ITMI20110758A1 - Film di fibroina e pectina, in particolare per applicazioni medicali e di ingegneria tissutale, e relativo metodo di preparazione - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

“FILM DI FIBROINA E PECTINA, IN PARTICOLARE PER APPLICAZIONI MEDICALI E DI INGEGNERIA TISSUTALE, E RELATIVO METODO DI PREPARAZIONEâ€

La presente invenzione à ̈ relativa ad un film di fibroina e pectina, in particolare per applicazioni medicali e di ingegneria tissutale, e al relativo metodo di preparazione.

I sempre più rapidi sviluppi conseguiti nel campo della medicina hanno recentemente consentito lo sviluppo di tecnologie innovative, quali l’ingegneria tissutale, volte a sostituire o riparare organi e tessuti danneggiati in seguito a patologie traumatiche o degenerative. Per rispondere a queste esigenze, sono stati richiesti alla ricerca biomedica nuovi biomateriali compatibili con l’organismo umano e che dimostrino di possedere caratteristiche fisiche, chimiche e biologiche tali da poter svolgere adeguatamente il compito per cui sono stati progettati, come fornire un supporto resistente, sostituire tessuti persi o favorire la ricrescita di tessuti danneggiati.

La fibroina, la principale proteina della seta naturale, grazie alle sue proprietà meccaniche, di biocompatibilità e biodegradabilità, di permeabilità all’ossigeno e al vapore acqueo, di resistenza alla contaminazione microbica e di stabilità ambientale, à ̈ considerata un ottimo biomateriale.

La fibroina à ̈ infatti largamente impiegata, sia nella forma di fibra nativa che in quella chimicamente rigenerata, per ottenere una vasta gamma di strutture quali film, membrane, idrogeli e spugne, utilizzati con successo per l’adesione e la crescita di osteoblasti, fibroblasti, epatociti e cheratinociti, nonché per la cura di ustioni e ferite e nel caso di protesi vascolari, nella sostituzione del legamento crociato anteriore e nella rigenerazione ossea.

Condizione fondamentale affinché la fibroina possa essere utilizzata come supporto nell’ambito dell’ingegneria tissutale, in forma di film o scaffold 3D, à ̈ che essa si trovi in conformazione molecolare cosiddetta silk II, rendendosi pertanto insolubile in soluzioni acquose. Generalmente il cambio di conformazione molecolare viene assicurato tramite l’impiego di solventi organici, quali il metanolo o l’etanolo, i quali presentano però l’indubbio svantaggio di compromettere le proprietà fisico-meccaniche del materiale, in particolar modo nel caso dei film, per i quali la resistenza alla trazione risulta drasticamente ridotta in seguito a trattamento con tali solventi. Anche miscelando la fibroina con polietilenglicole, un polimero spesso impiegato nella realizzazione di film in fibroina, per poter garantire un’efficace transizione alla conformazione silk II senza il successivo impiego di solventi, sarebbe necessario durante la procedura di essiccamento portare il film ad una temperatura di 120°C: nella pratica ciò non à ̈ realizzabile per non incorrere in fenomeni degradativi a carico della fibroina.

I metodi attualmente noti per la realizzazione di film in fibroina per applicazioni medicali non sono pertanto pienamente soddisfacenti, risultando generalmente complessi e costosi da attuare, e/o presentando limitazioni di carattere ambientale, e/o non sono idonei all’impiego a livello di produzione industriale.

Inoltre, le strutture di fibroina che si ottengono con i metodi noti risultano talvolta fragili e/o instabili, tendendo a perdere rapidamente le proprie caratteristiche meccaniche, soprattutto di flessibilità e resistenza, e diventare rigide, non risultando pertanto idonee all’uso medicale.

È uno scopo della presente invenzione quello di fornire un film di fibroina, in particolare per applicazioni medicali e di ingegneria tissutale, e un metodo di preparazione dello stesso che siano privi degli inconvenienti qui evidenziati della tecnica nota.

La presente invenzione à ̈ dunque relativa a un film di fibroina e ad un metodo di preparazione di tale film, come definiti in termini essenziali nelle annesse rivendicazioni 1 e, rispettivamente, 7, nonché, per i caratteri addizionali preferiti, nelle rivendicazioni dipendenti.

In accordo all’invenzione, si realizzano film in fibroina nei quali la transizione conformazionale delle molecole di fibroina dalla struttura silk I alla struttura silk II viene promossa dalla pectina, un polimero naturale biocompatibile, senza l’impiego di solventi organici quali etanolo o metanolo che ne compromettono le proprietà fisicomeccaniche.

I film dell’invenzione sono quindi film in fibroina contenenti pectina.

Vantaggiosamente, come sarà chiarito nel seguito, i film contengono pectina in quantità uguale o superiore a circa 6% in peso; per esempio, la pectina à ̈ compresa tra circa 4 e circa 20% in peso e preferibilmente tra circa 6 e circa 7% in peso.

I film dell’invenzione contengono inoltre, preferibilmente (ma non necessariamente), un plastificante, in particolare glicerina. La glicerina ha essenzialmente la funzione di plastificante per migliorare le proprietà di elasticità e resistenza del film, nonché per consentire una maggiore facilità di preparazione.

Preferibilmente, i film dell’invenzione contengono glicerina (o altro plastificante) in rapporto compreso tra 1:1 e 3:1 rispetto alla pectina (rapporto % sul peso secco); più preferibilmente, i film contengono plastificante, specificamente glicerina, in rapporto 2:1 rispetto alla pectina.

I film secondo l’invenzione, una volta sottoposti a processo di sterilizzazione, sono adatti all’uso in applicazioni medicali e di ingegneria tissutale; in particolare, prove di coltura di cellule mesenchimali estratte da tessuto adiposo condotte su substrati costituiti da film realizzati in accordo all’invenzione ne hanno confermato la funzionalità e l’efficacia nella medicina rigenerativa.

Dopo avere estratto la fibroina dalla seta naturale (proveniente dai bozzoli di Bombyx mori) tramite separazione della fibroina dalla sericina, per esempio mediante sgommatura in autoclave, il metodo dell’invenzione comprende in sintesi le fasi di:

- solubilizzare la fibroina, per esempio in una soluzione di Ca(NO3)2in MeOH;

- purificare la fibroina, per esempio tramite filtraggio e/o dialisi;

- preparare una miscela base di fibroina, pectina e, preferibilmente, glicerina (o altro plastificante) in un sistema solvente (formato da uno o più solventi);

- formare un film di fibroina, contenente anche pectina e glicerina (o altro plastificante), per esempio tramite tecnica di cosiddetto “casting†;

- sterilizzare il film, in particolare con vapore saturo sotto pressione (in autoclave).

In maggior dettaglio, la preparazione della miscela di fibroina, pectina ed eventualmente plastificante (glicerina) comprende le fasi di:

- predisporre rispettive soluzioni separate di fibroina, pectina e glicerina (o altro plastificante);

- miscelare le soluzioni a formare la miscela base. La miscela base, formata da fibroina e pectina e preferibilmente anche plastificante (glicerina) in solvente essenzialmente acquoso à ̈ poi utilizzata per la preparazione dei film di fibroina, in particolare tramite le fasi di:

- disporre la miscela base su una base di formatura; - rimuovere il solvente (o i solventi) del sistema solvente per ottenere un film di fibroina e pectina, contenente opzionalmente anche glicerina, per esempio tramite asciugatura in stufa.

Per il successivo utilizzo come supporto per colture cellulari, à ̈ fondamentale che i film sopportino un processo di sterilizzazione e che questo sia condotto con modalità tali da non deteriorare le proprietà dei film.

Alcuni metodi di sterilizzazione tradizionali (per esempio, immersione in etanolo, somministrazione di calore secco) presentano inconvenienti o non sono idonei, in particolar modo nel caso di una produzione industriale.

In accordo al trovato, i film di fibroina sono vantaggiosamente sterilizzati mediante vapore saturo sotto pressione (per esempio in autoclave). Con questa tecnica, i film sterilizzati mantengono la struttura silk II e le caratteristiche fisico-meccaniche volute, e non si riscontrano fenomeni di degradazione significativi.

Sostanze medicali e/o terapeutiche possono essere aggiunte alla miscela base e/o al film di fibroina. Preferibilmente, queste sostanze sono introdotte nella miscela base, prima della formazione del film.

La base di formatura può essere semplicemente una superficie di fondo di un contenitore dai bordi rialzati e forma opportuna, in cui si versano le miscele base; oppure possono essere usati stampi e forme in grado di conferire una geometria tridimensionale e comunque variabile ai film, ed eventualmente anche strutturati per la formazione di membrane forate.

I film in fibroina e pectina realizzati secondo l’invenzione sono utili principalmente per uso medicale in genere e specificamente per la realizzazione di bendaggi e supporti tessutali (supporti o impalcature per la crescita di tessuti biologici).

I film realizzati in accordo al trovato hanno eccellenti caratteristiche meccaniche, risultando flessibili e resistenti, e sono stabili nel tempo, mantenendo tali caratteristiche per lunghi periodi.

L’invenzione à ̈ ulteriormente descritta nei seguenti esempi di attuazione non limitativi.

ESEMPI

1. Preparazione dei film di fibroina.

Bozzoli di Bombyx mori forniti dall’Istituto Zoologico di Padova, dove l’allevamento della specie viene effettuato con dieta artificiale ed in condizioni di contaminazione microbica controllata, sono stati sgommati in autoclave con acqua bidistillata a 120°C (1 g di bozzoli in 40 mL d’acqua) alla pressione di 2 bar per 1 h. Per completare il processo di separazione della sericina dalla fibroina, i bozzoli sgommati sono stati sottoposti a tre lavaggi con acqua deionizzata alla temperatura di 60°C e lasciati asciugare a temperatura ambiente per 36÷48 h.

La fibroina à ̈ stata successivamente solubilizzata in una soluzione di nitrato di calcio-metanolo (75:25 w/w) ponendola in bagno termostatico per 1 ora a 65°C sotto agitazione ed in modo da ottenere una concentrazione di fibroina in soluzione pari al 5% w/v. La soluzione di fibroina à ̈ stata quindi filtrata su setto poroso in vetro sinterizzato (diametro dei pori 10÷16 •m) e posta a dializzare in acqua bidistillata per quattro giorni utilizzando membrane semipermeabili con cut-off di 12.000 Da, avendo l’accortezza di cambiare regolarmente l’acqua per rimuovere completamente i sali. Al termine della dialisi la soluzione à ̈ stata nuovamente filtrata su setto poroso (diametro dei pori 100÷160 •m) e quindi impiegata in soluzione acquosa per la produzione dei film di fibroina.

Polvere di pectina à ̈ stata disciolta in acqua deionizzata a circa 80°C sotto agitazione continua fino ad ottenere una soluzione all’1% in peso.

Si à ̈ preparata una soluzione acquosa di glicerina al 50% in volume in acqua deionizzata.

Varie quantità delle soluzioni di fibroina, pectina e glicerina sono state miscelate sotto gentile agitazione, formando diverse miscele base formate essenzialmente da fibroina, pectina e glicerina in un sistema solvente (acquoso) e aventi le seguenti composizioni (percentuali peso su volume di soluzione):

fibroina: circa 2,50÷6,00 % (w/v)

pectina: circa 0,05÷0,50 % (w/v)

glicerina: circa 0,10÷2,00 % (w/v)

Le miscele base risultanti sono state versate su basi di formatura (per esempio piastre Petri in polietilene) e messe in stufa ventilata a 60°C fino a completa eliminazione del sistema solvente (circa 6 ore), ottenendo dei film aventi le seguenti composizioni (percentuali peso su peso totale):

fibroina: circa 60÷99 % (w/w)

pectina: circa 1÷20 % (w/w)

glicerina: circa 1÷30 % (w/w)

I diversi film ottenuti sono stati analizzati mediante spettroscopia FT-IR per valutare il cambio di conformazione molecolare in funzione della quantità di pectina impiegata.

La modifica conformazionale alla struttura silk II si osserva a partire da una concentrazione di pectina del 4% (percentuale in peso sul secco); la presenza della struttura silk II cresce al crescere del contenuto di pectina fino a circa il 6%, per poi rimanere sostanzialmente inalterata al crescere ulteriore del contenuto di pectina oltre il 6%.

Vantaggiosamente, quindi, il film contiene pectina in quantità uguale o superiore a circa 6% in peso; i film dell’invenzione possono comunque contenere una quantità di pectina compresa tra circa 4 e circa 20% in peso e preferibilmente tra circa 6 e circa 7% in peso.

Con contenuto di pectina intorno a circa 6% il cambio conformazionale à ̈ soddisfacente ed il film, quando posto in acqua, risulta insolubile e stabile.

La presenza di glicerina, avente essenzialmente la funzione di plastificante (per migliorare le proprietà di elasticità e resistenza del film, nonché per consentire una maggiore facilità di preparazione), non sembra incidere sulla transizione conformazionale promossa dalla pectina.

Preferibilmente, i film dell’invenzione contengono glicerina in rapporto compreso tra 1:1 e 3:1 rispetto alla pectina (rapporto % sul peso secco); più preferibilmente, i film contengono glicerina in rapporto 2:1 rispetto alla pectina.

Al posto della glicerina, possono essere impiegati altri plastificanti.

2. Sterilizzazione dei film di fibroina.

I film ottenuti sono stati sottoposti a sterilizzazione con diversi metodi: vapore saturo sotto pressione, calore secco e raggi •.

La sterilizzazione con vapore saturo à ̈ stata effettuata mediante autoclave effettuando un ciclo di sterilizzazione a 121°C per 20 minuti con tempo di asciugatura di 10 minuti.

La sterilizzazione con calore secco a 160°C per 120 minuti à ̈ stata compiuta tramite stufa termostatica ad aria.

La sterilizzazione con raggi • à ̈ stata condotta alle dosi di 20, 40 e 60 kGy.

La sterilizzazione in autoclave mediante vapore saturo sotto pressione si à ̈ rivelata la tecnica più idonea. Con questa tecnica, i film sterilizzati mantengono la struttura silk II e le caratteristiche fisico-meccaniche volute, e non si riscontrano fenomeni di degradazione significativi.

3. Prove di coltura.

I film realizzati in accordo all’invenzione sono stati impiegati come supporto per la coltura di cellule staminali da tessuto adiposo, al fine di verificare la

Tramite analisi al microscopio ottico, al microscopio elettronico a scansione e a trasmissione si à ̈ dimostrato che i film sono in grado di supportare efficacemente l’adesione, la crescita e la proliferazione delle cellule. In particolar modo si à ̈ potuta osservare una crescita particolarmente diffusa e con numerose interconnessioni fra le cellule sui film contenenti almeno il 6% (w/w) di pectina.

Resta infine inteso che al film in fibroina e al relativo metodo di preparazione qui descritti ed illustrati possono essere apportate modifiche e varianti che non escono dall’ambito delle annesse rivendicazioni.

Claims (14)

1. RIVENDICAZIONI 1. Film in fibroina, in particolare per applicazioni medicali e di ingegneria tissutale, caratterizzato dal fatto di comprendere pectina.
2. 2. Film secondo la rivendicazione 1, contenente pectina in quantità uguale o superiore a circa 6% in peso.
3. 3. Film secondo la rivendicazione 1 o 2, contenente una quantità di pectina compresa tra circa 4 e circa 20% in peso e preferibilmente tra circa 6 e circa 7% in peso.
4. 4. Film secondo una delle rivendicazioni precedenti, comprendente inoltre glicerina e/o altro plastificante.
5. 5. Film secondo la rivendicazione 4, contenente glicerina e/o altro plastificante in quantità compresa tra circa 1 e circa 30% in peso.
6. 6. Film secondo la rivendicazione 4 o 5, contenente glicerina e/o altro plastificante in rapporto compreso tra circa 1:1 e circa 3:1 rispetto alla pectina (rapporto sul peso secco) e preferibilmente in rapporto 2:1.
7. 7. Metodo di preparazione di un film in fibroina, in particolare per applicazioni medicali e di ingegneria tissutale, comprendente le fasi di: - preparare una miscela base di fibroina e pectina in un sistema solvente; - formare un film di fibroina e pectina a partire dalla miscela base, rimuovendo il sistema solvente.
8. 8. Metodo secondo la rivendicazione 7, in cui la fase di preparazione della miscela base include l’aggiunta di un plastificante, in particolare glicerina, alla fibroina e alla pectina.
9. 9. Metodo secondo la rivendicazione 8, in cui il plastificante à ̈ glicerina.
10. 10. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 7 a 9, in cui la fase di preparazione della miscela base comprende le fasi di: predisporre rispettive soluzioni separate di fibroina, pectina ed eventualmente plastificante; e miscelare le soluzioni a formare la miscela base.
11. 11. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 7 a 10, in cui la fase di formazione del film à ̈ condotta tramite tecnica di “casting†e comprende le fasi di: disporre la miscela base su una base di formatura; e rimuovere il sistema solvente tramite asciugatura.
12. 12. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 7 a 11, in cui il sistema solvente à ̈ essenzialmente una soluzione acquosa.
13. 13. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 7 a 12, comprendente, prima della fase di preparazione della miscela base, le fasi di: solubilizzare la fibroina; e purificare la fibroina.
14. 14. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 7 a 13, comprendente una fase di sterilizzare il film tramite trattamento con vapore saturo sotto pressione.