ITFI980232A1 - Sets di oligonucleotidi sintetici specifici per l'identificazionee la tipizzazione dei virus polioma sv40,bk e jc, mediante la tecnica - Google Patents

Description

Sets di oligonucleotidi sintetici specifici per l'identificazione e la tipizzazione dei virus Polioma SV40. BK e JC. mediante la tecnica di nested PCR ed ibridazione molecolare,

Campo dell'invenzione

La presente invenzione si riferisce a nuovi oiigonucieondi sintetici specifici per l’identificazione e la tipizzazione dei virus Polioma SV40. BK e JC ed al loro uso, in combinazione con oligonucleotidi e o/igosonde interne noti, nella tecnica di nested PCR ed ibridazione molecolare.

Stato dell’arte

I virus Polioma umani fino ad ora identificati sono i virus BK e JC, mentre più recentemente si è osservata nelia popolazione umana la presenza del virus della scimmia SV40 (simian virus 40). I virus Polioma BK e JC furono isolati nel 1971 da pazienti le cui iniziali hanno dato il nome a questi due nuovi agenti infettivi.

Diversi articoli, pubblicati negli ultimi anni da prestigiose riviste scientifiche internazionali, hanno fornito evidenze della presenza in tumori umani, principalmente tumori cerebrali, mesoteliomi, sarcomi ed osteosarcomi, tumori della tiroide e dell’ipofisi, e disordini linfoproliferatìvi del virus tumorale della scimmia SV40. Inoltre, il nostro gruppo ha evidenziato sequenze di SV40 anche in campioni di sangue e sperma di individui sani, ma in una minore prevalenza rispetto ai tessuti neoplastici detti sopra. Tale virus, è naturalmente presente nelle scimmie sia africane che indiane dove non sembra provocare malattie E’ probabile che SV40, JC e BK, viste le loro proprietà tumorali, possano essere dei cofattori responsabili dell'insorgenza di quei tumori umani, menzionati sopra, percentualmente in crescita negii ultimi anni. In passato e anche recentissimamente nel nostro laboratorio, il virus SV40 é stato trovato nel fluido cefalospinale di individui affetti da leucoencefalopatia multifocaie progressiva (LMP).

Attualmente non sono disponibili metodi standardizzati cne si basino sull'utilizzo di tecniche immunologicne, virologiche o di biologia molecolare. Solo a fini di ricerca alcuni gruppi hanno impiegato tecniche di biologia molecolare, utilizzando la ibridazione secondo la tecnica di Southern e la metodica di single step PCR. In particolare in: Bergsagel et al. DNA sequences similar to those of simian virus 40 in ependymomas and choroid plexus tumors of childhood. New Engiand Journal of Medicine 326: 988-993 (1992) sono descritti l’uso dei seguenti oligonucleotidi denominati rispettivamente

e le oligosonde interne denominate

SV probe 5'-ATG TTG AGA GTC AGC AGT AGC C-3';

BK probe 5'-GAG AAT CTG CTG TTG CTT CTT-3'

JC probe 5'- GTT GGG ATC CTG TGT TTT CAT-3’

ed il loro uso per l’identificazione rispettivamente dei virus SV40, BK e JC in single step PCR seguita da ibridazione su filtro

Inoltre in De Mattei et al. High incidence of 3K virus !arge T antigen coding sequences in normal human tissues and tumors of different histotypes. International Journal of Cancer 61: 756-760 (1995) sono descritti gli oligos (noti):

PYV.for 5’-TAG GTG CCA ACC TAT GGA ACA GA-3’ e

PYV.rev 5 -GGA AAG TCT TTA GGG TCT TCT ACC-31

l’oligosonda interna specifica dei DNA di BKV denominata:

BKV probe 5’-AAT CTT CAT CCC ATT TTT CA-3'

ed il loro uso per l'identificazione del virus BK in single step PCR seguita da ibridazione su filtro.

Visto l’attuale stato delle conoscenze è evidente l’importanza di disporre di metodi di analisi alternativi e più sensibili che consentano di identificare la eventuale presenza nei pazienti dei suddetti virus Polioma.

Descrizione dettagliata dell'invenzione

La presente invenzione consente di risolvere il problema della mancanza di metodiche analitiche certe, con l'impiego di una serie di oligonucleotidi sintetici (nuovi e noti) impiegati in nested PCR, seguita da ibridazione su filtro con sonde oligonucleotidiche specifiche che consentono di identificare i virus SV40, BK e JC.

Materiali e metodi

Campioni biologici

Le biopsie di tumori cerebrali, osteosarcomi, mesoteliomi, linfomi e tumori della tiroide di pazienti, così come i tessuti normali rappresentati da frammenti tissutali di cervello e osso normale, ci sono state fornite/i da diversi Centri, Ospedali e Cliniche universitarie sia italiani che stranieri. Linee cellulari derivate da tumori cerebrali e osteosarcomi umani sono state coltivate a 37°C. in monostrato con terreno DME addizionato con siero di vitello o fetale bovino al 10%. Campioni di sangue e buffy coats di donatori sani ci sono stati forniti della Banca del Sangue dell’Arcispedale Sant'Anna, mentre preparazioni di linfociti B e T ci sono stati forniti dall’Istituto di Genetica Medica, Università di Ferrara. I campioni di liquido spermatico sonc del Laboratorio di Endocrinologia dell'Ospedale di Modena [vedi Martini F.et al. Simian virus 40 early region and large T antigen in human brain tumors, peripheral blood cells and sperm fluids from healthy individuals. Cancer Research 56, 4820-4825, 1996],

Il DNA del ceppo di SV40 wild type 776 é di fonte commerciale, mentre i DNA clonati dei virus BK e JC provengono dal nostro laboratorio. DNA Umani

I DNA genomici umani sono stati isolati mediante lisi dei tessuti e delle cellule con la metodica standard di digestione con SDS e proteinasi K, estrazione con fenolo-cloroformio-alcool isoamilico e dialisi in un tampone di Tris-EDTA 10 mM-1mM pH 7,4. La concentrazione del DNA é stata determinata spettrofotograficamente. I DNA sono stati analizzati in elettroforesi in gel d'agarosio in tampone acetato. Dopo la corsa elettroforetica i gel sono stati colorati con bromuro di etidio, osservati con un transilluminatore a raggi U.V. e fotografati con un apparecchiatura Polaroid MP4.

Oligonucleotidi sintetici e condizioni di PCR.

Gli oligonucleotidi impiegati in PCR per identificare e discriminare i virus Polioma SV40, BK e JC sono derivati dalle sequenze del DNA dei tre virus, all'interno della regione precoce codificante per l'antigene tumorale chiamato "antigene T grande (agT)" [vedi Fiers W. et al. Complete nucleotide sequence of SV40 DNA. Nature 273, 113-120, 1978; Padgett BL. In: J. Tooze (ed), DNA Tumor Viruses, part 2, pp.

205-296. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1981 ; Frisque et al. Human polyomavirus JC virus genome. Journal cf Viroiogy 51, 456-469,1984; e Bergsagei DJ et ai. DNA sequences similar to those of Sìmian virus SV40 in ependymomas and cnoroid plexus tumors of childhood. New England Journal of Medicine 326: 988-993, 1992],

La regione precoce dei virus Polioma é altamente conservata e di conseguenza l'omologia di queste sequenze nei tre genomi é di circa Γ 80%. Tuttavia, all'interno di questa regione vi sono piccole variazioni di sequenza che consentono di ottenere oligonucleotidi unici, oppure si può discriminare l'amplificato comune ai tre virus con delle oligosonde interne specifiche per ognuno dei tre DNA.

Gli oligonucleotidi riportati in questa domanda, sia quelli noti che quelli descritti per la prima volta, sono stati sintetizzati utilizzando tecniche e apparecchiature standard.

Le due coppie di oligonucleotidi sintetici utilizzati per l'amplificazione mediante nested PCR (nPCR) delle sequenze della regione precoce del virus SV40, ceppo selvatico 776, sono stati denominati rispettivamente, la coppia esterna, già nota, SV.for2 (5’-CTT TGG AGG CTT CTG GGA TGC AAC T-3' dal nt 4372 al nt 4396) e SV.rev (5‘-GCA TGA CTC AAA AAA CTT AGC AAT TCT G-3' dal nt 4918 al nt 4945). Questa coppia amplifica in single step PCR una banda di 574 bp. La seconda coppia di oligonucleotidi, secondo questa invenzione, denominata, SV.forl (5-TAG ATT CCA ACC TAT GGA ACT GA-3’ dal nt 4574 al nt 4552) e SV.revI (GAA AGT CCT TGG GGT CTT CTA C-3' dal nt 4403 ai nt 4425) produce in nPCR o in single step PCR, un amplificato di 172 paia di basi. La specificità deH'amplificato di SV40 è stata determinata mediante ibridazione su filtro utilizzando l'oligosonda nota SV probe avente come sequenza: 5'-ATG TTG AGA GTC AGC AGT AGC C-3';

Mediante nPCR sono state amplificate le sequenze della regione precoce del virus BK, ceppo selvatico Dunlop. Nella prima PCR sono stati impiegati secondo l'invenzione gli oligonucleotidi denominati rispettivamente BK.for2 (5'-TTT TGG AAC CTG GAG TAG CTC AGA G-3' dal nt 4827 al nt 4803) e BK.rev (5*-GCT TGA CTA AGA AAC TGG TGT AGA TCA G-31 dal nt 4250 al nt 4277). Questa prima reazione di PCR da un prodotto di 578 paia di basi. Nella seconda PCR abbiamo impiegato gli oligonucleotidi noti PYV.for (dal nt 4461 al nt 4439) e PYV.rev. (dal nt 4280 al nt 4303) che danno un prodotto di 181 paia di basi. La specificità dell'amplificato di BKV é stata determinata mediante ibridazione su filtro con l'oligosonda nota BKV probe avente sequenza: 5'-AAT CTT CAT CCC ATT l'TT CA-3'.

Gli oligonucleotidi sintetici secondo l'invenzione, utilizzati per l'amplificazione mediante nPCR delle sequenze della regione precoce de! virus JC, ceppo selvatico Mad1, sono stati denominati rispettivamente: JC.for2 (5’-TTT TGG TAC ATG GAA TAG TTC AGA G-3’ dal nt 4795 al nt 4771 ) e JC.rev (5‘-GCT TGA CTG AGG AAT GCA TGC AGA TCT-3' dai nt 4221 al nt 4247). Questa prima reazione di PCR da un prodotto di 575 paia di basi. Nella seconda PCR abbiamo impiegato gli oligonucleotidi noti PYV.for (dal nt 4429 al nt 4407) e PYV.rev. (dal nt 4251 al nt 4274) che danno un prodotto di 178 paia di basi. La specificità dell'amplificato di JCV é stata determinata mediante ibridazione su filtro con l'oligosonda nota JC probe avente sequenza: 5'-GTT GGG ATC CTG TGT TTT CAT -3’

Amplificazione delle sequenze di SV40

Le condizioni utilizzate in PCR con gli oligonucleotidi noti SV.for2-SV.rev, per l'amplificazione della sequenza bersaglio di 574 bp sono state le seguenti: 5 minuti a 94°C per la denaturazione e aggiunta della Taq polimerasi a 80°C (hot start), 94°C per 5 min. poi 45 cicli di PCR con 1 min. di denaturazione a 94°C; 1 min. di appaiamento a 55°C; ed 1 min. di estensione a 72°C.

In seguito, per la nested PCR, un microlitro della precedente è stato amplificato con il secondo set di oligos secondo l'invenzione denominati SV.for 1, 5-TAG ATT CCA ACC TAT GGA ACT GA-3' e SV.revI, GAA AGT CCT TGG GGT CTT CTA C-3 , nelle seguenti condizioni: hot start, 94X per 5 min. poi 35 cicli di PCR con 1 minuto a 94°C, 30 sec. a 56°C e 16 sec. a 72°C. Le due coppie di oligos suddetti sono specifici per la regione precoce di SV40.

Amplificazione delle sequenze di BKV

Le condizioni utilizzate in PCR con gli oligonucleotidi secondo l'invenzione denominati BK.for2 (5'-TTT TGG AAC CTG GAG TAG CTC AGA G-3’)-BK.rev (5'-GCT TGA CTA AGA AAC TGG TGT AG A TCA G-3’), per l'amplificazione della sequenza bersaglio di 578 bp sono state le seguenti: 5 minuti a 94°C per la denaturazione e aggiunta della Taq polimerasi a 80°C (hot start), poi 45 cicli di 1 min. a 94°C; 1 m in. a 58°C; ed 1 min. a 72°C. In seguito, per la seconda PCR, un microlitro della precedente è stato amplificato con il secondo set di oligos (noti): PYV.for 5’-TAG GTG CCA ACC TAT GGA ACA GA-3’ e PYV.rev 5’ -GGA AAG TCT TTA GGG TCT TCT ACC-3’. nelle seguenti condizioni: hot start, 94°C per 5 min., poi 35 cidi di 1 min. a 94°C, 30 sec. a 54°C e 16 sec. a 72°C. La coppia di oligos BK.for2-BK.rev essendo specifica per la regione precoce del virus BK, non amplifica le corrispondenti regioni di SV40 e JCV. La seconda coppia di oligos interna amplifica la corrispondente regione dei tre virus Polioma BK, JC e SV40. Tuttavia, le oligosonde interne (note, vedi sopra) sono in grado di discriminare le tre diverse sequenze.

Amplificazione delle sequenze di JCV

Le condizioni utilizzate in PCR con gli oligonucleotidi, denominati secondo l’invenzione JC.for2-JC.rev, per l'amplificazione della sequenza bersaglio di 575 bp, sono state le seguenti: 5 minuti a 94°C per la denaturazione e aggiunta delia Taq polimerasi a 80°C (host start), poi 45 cicli di 1 min. a 94°C: 1 min. a 60°C; ed 1 min. a 72°C. In seguito, per la nPCR, un microlitro della precedente è stato amplificato con il secondo set di oligos (noti): PYV.for (5’-TAG GTG CCA ACC TAT GGA ACA GA-3’) e PYV.rev (5’-GGA AAG TCT TTA GGG TCT TCT ACC-3’) nelle seguenti condizioni: hot start, 94°C per 5 min., poi 35 cicli di 1 min. a 94°C, 30 sec. a 54°C e 16 sec. a 72°C. La coppia di oligos JC.for2-JC.rev sono specifici per la regione di JC mentre la seconda coppia di oligos amplifica la corrispondente regione dei tre virus Polioma BK, JC e SV40. Tuttavia, le oligosonde interne (note, vedi sopra) sono in grado di discriminare le diverse sequenze dei tre virus Polioma.

RISULTATI

Saggio di specificità degli oligonucleotidi e delle metodiche con i DNA di SV40, JCV e BKV, usati come controllo e successiva analisi di DNA ottenuti da campioni umani tumorali e normali .

Nei saggi di controllo positivo, ogni campione rappresentato da 100 nanogrammi di DNA di SV40, BKV o JCV, è stato sottoposto ad amplificazione, secondo i parametri di PCR descritti sopra, nelle seguenti condizioni: 150 micromolare di dNTP, 25 picomoli di ogni oligonucleotide, una unità di Taq polimerasi in un volume totale di 50 microlitri per ogni reazione. Dopo l'amplificazione, un’aliquota corrispondente a 10 microlitri di campione è stata analizzata in elettroforesi su gel di agarosio 2% in tampone acetato-EDTA (TAE) 0,5X a 100 V per 30-40 min. e successivamente colorato con bromuro di etidio. Gli esperimenti di PCR di controllo hanno consentito, per ogni coppia di oiigos che riconosce una sequenza bersaglio specifica di SV40, BKV o JCV, di amplificare selettivamente le sequenze dei tre virus Polioma. Abbiamo osservato che la coppia di oiigos specifica per SV40 amplifica nella prima PCR una banda di 574 bp seguita nella seconda PCR da una seconda banda di 172 bp. Per il DNA di BKV la metodica di nPCR consente di amplificare una banda di 578 bp seguita da una banda da 181 bp, mentre per JCV osserviamo un primo amplificato di 575 seguito da un secondo amplificato di 178 bp. Nelle nostre condizioni quindi questi oligonucleotidi impiegati in nested PCR permettono di identificare SV40, BKV e JCV. rispettivamente. Inoltre, per dimostrare che gli amplificati erano specifici dei tre diversi virus Polioma SV40, BK e JC, gli stessi oiigos sono stati utilizzati in PCR con DNA umani privi delle sequenze virali in oggetto, impiegati come controlli negativi. Nessun amplificato è stato ottenuto in queste condizioni. La conferma definitiva della specificità dei tre diversi amplificati é stata ottenuta dai saggi di ibridazione su filtro, con tre diverse oligosonde, ognuna specifica per i tre diversi DNA dei virus Polioma. Le condizioni di ibridazione per le tre sonde specifiche sono le seguenti: il gel d'agarosio contenente i DNA amplificati sono stati trasferiti in presenza di 20X SSC (Na citrato 0,3 M, NaCI 3 M) su filtri di nylon (Hybond N, Amersham. UK). In seguito i DNA su filtro sono stati fissati al filtro mediante radiazione UV di un transilluminatore per 2 min.

I filtri sono stati ibridati con la SV probe (5-ATG TTG AGA GTC AGC AGT AGC C-3'), oppure con la JC probe, 5'-GTT GGG ATC CTG TGT TTT CAT-3' o con la BKV probe, 5'-AAT CTT CAT CCC ATT TTT CA 3', precedentemente marcata terminalmente al 5' con 32P. In breve, 10 picomoli dell'oligosonca sonG stati marcati con 10 unità di polinucleotide cninasi (Boehringer, Germania) con 30 mCi di ATP [y.

32P] (attività specifica 3.000 Ci/mmol, NEN Dupont. U.S.A.) in 20 ul di miscela di marcatura contenente 0,05 M Tris-HCI, pH 7.6, 0,01 M MgCI2, 5 mM DTT, 0,1 mlVI spermidina-HCI, 0,1 mM EDTA, pH 8. In alternativa le oligosonde sono state marcate con traccianti chemioluminescenti di kit commerciali ed impiegati come descritto dalle ditte fornitrici. Le sonde SV e JC sono state impiegate a 42°C per 2-4 hr in 6X SSPE (20X SSPE soluzione madre: 3,6 M NaCI, 0,2 M NaH2P04, 0,02 M Na2EDTA), 5X soluzione di Denhardt (100X: 10 g di BSA, Sigma, U.S.A., 10 g di Fycoll 400, Pharmacia, Svezia, 10 g di polyvinylpyrrolidone, Sigma, U.S.A.), 100 mg/ml DNA di sperma di salmone (SS-DNA), Boehringer, Germania and 0,5% di SDS (Sigma, U.S.A.). Per la sonda BKV l'ibridazione é stata eseguita a 37°C in 5 X SSPE, 5 X soluzione di Denhardt, 100pg/ml SS-DNA e 0,5% SDS. I lavaggi di ibridazione per SV40 sono stati eseguiti in condizioni di alta astringenza, vale a dire due volte per 15 min. in 2 a SSPE, 0,1% SDS, a temperatura ambiente, una volta per 15 min. con la medesima soluzione a 42°C, e una volta a 61 °C in 6 X SSPE, 0,1% SDS.

I lavaggi di ibridazione per BKV sono stati : 2 volte per 15 minuti in 2 X SSC, 0,1% SDS a temperatura ambiente, 1 volta x 15 minuti in 0,5 X SSC, 0,1% SDS a 37°C.

I lavaggi per JCV sono stati : 2 volte per 15 minuti in 2 X SSPE. 0,1% SDS a temperatura ambiente. 1 volta per 15 minuti in 2 X SSPE, 0,1% SDS a 42°C e 1 volta per 15 minuti in 6 X SSPE, 0,1% SDS a 55°C. Le autoradiografie sono state fatte a -80°C. con film Kodak X-omat AR, per i campioni virali di controlio positivi per una notte, mentre per i campioni umani in esame per 3-7 giorni. Nelle nostre condizioni di PCR ed ibridazione su filtro non abbiamo verificato cross-ibridazioni.

DNA genomico umano isolato da tumori cerebrali, osteosarcomi e sarcomi, mesoteliomi pleurici, disordini linfoproliferativi di diverso istotipo, linee cellulari derivate dai tumori suddetti e tessuti normali di cervello, osso, sangue periferico, buffy coats. linfociti B e T e fluidi spermatici di individui sani sono stati analizzati con le modalità descritte sopra per le sequenze di DNA ed RNA di SV40, BK e JC. I risultati ottenuti sono riassunti nelle Tabelle 1-3.

Infine, la specificità delle sequenze amplificate é stata ulteriormente confermata mediante l'analisi di sequenza del DNA con la tecnica di Sanger.

E’ importante considerare come l'utilizzo della nPCR seguita da ibridazione molecolare, grazie agli oligos e alle condizioni impiegate secondo l'invenzione consentono, di rilevare concentrazioni bassissime di DNA dei tre diversi virus Polioma, fino a 10~4 genomi equivalenti per cellula, corrispondenti a 2 molecole di DNA virale per campione esaminato costituito da 500 nanogrammi di DNA genomico umano. La presente invenzione si riferisce inoltre anche a kits diagnostici comprendenti gli oligonucleotidi e le rispettive oligosonde per la determinazione e la lipizzazione dei virus polioma SV40, BK e JC. In particolare un kit. di tipo completo, può essere costituito da 10 provette contenenti ciascuna uno degli oligonucleotidi per la determinazione del virus come sopra descritti, normalmente in forma liofilizzata, e tre provette contenenti le rispettive oligosonde sopra descritte.

Ovviamente sono possibili anche kits più ridotti, ad esempio relativi a uno solo dei virus Polioma indicati.

Il kit può inoltre comprendere anche i DNA dei/del virus Polioma cercato da impiegare come controlli positivi.

Tabella 1. Sequenze del virus Polioma SV40 in tumori umani, linee cellulariderivate e tessuti normali.

TABELLA 2. Sequenze del virus Polioma 6K in tumori umani, lìnee cellulari derivala e tessuti normali.

TABELLA 3. Sequenze del virus Polioma JC in tumori umani, linee cellulari derivate e tessuti normali.

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI 1. Oligonucleotidi aventi le seguenti sequenze: SV.for 1 , 5’-TAG ATT CCA ACC TAT GGA ACT GA-3' e SV.revI , GAA AGT CCT TGG GGT CTT CTA C-3’ 2. Oligonucleotidi aventi le seguenti sequenze: BK.for2, 5’-TTT TGG AAC CTG GAG TAG CTC AGA G-3' e BK.rev, 5'-GCT TGACTA AGA AAC TGG TGT AGA TCA G-3’. 3. Oligonucleotidi aventi le seguenti sequenze: JC.for2, 5’-TTT TGG TAC ATG GAA TAG TTC AGA G-3' e JC.rev, 5’-GCT TGA CTG AGG AAT GCA TGC AGA TCT-31 4. Uso degli oligonucleotidi secondo la rivendicazione 1 per la identificazione mediante nPCR o single step PCR di SV40. 5. Processo per l'identificazione del virus SV40 in cui si utilizzano, con tecnica PCR, gli oligonucleotidi noti SV.for2, 5’-CTT TGG AGG CTT CTG GGA TGC AAC T-3’ e SV.rev, 5’-GCA TGA CTC AAA AAA CTT AGC AAT TCT G-3'; nelle seguenti condizioni per ia prima PCR: denaturazione 5 minuti a 94°C e aggiunta deila Taq polimerasi a 80°C, 5 minuti a 94°C, 45 cicli di PCR con 1 minuto di denaturazione a 94°C, 1 minuto di appaiamento a 55°C e 1 minuto di estensione a 72°C; e quindi si amplifica, con una seconda PCR, un microlitro della soluzione cosi ottenuta in presenza degli oligos SV.for 1, 5' -TAG ATT CCA ACC TAT GGA ACT GA-3’ e SV.revI , GAA AGT CCT TGG GGT CTT CTA C-3’ secondo la rivendicazione 1, nelle seguenti condizioni: hot start, 94°C per 5 min. poi 35 cicli di PCR con con 1 minuto a 94X, 30 sec. a 56°C e 16 sec. a 72°C. 6. Uso degii oligonucleotidi, BK.for2, 5'-TTT TGG AAC CTG GAG TAG CTC AGA G-3’ e BK.rev, 5'-GCT TGACTA AGA AAC TGG TGT AGA TCA G-3', secondo la rivendicazione 2 per la identificazione mediante nPCR o single step PCR di BKV. 7. Processo per l'identificazione del virus BK in cui si utilizzano, con tecnica nPCR, gli oligonucleotidi secondo la rivendicazione 2 nelle seguenti condizioni: denaturazione 5 minuti a 94°C e aggiunta della Taq polimerasi a 80°C (hot start), poi 45 cicli di 1 min. a 94°C; 1 min. a 58°C; ed 1 min. a 72°C quindi si amplifica, con tecnica nested PCR. un microlitro della soluzione così ottenuta in presenza degli oligos noti: PYV.for 5’-TAG GTG CCA ACC TAT GGA ACA GA-3' e PYV.rev 5'-GGA AAG TCT TTA GGG TCT TCT ACC-3'; nelle seguenti condizioni: hot start, 94°C per 5 min., poi 35 cicli di 1 min. a 94°C, 30 sec. a 54°C e 16 sec. a 72°C. 8. Uso degli oligonucleotidi JC.for2, 5'-TTT TGG TAC ATG GAA TAG TTC AGA G-3’ e JC.rev, 5'-GCT TGA CTG AGG AAT GCA TGC AGA TCT-3’, secondo la rivendicazione 3 per la identificazione mediante nPCR o single step PCR di JCV. 9. Processo per l’identificazione del virus JC in cui si utilizzano, con tecnica nPCR, gli oligonucleotidi secondo la rivendicazione 3 nelle seguenti condizioni: denaturazione 5 minuti a 94°C e aggiunta della Taq polimerasi a 80°C (host start), poi 45 cicli di 1 min. a 94°C; 1 min. a 60°C; ed 1 min. a 72°C quindi si amplifica, con tecnica nested PCR, un microlitro della precedente in presenza degli oligos noti : PYV.for, 5'-TAG GTG CCA ACC TAT GGA ACA GA-3’ e PYV.rev, 5’-GGA AAG TCT TTA GGG TCT TCT ACC-3’ nelle seguenti condizioni: hot start, 94°C per 5 min., poi 35 cicli di 1 min. a 94°C, 30 sec. a 54°C e 16 sec. a 72°C. 10. Kit diagnostico per la determinazione in nPCR dei virus Polioma SV40, BK e JC costituito da 10 provette contenenti rispettivamente gli oiigonucleotidi, per la determinazione di SV40, BKV e JCV (come indicati nelle rivendicazioni 1 - 3 e nelle rivendicazioni 6 e 8) e tre provette contenenti le rispettive oligosonde di controverifica. 11. Kit diagnostico secondo la rivendicazione 11 comprendente anche : DNA dei tre virus Polioma da impiegare come controlli positivi.