ITFI20060008A1 - Ibridoma capace di produrre un anticorpo monoclonale anti-herg1, anticorpo monoclonale cosi' prodotto, metodo per la determinazione dei livelli di proteina herg1 e kit per tale determinazione - Google Patents
Ibridoma capace di produrre un anticorpo monoclonale anti-herg1, anticorpo monoclonale cosi' prodotto, metodo per la determinazione dei livelli di proteina herg1 e kit per tale determinazione Download PDFInfo
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Description
“Ibridoma capace di produrre un anticorpo monoclonale anti-HERG1, anticorpo monoclonale così prodotto, metodo per la determinazione dei livelli di proteina HERG1 , e kit per tale determinazione"
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione riguarda un anticorpo monoclonale specifico anti-HERG1, l'ibridoma che lo produce, il metodo per la determinazione della proteina HERG1, ed il relativo kit utile per la diagnosi di patologie a cui è associata una sovraespressione della proteina HERG1.
STATO DELL'ARTE
E’ stato dimostrato già da diversi anni che in presenza di varie patologie neoplastiche cellule tumorali di diversa origine istologica, al contrario delle cellule normali corrispondenti, presentano una sovraespressione del gene hergl (Human Ether-a-Gogo-Related Gene-1), che codifica per un canale di K<+>, detto canale HERG.
La struttura del canale HERG è caratterizzata dalla presenza di quattro subunità proteiche disposte simmetricamente attorno ad un poro centrale P, in modo che ciascuna subunità, con la propria regione centrale idrofobica, delimiti tale poro P; il canale presenta una porzione non citoplasmatica, detta “porzione extra-cellulare” del canale HERG e identificata come porzione S5-poro.
La sovraespressione del gene hergl e del canale corrispondente è stata dimostrata in neoplasie umane di varia origine, quali ad esempio adenocarcinomi dell’endometrio (Cherubini A. et al., Br. J. Caricar, 83: 1722-1729, 2000) e del colon (Lastraioli E. et al., Cancer Res. 64: 606-611, 2004), astrocitomi (Masi A. et al., Br. J. Cancer, 93: 781-792, 2005) e in vari tipi di leucemie e linfomi (Pillozzi S. et al., Leukemia 16: 1791-1798, 2002; Smith G.A. et al. J. Bici. Chem. 277: 8528-8534, 2002).
E’ inoltre stato dimostrato che l'attività del canale HERG regola il valore di voltaggio a livelli favorevoli alla crescita e alla sopravvivenza delle cellule tumorali, cosicché il canale HERG risulta avere una funzione rilevante e di vario tipo nel processo di avanzamento della neoplasia, che include il controllo della proliferazione cellulare e dell'apoptosi, la regolazione dell'invasività delle cellule tumorali e della angiogenesi. Da ciò deriva che l’individuazione di un anticorpo monoclonale specifico capace di riconoscere la proteina HERG1 rappresenterebbe uno strumento essenziale di diagnosi di queste patologie, cosi eterogenee tra loro, ma che mostrano tutte una sovraespressione di HERG1.
Inoltre, l'aumento dei livelli di HERG si è dimostrato correlato con l'aumento di malignità nei carcinomi colon-rettali, nelle lesioni neoplastiche dello stomaco, ed in leucemie acute mieloidi: pazienti HERG positivi presentano una prognosi più sfavorevole di pazienti non esprimenti HERG.
L'individuazione di un tale anticorpo potrebbe perciò portare anche a significativi avanzamenti nella scelta del trattamento, e nel monitoraggio delle patologie sopra menzionate.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
Ora la Richiedente ha individuato un ibridoma, selezionato con metodi convenzionali descritti in dettaglio nel seguito, capace di produrre un anticorpo monoclonale specifico anti-HERG1 con un processo di preparazione condotto secondo metodologie convenzionali, descritte in dettaglio nel seguito.
Tale anticorpo monoclonale è un anticorpo specifico anti-HERG1 e in particolare contro la sua porzione extra-cellulare. Per quanto riportato sopra, tale anticorpo può essere usato per la determinazione dei livelli della proteina HERG1 in campioni istologici prelevati da pazienti che richiedono una diagnosi di patologie alle quali è associata una sovraespressione della proteina HERG1.
Rappresenta pertanto oggetto dell'invenzione un ibridoma capace di produrre una quantità percettibile di un anticorpo monoclonale specifico contro la porzione extracellulare S-5 poro della proteina HERG1, comprendente il prodotto della fusione tra una cellula immortalizzata ed un linfocita ottenuto per immunizzazione di un animale ospite con un peptide di sequenza EQPHMDSRIGWLHN.
L'anticorpo monoclonale specifico contro la porzione extra-cellulare della proteina HERG1 prodotto dal suddetto ibridoma, costituisce ulteriore oggetto dell’invenzione.
Ulteriori oggetti dell’invenzione sono le composizioni farmaceutiche comprendenti il suddetto anticorpo monoclonale, l'uso dell'anticorpo per la preparazione delle composizioni farmaceutiche, un metodo per la determinazione dei livelli di proteina HERG1 in campioni istologici prelevati da pazienti che richiedono una diagnosi di patologie alle quali è associata una sovraespressione della suddetta proteina, ed un kit comprendente l'anticorpo monoclonale per la realizzazione di tale metodo.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1: Immunoistochimica eseguita con il sovranatante deH’ibridoma selezionato come descritto nell'Esempio 1 seguente, non diluito, senza l'utilizzo di permeabilizzazione cellulare.
Fi<g>ura 2: Analisi citofluori metrica di cellule HEK293 trasfettate con il gene hERG1 (HEK-hERG1) In verde, è mostrato il controllo negativo (HEK293-hERG1 marcate con il solo anticorpo secondario, anti-mouse IgG FITC); in blu, HEK293-hERG1 marcate con l’anticorpo monoclonale anti-HERG1 ottenuto come descritto nell’Esempio 1 e con l’anticorpo secondario anti-mouse IgG FITC.
Fi<g>ura 3: A) Colorazione con blu di Comassie di un gel al 6% ottenuto tramite elettroforesi in condizioni non riducenti. I tre campioni sono rappresentati dallo standard, l’anticorpo A7 purificato (10 pi) ottenuto come descritto nell’Esempio 2, ed un anticorpo monoclonale anti-tubulina (lgG2a, 200 ng/μΙ, Santa Cruz Biotechnology). B) Colorazione con blu di Comassie eseguito su gel al 10% in condizioni riducenti; i 9 campioni sono: standard, anticorpo purificato ottenuto come descritto nell'Esempio 2 (1 μΙ, 2μΙ, 5μΙ, 10 μΙ, 15 μΙ) e BSA (0,1 pg, 0,2 pg, 0,5 pg).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
Secondo l’invenzione, la linea cellulare usata come popolazione immortalizzata per la selezione dell ibridoma, appartiene alla linea cellulare NSO neoplastica murina, mentre animale ospite usato di preferenza per la produzione deiribridoma è il topo.
L'anticorpo monoclonale ottenuto secondo l’invenzione può essere purificato mediante cromatografia per affinità mediante proteina A legata a sefarosio.
I requisiti che l'anticorpo anti-hERG1 dell'invenzione ha mostrato di possedere, sono essenziali per considerare tale molecola un mezzo fondamentale di identificazione della proteina nella ricerca di base, e per la sua applicazione in diagnostica.
In diagnostica, l'anticorpo monoclonale secondo l’invenzione può essere usato per la determinazione dei livelli di HERG1 che, come spiegato sopra, sono indice della presenza di patologie in cui tale proteina viene sovraespressa, quali ad esempio neoplasie umane di varia origine, come adenocarcinomi dell’endometrio e del tratto gastrointestinale, astrocitomi e vari tipi di leucemie e linfomi. Il presente metodo è messo in atto su un campione istologico prelevato al paziente che necessita della diagnosi, ed è basato sull'uso dell'anticorpo monoclonale (anticorpo primario), e di un anticorpo secondario, coniugato con una perossidasi, comprendente gruppi Fab che riconoscono e legano l'anticorpo monoclonale. In questo modo, più copie di secondario possono legarsi all'anticorpo primario, con il risultato di un segnale più evidente, e senza che la specificità dell’anticorpo primario verso l'antigene venga modificata dai procedimenti chimici impiegati per la marcatura. L’enzima perossidasi coniugato all'anticorpo secondario viene rivelato tramite una reazione istochimica con un adatto rivelatore, come la 3,3'-diaminobenzidina (Dab). L’uso di una perossidasi legata all'anticorpo secondario aumenta la sensibilità del metodo, perché occorrono poche molecole di enzima perossidasi per produrre una reazione visibile al microscopio. Prima dell'incubazione con i due anticorpi, il campione viene preventivamente trattato con un agente ossidante che blocca le perossidasi endogene, ad esempio con H2O21% in PBS. Prima di aggiungere il rivelatore, il campione viene preferibilmente trattato con una soluzione di proteinasi K in PBS per eliminare tutte le porzioni proteiche che nascondono l’antigene. Il livello di proteina HERG1 nel campione può essere poi determinato per confronto con un campione a concentrazione nota di proteina HERG1.
Rientra negli scopi dell'invenzione un kit adatto a realizzare tale metodo, comprendente il presente anticorpo monoclonale. Oltre all'anticorpo, il presente kit può inoltre comprendere il peptide di sequenza EQPHMDSRIGWLHN con il quale è stata prodotta la proteina, un adatto standard di controllo a concentrazione nota della proteina, ed uno o più tamponi a scopo di diluizione e mantenimento del valore di pH appropriato per non alterare la struttura e la capacità di legame anticorpale.
Oltre che in diagnostica, il presente anticorpo anti-hERG1 può trovare inoltre applicazione in clinica; infatti, l’epitopo specifico di tale anticorpo si trova a livello di una porzione del canale capace di interagire con l’unità funzionale della proteina, il poro P, così da indurre alterazioni sulle caratteristiche biofisiche e quindi sui processi biologici che ne sono influenzati, come ad esempio la proliferazione e la capacità invasiva delle cellule neoplastiche.
Rientrano pertanto negli scopi dell’invenzione composizioni farmaceutiche comprendenti l'anticorpo monoclonale come sopra descritto o suoi sali farmaceuticamente accettabili, formulato con carriers, eccipienti e/o diluenti farmaceuticamente accettabili secondo le tecniche convenzionali nel campo delia tecnologia farmaceutica e note a qualsiasi esperto del ramo. Tali composizioni possono essere somministrate a vari dosaggi e vie di somministrazione e formulate di conseguenza; la scelta dipende dai risultati terapeutici desiderati e può essere effettuata da qualsiasi tecnico del ramo.
Le presenti composizioni farmaceutiche possono eventualmente comprendere l’anticorpo monoclonale dell'invenzione in combinazione con altri principi attivi o coadiuvanti, scelti opportunamente, o possono essere somministrate in combinazione con altri principi attivi in adatti rapporti. Le composizioni farmaceutiche dell'invenzione sono utili nel trattamento delle patologie a cui è associata una sovraespressione della proteina HERG1, quali ad esempio neoplasie umane di varia origine, come adenocarcinomi deH’endometrio e del tratto gastrointestinale, astrocitomi e vari tipi di leucemie e linfomi.
I seguenti esempi sono riportati a scopo illustrativo e non limitativo dell'invenzione.
ESEMPIO 1
Selezione dell’ibridoma e produzione dell’anticorpo monoclonale Immunizzazione
Tre topi BALB C acquistati dalla Ditta Harian sono stati inoculati con un peptide diretto contro 14 amminoacidi della porzione extracellulare S5-poro della proteina HERG1 umana (residui 575-588 della sequenza conservata in Banca Dati, Numero di Accesso NM 000238). Tale peptide è stato acquistato dalla ditta PRIMM s.r.l. La sequenza specifica è la seguente:EQPHMDSRIGWLHN.
in particolare, sono stati eseguiti tre inoculi intramuscolari nell'arco di 45 giorni e due inoculi endovena a distanza di 2 settimane l'uno dall'altro.
Protocollo di fusione cellulare
Dopo 3 giorni dal secondo inoculo endovenoso sono state prelevate le milze dei tre topi immunizzati: una milza è stata congelata dopo disgregazione meccanica, mentre le altre due sono state utilizzate immediatamente per l'esperimento di fusione cellulare.
Per ogni milza, 100.000.000 di linfociti ottenuti dalla disgregazione meccanica sono stati fusi con altrettante cellule NS0 (cellule di mieloma murino) mediante l'utilizzo di una soluzione acquosa di polietilen glicole al 50%.
Sono state quindi effettuate quattro diverse diluizioni (1:2; 1:4; 1:8; 1:16) del volume totale derivante dalla fusione (48 mi) e sono stati preparati 96 pozzetti del diametro di 1,4 cm l’uno.
Selezione colture cellulari positive
Mediante test ELISA è stata valutata la presenza dell’anticorpo nel terreno delle varie colture cellulari. Tra queste sono state selezionate quelle con assorbenza maggiore di 2 rispetto al controllo, rappresentato dal solo terreno di coltura.
Amplificazione delle colture positive
Tutte le colture risultate positive sono state amplificate (dai pozzetti di 1 ,4 cm sono state fatte crescere fino ad essere in grado di riempire una fiasca da 25 cm<2>), in modo da ottenere almeno 10.000.000 di cellule per ognuna e da congelarle in azoto liquido (10<7>è infatti la concentrazione necessaria perchè le cellule non muoiano durante il congelamento). Prima del congelamento sono stati eseguiti tre test ELISA per ogni coltura cellulare.
Delle 96 colture di partenza ne sono state congelate 10.
Clonazione in soft aaar
Le tre colture migliori, oltre che essere congelate, sono state clonate in soft agar, in modo da ottenere colture cellulari derivanti da una singola cellula (cloni). Per ogni coltura sono state fatte quattro piastre di soft agar del diametro di 6 cm con 1.000, 10.000, 20.000, 40.000 cellule, rispettivamente. Dopo circa tre settimane sono stati prelevati singoli cloni derivanti da una cellula e sono stati rimessi in coltura in pozzetti dal diametro di 0,6 cm. Sono stati ottenuti circa 80 pozzetti per ognuna delle 3 colture cellulari.
Selezione dei cloni positivi
Ciascun clone è stato sottoposto a test ELISA e sono stati mantenuti tutti i cloni con valore maggiore di 2 rispetto al controllo, rappresentato dal solo terreno di coltura.
Amplificazione dei cloni positivi
Tutti i cloni risultati positivi sono stati amplificati (dai pozzetti da 0,6 cm sono stati fatti crescere fino ad essere in grado di riempire una fiasca da 25 cm<2>) in modo da ottenere almeno 10.000.000 di cellule per ognuno e congelarle in azoto liquido. Prima del congelamento sono stati eseguiti cinque test ELISA per ogni clone.
Dei 240 cloni di partenza ne sono stati congelati 30.
Di questi 30, ne è stato selezionato 1, denominato A7, che riconosce l'epitopo antigenico specifico in forma nativa ed è efficiente, anche sottoforma di sovranatante cellulare non purificato, in esperimenti di immunoistochimica (Figura 1) e citofluorimetria (Figura 2) descritti in dettaglio nei seguenti Esempi 3 e 4, senza l'utilizzo di permeabilizzazione cellulare, procedura che compromette la vitalità cellulare.
ESEMPIO 2
Purificazione dell’anticorpo monoclonale
L'anticorpo A7 selezionato secondo la procedura descritta sopra nell'Esempio 1, è stato successivamente purificato per ottenere una preparazione con un grado di purezza ed una concentrazione tali da avere la massima efficienza della proteina nella gran parte dei protocolli sperimentali. A tal fine, il clone di ibridomi secernente l'anticorpo di nostro interesse, normalmente mantenuto ad elevate concentrazioni sieriche (20% di BMP = Basai Medium Supplement), è stato adattato a crescere in presenza di concentrazioni di siero più basse (5-10% di BMP). La capacità del clone di ibridomi di produrre l’anticorpo è stata costantemente monitorata, tramite test ELISA, durante tutte le fasi di adattamento alla crescita.
In seguito, mediante una colonna di 2 mi di proteina A legata a sefarosio, sono stati purificati circa 450 mi del sovranatante. Il terreno di coltura, che conteneva quantità variabili di BMP (5-20%), è stato previamente filtrato attraverso filtri con pori di 0,2 μ<ηη>, in condizioni sterili. Prima dell'applicazione del sovranatante, la colonna è stata equilibrata con una soluzione di Potassio Fosfato 1 M (pH 9,0), che è stata utilizzata anche come soluzione di lavaggio. La velocità di flusso è stata mantenuta costante per tutta la durata dell'esperimento (circa 0,5 ml/minuto). Alla fine, dopo opportuni lavaggi, la colonna è stata eluita con una soluzione di Acido Citrico 0,1 M (pH 3,0). Sono state raccolti circa 10 mi di eluato monitorando l'awenuta eluizione mediante una conta spettrofotometrica a 280 nm. Il pH di ogni aliquota è stato istantaneamente neutralizzato aH’uscita della colonna con una soluzione di Tris-HCI 1,5 M pH 9,0 per impedire la degradazione dell'anticorpo. In seguito, un piccolo volume di ogni campione è stato fatto correre su un gel di acrilammide e colorato con Blu di Comassie per valutare la purezza e l'effettiva concentrazione delle varie aliquote (Figura 3). Mediante un gel al 6%, eseguito in condizioni non riducenti, si è verificato che i vari campioni di anticorpo purificato non presentassero alcuna traccia dei contaminanti presenti nel terreno di partenza; inoltre, con una corsa in condizioni riducenti in un gel al 10%, paragonando l'intensità di segnale dei vari campioni con concentrazioni note di albumina bovina (BSA), è stato possibile valutare la quantità di anticorpo purificato.
ESEMPIO 3
Valutazione dell’efficienza dell’anticorpo in esperimenti di citofluorimetria
L'anticorpo purificato ottenuto come descrìtto sopra nell'Esempio 2, è stato impiegato in esperimenti di citofluorimetria, dove si è dimostrato efficiente non solo nel riconoscere i'epitopo specifico in cellule iperesprìmenti hERG1 (vedi Figura 1), ma anche in una linea che lo esprime endogenamente, la linea leucemica monoblastica umana FLG 29.1.
Per tale protocollo i campioni di cellule da testare vengono prelevati da piastre Petri: il terreno viene tolto mediante aspirazione e si effettuano due lavaggi con PBS. I campioni vengono poi posti in centrifuga per 5 minuti a 2000 rpm. Al termine della centrifugata, si aspira il PBS, si aggiunge l’anticorpo primario (monoclonale purificato non diluito o diluito opportunamente) e si lascia il tutto 15 minuti a temperatura ambiente e 15 minuti a 37°C. In seguito, si centrifugano i campioni per 5 minuti a 2000 rpm e si aspira l’anticorpo primario; si effettua un lavaggio con 0,5 mi di PBS e si centrifuga per 5 minuti a 2000 rpm. Si ripetono gli ultimi due passaggi una volta e si aggiunge l'anticorpo secondario diluito in PBS (1 pg di anticorpo-» 1 pi di anticorpo e 99 pi di PBS). L’anticorpo secondario è un’anti-lgG di topo marcato con fluoresceina (FITC). Si incuba per 15 minuti a 37°C. Successivamente, si centrifuga per 5 minuti a 2000 rpm, si aspira e si aggiungono 0,5 mi di PBS. I campioni sono pronti per la lettura al citofluorimetro.
I campioni (vedi Figura 2) sono analizzati utilizzando un FACScan a flusso citometrico (Becton Dickinson) dotato di un laser ad ioni Argon di 5 W.
ESEMPIO 4
Valutazione dell'efficienza dell'anticorpo in esperimenti di immunofluorescenza
Infine, per definire se l'anticorpo monoclonale purificato come descritto sopra nell’Esempio 2, potesse essere impiegato in future ricerche sulle relazioni “struttura-funzione” del canale hERG1 e sulle sue interazioni con proteine coinvolte nel movimento cellulare e nel processo di invasività tumorale, è stata valutata la sua efficienza in esperimenti di immunofluorescenza.
In tale metodica sono utilizzate cellule trasfettate transientemente con il canale hERG1 , mediante Lipofectamine Reagent (Invitrogen).
Le cellule dopo 48 ore dalla trasfezione sono fissate mediante una soluzione di paraformaldeide in PBS al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente. Viene in seguito effettuato un lavaggio con una soluzione di glieina 100 mM per 10 minuti e due ulteriori lavaggi con una soluzione di PBS. Segue un'incubazione per 10 minuti con una soluzione acquosa di Albumina Bovina al 3%, in modo da saturare i siti di interazione aspecifica e da ottenere un segnale anticorpo-specifico. La soluzione viene eliminata sempre con due lavaggi con PBS, e si procede all’incubazione con 50 μΙ di anticorpo primario monoclonale per tutta la notte. Abbiamo utilizzato l'anticorpo primario sia in forma non diluita che diluita in PBS 1:2, 1:10, 1:20. La mattina successiva si procede a due lavaggi con PBS, seguiti dall'incubazione con l'anticorpo secondario per 45 minuti. L’anticorpo secondario è un'anti IgG di topo marcato con fluoresceina (FITC). Dopo ulteriori cinque lavaggi in PBS, di 5 minuti ciascuno, si montano i vetrini utilizzando il Mowiol 4-88 (Calbiochem), che permette l'adesione del vetrino copri-oggetto su cui sono attaccate le cellule ad un supporto) così da rendere il segnale fluorescente indice del legame antigene-anticorpo, di per sé poco durevole, più stabile. Dopo aver fatto asciugare i vetrini per alcune ore a temperatura ambiente si può procedere all'osservazione al microscopio a fluorescenza.
ESEMPIO 5
Metodo per la determinazione dei livelli di HERG1 in campioni istologici Si sono usate sezioni di mucosa colica umana, che non esprime la proteina HERG1 contro cui è diretto l'anticorpo, e sezioni di adenocarcinoma del colon, che la iperesprimono, come riportato in letteratura (Lastraioli E. et al., Caricar Ras. 64: 606-11, 2004).
Le sezioni vengono sparaffinate, attraverso tre passaggi in toluolo di 5 minuti ciascuno, e reidratate attraverso la serie discendente delle miscele etanolo/acqua [alcool etilico assoluto (5') - alcool etilico 75% (5') - alcool etilico 50% (5’)], fino all’acqua distillata (5 minuti). Le fette sono trattate, per 20 minuti, con H2021% in PBS a 25°C al buio (500-1000 pi di soluzione su ciascun vetrino, sopra le fette). Tolta l'H202, si fanno due lavaggi, di 5 minuti ciascuno, con 200 pi di PBS per fetta. Segue il trattamento con una soluzione di Proteinasi K in PBS (5 pg/ml) per 5 minuti a 37°C. Dopo aver eseguito altri due lavaggi con PBS, le fette vengono trattate per 4 minuti con Ultra V block (Lab Vision) a temperatura ambiente (50 μΙ per fetta). La soluzione viene eliminata sempre con due lavaggi con PBS, e si procede all’incubazione con 50 μΙ per fetta di anticorpo primario monoclonale tutta la notte a 4°C.
Abbiamo utilizzato l'anticorpo primario sia in forma non diluita che diluita in PBS 1x Ultra V block 1:2, 1:10, 1:20. La mattina successiva si procede a due lavaggi con PBS, seguiti dall’incubazione con l'anticorpo secondario, coniugato all'enzima perossidasi (Picture Plus Kit, Zymed), per 10 minuti a temperatura ambiente. Tale anticorpo secondario è un polimero contenente gruppi Fab (che riconoscono l’anticorpo primario indipendentemente dalla specie di origine) e molecole enzimatiche. Terminati i 10 minuti, e fatti due lavaggi con PBS, si aggiungono una o due gocce per fetta di 3,3'-diamminobenzidina (Dab), lasciandola agire per circa 8-10 minuti. In seguito alla reazione enzimatica, il substrato incolore viene convertito in un precipitato marrone. Si lava, poi, con acqua distillata per 5 minuti e si procede alla controcolorazione con ematossilina: a tale scopo, le fette vengono coperte, per 5 minuti, con ematossilina di Meyer, trasferite in acqua di fonte per 5 minuti, per permettere il viraggio del colore, e, infine, lasciate per altri 5 minuti in acqua distillata. Si procede poi alla disidratazione delle sezioni nella serie ascendente delle miscele etanolo/acqua (alcool etilico 50% -alcool etilico 75% - alcool etilico assoluto). Dopo due passaggi in toluolo, di 5 minuti ciascuno, si montano i vetrini utilizzando l’Entellan (Merck) che permette l’adesione del vetrino copri-oggetto ad un supporto. Dopo aver fatto asciugare i vetrini per alcune ore a temperatura ambiente, l'osservazione al microscopio mostra l'antigene marcato colorato di marrone, e i nuclei cellulari colorati di viola.
Claims (11)
- RIVENDICAZIONI 1. Ibridoma capace di produrre una quantità percettibile di un anticorpo monoclonale specifico contro la porzione extracellulare S5-poro della proteina HERG1, comprendente il prodotto della fusione tra una cellula immortalizzata ed un linfocita ottenuto per immunizzazione di un animale ospite con un peptide di sequenza EQPHMDSRIGWLHN.
- 2. Ibridoma secondo la rivendicazione 1, in cui detta cellula immortalizzata è appartiene alla linea cellulare NSO neoplastica murina.
- 3. Ibridoma secondo la rivendicazione 1 , in cui detto animale ospite è topo.
- 4. Anticorpo monoclonale specifico contro la porzione extra-cellulare S5-poro della proteina HERG1 prodotto daN’ibridoma come definito nelle rivendicazioni 1-3.
- 5. Metodo per la determinazione dei livelli di proteina HERG1 in un campione istologico, comprendente l’incubazione di detto campione, preventivamente trattato con un agente ossidante che blocca le perossidasi endogene, con l’anticorpo monoclonale specifico contro la porzione extra-cellulare S5-poro della proteina HERG1 come definito nella rivendicazione 4, e con un anticorpo secondario coniugato all’enzima perossidasi e comprendente gruppi Fab che bloccano e legano detto anticorpo monoclonale, seguita dalla rivelazione di detto enzima perossidasi mediante aggiunta di un adatto rivelatore.
- 6. Kit per la determinazione dei livelli di proteina HERG1 in un campione istologico, comprendente l'anticorpo monoclonale specifico contro la porzione extra-cellulare S5-poro della proteina HERG1 come definito nella rivendicazione 4.
- 7. Kit secondo la rivendicazione 6, comprendente inoltre il peptide di sequenza EQPHMDSRIGWLHN, un adatto standard di controllo a concentrazione nota di detta proteina, ed uno o più tamponi.
- 8. Composizioni farmaceutiche comprendenti l’anticorpo monoclonale specifico contro la porzione extra-cellulare S5-poro della proteina HERG1 come definito nella rivendicazione 4, o suoi sali farmaceuticamente accettabili, eventualmente in combinazione con altri principi attivi o coadiuvanti, scelti opportunamente.
- 9. Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 8, comprendenti inoltre carriers, eccipienti e/o diluenti farmaceuticamente accettabili.
- 10. Uso dell’anticorpo monoclonale specifico contro la porzione extracellulare S5-poro della proteina HERG1 come definito nella rivendicazione 4, per la preparazione di composizioni farmaceutiche utili nel trattamento delle patologie a cui è associata una sovraespressione della proteina HERG1.
- 11. Uso secondo la rivendicazione 10, in cui dette patologie sono scelte tra neoplasie umane di varia origine, come adenocarcinomi del’endometrio e del tratto gastrointestinale, astrocitomi e vari tipi di leucemie e linfomi.
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| ITFI20060008 ITFI20060008A1 (it) | 2006-01-10 | 2006-01-10 | Ibridoma capace di produrre un anticorpo monoclonale anti-herg1, anticorpo monoclonale cosi' prodotto, metodo per la determinazione dei livelli di proteina herg1 e kit per tale determinazione |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2016020483A1 (en) * | 2014-08-08 | 2016-02-11 | Universita' Degli Studi Di Firenze | Anti-herg1 antibodies |
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2006
- 2006-01-10 IT ITFI20060008 patent/ITFI20060008A1/it unknown
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