ITMI20000383A1

ITMI20000383A1 - Coniugati di acidi biliari con chelati complessi di ioni metallici e loro uso

Info

Publication number: ITMI20000383A1
Application number: IT2000MI000383A
Authority: IT
Inventors: Mario Virtuani; Haen Christoph De; Andrea Beltrami; Luciano Lattuada; Enrico Cappelletti
Original assignee: Bracco Spa
Priority date: 2000-02-29
Filing date: 2000-02-29
Publication date: 2001-08-29
Also published as: JP2003525306A; US6803030B2; IT1317862B1; EP1259532B1; ATE294813T1; EP1259532A1; DE60110558D1; JP5052726B2; AU4064401A; ITMI20000383A0; WO2001064708A1; US20030113265A1; DE60110558T2

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo:

"CONIUGATI DI ACIDI BILIARI CON CHELATI COMPLESSI DI IONI METALLICI E LORO USO”

La presente invenzione riguarda nuovi composti dotati di capacità chelante nei confronti di ioni metallici paramagnetici ed il loro uso come agenti di contrasto nella tecnica nota come “Magnetic Resonance Imaging” (M.R.I.)· particolare, la presente invenzione riguarda composti ottenuti dalla coniugazione di un carrier costituito da un residuo di un acido biliare con molecole dotate di capacità chelante, i loro chelati complessi con ioni metallici paramagnetici bi e trivalenti, i loro sali e l’uso degli stessi come agenti di contrasto per M.R.I..

La letteratura brevettuale è ricca di brevetti e domande di brevetto relativi a chelati di leganti poliamminopolicarbossilici lineari e ciclici con metalli paramagnetici come agenti di contrasto per M.R.I.. Lo sviluppo di questi composti è, anzi, tale che alcuni di loro sono già in uso clinico (Gd-DTPA, sale di N-metilglucammina del complesso di gadolinio con l’acido dietilentriamminopentaacetico, MAGNEVIST<®>, Schering; Gd-DOTA, sale di N-metilglucammina del complesso di gadolinio con l’acido 1,4,7,1 0-tetraazaciclododecan-1 ,4,7,10-tetraacetico, DOT AREM<®>, Guerbet; Gd-HPD03A, complesso di gadolinio con l’acido 10-(2-idrossipropil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecan- 1 ,4,7-triacetico, PROHANCE<®>, BRACCO). Questi agenti di contrasto si distribuiscono principalmente negli spazi extracellulari e sono destinati ad un uso di tipo generale.

Perché un agente di contrasto sia in grado di fornire informazioni diagnosticamente utili anche nel caso di piccole lesioni quali, ad esempio, le metastasi del tessuto epatico, deve, invece, accumularsi prevalentemente negli spazi intracellulari del parenchima di detto organo. Gli agenti epatobliliari intracellulari sono in grado di entrare negli epatociti attraversandone la membrana sinusoidale e sono escreti prevalentemente per via biliare. La natura lipofilica delle loro unità chelanti è ritenuta responsabile dell’uptake preferenziale da parte degli epatociti (Lauffer, R.B.; Chem. Rev. 87, 901-927, 1987; Lauffer, R.B. e al.; Magn. Reson. Med. 4, 582-590, 1987).

L’acido colico è uno degli acidi biliari ottenuti per catabolismo del colesterolo; esso viene secreto dagli epatociti nella bile (Elliot, W. H.; Sterols and bile acìds ; H. Danielsson and J. Sjovall, Eds.; pp 231-278, Elsevier, New York, 1985).

Agenti di contrasto per M.R.I. comprendenti un residuo di un agente chelante coniugato tramite una catena spaziante ad un residuo di un acido biliare vengono descritti nella domanda di brevetto Bracco WO95/01958. Detti agenti sono indicati come particolarmente utili nellimaging del fegato e dei dotti biliari.

Si è altresì visto che il residuo di acido biliare fornisce ai chelanti che lo comprendono una capacità di interagire con le proteine piasmatiche e di formare con queste legami di natura non covalente. Questa proprietà fa sì che gli agenti di contrasto comprendenti un residuo di acido biliare siano anche particolarmente utili nell’imaging del sistema vascolare mediante MRI, come viene descritto nella domanda di brevetto MI98A002802.

Altri esempi di agenti di contrasto in cui chelanti poliamminopolicarbossilici, in grado di complessare ioni metallici, sono coniugati con vari substrati, tra cui gli acidi biliari, sono descritti nella domanda di brevetto EP 279307( Abbott). L’unico composto di questo tipo esemplificato nella domanda di brevetto è un complesso di <lu>In di un coniugato in cui un derivato funzionalizzato dell’EDTA è legato, via legame ammidico, alla funzione carbossilica di un acido colico. Non viene però citata in alcun modo la possibilità di chelare ioni metallici paramagnetici per un uso dei complessi chelati in M.R.I.

Betebenner David A. e al. in Bioconjugate Chem. 2; 117-123, 1991 descrivono la preparazione e la caratterizzazione di un derivato dell’EDTA coniugato con un acido colico e del corrispondente chelato complesso con <11 >‘In. La coniugazione avviene tramite l aminino gruppo terminale di un derivato funzionale dell’EDTA con un estere dell’acido colico, sfruttando una reazione già nota ed usata per legare unità chelanti alle proteine (Westerberg, D. A. e al., J. Med. Chem. 32, 236-243, 1989; Brechbiel, M. W. E al., Inorg. Chem. 25, 2772-2781, 1986).

Studi di biodistribuzione e di imaging scintigrafico condotti con questo composto mostrano l’uptake dello stesso da parte del fegato seguito da un rapido passaggio nell’ intestino.

Tutti gli agenti noti comprendenti il residuo di un acido biliare sono caratterizzati dalla presenza di una sola unità di chetante e, di conseguenza, di un solo ione metallico coordinato per ogni molecola dell’agente stesso.

Oggetto della presente invenzione sono composti in grado di chelare almeno due ioni metallici. Detti composti sono ottenuti dalla coniugazione di un carrier costituito da un residuo di un acido biliare con due molecole dotate di capacità chelante, laddove detta coniugazione avviene tramite un substrato reattivo centrale polifunzionale o sintone centrale. In particolare, i legami tra i sintoni centrali dell’invenzione e le unità di chelante sono ottenuti tramite residui funzionali scelti opportunamente in modo da consentire a dette unità chelanti di mantenere invariata la propria capacità di coordinazione dello ione metallico e da non diminuire in alcun modo la stabilità dei chelati complessi ottenuti.

In particolare, oggetto della presente invenzione sono composti di formula generale (I)

dove:

A è un substrato reattivo polifunzionale contenente almeno tre gruppi funzionali derivante da un qualunque residuo organico polivalente che può essere alifatico a catena aperta, ramificata o no, oppure può essere aliciclico, o eterociclico contenente N, O e/o S, oppure può essere aromatico o eteroaromatico;

Z è un residuo di un acido biliare;

Yj ed Y 2, uguali o diversi tra loro, rappresentano il residuo di un agente chelante degli ioni metallici bi-trivalenti aventi numero atomico variabile tra 20 e 31, 39, 42, 43, 44, 49, o fra 57 e 83;

Lb L2 ed L3, uguali o diversi tra loro, rappresentano un legame (semplice) tra i gruppi funzionali delle unità coinvolte nel legame o una catena spaziante comprendente fino a un massimo di 20 atomi di carbonio.

Per acido biliare si intende l’insieme degli acidi biliari ottenuti per bioconversione del colesterolo o per modificazione sintetica dello stesso, ed in particolare gli acidi: colico, deossicolico, chenodeossicolico, ursodeossicolico, litocolico, ed i loro derivati compresi quelli con la taurina e la glieina . Detti residui sono uniti al gruppo L 3 attraverso legami covalenti che coinvolgono il gruppo idrossi, eventualmente convertito in un gruppo animino, in posizione 3 o il gruppo carbossi in posizione 24 dello scheletro colanico.

Composti preferiti sono quelli in cui L, e L2, uguali o diversi tra loro, rappresentano una catena spaziante di formula (II)

in cui:

Q è una catena alchilica C1C8 eventualmente sostituita da 1 a 3 gruppi OH;

s è un numero da 0 a 5;

Rx è un atomo di H, o un gruppo alchile C1-C5;

X è uguale a

L3 è un gruppo di formula (III)

in cui: X ed s assumono i valori precedentemente definiti (con la condizione che se s è diverso da 0 allora CO e X sono presenti).

Particolarmente preferiti sono i composti in cui L1 e L2 sono scelti tra quelli di formula (IV), (V), (VI)

L3 è un legame semplice tra i gruppi funzionali Z ed A o un gruppo

—

in cui:

n è un numero tra 1 e 8, e

R, assume i valori precedentemente definiti.

L’invenzione riguarda anche i chelati complessi di detti composti di formula (I) con gli ioni bi e trivalenti degli elementi metallici aventi numero atomico variabile tra 20 e 31, 39, 42, 43, 44, 49, o fra 57 e 83, come pure i loro sali con basi organiche fisiologicamente compatibili scelte tra ammine primarie, secondarie, terziarie o amminoacidi basici, oppure con basi inorganiche i cui cationi sono sodio, potassio, magnesio calcio o loro miscele, oppure con anioni di acidi organici fisiologicamente accettabili scelti, ad esempio, fra acetato, succinato, citrato, fumarato, maleato, ossalato oppure con anioni di acidi inorganici quali gli ioni degli acidi alogenidrici, cioè cloruri, bromuri, ioduri.

L’invenzione riguarda anche la preparazione dei prodotti di formula generale (I) come pure dei loro sali complessi e l’uso degli stessi per la preparazione di formulazioni farmaceutiche ad uso diagnostico, in particolare per formulazioni contrastografiche per Risonanza Magnetica.

I composti oggetto della presente invenzione possono inoltre essere eventualmente coniugati chimicamente ad opportune macromolecole o inglobati in adatti mezzi veicolanti.

Composti preferiti sono quelli in cui Z è un residuo derivante dai seguenti acidi biliari o dai loro derivati con la taurina e la glieina:

Acidi biliari

A è un substrato reattivo polifunzionale avente preferibilmente funzioni ammino e/o carbossi. Esempi preferiti di substrati A sono riportati in Tabella 1.

I composti 1-17 possono essere utilizzati come tali oppure sotto forma di derivati protetti o attivati ai gruppi funzionali amminici o carbossilici.

Y 1 ed Y2 sono preferibilmente i residui di due leganti poliamminopolicarbossilici, sia nella forma di acidi che di loro derivati. In particolare Y 1 ed Y2 sono preferibilmente residui degli acidi dietilentriamminopentaacetico (DTPA), 1 ,4,7, 10-tetraazaciclododecan- 1 ,4,7, 1 Or tetracetico (DOTA), 10-(2-idrossipropil)- 1 ,4,7,10-tetraazaciclododecan- 1 ,4,7-triacetioo (HPD03A), acido 4-carbossi-5,8,l1-tris(carbossimetil)-1-fenil-2-ossa5,8,1 1-triazatridecan-13-oico (BOPTA), o delle N-[2-[bis(carbossimetìl)ammino]-3-(4-etossifenil)propil]-N-[2-[bis(carbossimetil)ammmo]etil]glicina (EOB-DTPA) e Ν,Ν-bis [2- [(carbossimetil) [(metilcarbamoil)metil]ammino] etil] glieina (DTP A-BMA) .

Particolarmente preferiti sono i composti in cui Z rappresenta un residuo dell’acido colico, A rappresenta un nucleo poliiunzionale scelto tra quelli di formula 1, 2, 3 e 4 e 17 ed Yi ed Y2, uguali o diversi tra loro, sono scelti tra i residui illustrati nella seguente Tabella 2:

Particolarmente preferiti sono i seguenti composti:

Acido [3α [3(S),4(S)],5β,12α]-3-[[[trans-3,4-bis[[[5-[bis[2-[bis(carbossimetil)ammino] etil] ammino] -5 -carbossipentil] ammino] carb onil] - 1 -pirrolidinil] carbonil]ossi]-12-idrossicolan-24-oico;

Acido [3α [3(S),4(S)],5β,12ct]-3-[[[trans-3,4-bis[[[2-[bis[2-[bis(carbossimetil)ammino]etil]ammino]-2-carbossietil]ammino]carbonil]-1-pirrolidmil]carbonil]-ossi]- 12-idrossicolan-24-oico;

Acido (3α ,5β,12α)-3-[[[trans-3,4-bis[[[2-[[[4,7,10-tris(carbossimetil)-1 , 4,7, 10-tetraazacicl ododec- 1 -il] acetil] amino] etil] amino]c arb onil]- 1 -pirroIidinil]carbonil]ossi]- 12-idrossicolan-24-oico;

Acido [3α [3(S),4(S)],5β,12α]-3-[[[trans-3,4-bis[[[5-[[2-[bis(carbossimetil)-ammino] etil] (carbossimetil)ammino] - 5 -carbossipentil] ammino] carb onil] - 1 -pirrolidinil]carbonil]ossi]-12-idrossicolan-24-oico;

Acido [3α [1(S),2(S)],5β,7a,12α]-3-[[[[cis-l,2-bis[[[5-[bis[2-[bis(carbossimetiliammino] etil] ammino]- 5 -carbossipentil] ammino]carbonil]-4-ciclopentil]ammino] carbonil] ossi] -7, 12-diidrossicolan-24-oico;

Acido [3α [1(S)],5β,7a,12α]-3-[[[[cis-1-[[[5-[bis[2-[bis(carbossimetil)ammino]etil]ammino]-5-carbossipentil]ammino]carbonil]-2-[[[2-[[[4,7,10-tris(carbossimetil)- 1 ,4,7, 10-tetraazaciclododec- 1 -il]acetil]amino]etil]amino]carbonil]-4-ciclopentil]ammino]carbonil]ossi]-7,12-diidrossicolan-24-oico;

Acido [3P[3(S),5(S)],5β,7a,12α]-3-[[[3,5-bis[[4-[bis[2-[bis(carbossimetil)ammino]etil]ammino]-4-carbossi-1-ossobutil]ammino]fenil]carbonil]ammino]-7, 12-diidrossicolan-24-oico;

come pure i loro chelati complessi ed i sali fisiologicamente compatibili degli stessi.

Ioni adatti a formare sali complessi con i chelanti di formula generale (I) sono quelli bivalenti o trivalenti degli elementi aventi numero atomico variabile tra 20 e 31, 39, 42, 43, 44, 49, fra 57 e 83; particolarmente preferiti sono Fe <(2+)>, Fe <(3+)>, Cu <(2+)>, Cr <(3+)>, Gd <(3+)>, Eu <(3+)>, Dy<(3+>\ La<(3+)>, Yb<(3+)>, o Mn <(2+)>, o anche radioisotopi come <; i>Cr, <67>Ga, <68>Ga, <H I>In, <Wm>Tc, <140>La, <175>Yb, <153>Sm, <166>Ho, <90>Y, <149>Pm, <l77>Lu, <47>Sc, <I42>Pr, <159>Gd, <212>Bi.

I composti della presente invenzione hanno mostrato di essere in grado di coniugare buona tollerabilità e solubilità in acqua.

Il miglioramento dell’immagine M.R.I. che appare al radiologo, consistente in un aumento del contrasto tra tessuto sano e tessuto malato, rappresenta certamente un ausilio per la successiva formulazione della diagnosi. Tale miglioramento viene generalmente ottenuto mediante somministrazione al paziente di appropriate sostanze esogene, quali gli ioni di metalli paramagnetici opportunamente complessati, in grado di alterare significativamente la relassività dei protoni dell’acqua appartenente al tessuto con cui esse vengono a contatto, quando tali protoni sono sottoposti ad un campo magnetico esterno.

La presenza di due ioni di metallo paramagnetico per molecola di agente somministrato, caratteristica degli agenti dell’invenzione, produce detta alterazione in misura sensibilmente intensificata, consentendo di ottenere un contrasto tra tessuto sano e tessuto malato già diagnosticamente utile a dosaggi minori di agente di contrasto.

Un vantaggio presentato dai chelati complessi dell’invenzione è, quindi, quello di poter essere utilizzati in formulazioni diagnostiche a basso dosaggio in grado di garantire immagini di buona qualità e, allo stesso tempo, di diminuire sensibilmente la tossicità ed il disagio inevitabilmente legati alla somministrazione di una sostanza esogena, quale un agente di contrasto.

1 composti dell’invenzione possono pertanto essere vantaggiosamente somministrati a dosi variabili tra 0,005 e 1,0 mmol/kg e preferibilmente tra 0,01 e 0,1 mmol/kg.

La presenza nella molecola di un carrier quale il residuo di un acido biliare consente agli agenti dell’invenzione di interagire con le proteine piasmatiche e di formare con esse legami di natura non covalente.

Questa proprietà consente loro di avere alta relassività in siero ed una buona permanenza nel comparto sanguigno rendendoli particolarmente indicati nell’imaging mediante M.R.I. del sistema vascolare.

Ora si è sorprendentemente visto che, oltre ad aumentare il numero degli ioni metallici paramagnetici presenti, con conseguenti vantaggi in termini di relassività e di intensità di segnale, l’introduzione di una seconda unità di chelante nella unità molecolare degli agenti dell’invenzione produce una importante variazione nel meccanismo di escrezione degli agenti stessi.

I composti dell· invenzione, infatti, vengono sorprendentemente eliminati pressoché completamente per via renale, tramite filtrazione glomerulare.

(ìli agenti dell’invenzione, pertanto, pur mantenendo inalterate le proprietà derivanti dalla presenza del residuo di acido biliare, vale a dire l’uso vantaggioso nell’imaging del sistema biliare e di quello vascolare, a differenza dai composi dello stato dell’arte comprendenti un solo residuo di chelante non entrano negli spazi intracellulari del fegato e non vengono escreti per via biliare se non in misura minore e limitata.

Ciò consente loro, da un lato, un inaspettato guadagno dal punto di vista tossicologico generale, dovuto alla totale assenza di metabolizzazione da parte degli epatociti.

Da un altro punto di vista, gli agenti dell’invenzione presentano un tempo di emivita nel comparto sanguigno sensibilmente aumentato, come conseguenza del fatto che essi non vengono, se non in misura marginale, catturati ed inglobati precocemente dagli epatociti stessi.

Questa ulteriore inaspettata proprietà, unitamente all’aumentata relassività in siero, contribuisce a rendere gli agenti della presente invenzione particolarmente indicati per l’imaging del sistema vascolare, in generale, e delle coronarie, in particolare, pur alle basse dosi impiegate.

I composti di formula generale (I) possono essere preparati con metodi di sintesi facenti parte della normale tecnica industriale.

In particolare, la preparazione di composti in cui le due unità di chelante sono uguali tra di loro è ottenuta secondo un procedimento sintetico del tutto analogo a quello illustrato nel seguente Schema in cui viene schematizzata la sintesi di un composto, descritta poi dettagliatamente nella parte sperimentale, in ESEMPIO I .

Brevemente, il processo sintetico dello Schema prevede i seguenti passaggi:

1) sintesi del residuo centrale polifunzionale A in una sua forma opportuna in cui i gruppi funzionali, indipendentemente l’uno dall’altro, possono essere in forma opportunamente protetta o attivata;

2) sintesi del residuo di chelante opportunamente funzionalizzato B, ovvero di un chelante capace di coordinare stabilmente gli ioni metallici ed in grado anche di legarsi covalentemente al residuo centrale polifunzionale mediante un opportuno gruppo funzionale;

3) reazione di aggancio del residuo centrale poli funzionale con i residui di chelante ed isolamento dell’intermedio C;

4) sintesi di un acido biliare opportunamente funzionalizzato D, ovvero capace di legarsi stabilmente al residuo centrale poli funzionale mediante un opportuno gruppo funzionale;

5) eventuale sblocco e/o attivazione del terzo residuo funzionale di A, reazione di aggancio del composto ottenuto con D ed isolamento di E;

6) sblocco degli eventuali gruppi protettivi ed isolamento del poliacido F;

7) complessazione degli ioni metallici ed isolamento del complesso chelato G.

Nel caso di composti in cui le due unità di chelante sono diverse tra di loro, gli agenti di contrasto dell 'invenzione possono essere preparati utilizzando un analogo procedimento sintetico in cui l’intermedio C viene ottenuto per reazione dell’unità polifunzionale opportuna A con un primo residuo di chelante Bl, successiva attivazione di un secondo gruppo funzionale di A e reazione di aggancio dello stesso con il secondo residuo di chelante B2.

Brevemente, detto procedimento prevede i seguenti passaggi sintetici: 1) sintesi del residuo centrale polifunzionale A in una sua forma opportuna in cui i gruppi funzionali, indipendentemente l’uno dall’altro, possono essere in forma opportunamente protetta o attivata;

2) sintesi dei due residui di chelante opportunamente funzionalizzati B1 e B2, ovvero di due unità di un chelante capaci di coordinare stabilmente gli ioni metallici ed in grado anche di legarsi covalentemente al residuo centrale polifunzionale mediante un opportuno gruppo funzionale;

3) reazione di aggancio del residuo polifunzionale con un primo residuo di chelante Bl; eventuale sblocco e/o attivazione di un secondo residuo funzionale di A, reazione di aggancio dello stesso con una unità di chelante B2 ed isolamento dell’intermedio C;

4) sintesi di un acido biliare opportunamente funzionalizzato D, ovvero capace di legarsi stabilmente al residuo centrale polifunzionale mediante un opportuno gruppo funzionale;

6) sblocco degli eventuali gruppi protettivi ed isolamento del poliacido F;

7) complessazione degli ioni metallici ed isolamento del complesso chelato G.

Detti composti, o i loro opportuni precursori e/o derivati funzionali, possono essere facilmente ottenuti secondo le tecniche sintetiche note.

Ad esempio, il composto 2 è commercialmente disponibile, derivati del composto 7 in cui le funzioni amminiche sono convenientemente protette possono essere preparati come descritto in J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 2567 oppure in Polymer 1982, 23, 771; il composto 5 come descritto in Tetrahedron Lett. 1993, 34, 4989; l’estere dimetilico del composto 4 come descritto in J. Org. Chem. 1989, 54, 5115; l’estere dimetilico del composto 1 la cui funzione amminica è convenientemente protetta come benzil derivato, come descritto in Bull. Soc. Chim. Fr. 1988, 579; il derivato del composto 3 in cui le funzioni amminiche sono convenientemente protette, come descritto in Chem. Commun. 1998, 1629; gli esteri dimetilici dei composti 6 e 8 in cui le funzioni amminiche sono convenientemente protette, come descritto in J. Chem. Soc. Perkin trans. I 1991, 409 e Tetrahedron Leti. 1994, 35, 4515 rispettivamente; l’estere dimetilico del composto 13 come descritto in J. Med. Chem. 1990, 33, 1561; l’anidride 17 come descritto in Chem. Pharm.Bull.1984, 32, 805.

La preparazione dei residui di Tabella 2 può essere ottenuta utilizzando tecniche note. I residui a, b e c, ad esempio, possono essere preparati in analogia a quanto descritto in Bioconjugate Chem. 1999, 10, 137; la preparazione del residuo d è descritta nella domanda di brevetto WO 9601655, quella del residuo e in WO 9528967, quella di f è descritta nella parte sperimentale, ESEMPIO 4.

Derivati funzionali degli acidi biliari preferiti nella preparazione dei composti oggetto dell’invenzione sono, ad esempio, i 3 β -animino derivati degli stessi, ottenuti a partire dai corrispondenti 3α -idrossili seguendo il procedimento sintetico descritto in Synth. Commun. 1998, 28, 109.

Altrettanto preferiti sono i cloroortoformiati ottenuti dai corrispondenti 3 a -idrossili secondo il procedimento sintetico descritto in J. Am. Chem. Soc. 1997, 117, 640.

Entrambi i derivati citati possono essere utilizzati nelle reazioni di aggancio direttamente, oppure possono essere ulteriormente modificati per reazione dei rispettivi gruppi funzionali con opportuni spaziatori bifìmzionali.

Viene di seguito riportato un elenco dei derivati funzionali degli acidi biliari particolarmente preferiti.

L’elenco, per molti composti, comprende anche un riferimento bibliografico relativo alla loro preparazione.

La reazione di aggancio tra il nucleo centrale polifunzionale ed il residuo di chelante può ad esempio avvenire tra un gruppo amminico presente sul chelante opportunamente funzionali zzato ed un residuo carbossilico presente sul nucleo centrale polifunzionale o, viceversa, tra un residuo carbossilico dell’opportuno derivato funzionale del legante e un residuo amminico dell’unità centrale polifunzionale, con formazione di un’ammide, in entrambi i casi.

La reazione di aggancio tra il residuo centrale polifunzionale ed il residuo dell’acido biliare può avvenire mediante formazione di un legame ammidico, ad esempio tra la funzione acida in posizione 24 del residuo biliare e un gruppo amminico presente nel sintone centrale poli funzionale, secondo una procedura ampiamente descritta ed utilizzata nella preparazione, ad esempio, di peptidi (Tetrahedron, 32, 2211, 1976).

Alternativamente, il legame ammidico può essere formato tra il gruppo amminico di un 3p-ammino derivato dell’acido biliare e un residuo funzionale carbossilico del nucleo centrale polifunzionale, oppure ancora tra il residuo clorocarbonilico del cloroformiato dell’acido biliare con un ammino gruppo del residuo centrale polifunzionale.

Dette reazioni di aggancio possono essere eventualmente precedute da una reazione di sblocco e/o attivazione del gruppo funzionale dell’unità centrale che viene coinvolto nella reazione.

I gruppi funzionali di tipo amminico sono generalmente protetti per trasformazione degli stessi nei corrispondenti benzil, carbobenzilossi (Cbz) o terbutilossicarbonil (BOC) derivati. Nei primi due casi, ad esempio, la reazione di sblocco può avvenire mediante idrogenazione dei benzil o Cbz derivati, in presenza di un opportuno catalizzatore metallico, ad esempio Pd/C.

Nel terzo caso lo sblocco può essere ottenuto in condizioni acide, ad esempio con CF3COOH.

I residui carbos silici sono generalmente protetti per trasformazione degli stessi in esteri opportuni.

La successiva deprotezione delle funzioni carbossiliche delle due unità di chelante può essere ottenuta per idrolisi dei gruppi protettivi esterei, ad esempio con LiOH, CF3COOH o iodotrimetilsilano in un opportuno solvente organico quale, ad esempio, diossano CH2Cl2 o CH3CN o un alcool, ad esempio, l’i.PrOH.

I composti dell’ invenzione possiedono un ampio campo di applicazione poiché possono essere somministrati sia per via intravasale (per esempio per via endovenosa, intraarteriale, intracoronarica, intraventricolare, et.), sia intratecale, come pure intraperitoneale, intralinfatica e intracavitale. I composti sono inoltre adatti alla somministrazione orale o enterale e, quindi, per la visualizzazione del canale gastrointestinale.

Per la somministrazione parenterale i composti dell’invenzione sono preferibilmente formulati come una soluzione o sospensione acquosa sterile, il cui pH può variare preferibilmente tra 6,0 e 8,5.

Tali soluzioni o sospensioni acquose possono essere somministrate ad una concentrazione variabile tra 0,002 e 1,0 molare. Le formulazioni ottenute possono essere liofilizzate e fomite come tali in modo da essere ricostituite al momento dell’uso.

Per uso gastrointestinale o per iniezione nelle cavità corporee, tali agenti possono essere formulati come una soluzione o sospensione eventualmente contenente opportuni additivi adatti, ad esempio, a modificarne opportunamente la viscosità.

Per somministrazione orale possono venire formulati secondo metodi di preparazione comunemente impiegati in tecnica farmaceutica, eventualmente anche come formulazione ricoperta in modo da avere una protezione addizionale contro il pH acido dello stomaco, in modo da impedire il rilascio dello ione metallico chelato, che potrebbe, al contrario, verificarsi ai valori di pH tipici dei succhi gastrici.

Altri eccipienti, come ad esempio edulcoranti e/o aromatizzanti possono essere eventualmente aggiunti secondo tecniche note di formulazione farmaceutica.

Le soluzioni o sospensioni dei composti dell’invenzione si possono anche formulare come aerosol per essere impiegate in aerosol-broncografia e in’istill azione.

Per quanto riguarda il loro impiego, i chelati oggetto della presente invenzione possono essere usati anche in medicina nucleare, sia come agenti per l’imaging diagnostico che come agenti terapeutici. In questo caso lo ione metallico che viene chelato è un radioisotopo, per esempio il <5l>Cr, <67>Ga, <1 1 >'In, <99m>Tc, <140>La,

<175>Yb, <153>Sm, <166>Ho, <90>Y, <149>Pm, <177>Lu, <47>Sc, <142>Pr, <159>Gd <212>Bi.

Cationi preferiti di basi inorganiche adatte a salificare i complessi chelati oggetto della presente invenzione comprendono, in particolare, ioni di metalli alcalini o alcalino-terrosi, quali potassio, sodio, calcio, magnesio e loro miscele.

Cationi preferiti di basi organiche adatte allo scopo precedentemente esposto comprendono, fra gli altri, quelli di ammine primarie, secondarie e terziarie, quali, ad esempio, etanolammina, dietanolammina, morfolina, glucammina, N-metilglucammina, N,N-dimetilglucammina.

yVnioni preferiti di acidi inorganici eventualmente adatti a salificare i complessi chelati oggetto della presente invenzione comprendono, in particolare, gli ioni di acidi alogenidrici, quali cloruri, bromuri, ioduri o altri ioni quali, ad es. solfato.

iVnioni preferiti di acidi organici adatti allo scopo precedentemente esposto comprendono quelli di acidi normalmente impiegati in tecnica farmaceutica per la salificazione di sostanze basiche, quali, ad esempio, acetato, succhiato, citrato, maleato e fumarato.

Cationi ed anioni preferiti di amminoacidi comprendono, ad esempio, quelli di taurina, glieina, lisina, arginina o omitina o dell’acido aspartico e glutammico.

. I complessi chelati coniugati con gli acidi biliari oggetto della presente invenzione, possono essere inglobati in liposomi o essere costituenti della loro struttura chimica e venire impiegati come vescicole uni o multilamellari.

I composti oggetto della presente invenzione possono anche essere coniugati a macromolecole o inglobati o associati ad opportuni mezzi veicolanti.

Allo scopo di meglio esemplificare l’amplio potenziale applicativo della presente invenzione, viene qua di seguito presentato un elenco assolutamente non limitante dei composti preferiti dell’invenzione.

PARTE SPERIMENTALE

ESEMPIO 1

Complesso di gadolinio delTacido [3α [3(S),4(S)],5β,12α]-3-[[[trans-3,4-bis[[[5-[bis[2-[bis(carbossimetil)ammino]etil]ammino]-5-carbossipentil]ammino]-carbonil]-1-pirrolidinil]carbonil]ossi]-12-idrossicolan-24-oico salificato con sodio (1:5)

a) Acido trans- 1-(fenilmetil)-3,4-pirrolidindicarbossilico.

Acido trans- 1-(fenilmetil)-3,4-piiTolidindicarbossiIico dimetil estere (13.4 g; 48,3 mmol) (preparato come descritto in Bull. Soc. Chim. Fr. 1988, 579) è sciolto in una miscela di EtOH (220 mL) e H2O (35 mL) e saponificato con NaOH IN (96.4 mL). La soluzione è poi concentrata ed il residuo ripreso con 100 mL di H2O. La soluzione è acidificata a pH 1.8 con HC1 6N ottenendo precipitazione delTacido che è isolalo come solido bianco (10 g; 40,11 mmol).

Resa: 83%

p.f.:140-145°C

titolo HPLC 99.5% (in area %)

Analisi elementare

C H N

% cale.: 62,24 6,07 5.62

% trov.: 63,77 6,15 5.63

Gli spettri 1H-NMR, l^C-NMR, I e MS sono accordo con la struttura indicata.

b) N",N<2>-Bis[2-[bis[2-(l,1-dimetiletossi)-2-ossoetil]ammino]etiI]-N<6>-[(feniImetossi)carbonil]-L-lisina metil estere.

N<6>-[(Fenilmetossi)carbonil]-L-lisina metil estere cloridrato (10,6 g; 32,2 mmol) (prodotto commerciale) e N-(2-bromoetil)-N-[2-(l,1-dimetiletossi)-2-ossoetil]glicina 1,1-dimetiletil estere (preparato secondo Rapoport, J. Org. Chem.

1993, 58, 1151) (27,2 g; 77,1 mmol) vengono sciolti in CH3CN (160 mL). La miscela viene quindi addizionata di tampone fosfato 2M pH 8 (160 mL) e lasciata in agitazione per 2 ore. Le fasi vengono poi separate, lo strato acquoso viene sostituito con tampone fresco (160 mL) e la miscela viene lasciata in agitazione per altre 70 ore. La fase organica viene quindi separata ed evaporata ed il residuo viene ripreso con CH2Cl2 (150 mL). La soluzione metilenica ottenuta viene lavata con H2O ed evaporata a residuo ottenendo un olio che viene purificato mediante cromatografia su gel di silice. Per evaporazione delle frazioni omogenee si ottiene il prodotto in oggetto come olio di colore giallo (18,1 g; 21,7 mmol).

Resa: 67%

titolo HPLC: 97,8 (in area %)

TLC: Supporto: lastra al gel di silice 60F 254 Merck

Eluente: n-esano/AcOEt = 1:1.

Rivelatore: 1 % KMn04 in 1 M NaOH; R^0,58

Analisi elementare

C H N

% cale.: 61,70 8,67 6,69 % trov.: 61,85 8,74 6,34 Potere rotatorio specifico: [a] <20 >_

D -27,05; (c 5,1, CHC13)

Gli spettri 1H-NMR, 13C_NMR/ IR e MS sono in accordo con la struttura indicata.

c) N<2>,N<2>-Bis[2-[bis[2-( 1 , 1 -dimetiIetossi)-2-ossoetil]ammino]etil]-L-lisina metil estere

Ad una soluzione di intermedio ottenuto come descritto al punto b (40 g; 47,5 mmol) in MeOH (700 mL) viene aggiunto carbone palladiato (4 g; al 5% di Pd). La sospensione viene mantenuta in agitazione a temperatura ambiente e in atmosfera di idrogeno per 4 ore, poi viene filtrata su filtro Millipore<® >HA 0,45 pm e il catalizzatore è lavato con MeOH. La soluzione viene evaporata ottenendo il prodotto desiderato come olio giallo (32,5 g; 46,2 mmol).

Resa: 97%

titolo HPLC: 99 (in area %)

TLC: Supporto: lastra al gel di silice 60F 254 Merck

Eluente: n-esano/AcOEt = 1:1.

Rivelatore: 1% ΚΜηθ4 in 1M NaOH; Rf=0,13

Analisi elementare

C H N H2O

% cale.: 59,80 9,46 7,97

% trov.: 57,89 9,44 7,39 0,98

Potere rotatorio specifico: [a] <2>°= -28,68; (c 5,0, CHC13)

Gli spettri iH-NMR, 1<3>C-NMR, IR e MS sono in accordo con la struttura indicata.

d) N<6>,N<6 >-[[Trans- 1-(fenilmetil)-3, 4-pirrolidindiil]biscarbonil]bis[N<2>, N<2>-bis[2-[bis[2-(l,1-dimetiletossi)-2-ossoetil]ammino]etil]-L-lisina] dimetil estere.

Ad una soluzione di acido trans- 1-(fenilmetil)-3,4-pirrolidindicarbossilico ottenuto come descritto al punto a (4,0 g; 16,0 mmol) in CH3CN (110 mL), raffreddata a 0°C e mantenuta in atmosfera di N2, viene aggiunta trietilammina (4,9 mL; 3:5,3 mmol) e quindi pivaloile cloruro (4,4 mL; 35,3 mmol). Dopo 20 min nella miscela ottenuta viene gocciolata una soluzione di N<2>,N<2>-bis[2-[bis[2-(l,1-dimetiletossi)-2-ossoetil]ammino]etil]-L-lisina metil estere (24,8 g; 35,3 mmol) in CH3CN (90 mL). La miscela viene quindi portata a temperatura ambiente e mantenuta a queste condizioni per 1 h e poi evaporata. Il residuo viene ripreso con AcOEt (300 mL), lavato con H2O e concentrato. L’olio grezzo ottenuto è purificato mediante cromatografia su gel di silice ottenendo il prodotto in oggetto come olio giallo (17,5 g; 10,9 mmol).

Resa: 68%

titolo HPLC 98,4% (in area %)

TLC: Supporto: lastra al gel di silice 60F 254 Merck

Eluente: n-esano/AcOEt = 1:1.

Rivelatore: 1% KMn04 i<n >1M NaOH; Rf=0,24

Analisi elementare

C H N

% cale.: 61,57 8,90 7,79

% trov.: 61,58 8,99 7,48

Gli spettri ^H-NMR, ^C-NMR, IR e MS sono in accordo con la struttura indicata.

e) N<6>;N<6’>-[[trans-3,4-pirrolidindiil]biscarbonil]bis[N<2>,N<2>-bis[2-[bis[2-( 1 , 1 -dimetiletossi)-2-ossoetil]ammino]etil]-L-lisina] dimetil estere.

Ad una soluzione del composto del punto d (21,6 g; 13,4 mmol) in EtOH (250 mL) viene aggiunto carbone palladiato (2,2 g; al 5% di Pd) e la sospensione viene mantenuta 4 ore in atmosfera di idrogeno, sotto vigorosa agitazione. La miscela è quindi filtrata mediante un filtro Millipore<® >FH 0,5 μτη ed evaporata a residuo ottenendo il prodotto di riduzione come olio giallo (18,2 g; 11,9 mmol). Resa: 90%

titolo HPLC 99% (in area %)

Analisi elementare

C H N

% cale.: 59,70 9,03 8,24

% trov.: 59,12 9,38 7,72

Gli spettri 1H-NMR, ^C-NMR, IR e MS sono in accordo con la struttura indicata.

f) Estere metilico dell’acido (3α,5β,12α)-3-[(clorocarbonil)ossi]-12-idrossicolan-24-oico.

Una soluzione di fosgene al 20% in toluene (100 mL) è gocciolata in una soluzione di estere metilico dell’acido (3α,5β,12α)-3,12-diidrossicolan-24-oico (14,7 g; 36 mmol) (prodotto commerciale) in CH2Cl2 anidro a 0°C e in atmosfera di azoto. La soluzione è agitata per 3 h poi evaporata a residuo ottenendo il prodotto desiderato come solido bianco (15,2 g; 32,4 mmol).

Resa: 90%

Gli spettri Ifi-NMR, 1C-NMR, IR e MS sono in accordo con la struttura indicata.

g) Estere metilico dell’acido [3α [3(S),4(S)],5β,12α]-3-[[[trans-3,4-bis[[[5-[bis[2-lbis[2-(l,1-dimetiletossi)-2-ossoetil]ammino]etil)ammino]-6-metossi-6-ossoesil]ammino]carbonil]-1-pirrolidinil]carbonil]ossi]-12-idrossicolan-24-oico.

In una soluzione del composto ottenuto al punto f (estere metilico dell’acido (3oc,5β512cx)-3-[(clorocarbonil)ossi]-12-idrossicolan-24-oico) (5,5 g; 11,7 mmol) e N,N-diisopropiletilammina (4,5 mL) in CH2C12 (150 mL) raffreddata a 0°C viene gocciolata, sotto azoto, una soluzione del composto ottenuto al punto e (17,8 g; 11,7 mmol) in CH2C12 (50 mL). La miscela risultante viene mantenuta in agitazione a temperatura ambiente per 3 ore, poi viene lavata con H2O e concentrata. Il residuo viene purificato mediante cromatografia flash ottenendo il composto in oggetto come olio giallo (17,0 g; 8,7 mmol).

Resa: 74%

titolo HPLC 94,4% (in area %)

TLC: Supporto: lastra al gel di silice 60F 254 Merck

Eluente: /i-esano/AcOEt = 1:1

Rivelatore: 1% KMn04 in 1M NaOH; Rf=0,29

Analisi elementare

C H N

% cale.: 62,46 9,10 6,43

% trov.: 62,15 9,16 6,32

Gli spettri iH-NMR, l^C-NMR, IR e MS sono in accordo con la struttura indicata.

h) Acido [3α [3(S),4(S)],5β,12α]-3-[[[trans-3,4-bis[[[5-[bis[2-[bis(carbossimetil)-ammino]etil]ammino]-5-carbossipentil]ammino]carbonil]-1-pirroIidiniI]carboniI]ossi]- 12-idrossicolan-24-oico.

In una soluzione del poliestere ottenuto al punto g (14,0 g; 7,1 mmol) in 1,4-diossano (190 mL) viene gocciolata, a temperatura ambiente, una soluzione acquosa di LiOH 2M (190 mL). Dopo 26 ore la soluzione viene concentrata ed addizionata di HC1 acq 2M fino ad un pH finale di 1,8 (175 mi) favorendo la precipitazione dell’acido che viene filtrato, lavato con acqua e seccato ottenendo il prodotto in oggetto come solido bianco (8,7 g; 5,9 mmol).

Resa: 83%

p.f.:210-215°C

titolo HPLC: 98,9% (in area %)

TLC: Supporto: lastra al gel di silice 60F 254 Merck

Eluente: CHCl3/MeOH/NH4OH acq = 5:4:2

Rivelatore: 1% KMn04 in 1M NaOH; Rf=0,38

Analisi elementare

C H N H2O

% cale.: 54,74 7,33 8,57

% trov.: 51,72 7,51 8,27 4,96 Potere rotatorio specifico: [a] 16,17; (c 1; NaOH 1M)

Gli spettri 1H-NMR, l^C-NMR, IR e MS sono in accordo con la struttura indicata.

i) Complesso di gadolinio dell’acido [3α [3(S),4(S)],5β,12cc]-3-[[[trans-3,4-bis[[[5-[bis[2-[bis(carbossimetil)ammino]etil]ammino]-5-carbossipentil]ammino]-carbonil]-1-pirrolidinil]carbonil]ossi]-12-idrossicolan-24-oico salificato con sodio (1:5).

Il legante preparato al punto h viene sospeso in acqua e portato in soluzione mediante aggiunta di NaOH (32 mL). Nella soluzione ottenuta viene aggiunto GdCl3 (3,5 g; 9,6 mmol) in H2O (20 mL), mantenendo il pH a 6.5 mediante aggiunta di NaOH 1M (17,5 mL).

La miscela viene tenuta un’ora a temperatura ambiente e quindi viene caricata su colonna di Amberlite XAD<® >16.00 eluendo con un gradiente a base di CH3CN e H2O. Per evaporazione delle frazioni contenenti il prodotto si ottiene lo stesso come solido bianco (8,3 g; 4,4 mmol).

Resa: 92%

p.f.:>300°C

titolo HPLC: 100% (in area %)

Analisi elementare

C H N Gd Na H2O % cale.: 42,60 5,12 6,67 16,65 6,09

% trov.: 37,68 5,90 5,90 14,67 6,47 9,90% Potere rotatorio specifico: [a] - 12,32; (c 2; H2O)

Gli spettri IR e MS sono in accordo con la struttura indicata.

ESEMPIO 2

In modo del tutto analogo, a partire da 3-[[(fenilmetossi)carbonil]ammino]-N-ter-butossicarbonil-L-alanina metil estere (Chem. Pharm. Bull. 1985, 33, 509), è stato sintetizzato il complesso di gadolinio dell’acido [3α [3(S),4(S)],5β,12ot]-3-[[[trans-3,4-bis[[[2-[bis[2-[bis(carbossimetil)ammino]etil]ammino]-2-carbossietil]-ammino]carbonil]- 1 -pirrolidinil]carbonil]ossi]- 12-idrossicolan-24-oico.

ESEMPIO 3

Analogamente, a partire da l,4,7-tris-[2-(l,1-dimetiletossi)-2-ossoetil]-10-[[2-[2-amminoetil]ammino]-2-ossoetil]- 1 ,4,7, 10-tetraazaciclododecano (WO 95/28967, esempio 2), è stato sintetizzato il complesso di gadolinio dell’acido (3α,5β, 12α)-3-[[[trans-3,4-bis[[[2-[[[4,7, 10-tris(carbossimetil)- 1 ,4,7, 10-tetraazaciclododec-1-il]acetil]amino]etil]amino]carbonil]-1-pirrolidinil]carbonil]ossi]-12-idrossioolan-24-oico.

ESEMPIO 4

In modo del tutto analogo, impiegando MnCl2 per la complessazione, è stato sintetizzato il complesso di manganese dell’acido [3α [3(S),4(S)],53,12α]-3-[[[trans-3,4-bis[[[5-[[2-[bis(carbossimetil)ammino]etil](carbossimetil)ammino]-5-carbossipentil]ammino]carbonil]-1-pirrolidinil]carbonil]ossi]-12-idrossicolan-24-oico.

L’unità chelante utilizzata in questo caso è l’N<2>-[2-[bis[2-(l,1-dimetiletossi)2-ossoetil]ammino]etil]-N<2>-[2-(l,1-dimetiletossi)-2-ossoetil]-L-lisina metil estere, la cui sintesi è descritta qui di seguito:

a) N<2>-[2-[bis[2-( 1 , 1 -dimetiletossi)-2-ossoetil]ammino]etil]-N<2>-[2-(1, 1 -dimetiletossi)-2-ossoetil]- N<6>-[(fenilmetossi)carbonil]-L-lisina metil estere.

Una soluzione di N-(2-bromoetil)-N-[2-(l,1-dimetiletossi)-2-ossoetil]glicina 1,1-dirnetiletil estere (21,1 g; 60 mmol) in CH3CN (25 mL) è gocciolata in una miscela di N<6>-[(fenilmetossi)carbonil]-L-lisina metil estere cloridrato (20 g; 60,4 mmol) (prodotto commerciale) e N,N-diisopropiletilammina (12,6 mL) in CH3CN (250 mL). Dopo 120 h a temperatura ambiente sono aggiunti ter-butil bromoacetato (18,8 g; 101,6 mmol) e N,N-diisopropiletilammina (17,7 mL). La miscela viene mantenuta in agitazione per altre 24 h, il solvente è quindi evaporato e il residuo sciolto con Et2O e filtrato. La soluzione eterea è lavata con HC1 acq. 0,1 M, anidrificata ed evaporata ottenendo un residuo che è purificato mediante cromatografia flash. Per unione delle frazioni omogenee si ottiene il prodotto desiderato sotto forma di olio bruno (13 g; 19 mmol).

Resa: 32%

titolo HPLC 91% (in area %)

TLC: Supporto: lastra al gel di silice 60F 254 Merck

Eluente: «-esano/AcOEt = 7:3

Rivelatore: 1% ΚΜηθ4 <in >NaOH; Rfi=0,4

Analisi elementare

C H N

% calc.: 61,83 8,45 6,18

% trov.: 61,70 8,52 5,84

Gli spettri 1H-NMR, IR e MS sono in accordo con la struttura indicata.

b) N<2>-[2-[bis[2-( 1 , 1 -dimetiletossi)-2-ossoetil]ammino]etil]-N<2>-[2-( 1,1-dimetiletossi)-2-ossoetil]-L-lisina metil estere.

Ad una soluzione di prodotto ottenuto come al punto a (12,3 g; 18,1 mmol) in MeOH (120 mL) viene aggiunto carbone palladiato (1,3 g; al 5% di Pd) e la sospensione viene mantenuta 3 ore in atmosfera di idrogeno, sotto vigorosa agitazione. La miscela è quindi filtrata mediante un filtro Millipore<® >FH 0,5 pm ed evaporata a residuo ottenendo il prodotto di riduzione che viene utilizzato come tale.

ESEMPIO 5

Complesso di gadolinio dell’acido [3α [1(S),2(S)],5β,7a,12α]-3-[[[[cis-1,2-bis[[[5-[bis[2-[bis(carbossimetil)ammino]etil]ammino]-5-carbossipentil]ammino]-carbonil]-4-ciclopentil]ammino]carbonil]ossi]-7, 12-diidrossicolan-24-oico salificato con sodio (1:5)

a) N<6>,N<6 >-[(Cis-4-oxo- 1 ,2-ciclopentanediil)biscarbonil]bis[N<2>,N<2>-bis[2-[bis[2-( 1,1-dimetiletossi)-2-ossoetil]ammino]etil]-L-lisina] diterbutil estere.

Ad una sospensione di cis-tetraidro-1H-ciclopenta[c]furan-1,3,5-trione (1,2 g; 7,8 mmol) (ottenuto come descritto in Chem. Pharm. Bull. 1984, 32, 805) in THF (30 mL) mantenuta a 20°C è gocciolata una soluzione di N<2>,N<2>-bis(2-[bis[2-(l,1-dimetiletossi)-2-ossoetil]ammino]etil]-L-lisina terbutil estere (5,8 g; 7,8 mmol) (Bioconjugate Chem. 1999, 10, 137) in 20 mL THF. Dopo Ih nella soluzione di reazione raffreddata a -5°C è aggiunta trietilammina (2,17 mL; 15,57 mmol) e isobutil cloroformiato (1 mL; 7,8 mmol) (prodotto commerciale). La miscela è quindi portata a 20°C e, dopo un’ora, viene gocciolata nella stessa una soluzione di N<2>,N<2>-bis[2-[bis[2-( 1 , 1 -dimetiletossi)-2-ossoetil]ammino]etil]-L-lisina terbutil estere (5,8 g; 7,8 mmol) in THF (25 mL). La soluzione è mantenuta a 20°C per altre 18 h e poi concentrata. L’olio residuo è ripreso con CH2CI2 (75 mL) e 3⁄40 (75 mL). La fase organica è separata, anidrificata e purificata per cromatografia su colonna flash con isolamento del prodotto desiderato (6 g; 3,7 mmol).

Resa: 47%

TLC: Supporto: lastra al gel di silice 60F 254 Merck

Eluente: n-esano/AcOEt/2-PrOH = 7:2:1

Rivelatore: 1% KMn04 in 1M NaOH; Rf=0,29

Analisi elementare

C H N

% cale.: 61,31 9,17 6,89 % trov.: 61,02 9,04 6,83 Gli spettri 1H-NMR, IR e MS sono in accordo con la struttura indicata.

b) N<6>,N<6’>-[(cis-4-idrossiimmino- 1 ,2-ciclopentanediil)biscarboniI]bis[N<2>,N<2>-bis[2-[bis[2-( 1 , 1 -dimetiletossi)-2-ossoetil]ammino]etil]-L-lisina] diterbutil estere.

Ad una soluzione del composto del punto a (14 g; 8,61 mmol) in H2O (10 mL) e 2-propanolo (150 mL) mantenuta a 20°C, si aggiungono idrossilammina cloridrato (2,69 g; 38,7 mmol) e acetato di sodio (8,8 g; 64,6 mmol). La miscela è riscaldata a 90°C per 2 ore, concentrata ed il residuo viene ripreso con CHC13 (100 mL) e H2O (100 mL). Dopo separazione delle fasi, la soluzione acquosa è estratta con CHC13 (200 mL). Le fasi organiche riunite sono anidrificate e concentrate ottenendo il prodotto desiderato come solido bianco (1 1 ,8 g; 7,2 mmol).

Resa 84%.

p.f.:210-215°C

titolo HPLC: 96,8% (in area %)

TLC: Supporto: lastra al gel di silice 60F 254 Merck

Eluente: CHCl3/MeOH/NH4OH acq = 14:2:0,2

Rivelatore: 1 % KMn04 in 1 M NaOH; Rf=0,29

Analisi elementare

C H N H2O % cale.: 60,75 9,15 7,68

% trov.: 61,11 9,26 7,54 0,29 Gli spettri 1H-NMR, l^C-NMR, IR e MS sono in accordo con la struttura indicata.

c) N<6>,N<6’>-[(cis-4-ammino-1,2-ciclopentanediil)biscarbonil]bis[N<2>,N<2>-bis[2-[bis[2-(1,1 -dimetiletossi)-2-ossoetil]ammino]etil]-L-lisina] diterbutil estere.

Ad una soluzione del composto del punto b (10 g; 6,1 mmol) in CH3OH (60 mL) è aggiunto Ni-Raney (1,2 g) e la sospensione è mantenuta a 30°C e 30 atm di idrogeno per 18h. Dopo raffreddamento a 15°C la soluzione è concentrata e purificata mediante cromatografia flash ottenendo il prodotto desiderato come olio (7,1 g; 4,4 mmol).

Resa 72%.

titolo HPLC: 97, 1 % (in area %)

K.F.: <0,1%

TLC: Supporto: lastra al gel di silice 60F 254 Merck

Eluente: CHCl3/MeOH/NH4OH acq = 14:2:0,2

Rivelatore: 1% KM11O4 in 1M NaOH; Rf=0,52.

Gli spettri iH-NMR, ^C-NMR, IR e MS sono in accordo con la struttura indicata.

d) Acido [3α[ 1 (S),2(S)],5β,7a, 12α]-3- [[[[cis- 1 ,2-bis[[[5-[bis[2-[bis(carbossimetil)aminino]etil]ammino]-5-carbossipentil]ammino]carbonil]-4-ciclopentil]ammino]carbonil]ossi]-7, 12-diidrossicolan-24-oico.

In una soluzione raffreddata a 0°C di estere metilico dell’acido (3α,5β,7ot,12α)-3-[(clorocarbonil)ossi]-7,12-diidrossicoIan-24-oico (5 g; 10,3 mmol) (ottenuto come descritto in J. Am. Chem. Soc. 1997, 117, 640) e N,N-diisopropiletilammina (5 mL), in CH2C12 (150 mL), viene gocciolata, sotto azoto, una soluzione del composto ottenuto al punto c (16,8 g; 10,3 mmol) in CH2C12 (50 mL). La miscela risultante viene mantenuta in agitazione a temperatura ambiente per 3 ore, poi viene lavata con H2O e concentrata. Il residuo viene purificato mediante cromatografia flash. Il prodotto ottenuto è sciolto in 1,4-diossano (200 mL) e in tale soluzione è gocciolata una soluzione acquosa di LiOH 2M (200 mL). Dopo 24 h la soluzione è concentrata e acidificata con HC1 acq. 2 M fino a pH 1.8, ottenendo la precipitazione dell’acido che è filtrato, lavato con acqua e seccato per dare il prodotto desiderato come solido bianco (6,8 g; 4,5 mmol).

Resa: 44%

titolo HPLC 98,4% (in area %)

Analisi elementare

C H N

% cale.: 54,43 7,32 8,40

% trov.: 54,33 7,25 8,35

Gli spetto 1H-NMR, ^C-NMR, IR e MS sono in accordo con la struttura indicata:

e) Complesso di gadolinio dell’acido [3α [1(S),2(S)],5β,7a,12ot]-3-[[[[cis-1,2-bis[[[5-[bis[2-[bis(carbossimetiI)ammino]etil]ammino]-5-carbossipentil]ammino]-carbonil]-4-ciclopentil]ammino]carbonil]ossi]-7, 12-diidrossicolan-24-oico salificato con sodio (1:5).

Il legante preparato al punto d (6 g; 4 mmol) viene sospeso in acqua e portato in soluzione mediante aggiunta di NaOH. Nella soluzione ottenuta viene aggiunto GdCl3 (2,97 g; 8 mmol) in H2O (20 mL), mantenendo il pH a 6.5 mediante aggiunta di NaOH 1M.

La miscela viene tenuta 2 h a temperatura ambiente e quindi viene caricata su colonna di Amberlite XAD<® >16.00 eluendo con un gradiente a base di CH3CN e H2O. Per evaporazione delle frazioni contenenti il prodotto di ottiene lo stesso come solido bianco (6,7 g; 3,5 mmol).

Resa: 88%

p.f.:>300°C

titolo HPLC: 100% (in area %)

Analisi elementare

C H N Gd Na

% cale.: 42,56 5,15 6,57 16,39 5,99

% trov.: 42,42 5,10 6,45 16,28 5,87 Gli spettri IR e MS sono in accordo con la struttura indicata.

ESEMPIO 6

In modo del tutto analogo a quanto descritto nell’esempio 5, a partire da cistetraidro- lH-ciclopenta[c]furan- 1 ,3 ,5-trione, 1 ,4,7-tris-[2-(1, 1 -dimetiletossi)-2-ossoetil]- 10-[[2-[2-amminoetil]ammino]-2-ossoetil]- 1 ,4,7, 10-tetraazaciclododecano (W095/28967, esempio 2) e N<2>,N<2>-bis[2-[bis[2-(l,1-dimetiletossi)-2-ossoeti<)>]ammino]etil]-L-lisina terbutil estere (Bioconjugate Chem. 1999, 10, 137) è stato sintetizzato il complesso di gadolinio dell <5 >acido [3α [1(S)],5β,7a,12α]-3-[[[[cis~1-[[[5-[bis[2-[bis(carbossimetil)ammino]etil]ammino]-5-carbossipentil]ammino]carbonil]-2-[[[2-[[[4,7, lO-tris(carbossimetil)- 1 ,4,7, 10-tetraazaciclododec- 1 -il]acetiI]amino]etil]amino]carbonil]-4-ciclopentil]ammino]carbonil]ossi]-7,12-diidrossicolan-24-oico (COMPOSTO 6).

ESEMPIO 7

Complesso di gadolinio dell’acido [3p[3(S),5(S)],5β,7a,12α]-3-[[[3,5-bis[[4-[bis[2-[bis(carbossimetil)ammino]etil]ammino]-4-carbossi-1-ossobutil]ammino]fcnil]carbonil]ammino]-7,12-diidrossicolan-24-oico salificato con sodio (1:5)

a) Estere metilico dell’acido (3P,5β,7a,12α)-3-[[(3,5-diamminofenil)carbonil]ammino]-7, 12-diidrossicoIan-24-oico dicloridrato.

Acido 3,5-di(ter-butossicarbonil)amminobenzoico (3,16 g; 10 mmol) (preparato come indicato in Chem. Commun. 1998, 1629) è sciolto in DMF (150 mL) e nella soluzione ottenuta sono aggiunti, a 0°C, trietilammina (3 mL) e dietilcianofosfonato (1,8 g; 11 mmol) (prodotto commerciale). Nella miscela ottenuta è gocciolata, in 30 min, una soluzione di estere metilico dell’acido (3P,5β,7cc,12ct)-3-ammino-7,12-diidrossicolan-24-oico (4,22 g; 10 mmol) (ottenuto come descritto in Synth. Commun. 1998, 28, 109). Dopo 8 h a temperatura ambiente la soluzione è evaporata e il residuo isolato è purificato su gel di silice mediante cromatografia flash. Il prodotto ottenuto è trattato con MeOH (100 mL) saturo di HC1 favorendo la precipitazione del prodotto in oggetto che viene isolato come solido bianco (2,7 g; 4,3 mmol).

Resa: 43%

titolo HPLC: 97% (in area %)

Analisi elementare

C H N Cl % cale.: 61,14 8,18 6,68 11,28 % trov.: 60,98 8,11 6,59 11,22 Gli spettri iH-NMR, l^C-NMR, ^ <e >sono in accordo con la struttura indicata.

b) Acido [3P[3(S),5(S)],5β,7a,12α]-3-[[[3,5-bis[[4-[bis[2-[bis[2-(l,1-dimetiletossi)-2-o3soetil]ammino]etil]ammino]-5-( 1 , 1 -dimetiletossi)- 1 ,5-diossopentiI]ammino]fenil] carbonil]ammino]-7, 12-diidrossicoIan-24-oico.

In una soluzione in DMF, mantenuta a 0°C, del prodotto ottenuto al punto a) (2,5 g; 4 mmol), ter-butil estere dell’acido N,N-bis[2-[bis[2-(l,1-dimetiletossi)-2-ossoetil]ammino]etil]-L-glutammico (3 g; 4 mmol) (Bioconjugate Chem. 1999, 10, 137) e dietilcianofosfonato (0,72 g; 4,4 mmol), viene gocciolata trietilammina (0,7 mL). Dopo 1 h a 0°C e 5 h a temperatura ambiente la miscela di reazione è evaporata e il residuo purificato mediante cromatografia flash su gel di silice, ottenendo il prodotto desiderato come olio (5,79 g; 2,9 mmol).

Resa: 73%

titolo HPLC: 98% (in area %)

Analisi elementare

C H N % cale.: 64,18 9,10 4,94

% trov.: 64,03 8,99 4,95

Gli spettri 1H-NMR, ^C-NMR, IR e MS sono in accordo con la struttura indicata:

c) Acido [3P[3(S),5(S)],5β,7a,12cc]-3-[[[3,5-bis[[4-[bis[2-[bis(carbossimetil)ammino]etil]ammino]-4-carbossi- 1 -ossobutil]ammino] fenil]carbonil]ammino]-7, 12-diidrossicolan-24-oico.

In una soluzione del poliestere ottenuto come descritto al punto b (5,5 g; 2,8 mmol) in 1,4-diossano (100 mL) viene gocciolata, a temperatura ambiente, una soluzione acquosa di LiOH 2M (100 mL). Dopo 24 ore la soluzione viene concentrata ed addizionata di HC1 acq 2M fino ad un pH finale di 1,8 favorendo la precipitazione dell’acido che viene filtrato, lavato con acqua e seccato ottenendo il prodotto in oggetto come solido bianco (3,6 g; 2,2 mmol).

Resa: 80%

titolo HPLC: 99% (in area %)

Analisi elementare

C H N

% cale.: 61,92 5,93 5,95

% trov.: 61,85 5,88 5,90

Gli spettri 1H-NMR, ^C-NMR, IR e MS sono in accordo con la struttura indicata:

d) Complesso di gadolinio dell’acido [3p[3(S),5(S)],5β,7a,12α]-3-[[[3,5-bis[[4-[bis[2-[bis(carbossimetil)ammino]etil]ammino]-4-carbossi-1-ossobutil]ammino]fenil] carbonil]ammino]-7,12-diidrossicolan-24-oico salificato con sodio (1:5).

Il legante del punto c) (3,5 g; 2,1 mmol) è sospeso in H2O e portato in soluzione mediante aggiunta di NaOH 1 M. Nella soluzione è poi gocciolato GdCl3 (1,56 g; 4,2 mmol) in H2O (20 mL), mantenendo il pH a 6.8 mediante aggiunta di NaOH 1 M. La miscela viene mantenuta in agitazione per 4 h a temperatura ambiente e poi caricata su colonna di Amberlite XAD<® >16.00 eluendo con un gradiente a base di CH3CN e H2O. Per evaporazione delle frazioni contenenti il prodotto si ottiene lo stesso come solido bianco (4,1 g; 2 mmol).

Resa: 95%

p.f.:>300°C

titolo HPLC: 100% (in area %)

Analisi elementare

C H N Gd Na % cale.: 49,39 4,19 4,74 15,21 5,56 % trov.: 49,27 4,02 4,70 15,18 5,48 Gli spettri IR e MS sono in accordo con la struttura indicata.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Composti di formula (I), dove:

A è un substrato reattivo polifunzionale contenente almeno tre gruppi funzionali derivante da un qualunque residuo organico polivalente che può essere alifatico a catena aperta, ramificata o no, oppure può essere aliciclico, o eterociclico contenente N, O e/o S, oppure può essere aromatico o eteroaromatico; Z è un residuo di un acido biliare; Y, ed Y2, uguali o diversi tra loro, rappresentano il residuo di un agente chelante degli ioni metallici bi-trivalenti aventi numero atomico variabile tra 20 e 31, 39, 42, 43, 44, 49, o fra 57 e 83; Lt, L2 sd L3, uguali o diversi tra loro, rappresentano un legame (semplice) tra i gruppi funzionali delle unità coinvolte nel legame o una catena spaziante comprendente fino a un massimo di 20 atomi di carbonio, come pure i chelati complessi degli stessi con gli ioni degli elementi metallici aventi numero atomico compreso tra 20 e 31, 39, 42, 43, 44, 49, o fra 57 e 83, ed i loro sali con basi organiche scelte tra ammine primarie, secondarie, terziarie o amminoacidi basici, oppure con basi inorganiche i cui cationi sono sodio, potassio, magnesio, calcio o loro miscele, oppure con anioni di acidi organici o inorganici fisiologicamente accettabili.
2. Composti secondo la rivendicazione 1 in cui Lj ed L2, uguali o diversi tra loro, rappresentano una catena spaziante di formula (II)

in cui: Q è una catena alchilica C]-C8 eventualmente sostituita da 1 a 3 gruppi OH; s è un numero da 0 a 5; R. è un atomo di H, o un gruppo alchile C[-C5; x è uguale a

L3 è un gruppo di formula (III)

in cui: X ed s assumono i valori precedentemente definiti (con la condizione che se s è diverso da 0 allora CO e X sono presenti).
3. Composti secondo le rivendicazioni 1 e 2 in cui L, ed L2, uguali o diversi, sono scelti tra quelli di formula (IV), (V), (VI)

L3 è un legame semplice tra i gruppi funzionali Z ed A o un gruppo

in cui: n è un numero tra 1 a 8, e R, assume i valori precedentemente definiti.
4. Composti secondo le rivendicazioni da 1 a 3 in cui A è un substrato reattivo polifunzionale scelto tra quelli di Tabella 1.
5. Composti secondo le rivendicazioni da 1 a 3 in cui Z è un residuo derivante dagli acidi colico, deossicolico, chenodeossicolico, ursodeossicolico, litocolico e loro derivati, compresi i coniugati con taurina e glieina.
6. Composti secondo le rivendicazioni da 1 a 3 in cui ed Y2, uguali o diversi, rappresentano un residuo di un acido poliamminopolicarbossilico, o di un suo derivato.
7. Composti secondo ognuna delle rivendicazioni da 1 a 6 in cui Yj ed Y2, uguali o diversi, rappresentano un residuo di un acido poliamminopolicarbossilico scelto tra quelli di Tabella 2, Z è un residuo dell' acido colico o di un suo derivato e A è un substrato reattivo polifunzionale scelto tra quelli di Tabella 1.
8. Composto secondo una delle rivendicazioni da 1 a 7 scelto tra i seguenti: Acido [3α [3(S),4(S)],5β,12α]-3-[[[trans-3,4-bis[[[5-[bis[2-[bis(carbossimetil)ammino]etil]ammino]-5-carbossipentil]ammino]carbonil]-1-pirrolidinil]carbonil]ossi]-12-idrossicolan-24-oico; Acido [3α [3(S),4(S)],5β,12α]-3-[[[trans-3,4-bis[[[2-[bis[2-[bis(carbossimetil)ammino]etil]ammino]-2-carbossietil]ammino]carbonil]-1-pirrolidinil]-carbonil]ossi]-12-idrossicolan-24-oico; Acido (3α ,5β,12α)-3-[[[trans-3,4-bis[[[2-[[[4,7,10-tris(carbossimetil)-1 ,4,7,10-tetraazaciclododec- 1 -il]acetil]amino]etil]amino]carbonil]- 1 -pirrolidinil]carbonil]ossi]-12-idrossicolan-24-oico; Acido [3α [3(S),4(S)],5β,12α]-3-[[[trans-3,4-bis[[[5-[[2-[bis(carbossimetil)ammino]etil](carbossimetil)ammino]-5-carbossipentil]ammino]carbonil]-1-pirrolidinil]carbonil]ossi]-12-idrossicolan-24-oico; Acido [3α [1(S),2(S)],5β,7a,12α]-3-[[[[cis-1 ,2-bis[[[5-[bis[2-[bis(carbossimetil)ammino]etil]ammino]-5-carbossipentil]ammino]carbonil]-4-ciclopentii] ammino]carbonil]ossi]-7,12-diidrossicolan-24-oico; Acido [33aα [1(S)],5β,7a,12α]-3-[[[[cis-1-[[[5-[bis[2-[bis(carbossimetil)ammino]etil]ammino]-5-carbossipentil]ammino]carbonil]-2-[[[2-[[[4,7,10-tris(carbossimetil)- 1 ,4,7, 10-tetraazaciclododec- 1 -il]acetil]ammino]etil]amino]-carbonil]-4-ciclopentil]ammino]carbonil]ossi]-7,12-diidrossicolan-24-oico; Acido [3β[3(S),5(S)],5β,7as12α]-3-[[[3,5-bis[[4-[bis[2-[bis(carbossimetil)ammino]etil]ammino]-4-carbossi-1-ossobutil]ammino]fenil]carbonil]ammino]-7, 12-diidrossicolan-24-oico.
9. Composti secondo la rivendicazione 1 in cui g i ioni metallici bi o trivalenti complessati dai residui chelanti Y] ed Y2 sono selezionati tra Fe <(2+)>, Fe <(3+>>, Gd <(3+)>, Eu <(3+)>, Dy<(3+)>, La<(3+)>, Yb<(3+) >e Mn <(2+) >.
10. Composti secondo la rivendicazione 1 in cui la base organica salificante è scelta tra: etanolammina, dietanolammina, morfolina, glucammina, N,N-dimetilglucammina, N-metilglucammina, lisina, arginina, ornitina.
11. Composti secondo la rivendicazione 1 in cui l’anione delFacido inorganico salificante è scelto tra gli ioni degli acidi alogenidrici quali ioduri, bromuri e cloruri.
12. Composizione farmaceutica diagnostica contrastografica comprendente almeno uno dei chelati complessi secondo la rivendicazione 1 o un suo sale fisiologicamente compatibile.
13. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 12, per ottenere immagini di organi e/o tessuti del corpo umano o animale, tramite l’impiego della risonanza magnetica nucleare.
14. Uso dei chelati complessi dei composti di formula (I) e/o dei loro sali fisiologicamente compatibili per la preparazione di formulazioni diagnostiche, allo scopo di ottenere immagini di organi e/o tessuti del corpo umano e animale, tramite l’impiego della risonanza magnetica nucleare.