 Procedimento per utilizzo Coagulometro
Nei rotori del coagulometro, secondo le istruzioni descritte dalle procedure, sono poste le cuvette contenenti i reattivi per ciascuna delle 5 concentrazioni di eparina working standard, delle 5 concentrazioni di Mesoglicano usato come materia prima per quel corrispondente lotto di dispositivo e dei 5 campioni alla stessa concentrazione teorica di 3.01 Î1⁄4g/mL di biofilm.
Nella reazione l’eparina modifica allostericamente l’antitrombina III che va ad inibire il fattore Xa. La reazione à ̈ monitorata dalle assorbanze rilevate a 405 nm.
3.6 Calcoli per ottenere il Titolo di Mesoglicano
In base all’attività dell’Eparina utilizzata (UI/mL) ed alla corrispondente assorbanza ottenuta si costruisce la retta di calibrazione. Da questa retta, conoscendo l’assorbanza delle soluzioni di Mesoglicano se ne estrapola l’attività in Unità Internazionali anti-Xa (UaXa/mL).
Per risalire all’attività anti-Xa espressa in UaXa/mg si utilizza la seguente formula:
attività (UaXa/mg)=<a>x 1000
c
dove:
a = attività Mesoglicano estrapolata dalla curva espressa in UaXa/mL c = concentrazione del Mesoglicano espressa in mg/mL
I valori calcolati per le corrispondenti concentrazioni di Mesoglicano testato vengono mediati ottenendo il Titolo (T) espresso in UaXa/mg.
Calcoli per ottenere il contenuto di Mesoglicano nel biofilm
In base all’attività dell’Eparina utilizzata (UI/mL) ed alla corrispondente assorbanza ottenuta si costruisce la retta di calibrazione. Da questa retta, conoscendo l’assorbanza delle soluzioni del film se ne estrapola l’attività in UaXa/ml. Per risalire alla concentrazione di Mesoglicano presente nella soluzione di biofilm espressa in µg/mL si utilizza la seguente formula:
Concentrazione Mesoglicano<a>x 1000
(µg/mL) =<T>
dove
a = attività biofilm estrapolata dalla curva espressa in UaXa/mL
T = Titolo Mesoglicano espresso in UaXa/mg
I cinque valori calcolati, ottenuti nelle 5 repliche della diluizione del biofilm testato vengono mediati ottenendo la concentrazione (C) di Mesoglicano nella soluzione di biofilm espressa in µg/mL.
Per risalire al contenuto di Mesoglicano nel biofilm, espresso in percentuale sul valore teorico di 30.10 mg, si utilizza la formula:
Mesoglicano % =<C>x 100
3.01
dove:
C = concentrazione trovata (C) di Mesoglicano nel film espressa in µg/mL 3.01 concentrazione teorica di Mesoglicano espressa in Î1⁄4g/mL
Mediare i valori ottenuti dai differenti film (almeno 3) per ottenere il contenuto di Mesoglicano nel film.
Sono stati utilizzati 3 film idrosolubili differenti preparati come descritto nell'esempio 1 per ciascun tempo; per i lotti P1270C0 e P1271C0 al T0e per il lotto P1251A0 al T1mesene sono stati utilizzati 5.
3.6.1 Risultati
Nella tabella 3, sono riportati i risultati relativi al film P1251A0 posto in stabilità a 25°C e 60% di umidità relativa (u.r.), a 30°C e 65% di u.r., per 12 mesi e a 40° C e 75% di u.r. per 6 mesi
Tabella 3. Lotto di biofilm P1251A0
Condizioni Mesi Recupero percentuale dell’attività Titolo di anti-Xa rapportata al peso teorico Mesoglicano della membrana Lotto 08-O-041 Media ± (t ∙ CV%)/(g.l.)<1/2>°°° UI-anti-Xa/mg
0 86.37 ± 2.87 % 39
25° C 1 85.47 ± 4.06 % 41
60% u.r. 3 86.45 ± 5.20 % 45
6 86.45 ± 4.52 % 46
12 82.69 ± 4.28 % 47
30° C 1 81.12 ± 5.39 % 41
65% u.r. 3 90.35 ± 3.89 % 45
6 84.32 ± 2.33 % 45
9 88.09 ± 5.73 % 41
12 81.20 ± 2.29 % 47
40° C 1 82.29 ± 4.17 % 41
75% u.r. 3 87.39 ± 2.78 % 45
6 77.29 ± 1.86 % 44
6 â™ â™ 88.88 ± 3.60 %
Nota alla Tabella 3: il t di Student per la probabilità del 95% e per n -1 (15 -1) gradi di libertà à ̈ 2.15;
°°° per metodi complessi si conviene che l’errore del metodo possa essere rappresentato da X% ± t∙ CV% / (n-1)<1/2 .>Dove (n-1)<1/2>per 15 misure = 3.74 â™ â™ Replica di analisi eseguite su altre 3 membrane conservate nel frattempo a 20 °C.
Nella tornata di analisi a 1 mese il mesoglicano 08-O-041 ha dato 41 IU/mg con CV% 3.52. Nella seduta analitica dei 12 mesi ha dato 47 IU/mg con CV% = 6.25. Nella tabella 4, sono riportati i risultati relativi al film P1270C0 posto in stabilità alle stesse condizioni sopra indicate
Tabella 4. Lotto di biofilm P1270CO
Condizioni Mesi Recupero percentuale Titolo di Mesoglicano dell’attività anti-Xa rapportata Lotto 08-O-023 al peso teorico della UI anti-Xa membrana
Media ± (t ∙ CV%)//(g.l.)<1/2>
°°°
0 82.19 ± 3.57 % 41
â–²
25°C 1 85.68 ± 4.02 % 42
60% u.r. 3 76.99 ± 4.51 % 44
6 89.53 ± 2.36 % 42
12 ** 45
74.64 ± 3.42 %
30°C 1 71.66 ± 4.17 % 42
65% u.r. 3 73.31 ± 5.85 % 44
6 81.06 ± 3.58 % 42
9 ** 41
12 84.97 ± 3.46 % 45
83.83 ± 3.30 %
40°C 1 79.80 ± 2.92 % 42
75% u.r. 3 78.01 ± 2.36% 44
6 84.12 ± 2.07% 42
Nota alla Tabella 4:
â–² Sono state eseguite 25 misure. Per 25 misure (n-1)<1/2>= 4.90 ed il tstudent= 2.06 (**) solo 14 valori. Per 14 valori tstudent= 2.16. Per 14 valori (n-1)<1/2 =>3.60 Il lotto di mesoglicano 08-O-023 ha dato nella tornata di analisi dei 9 mesi il valore 41 IU/mg, (anti-Xa) con CV % 6.16. Nella seduta analitica dei 12 mesi ha dato 45 IU/mg con CV% 6.83.
Nella tabelle 5 sono riportati i risultati relativi al film P1271C0 posto in stabilità a 25° C e60% di u.r., a 30° C e 40% di u.r. per 12 mesi e per 6 mesi a 40°C e 75 di u.r.
Tabella 5. Lotto di biofilm P1271CO
Condizioni Mesi Recupero percentuale Titolo di Mesoglicano dell’attività anti-Xa Lotto 09-O-051 rapportata al peso teorico UI anti-Xa/mg della membrana
Media ± (t ∙ CV%)/(g.l.)<1/2>
°°°
0 75.21 ± 2.85 39
% â–²
25° C 1 78.87 ± 3.31 44
60% u.r. 3 % 45
6 73.05 ± 44
12 8.61 % 46
82.80 ± 5.01
%
76.04 ± 3.40
%
30° C 1 76.52 ± 3.33 % 44
65% u.r. 3 77.38 ± 5.75 45
6 % 44
9 75.55 ± 3.0 45
12 % 46
77.70 ± 2.82
%
76.28 ± 2.01
%
40° C 1 73.99 ± 2.06 44
75% u.r. 3 % 45
6 73.76 ± 2.99 45
%
80.92 ± 2.17
%
Nota alla Tabella 5:
â–² Sono state eseguite 25 misure. Per 25 misure (n-1)<1/2>= 4.90 ed il tstudent= 2.06 Il lotto di mesoglicano 09-O-051 ha dato nella seduta d’analisi dei 9 mesi, 45 IU/mg con CV% 7.39 e nella seduta dei 12 mesi, 46 IU /mg con CV% = 5.91. Nella terza colonna di ciascuna tabella à ̈ indicato il contenuto di Mesoglicano in ciascun film testato (media 5 repliche eseguite su 3 membrane diverse o su 5) Poiché il peso sperimentale dei tre lotti di film à ̈ risultato 550 mg ± 15 mg, pari a circa l’85% del teorico; questa differenza à ̈ stata tenuta presente nel calcolo del recupero percentuale dell’attività dal biofilm.
I limiti fiduciali di un metodo complesso possono essere quantificati mediante la seguente formula: ± (t x CV%)/(n-1)<1/2>in cui n à ̈ il numero di repliche effettuate ed il t di Student à ̈ calcolato al 95% di probabilità per n-1 gradi di libertà .
Trattandosi di un metodo biologico abbastanza complesso e quindi affetto da errori, à ̈ stato deciso, per ogni sessione di lavoro, di testare anche l’ingrediente attivo utilizzato per la preparazione di ciascun lotto di film idrosolubile; con l’intenzione di verificare l’attendibilità dei risultati ottenuti in ciascuna sessione. Nella quarta colonna di ciascuna tabella sono riportati i titoli del lotto di Mesoglicano utilizzato per quel lotto di film. Generalmente i 3 film sono stati valutati in un’unica sessione perciò il titolo del Mesoglicano à ̈ unico, dove si à ̈ reso necessario effettuare l’analisi in più sessioni viene riportato il titolo di Mesoglicano per ciascuna sessione.
3.6.2 Discussione
Tutti i biofilm saggiati nello studio di stabilità avevano un contenuto di acqua intorno al 14% ÷ 16%. Pertanto i recuperi di mesoglicano dalla matrice si approssimano al 90%, come nel caso del lotto P1271C0 o al 100% del contenuto teorico, come nel caso del lotto P1251C0. Questa evidenza sperimentale conferma la stabilità del mesoglicano nella matrice, ma soprattutto dimostra l’attitudine del film a rilasciare l’ingrediente attivo nella zona della lesione dove ce ne sia bisogno.
Il metodo ha mostrato un certa imprecisione derivante dalla complessità dell’analisi e dal non parallelismo tra le rette dell’Eparina utilizzata come standard e quelle del Mesoglicano. Accertata quindi la ragione degli ampi limiti fiduciali,si può ritenere stabile, nel tempo,il dispositivo medico a tutte le condizioni saggiate.
Esempio 4
Valutazione dell’attività riparatrice del film idrosolubile
La sperimentazione à ̈ consistita nella valutazione dell’attività riparatrice (wound healing) del biofilm nel ridurre/chiudere una ferita indotta artificialmente. La sperimentazione à ̈ stata effettuata su un monostrato di cellule di cheratinociti umani (hacat); sul quale à ̈ stata creata una ferita (scrape) facendo scivolare una lama lungo tutto il monostrato. L’efficacia riparatrice e rigenerativa del dispositivo alle concentrazioni di 5 mg/mL, 2,5 mg/mL e 1,25 mg/mL di film idrosolubile à ̈ stata determinata mediante acquisizione di immagini fotografiche delle colture cellulari ai tempi T0, T2h, T4h, T8he T24hin confronto con la stessa colture cellulare non trattata. E’ stata ottenuta evidenza sperimentale che i margini della ferita si rimarginano spontaneamente nel controllo, ma alle concentrazioni di 5 mg/mL, 2,5 mg/mL e 1,25 mg/mL di film, già dopo 2 ore, 4 ore e 8 ore la velocità di rimarginazione à ̈ maggiore rispetto alla velocità della riparazione spontanea rilevata nei controlli. Le variazioni di ampiezza della ferita, intese come maggiore velocità di rimarginazione, nelle colture trattate rispetto alla coltura controllo sono significative ai tempi T2he T4h. Il film idrosolubile incrementa le proprietà rigeneranti delle cellule, stimolandone la proliferazione e la migrazione rendendo così più veloci ed efficaci le loro capacità riparatrici.
Esempio 5
Modulazione dell’effetto tamponante del film.
Un campione di film idrosolubile à ̈ preparato secondo la ricetta dell’esempio 1, con la differenza che nella mescola di preparazione al momento del controllo del pH à ̈ stata addizionata una quantità opportuna di un idrossi-acido organico fino ad ottenere un pH del sistema pari a pH 5,44. Il film idrosolubile ottenuto, sottoposto al modello di valutazione come descritto nell’esempio 2, ha dimostrato di riuscire a mantenere i valori di pH variabili solo nell’intervallo di pH 6,0 ± 0,4, sebbene con le aggiunte di acido cloridrico o sodio idrossido 0,01M, nelle rispettive soluzioni e alle quantità descritte nell’esperimento dell’esempio 2. Questa caratteristica tamponante del film à ̈ stata ottenuta mediante aggiunta di un idrossiacido alla mescola di preparazione. Gli idrossiacidi preferiti sono composti organici alifatici contenenti da 3 a 6 atomi di carbonio, uno o più carbossili ed almeno una funzione ossidrilica.
Claims (16)
- RIVENDICAZIONI 1. Film idrosolubile contenente a) tra 25 e 60% in peso sul peso totale del film di sodio alginato come sostanza filmogena principale; b) tra 0,1 e 20% in peso di cellulosa microcristallina in peso sul peso totale del film, c) tra 0,1 e 25% in peso di proteine vegetali , d) almeno un glicosaminoglicano solfato e/o galattosaminoglicano solfato, come principio attivo ad attività cicatrizzante.
- 2. Film idrosolubile secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto glicosaminoglicano solfato e/o galattosaminoglicano solfato à ̈ scelto nella classe costituita da: condroitin solfato, dermatansolfato, eparansolfato, eparina, cheratansolfato e relative miscele di almeno due dei suddetti componenti.
- 3. Film idrosolubile secondo la rivendicazione 2, caratterizzata dal fatto che detta eparina ha peso molecolare medio compreso tra 4000 e 6500 e con il 60% delle molecole con pesi inferiori a 8000 Da.
- 4. Film idrosolubile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-2, caratterizzato dal fatto che l’eparina ha peso molecolare medio compreso tra: 6500 e 10500 e con almeno il 60% delle molecole caratterizzate da un peso molecolare medio inferiore a 12000 Da.
- 5. Film idrosolubile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-2, caratterizzato dal fatto che l’eparina ha peso molecolare medio compreso tra 12000 e 18000 Da.
- 6. Film idrosolubile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1, 2, 4, caratterizzata dal fatto che il glicosamminoglicano solfato e/o galattosamminoglicano solfato à ̈ costituito da una miscela (A) comprendente: α) eparina con peso molecolare 6500 e 12000 e con almeno il 60% delle molecole caratterizzate da un peso molecolare medio inferiore a 12000 Da. β) dermatan solfato γ) condroitin solfato.
- 7. Film idrosolubile secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che la miscela (A) Ã ̈ costituita da: · il 55-60% da una miscela di eparina con peso molecolare medio compreso tra 6500 e 10500 Da · 25-35% da dermatan solfato, · 4-8% da condroitin solfato (Ch-S-A prevalentemente)
- 8. Film idrosolubile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-2, in cui il glicosaminoglicano solfato e/o galattosamino glicano solfato à ̈ costituito dalla miscela (B) costituita da: α') eparina a relativamente basso peso molecolare, β') condroitin solfato.
- 9. Film idrosolubile secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che la miscela (B) Ã ̈ costituita per l'80% da eparina a relativamente basso peso molecolare e per il 20% da dermatan solfato.
- 10. Film idrosolubile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-2, in cui glicosaminoglicano solfato e/o galattosamminoglicano solfato à ̈ una miscela (C) costituita da: α") eparan solfato, β") condroitin solfato γ") dermatansolfato.
- 11. Film idrosolubile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, in cui il glicosaminoglicano e/o galattosamminoglicano solfato à ̈ una miscela (D) costituita da: α†’) dermatan solfato; β’’’) condroitinsolfato.
- 12. Film idrosolubile secondo la rivendicazione 10, in cui detta miscela (C) à ̈ costituita per 75-85% da eparan solfato, non più dell'8,5% in peso di condroitin solfati (Ch-S-A) e (Ch-S-C), e dall'8 al 16% di dermatan solfato.
- 13. Film idrosolubile secondo la rivendicazione 6, in cui la miscela (A) Ã ̈ contenuta nel film idrosolubile in concentrazioni comprese tra 0,1 e 10% in peso calcolato sul peso secco di detto film.
- 14. Dispositivo per uso medico comprendente il film idrosolubile secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-13.
- 15. Dispositivo per uso medico secondo la rivendicazione 14, caratterizzato dal fatto che à ̈ costituito dal film idrosolubile secondo la rivendicazione 14.
- 16. Dispositivo per uso medico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 14 o 15, per il trattamento di: · lesioni secondarie ad eventi patologici, scelte tra ulcere degli arti inferiori in soggetti con insufficienza venosa cronica, ulcere del piede diabetico,ulcere di origine arteriosa, · lesioni secondarie ad eventi traumatici scelte tra piaghe da decubito lesioni da escoriazioni, · lesioni secondarie ad eventi ambientali scelte tra lesioni da scottature , ustioni.
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