ITAR960035A1 - Dispositivo e metodo per la determinazione di glucosio e di altri analiti su sangue intero mediante una membrana microporosa - Google Patents

Description

TITOLO

Dispositivo e metodo per la determinazione di glucosio e altri analiti su sangue intero mediante una membrana microporosa asimmetrica reattiva.

RIASSUNTO

La presente invenzione riguarda un dispositivo ed un metodo per il dosaggio del glucosio e di altri analiti presenti in un campione di sangue. Il dispositivo è costituito da una lamina solida che funge da supporto per una membrana microporosa asimmetrica trattata chimicamente. Sopra la membrana può essere disposto una strato macroporoso, che, grazie alle sue proprietà capillari, accoglie il campione, lo distribuisce orizzontalmente e lo trasferisce verticalmente alla membrana microporosa asimmetrica. Questa, a causa delle propria composizione chimica, della struttura a gradiente di porosità e al particolare trattamento chimico, ha la capacità di drenare il campione, separare il plasma dagli elementi figurati del sangue e sviluppare un segnale colorimetrico, che viene rivelato visivamee o strumentalmente. Il dispositivo descritto nella presente invenzione trova la sua principale applicazione nel dosaggio del glucosio contenuto in campioni di sangue intero ottenuti per digitopuntura.

STATO DELLA TECNICA

Nella maggior parte dei casi l'analisi di campioni ematici con sistemi chimici a secco supportati su membrane al fine di determinare la identità e la concentrazione di sostanze in essi presenti, quali ad esempio glucosio e colesterolo, viene condotta tramite l'applicazione di una goccia di su una striscia reattiva, in questultima sono presenti miscele di sostanze chimiche che danno luogo a reazioni con sviluppo di colore e permettono il riconoscimento di un analita presente nel campione. Le strisce sono generalmente costituite da un supporto di plastica che su una piccola parte della propria superficie presenta i reattivi inglobati in membrane porose e/o in polimeri inerti di varia natura, in gel o matrici organiche stratificate. I problemi relativi alluso di simili sistemi di analisi sono molteplici. In alcuni tipi di strisce reattive, ad esempio, l'operatore è costretto a rimuovere la parte del campione che contiene gli eritrociti rimasti addensati tramite una pulizia manuale dell’area reattiva o un brusco scuotimento della striscia stessa. Queste procedure possono facilmente condurre ad un danneggiamento della striscia reattiva, a contaminazione dello strumento di misura, ad inquinamento reciproco di campioni diversi tra loro e soprattutto causare l'infezione dello stesso operatore.

Molti di questi dispositivi, utilizzati per analisi rapide decentrate, che possono essere effettuate anche dal paziente stesso, si basano sulla applicazione di una goccia di sangue direttamente sull'area reattiva della striscia, costituita da due o più strati di materiali diversi. Con questi dispositivo l’ottenimento di risultati precisi e accurati richiede la deposizione di volumi considerevoli e riproducibili di campione che non sempre ottenibili facilmente tramite la digitopuntura: spesso infatti il campione risulta essere in quantità insufficiente e dare cosi luogo ad una parziale bagnatura delle membrane reattive ed a uno sviluppo parziale di colore.

Per il dosaggio di uri analita in un campione di sangue intero è importante, nella maggior parte dei casi, allontanare i globuli rossi in modo tale che il colore che eventualmente si sviluppa nel corso della reazione di determinazione non risulti coperto dal colore del sangue e dell'emoglobina. Bisogna inoltre considerare che nella determinazione di alcuni analiti. i livelli di questi presenti all'interno degli eritrociti ne compromettono il dosaggio nel plasma in presenza di lisi anche parziale. Questo problema, nei sistemi di analisi che fanno uso di membrane e chimica a secco, è stato affrontato in vari modi. In linea di principio i globuli rossi possono essere separati in base alle loro dimensioni (circa 2 per 7 micrometri), utilizzando una membrana microporosa con pori di misura inferiore che dovrebbe consentire di ottenere il plasma sparato dagli erinociti. Applicando una goccia di campione su membrane secche con pori di dimensioni inferiori a 10 micrometri, il sangue viene assorbito cosi rapidamente che le cellule, sottoposte ad un'alta pressione idrodinamica, si rompono, e il contenuto, in particolare l'emoglobina, si riversa all'esterno. Π plasma di conseguenza si colora di rosso compromettendo i! dosaggio. Inoltre i frammenti cellulari finiscono per ostruire i pori della membrana, impedendo al campione o a parte di esso il passaggio. In conseguenza di ciò gli analiti più grandi dal punto di vista molecolare, ad esempio le lipoproteine. non riescono a raggiungere completamente i reattivi.

Una soluzione è stata individuata nell'uso di sostanze osmoticamente attive ( crenating agents) rappresentati generalmente da alogenuri di metalli alcalini o alcalino terrosi, quali NaCl o Mg CU. che essiccate su una membrana microporosa si solubili zzano rapidamente nel campione ematico rendendolo ipertonia) (per esempio U.S. Pat. N. 7.564.631). I globuli rossi diventano così sferociti compatti, capaci di resistere ad elevate pressioni idrodinamiche. Alte concentrazioni di questi agenti, se da una parte riescono a evitare la lisi delle cellule ematiche, dall'altra spesso influiscono negativamente sulla solubilità delle altre sostanze, reattivi ed analiti. implicate nella determinazione. Esse possono, ad esempio, ridurre drasticamente l'attività di alcuni enzimi, e appaiono quindi di uso estremamente limitato. Inoltre, per l'effetto osmotico che causano, queste sostanze diluiscono il plasma e possono cosi ridurre in modo incontrollato la concentrazione plasmatica di alcuni analiti.

In altri tipi di strisce reattive per il dosaggio di glucosio e altri analiti ematici con chimica a secco è stato adottato un sistema che evita la lisi dei globuli rossi imbevendo membrane polisulfoniche o di altra natura, oltre che con i reattivi necessari alla determinazione, con polimeri organici e gelatine che. dopo essiccazione, chiudono i pori della membrana (per esempio Pat. VVO 92/22815). Il campione, al suo arrivo, scioglie lentamente tali sostanze e si ottiene, come effetto finale, una considerevole riduzione del flusso idrodinamico a cui le cellule sono sottoposte con una pressoché totale eliminazione della lisi. Tuttavia, l'uso di tali polimeri nella preparazione delle membrane è estremamente critico e generalmente queste configurazioni presentano una scarsa riproducibilità (imprecisione elevata) e la risposta analitica risulta dipendente dall’ ematocrito del campione. Inoltre la permeabilità molto ridotta della membrana cosi trattata impedisce la utilizzabilità di tali dispositivi per la determinazione di altri analiti di elevato peso molecolare, o associati a componenti plasmatici di elevato peso molecolare, quali il colesterolo ed i trigliceridi..

Le soluzioni tecniche che prevedono l'uso di materiali filtranti che non danno luogo ad emolisi, quali il gtass fiber o filtri a base di fibre sintetiche per la separazione del plasma dal campione di sangue, in associazione con membrane reattive, si sono anch'esse rivelate problematiche. La difficoltà principale in questi casi è rappresentata dall’accoppiamento tra materiale filtrante e membrana reattiva per il glucosio o altri analiti. Risulta infatti molto critico realizzare un contatto che consenta una trasmissione riproducibile e uniforme del plasma tra il filtro e la membrana reattiva. Inoltre questi materiali hanno un’alta capacità di assorbimento che richiede volumi eccessivi di campione, senza peraltro evitare completamente i problemi di lisi e di otturazione dei pori. Una parziale eccezione può essere considerato l’uso di un filtro spesso di lana di vetro (per esempio Pat. U.S. 4.477.575). Anch'esso tuttavia, pur essendo efficace nell'evitare la lisi, richiede l'aggiunta di quantità di campione elevate e costanti. La lana di vetro, inoltre, mostra la sua efficacia soprattutto nella separazione del plasma dai globuli rossi mediante migrazione laterale, costringendo all'uso di sistemi analitici spesso di struttura molto complessa.

La maggior parte delle strisce reattive fino ad ora brevettate per il dosaggio del glucosio o di altri analiti nel sangue sono basate sull’impiego di due o più strati di materiali differenti dei quali uno svolge la funzione di separazione del plasma dagli elementi figurati del sangue e un altro svolge la funzione di sviluppo del segnale per reazione specifica con l’analita ( per esempio Pat. EPA N 90307129.7 e U.S.

5.240.862).

Una delle maggiori difficoltà presentate da dette configurazioni risiede nell' assicurare un trasferimento uniforme del plasma dallo strato con funzione di separazione a quello con funzione di sviluppo del segnale. Tale difficoltà risulta più marcata in quei dispositivi, come quello descritto nel breveno U.S. Patent N. 5,240,862 del 31 agosto 1993, in cui i due strati con funzione di separazione del plasma dal sangue intero e di sviluppo del segnale sono costituiti da due membrane microporose. In questo caso, infatti, il plasma passa dalla membrana separatrice a quella reattiva in uno o pochi punti di contatto dando luogo ad effetti cromatografici che determinano lo sviluppo di un colore non omogeneo sulla membrana reattiva.

Un tipo di striscia reattiva ( Pat. EPA N. 87307014.8) impiega un solo strato di materiale costituito da una membrana microporosa di poliamide. In questo caso il plasma non subisce separazione dal sangue intero. Infatti gli eritrociti vanno incontro a lisi e il colore dell'emoglobina liberata si sovrappone al colore sviluppato dalla reazione con il glucosio ematico. Per tale ragione la striscia in oggeto non consente una lettura visiva accurata e la rivelazione reflettometrìca del segnale colorimetrico richiede uno strumento dotato di doppia sorgente di luce ed una particolare elaborazione del segnale.

Recentemente sono stati sviluppati e introdotti in commercio dispositivi analitici monouso per la determinazione del glucosio e di altri analiti basati sulla tecnologia dei biosensori. Questi disposimi presentano un supporto solido, generalmente una lamina di materiale plastico, sulla cui superficie sono presenti due o più piste conduttrici (in rame, grafite, o altro materiale) che assicurano il contatto elettrico tra l’area reattiva del supporto e lo strumento di misura. L'area reattiva contiene, allo stato secco, una miscela o un miscuglio di sostanze chimiche che, una volte venute in contatto con il campione, si dissolvono in esso dando luogo ad un cambiamento della conducibilità elettrica o nel potenziale ossidoreduttivo del campione stesso. Tale variazione, di corrente o di voltaggio, viene misurato da uno strumento che elabora il segnale e presenta il risultato su un display.

Anche la tecnologia a biosensore presenta numerosi inconvenienti: dipendenza del segnale dalla temperatura e dal volume del campione, interferenza da parte di altri componenti del campione, cambiamento delle caratteristiche del dispositivo nel tempo, ecc.

La presente invenzione risolve in parte o completamente i problemi sopra esposti utilizzando una membrana microporosa asimmetrica trattata chimicamente in modo opportuno come unico componente in grado sia di separare il plasma dagli elementi figurati del sangue che di sviluppare un segnale rivelabile mediante lettura visiva o strumentalmente mediante un reflettometro.

SOMMARIO DELL’INVENZIONE

L'invenzione descritta nel presente brevetto mette a disposizione degli utilizzatori un dispositivo e un metodo per misurare la concentrazione del glucosio o di un altro analita in un campione di sangue intero. Il dispositivo è composto da un supporto solido in cui sono fisicamente accoppiati uno strato adesivo e una membrana microporosa asimmetrica. Il supporto solido presenta una finestra che permette l’osservazione visiva o strumentale, mediante reflettometro. del segnale colorimetrico sviluppato dalla membrana microporosa asimmetrica. La membrana microporosa asimmetrica presenta un gradiente di porosità dovuto alla presenza, nel senso del suo spessore, di canali capillari di diametro decrescente. La membrana microporosa asimmetrica, costituita da polimeri idrofilici di polietere suifone e di polivinilpirrolidone, è trattata chimicamente con una miscela di polimeri organici, enzimi, coenzimi, substrati e sali in modo tale da realizzare in essa due strati funzionalmente distinti, il primo con capacità di separazione e il secondo con capacità di sviluppo del colore. Quando un piccolo volume di sangue capillare viene depositato su una faccia di detta membrana trattala chimicamente, gli elementi figurati del sangue vengono trattenuti nel primo strato e il plasma così separato penetra nel secondo strato dove reagisce con alcuni componenti chimici precedentemente essiccati nella membrana. Sopra la membrana microporosa asimmetrica può essere sovrapposto uno strato macroporoso che svolge la funzione di accogliere il campione di sangue, distribuirlo lateralmente e trasmetterlo verticalmente alla membrana microporosa asimmetrica sottostante. Il sistema chimico di rivelazione essiccato sulla membrana microporosa asimmetrica si basa in genere su un metodo colorimetrico in cui l'analita o il prodotto della sua conversione reagiscono con un cromogeno generando un colore la cui intensità è proporzionale alla concentrazione o all'attività dell'analita stesso. Il colore può quindi essere osservato v isivamente o essere misurato per via reflettometrica.

BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI.

La forma preferita del dispositivo oggetto dell'invenzione è rappresentata nei disegni allegati.

In Figura l è mostrata una configurazione preferita del dispositivo analitico oggetto della presente invenzione.

La Figura 2 è una foto in microscopia elettronica di una sezione perpendicolare alla superficie della membrana microporosa asimmetrica.

La Figura 3 rappresenta lo schema della sezione perpendicolare alla superfìcie della membrana microporosa asimmetrica mostrata in Fig. 2. Risulta evidente che il diametro medio dei canali capillari diminuisce gradualmente attraverso lo spessore della membrana microporosa asimmetrica, dalla superficie A alla superficie B.

La Figura 4 mostra schematicamente i due strati funzionali della membrana microporosa asimmetrica dopo il trattamento chimico con la soluzione contenente i reattivi. Lo strato A indica la porzione della membrana microporosa asimmetrica che presenta i canali capillari aperti in cui si verifica la separazione degli elementi corpuscolati del campione. Lo strato B indica la porzione della membrana microporosa asimmetrica che presenta i canali capillari chiusi in seguito al trattamento chimico, in cui il plasma, proveniente dallo strato A, reagisce con le sostanze chimiche reattive per la determinazione dell’analita in esso contenuto.

La Figura 5 mostra una configurazione preferita del dispositivo analitico visto dalla faccia in cui la membrana microporosa asimmetrica (1) produce il segnale colorimetrico. In questa rappresentazione è visibile il supporto rigido (4) che presenta una finestra di profilo circolare (5) che permette l'osservazione visiva o strumentale della superficie B della membrana microporosa asimmetrica (1). La Figura 6 mostra la configurazione preferita del dispositivo analitico visto dalla faccia in cui tiene applicalo il campione di sangue. Al supporto rigido (4) è vincolato lo strato macroporoso (2) che riceve il campione e lo trasmette alla superficie A della membrana microporosa asimmetrica sottostante (non visibile).

La Figura 7 mostra la vista laterale esplosa della configurazione preferita del dispositivo analitico, in cui sono evidenti i vari strati che lo costituiscono: il supporto rigido (4). lo strato adesivo (3). la membrana microporosa asimmetrica (1) e lo strato macroporoso (2).

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

La presente invenzione è diretta ad ottenere un sistema semplice e affidabile per il dosaggio di anaiiii contenuti in un campione di sangue intero basato su una unica membrana microporosa asimmetrica che possiede due proprietà fondamentali: A) le qualità che permettono di ottenere plasma chiaro da pochi microlitri di sangue intero, rapidamente, con alta efficienza, senza diluizione degli analiti. senza l’applicazione di forze esterne e senza alcun pretrattamento del campione. B) la capacità di costituire il supporto per uno o piu reagenti necessari al dosaggio del glucosio o di altri analiti contenuti nel campione di sangue applicato sulla membrana stessa. In particolare la membrana microporosa asimmetrica trattata con i reattivi chimici è parte fondamentale di un dispositivo analitico per il dosaggio del glucosio o di altri analiti presenti in un campione costituito da una goccia di sangue ottenuto per prelievo capillare. Il suddetto campione é applicato su una delle due facce della stessa membrana, migra nello spessore della membrana microporosa asimmetrica e in questa migrazione il plasma è separato dalle cellule. La risposta analitica è dovuta alla/e reazione/i tra l’anaiita da determinare, più spesso glucosio, contenuto nel plasma e i reattivi supportati sulla membrana microporosa asimmetrica, e genera un colore che viene osservato sulla superficie opposta a quella di applicazione del campione.

La presente invenzione permette al plasma di venire in contatto intimo con gli enzimi necessari, le proteine, i cromogeni e gli altri reagenti senza l’applicazione di alcuna pressione esterna o altro trattamento del campione.

Il movimento del campione costituito dalla goccia di sangue avviene sia in senso orizzontale, tangenziale alla membrana microporosa asimmetrica, favorendo in tal modo la sua omogenea distribuzione su tutta la superficie utile al dosaggio, sia in senso trasversale, nello spessore della membrana microporosa asimmetrica. Questo è il movimento utile alia separazione del plasma dalle cellule del sangue, cosi che dalla parte opposta a quella di applicazione giunge solo plasma chiaro contenente la sostanza che si vuole determinare per mezzo dei reattivi con i quali la membrana microporosa asimmetrica era stata in precedenza trattata. L’effetto capillare, causato dalia presenza di canali capillari nella matrice della membrana microporosa asimmetrica, fornisce la forza appropriata per rattraversamento della membrana stessa da parte del campione liquido.

La presente invenzione utilizza una membrana microporosa asimmetrica per la produzione di strisce reattive per scopi diagnostici. I piccoli volumi di campione ematico che sono ottenuti tramite una digitopuntura possono migrare nello spessore della membrana grazie alla presenza in essa di pori connessi con canali capillari che la attraversano.

La scelta di una appropriata membrana è nel nostro caso di fondamentale importanza. Una membrana ideale dovrebbe bagnarsi facilmente con il plasma, permettere alle cellule del sangue di migrare al proprio interno e di introdursi nei canali capillari che l'attraversano senza che queste siano lisate da agenti chimici intrinseci alla sua composizione o dal realizzarsi di condizioni fisicamente inappropriate, dovrebbe essere sufficientemente resistente e possedere una struttura omogenea soprattutto a livello delle sue superfici esterne. Un gran numero di membrane microporose commercialmente disponibili sono state da noi esaminate: una di queste ha fornito risultati estremamente soddisfacenti. Si tratta di una membrana microporosa asimmetrica idrofilica. essenzialmente formata da un polimero idrofobico e da un polimero idrofilia), che è fissato sulla matrice polimerica. Come descritto nel brevetto E.P. N.

87201789.2. questo fissaggio può essere conseguito grazie alla formazione di legami crociati quando il polimero idrofilia) non è rigonfiato. Per dettagli ulteriori fare riferimento alla suddetta patente. L’applicazione preferita è quella in cui la membrana usata sia costituita da un polimero idrofobico rappresentato da polisulfone, sulfone polietere o polieterimide e il polimero idrofilia) è polivinilpirrolidone. Il processo di polimerizzazione è tale che la membrana assume un struttura asimmetrica caratterizzata da un gradiente di porosità. Con tale tennine si intende che le due superici di detta membrana presentano pori con dimensioni diverse. Le dimensioni medie dei pori sono preferibilmente comprese tra 1.5 e 4 μm su una superficie e tra 10 e 30 μm sulla superficie opposta. La presenza di pori di dimensioni differenti su una superficie rispetto alla superficie opposta della membrana significa che nello spessore della membrana sono presenti canali capillari che attraversando la membrana da una superficie all'altra presentano un diametro via via decrescente. Questi canali capillari sono rappresentati nella Figura 3 e mostrati nella fotografia oggetto della Figura 2. in cui è visibile la struttura dei canali e dei setti che li separano.

Le dimensioni dei pori sono tali che le cellule del sangue possono facilmente entrare nei canali capillari sottostanti. La particolare struttura di questi, e la loro natura chimica svolge un ruolo significamo nell'impedire la lisi delle cellule. La geometria particolare che i capillari hanno facilita inoltre la filtrazione del sangue con conseguente produzione di plasma limpido in un intervallo di tempo compreso in pochi secondi. Il meccanismo che si verifica è il seguente: il campione di sangue penetra la membrana microporosa asimmetrica, le cellule entrano nei pori che sono di dimensioni molto superiori alle loro, ma ritardate rispetto al plasma finiscono per impilarsi in uno strato superiore che possiamo chiamare A: il plasma prosegue la sua migrazione rapidamente in un secondo strato B. privo di cellule, trascinando con sé e accumulando i reattivi necessari al dosaggio dell'analita.

Una membrana microporosa asimmetrica con queste caratteristiche appare essere esclusivamente quella descritta nel brevetto EPA N. 87201789.2.

Detta membrana viene utilizzata nella presente invenzione ed ha uno spessore compreso tra 0,05 e 0.5 mm, preferibilmente tra 0,10 e 0,3 mm.

In genere tutte le membrane che mostrano sufficienti capacità di separazione del plasma dalle cellule del sangue una volta trattate chimicamente per renderle capaci di determinare analiti presenti nel campione ematico, modificano il proprio comportamento totalmente o in parte compromettendo le loro proprietà. Ciò significa che la possibilità di un dispositivo analitico costituito da una sola membrana di essere utilizzalo per la separazione di plasma da un campione di sangue intero e per il dosaggio di un analita presente nel plasma, senza previo pretrattamento dello stesso campione, non dipende solamente dalle caratteristiche della membrana usata ma anche dal particolare trattamento chimico a cui la membrana è stata sottoposta durante la fase di acquisizione dei reattivi necessari ad effettuare la suddetta analisi. La membrana microporosa asimmetrica sopra descrìtta acquista la proprietà di separare e contemporaneamente rivelare l'analita contenuto nel campione solamente se trattata con sostanze chimiche in modo opportuno. Quattro classi di sostanze chimiche sono necessarie al fine di impartire tali proprietà alla membrana:

1) uno o più polimeri organici idrofilici con la funzione di ostruire parzialmente i canali capillari della membrana microporosa asimmetrica nella zona in cui essi presentano il diametro minore. In tal modo si formano, in seguito al trattamento, due strati funzionalmente distinti, detti A e B in Figura 4. dei quali il primo presenta i canali capillari aperti e funziona da strato di separazione e il secondo presenta i canali capillari ostruiti, accoglie il plasma prodotto dal primo e ha la funzione di sviluppare il segnale colorimetrico. Tali polimeri appartengono alle famiglie di composti costituiti o derivati da: gelatine o idrolizzati di gelatine, destrano, albumina, ecc.

2) ) Uno o più polimeri con funzione di esaltare le proprietà idrofiliche della membrana, mantenere attivi e inalterati nel tempo gli enzimi e. in generale, tutte le sostanze con cui tiene trattata la membrana e impartire al plasma una elevata viscosità al fine di realizzare un trasferimento uniforme dello stesso in tutto lo spessore della membrana. Tali pomeri appartengono alle famiglie di composti costituiti o derivati da: meri Ivi niletere/anidride malica (GANTREZ), polietilene glicole: polivinilpirrolidone, acido polistirene-sulfonico, politi nilalcol. acido polivinilsulfonico. ecc.

3) Una miscela di enzimi specifici in rapporti ottimali per la rivelazione colorimetrica dell'analita da determinare. In particolare, per la determinazione del glucosio ematico tale miscela sarà costituita da glucosio ossidasi, e perossidasi.

4) una miscela di sostanze organiche e inorganiche necessarie per assicurare il pH ottimale per la reazione di rivelazione dell'analita, per il funzionamento ottimale degli enzimi e per lo sviluppo del segnale colorimetrico.

I diversi componenti chimici possono essere addizionati alla membrana microporosa asimmetrica mediante un unico trattamento o mediante due o più trattamenti in sequenza. In quest'ultimo caso la membrana viene essiccata tra un trattamento e il successivo.

La membrana microporosa asimmetrica descritta nel brevetto EPA N. 87201789.2 è stata utilizzata nella presente invenzione per la messa a punto e realizzazione di un dispositivo analitico per la determinazione del glucosio e di altri analiti presenti nel plasma utilizzando come campione un goccia di sangue ottenuto per digitopuntura. La configurazione preferita di tale dispositivo è mostrata nelle Figure 5. 6 e 7. Esso è costituito da un supporto rigido di materia plastica (4 in Figura 5. 6 e 7) che presenta un’area reattiva costituita da un singolo pezzo di membrana microporosa asimmetrica (1 in Figura 5 e 7) di dimensioni ridotte, tipicamente comprese tra 20 e 100 mm<2>, trattata con reattivi chimici in modo opportuno. In genere tale pezzo di membrana microporosa asimmetrica è attaccata tramite colla o nastro biadesivo (3 in Figura 7) al supporto rigido. Tale supporto può essere costituito da un pezzo, rettangolare o di altra forma, di un foglio di materia plastica dello spessore compreso di preferenza tra 0.1 e 0,5 mm. Il supporto rigido presenta in corrispondenza della superficie, in cui il pezzo di membrana microporosa asimmetrica è attaccata, un foro circolare (1 in Figura 5) che permette di vedere la membrana attraverso il supporto rigido (4 in Figura 5, 6 e 7). La superficie che viene mostrata è quella opposta a quella di applicazione del campione ed è quella su cui si sviluppa il segnale colorimetrico. Questa superficie viene utilizzata per la lettura reflettometrica del colore sviluppato dai reattivi nella determinazione dell'analita.

Nella applicazione prescelta il campione di sangue non viene applicato direttamente sulla membrana microporosa asimmetrica ma è di preferenza applicato su uno strato macroporoso sovrapposto alla membrana (2 in Figura 6 e 7). Tale strato macroporoso ha dimensioni maggiori della membrana in modo tale che possa essere fissato al supporto rìgido dallo stesso strato adesivo che trattiene anche la membrana. Questo materiale, che ha la funzione fondamentale di distribuire il campione rapidamente ed uniformemente sulla membrana microporosa asimmetrica, deve essere macroporoso, estremamente idrofilico e resistente, e può essere costituito da tessuto non tessuto ottenuto con fibre idrofiliche o da tessuto sintetico ottenuto con polimeri idrofìlici o da reti costituite da polimeri idrofobici sottoposti a trattamenti chimico-fisici che ne aumentino la bagnabilità. Tale strato macroporoso dovrà presentare una permeabilità tale da permettere il passaggio degli elementi figurati del sangue senza trattenerli, e quindi possedere pori di diametro medio non inferiore a 40 pm. Tale strato macroporoso è utile anche per assorbire l'eventuale eccesso di campione applicato sul dispositivo analitico in questione.

Questo brevetto riguarda l'utilizzo di qualsiasi membrana microporosa idrofilica asimmetrica con le caratteristiche sopra descritte, nella determinazione diretta di glucosio o altri analiti contenuti nel sangue al fine di creare dispositivi nei quali la separazione del sangue e lo sviluppo del segnale viene effettuata dalla membrana stessa sulla quale sono stati essiccati le sostanze chimiche necessarie alla reazione di rivelazione dell’analita in esame. Il sangue applicato sulla membrana microporosa asimmetrica tende a saturarla in misura dipendente dal suo volume, dallo spessore della membrana stessa, dalla geometria del sistema e dall'ematocrito del sangue. Per l'uso del dispositivo analitico raffigurato nelle Figure 5, 6 e 7 il volume ottimale di campione è approssimativamente 10-50 μΐ. Il sangue in eccesso che non viene assorbito dalla membrana microporosa viene escluso dalla membrana stessa e rimane nello strato macroporoso (2 in Figura 6 e 7) disposto sopra di essa.

ESEMPI

Esempio 1

Un dispositivo analitico come quello raffigurato nelle Figure 5, 6 e 7 viene preparato, disponendo uno strato macroporoso costituito da una rete o un tessuto di polietilene, poliamide o poliestere sopra la membrana microporosa asimmetrica trattata chimicamente (Figura 4). Ambedue questi elementi del dispositivo sono attaccati ad un foglio di materia plastica (ad esempio polistirolo, ecc.) tramite uno strato adesivo costituito da una pista gommata o un nastro doppio adesivo. Una goccia di sangue viene applicata sulla rete o tessuto che funge cosi da area di applicazione del campione: rapidamente il campione, dopo aver attraversato la rete, raggiunge la membrana microporosa asimmetrica trattata chimicamente che si bagna completamente. Nel primo strato ( A in Fig. 4) della membrana avviene la separazione del plasma che raggiunge il secondo strato (B in Figura 4) sol ubi lizzando i reattivi presenti allo stato secco e da luogo alla reazione atta a determinare l'analita. La reazione comporta la formazione di un composto colorato che è in relazione alla concentrazione dellanalita che si vuole determinare. Il foro presente nel supporto rigido permette l'osservazione della superficie colorata della membrana microporosa asimmetrica e la determinazione visiva o strumentale dell'analita.

Esempio 2

Un dispositivo analitico come quello descritto nell'esempio 1 in cui la membrana microporosa asimmetrica contiene anche i reattivi per la determinazione del glucosio da una goccia di sangue intero. A tal fine la membrana e stata bagnata con la seguente soluzione:

Esempio 3

Un dispositivo analitico come quello descritto nell’esempio 1 in cui la membrana microporosa asimmetrica contiene anche i reattivi per la determinazione del colesterolo nel sangue intero. A tal fine la membrana e stata bagnata con la seguente soluzione:

Claims (14)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un dispositivo per ottenere plasma da sangue intero e determinare quantitativamente gli analiti in esso contenuti, che comprende: a) un supporto rigido di materia plastica, in cui è ricavata b) una finestra di forma circolare che permette la misurazione visiva o reflettometrica del segnale colorimetrico sviluppato da c) una membrana microporosa asimmetrica contenente una miscela di sostanze chimiche allo stato secco che permette la separazione del plasma dal sangue intero e Io sviluppo di un segnale colorimetrico derivante da una reazione chimica specifica per un analita.
2. 2. Un dispositivo come quello descritto nella rivendicazione 1, nel quale la membrana microporosa asimmetrica è una membrana idrofilica costituita da polietere sulfone e polivinilpirralidone di spessore compreso tra 0.05 e 0,5 mm, preferibilmente tra 0,10 e 0.3 mm.
3. 3. Un dispositivo come quello descritto nella rivendicazione 2. nel quale la membrana microporosa asimmetrica presenta nel senso del suo spessore un gradiente di porosità, con dimensione dei pori compresa tra 0,2 e 5 pm su un lato e tra 8 e 100 μm sul lato opposto, preferibilmente tra 1.5 e 4 μm su un lato e tra 10 e 30 pm sul lato opposto.
4. 4. Un dispositivo come quello descritto nelle rivendicazioni 2 e 3. ma nel quale la membrana microporosa asimmetrica è trattata chimicamente in modo tale da realizzare in essa due strati funzionalmente distinti, dei quali il primo con funzione di separazione del plasma dagli elementi figurati del sangue e il secondo con funzione di sviluppo del segnale colorimetrico per reazione tra alcuni componenti chimici essiccati sulla membrana e un analita contenuto nel plasma.
5. 5. Un dispositivo come quello descritto nella rivendicazione 4. in cui per il trattamento chimico della membrana microporosa asimmetrica viene impiegata una miscela di sostanze chimiche aventi la funzione di: a) ostruire i canali capillari nella zona della membrana in cui essi presentano diametro minore; b) conferire stabilità ai reagenti e aumentare la viscosità del campione: c) rivelare selettivamente per via enzimatica un analita contenuto nel campione d) assicurare le condizioni ottimali per la rivelazione colorimetrica dell’analita.
6. 6. Un dispositivo come quello descritto nella rivendicazione I. ma nel quale alla membrana microporosa asimmetrica è sovrapposto uno strato di materiale macroporoso con funzione di diffusione laterale del campione e di trasmissione di questo alla membrana microporosa asimmetrica sonostante.
7. 7. Un dispositivo come quello descritto nella rivendicazione 6. ma nel quale lo strato macroporoso, di spessore compreso tra 0.05 e 1 mm. è formato da tessuto non tessuto costituito da fibre di polimeri organici naturali o sintetici.
8. 8. Un dispositivo come quello descritto nella rivendicazione 6. ma nel quale lo strato macroporoso, di spessore compreso tra 0.05 e 0.5 mm, è formato da un tessuto o da una rete costituiti da fibre di polimeri organici naturali o sintetici.
9. 9. Un dispositivo come quello descritto nelle rivendicazioni 7 e 8, ma nel quale lo strato macroporoso è costituito da polimeri organici fibrosi idrofilici di poliaininide. polietilene, polipropilene, poliestere, cellulosa e derivati della cellulosa.
10. 10. Un dispositivo come quello descritto nella rivendicazione 6, ma nel quale lo strato macroporoso, di spessore compreso tra 0.1 e 1,5 mm, è formato da un foglio di materiale plastico idrofilico poroso costituito da polietilene, polipropilene, poliestere, poliamide. ecc.
11. 1 1. Un dispositivo come quello descritto nelle rivendicazioni 9 e 10, ma nel quale lo strato macroporoso è trattato con un anticoagulante quale il citrato, l’EDTA, il fluoruro, l’eparina, al fine di mantenere fluido il sangue capillare durante il processo analitico.
12. 12. Un dispositivo come quello descritto nella rivendicazione 1, ma nel quale fanalita con cui reagiscono i componenti essiccati sulla membrana è il glucosio contenuto nel plasma.
13. 13. Un dispositivo come quello descritto nella rivendicazione 12, in cui il dosaggio del glucosio ematico utilizza mutarotasi, glucosio ossidasi, perossidasi e tolidina.
14. 14 Un dispositivo come quello descritto nella rivendicazione 13, in cui il cromogeno formato dalla ossidazione della tolidina viene rivelato mediante reflettometria utilizzando radiazioni elettromagnetiche nella regione infrarossa, in particolare tra 900 e 960 nm.