ITMI20011380A1 - Antigene tlp e sue applicazioni diagnostiche - Google Patents
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Description
Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:
“ANTIGENE TLP E SUE APPLICAZIONI DIAGNOSTICHE”
La presente invenzione riguarda un antigene TLP ed il suo uso in tecniche immunodiagnostiche per Γ individuazione precoce dei tumori.
Con Γ acronimo TLP (“Tumor liberated particles”) si identificano complessi proteici isolati da tessuti tumorali secondo la procedura inizialmente descritta in EP283433. Successivamente sono stati caratterizzati diversi peptidi e proteine formanti il complesso TLP. In Oncology, 1983 (40:248-253), si descrive una proteina TLP di 214 kDa espressa prevalentemente da carcinoma polmonare. Epitopi di tale proteina ed anticorpi diretti contro gli stessi sono descritti in WO98/01462. EP649433 descrive una proteina TLP di 100 kDa isolata da carcinoma polmonare e peptidi immunogenicamente attivi da essa derivati. Tali peptidi sono stati utilizzati per generare anticorpi monoclonali e policlonali che hanno trovato impiego nella caratterizzazione del pattern di espressione di TLP in tessuti di varia origine e nella convalida delle proteine TLP come marcatori tumorali (WO94/01458 e W098/15282).
Gli usi finora proposti del complesso TLP o delle proteine da esso derivate riguardano principalmente l’induzione di una risposta immunitaria in pazienti tumorali. Si è ora sorprendentemente trovato che i complessi TLP possono essere utilizzati per la determinazione precoce dell’insorgenza o delle fasi iniziali di progressione del tumore. In particolare si è visto che un preparato TLP ottenuto con una metodica diversa da quella precedentemente descritta in EP283433, è in grado di individuare in maniera specifica e attendibile la presenza di anticorpi nei fluidi biologici di pazienti tumorali in una fase precoce dello sviluppo della malattia.
Il procedimento di preparazione del complesso TLP, che costituisce un primo aspetto dell’invenzione, comprende i seguenti passaggi:
a. congelamento di un campione di tessuto tumorale;
b. scongelamento del campione;
c. rimozione delle parti necrotiche;
d. sminuzzamento della massa tumorale fino a omogeneità e lavaggio; e. congelamento e scongelamento del materiale omogenato per tre volte;
f. sonicazione per 3 minuti in bagno di ghiaccio, ripetuta tre volte; g. centrifugazione a 33000 x g per 120 minuti;
h. filtrazione del surnatante con filtri a porosità 0,45 μm;
i. centrifugazione come in (g) del filtrato sospeso in soluzione tampone;
j. filtrazione del sumatante come in (h);
k. separazione del filtrato contenente TLP.
Gli estratti tumorali così ottenuti sono costituiti da materiale proteico in cui è disperso il TLP. Quest’ultimo ha un peso molecolare apparente di 214 kDa.
Si è visto che il preparato TLP ottenuto con il procedimento descritto, opportunamente utilizzato in procedimenti immunodiagnostici, è in grado di rivelare con alta specificità la presenza di anticorpi nei fluidi biologici di pazienti neoplastici. Specificamente, testando diversi campioni di sangue (sieri) in saggi immunochimici in cui detto preparato veniva immobilizzato su un supporto solido, si rilevava una reazione immunospecifica verso i sieri di pazienti portatori di neoplasia e praticamente nessuna reattività verso i sieri di soggetti sani. Le prove, ripetute diverse volte su gruppi di soggetti con tumori di varia origine e a diversi stadi di progressione della malattia, hanno sempre confermato lo stesso risultato. Di rilievo, si è trovato che il preparato TLP dell’invenzione è in grado di discriminare i sieri di soggetti sani da quelli di pazienti neoplastici in una fase assai precoce della malattia (insorgenza e inizio iperproliferazione tumorale).
Pertanto, secondo un ulteriore aspetto, l’invenzione si riferisce all’uso di TLP ottenuto come descritto in precedenza, in immunosaggi per la diagnosi del tumore, in particolare per la diagnosi precoce della malattia.
Il metodo diagnostico basato sull’uso di TLP secondo l’invenzione è utile, per esempio, nello screening della popolazione al fine di determinare la presenza di malattia neoplastica o pre-neoplastica, nella determinazione del rischio di sviluppo di tale malattia, o per seguire l’andamento di una condizione neoplastica accertata.
; Tra i tipi di tumore che sono suscettibili di diagnosi secondo il metodo dell’ invenzione, si citano i carcinomi, in particolare carcinoma urogenitale e del colon, il cancro di seno, stomaco, esofago, colon, rene, utero, ovaio, prostata, fegato, tratto urinario, vescica, testa, collo, preferibilmente il cancro del polmone. La preparazione di TLP sarà diversa a seconda del tessuto di partenza.
Un immunosaggio secondo l’invenzione prevede essenzialmente le fasi di: a) porre in contatto un campione di fluido biologico contenente anticorpi con il preparato TLP;
b) determinare la formazione di un complesso tra gli anticorpi presenti nel fluido biologico e il preparato TLP.
Preferibilmente, l’immunosaggio comprende le fasi di:
a) immobilizzare il preparato TLP su supporto solido;
b) incubare il TLP immobilizzato (antigene) con un campione di siero da testare;
c) determinare il legame specifico antigene/anticorpo.
Supporti solidi idonei sono noti all’esperto del settore e comprendono materiale plastico (piastre di reazione, pozzetti, provette), beads di polistirene, latice, magnetici, particelle di metallo colloidale, superfici di vetro e/o silicio e altri.
Il legame antigene/anticorpo può essere rivelato con metodi radioisotopici o non-radioisotopici. Questi comprendono, per esempio, le tecniche IRMA (Immune Radioimmunometric Assay), EIA (Enzyme Immuno Assay), ELISA (Enzyme Linked Immuno Assay), FIA (Fluorescent Immuno Assay), CLIA (Chemioluminescent Immune Assay). Mezzi di detezione idonei prevedono l’uso di marcatori quali radionuclidi, enzimi, coenzimi, fluorofori, agenti di chemiluminescenza, cromogeni, substrati o cofattori enzimatici, inibitori enzimatici, produzione di radicali liberi, coloranti etc.
Gli immunosaggi possono essere di tipo competitivo o non competitivo, in forma diretta o indiretta. Per i diversi tipi di immunosaggio si fa per esempio riferimento a US3766162, US3791932, US3817837, US4233402, US43761 10.
Secondo una realizzazione preferita, l’immunosaggio è di tipo ELISA e può essere svolto seguendo la procedura qui descritta. Dopo che il preparato TLP è stato adsorbito su una superficie solida, si bloccano i siti di legame specifico con un’opportuna preparazione contenente proteine, quali BSA (bovine serum albumin), siero inattivato al calore (es. NGS - normal goat serum) oppure latte in polvere ricostituito con soluzione tampone. Dopo ripetuti lavaggi, il supporto solido è incubato con il campione da analizzare contenente anticorpi (anticorpo 1), preferibilmente siero opportunamente diluito mediante aggiunta di soluzione tampone eventualmente addizionata di proteine. Dopo incubazione per un periodo sufficiente alla formazione del legame antigene (TLP)/anticorpo 1, il supporto è lavato per rimuovere la proteina non legata e successivamente incubato con un anticorpo che lega le IgG presenti nel campione di siero (anticorpo 2 - anti-anticorpo 1), coniugato con perossidasi di rafano (HRP) oppure con altri enzimi quali betagalattosidasi, fosfatasi alcalina, glucosio ossidasi. Dopo un tempo sufficiente alla formazione del complesso ternario anticorpo2/anticorpol -antigene, si eseguono ripetuti lavaggi per rimuovere il coniugato non reagito e poi si aggiunge il substrato enzimatico. Si ha così reazione enzima/substrato con sviluppo di luce (colore) che può essere misurata mediante analisi della densità ottica (O.D.).
Secondo un ulteriore aspetto, l’invenzione comprende un kit per l’esecuzione del metodo diagnostico sopra descritto. Il kit, utilizzato per la determinazione di anticorpi anti-TLP nei campioni di fluidi bilogici da analizzare, potrà contenere uno o più preparati TLP, eventualmente già immobilizzati su supporto solido, gli anticorpi secondari marcati, per esempio coniugati con un enzima, reagenti per la rivelazione degli anticorpi legati, tamponi, controlli, diluenti, detergenti, stabilizzanti e ogni altro componente che abbia una qualche utilità nella preparazione ed esecuzione dell ’immunosaggio.
ESEMPI
Esempio 1 - preparazione di TLP
Si eseguono i seguenti passaggi:
Reperti chirurgici di tumore polmonare del peso di 20-60 gr sono posti in soluzione salina tamponata (20 mMTRIS-HCl pH 7,2) priva di glucosio e carbonato/bicarbonato;
Congelamento dei reperti, in soluzione tampone, fino al momento dell’uso;
Operando a 4°C, scongelamento delle parti necrotiche tramite tagliuzzamento con forbicine e lavando con tampone TRIS;
La massa tumorale pulita è tagliuzzata con forbicine fino a risultare materiale omogeneo e lavata con tampone TRIS;
Il materiale omogenato è congelato e scongelato per 3 volte; Il materiale tumorale è sonicato per 3 minuti, per tre volte (Raytheon sonic oscillator 0,9 Kc in bagno di ghiaccio);
- Il materiale sonicato è centrifugato mediante ultracentrifuga a 33000 g per 120 min;
Il sumatante è raccolto e filtrato con filtrini ACRODISC da 0,45 m; Il tessuto è risospeso in TRIS in opportuno rapporto 1:1 p/v e ultracentrifugato di nuovo;
Il sumatante è di nuovo filtrato e aggiunto a quello precedente;
La fase liquida contiene il TLP
La resa in rapporto alla massa tumorale di partenza è circa il 10% p/v. Il contenuto proteico nell’estratto tumorale grezzo ha una concentrazione di circa 20 μg/ml (il TLP è pari a circa Γ1% del contenuto proteico totale).
Esempio 2 - esecuzione saggio ELISA
TLP preparato come nell’esempio precedente, in tampone TRIS - pH 7,2 e ad una concentrazione di 10 μg/ml, è stato aggiunto a ciascun pozzetto in ragione di 0,1 ml pari a 0,1μg/pozzetto di una piastra per microtitolazione da 96 pozzetti e incubato per una notte a 25°C.
La piastra è stata lavata due volte con tampone PBS, stabilizzata ed essiccata per una notte sotto vuoto.
I campioni di siero sono stati diluiti 1: 50 con tampone di diluizione (PBS con 5mM EDTA e 1% BSA), aggiunti ai pozzetti rivestiti e incubati per 30 minuti a 25°C.
Al termine dell’incubazione, le piastre sono state lavate sei volte con TBS. E’ stato quindi aggiunto il substrato TMB (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina) a ciascun pozzetto, e le piastre sono state incubate per 15 min a 25°C. Al termine dell’ incubazione si sono aggiunti ΙΟΟμΙ di soluzione di stop (0,1 M HC1) a ciascun pozzetto. La soluzione contenuta in quest’ultimi è stata letta a 450 nm.
Curva di calibrazione:
a) Estratto tumorale grezzo (cattura dell’ anticorpo): vs. Pattern di sieri umani Ab+ (in precedenza testati vs. Γ antigene sintetico TLP correlato RTNKEASIC).
b) Monoclonale anti-TLP (cattura dell’ antigene): vs. Pattern di sieri umani Ag+ artificiali (sieri umani TLP-free addizionati in quantità scalari di antigene sintetico TLP correlato RTNKEASIC).
Controllo:
si usano come controllo, sieri di soggetti sani (Ab-anti-TLP-free) .
Questi sieri sono stati testati precedentemente vs. l’antigene sintetico TLP correlato RTNKEASIK e hanno dato esito negativo.
Esempio 3 - validazione del metodo diagnostico
Sono stati confrontati 10 sieri di soggetti con diagnosi certa di tumore polmonare (sieri positivi) contro 10 sieri di soggetti sani (sieri negativi). Il coating della piastra è stato effettuato con TLP estratto da tumore polmonare.
Il test diagnostico si considera valido se il rapporto di densità ottica (O.D.) tra campioni positivi e negativi è uguale o superiore a 4:1.
Tabella 1
Rapporto O.D. Sieri / O.D. Sieri - = 7:1
La stessa prova è stata condotta a partire da sieri di pazienti affetti da tumore del colon retto e tumore urogenitale. Il coating della piastra è stato effettuato con TLP ottenuto dai rispettivi tumori. I risultati sono riportati nelle tabelle 2 (tumore colon retto) e 3 (tumore urogenitale):
Tabella 2
Tabella 3
Rapporto OD: 16:1
Successivamente sono stati testati altri sieri a una diluizione di 1:200. I risultati sono riportati in Tabella 4:
Tabella 4
Fissando un cut-off pari a 0,03, si confermano sei dei sette sieri positivi.
Claims (9)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la preparazione di un estratto tumorale (TLP) che comprende i seguenti passaggi: a. congelamento di un campione di tessuto tumorale; b. scongelamento del campione; c. rimozione delle parti necrotiche; d. sminuzzamento della massa tumorale fino a omogeneità e lavaggio; e. congelamento e scongelamento del materiale omogenato per tre volte; f. sonicazione per 3 minuti in bagno di ghiaccio, ripetuta tre volte; g. centrifugazione a 33000 x g per 120 minuti; h. filtrazione del surnatante con filtri a porosità 0,45 μm; i. centrifugazione come in (g) del filtrato sospeso in soluzione tampone; j. filtrazione del sumatante come in (h); k. separazione del filtrato contenente TLP.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui il campione di tessuto tumorale proviene da carcinomi urogenitali, carcinomi del colon e cancro polmonare.
- 3 . Estratto tumorale (TLP) ottenibile con il procedimento delle rivendicazioni 1-2.
- 4. Uso di TLP secondo la rivendicazione 3 in immunosaggi per la diagnosi del tumore.
- 5. Uso secondo la rivendicazione 4, in cui detto immunosaggio è ELISA.
- 6. Uso secondo le rivendicazioni 4-5, in cui il tumore è carcinoma urogenitale, carcinoma del colon e cancro polmonare.
- 7. Metodo per la determinazione di anticorpi contro l’estratto tumorale della rivendicazione 3 in un campione di fluido biologico che comprende: a) porre in contatto il campione di fluido biologico con il preparato TLP; b) determinare la formazione di un complesso tra gli anticorpi presenti nel campione e il preparato TLP.
- 8. Metodo secondo la rivendicazione 6, che comprende: a) immobilizzare il preparato TLP su supporto solido, b) incubare il TLP immobilizzato (antigene) con un campione di siero da testare; c) determinare il legame specifico antigene/anticorpo.
- 9. Kit per l’esecuzione del metodo delle rivendicazioni 6-7 che comprende almeno un preparato TLP ed eventualmente anticorpi secondari marcati, reagenti per la rivelazione degli anticorpi legati, tamponi, controlli, diluenti, detergenti.
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