IT9067445A1 - Metodo per la rivelazione specifica di una sequenza nucleotidica bersaglio in un campione di materiale genetico. - Google Patents
Metodo per la rivelazione specifica di una sequenza nucleotidica bersaglio in un campione di materiale genetico. Download PDFInfo
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Description
DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Metodo per la rivelazione specifica di una sequenza nucleotidica bersaglio in un campione di materiale genetico"
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce ad un metodo.per la determinazione della presenza di una sequenza nucleotidica bersaglio in un campione di materiale genetico.
Nella determinazione della presenza o dell'identità di una specifica sequenza nucleotidica in un materiale genetico, ad esempio DNA, è stato proposto di denaturare il materiale genetico per portarla in forma di monofilamento e di porre a contatto il materiale genetico denaturato con una sonda nucleotidica marcata fissata ad un sopporto solido e insolubile, e presentante una sequenza di basi complementari alla sequenza nucleotidica bersaglio. Tale sonda, in forma di monofilamento è marcata con una sostanza in grado di fornire un segnale misurabile o suscettibile di generare un segnale misurabile. Alternativamente il materiale genetico in forma di monofilamento è fissato ad un sopporto solido e posto a contatto con la sonda marcata. Il contatto tra il materiale genetico monofilamento con la sonda monofilamiento è effettuato in condizioni che causano l'ibridazione della sonda e della sequenza bersaglio e si procede quindi alla rivelazione della formazione di un ibrido sonda/ bersaglio mediante la rivelazione diretta o indiretta del segnale ad esso associato.
Il brevetto US 4.358.535 descrive un metodo del tipo sopra citato che utilizza sonde di DNA marcate con isotopi radioattivi. Sono tuttavia noti gli svantaggi associati all'impiego di marcanti radioattivi. Tali svantaggi derivano non solo dalle precauzioni e dai rischi coinvolti nel trattamento di materiali radioattivi, ma anche dalla vita breve di tale materiale reattivo e dai costi relativi all'impiego ed alla manipolazione di sonde radioattive.
Sono anche noti metodi che prevedono l'impiego di sonde marcate chimicamente, mediante incorporazione nella sonda di una molecola rilevabile con uno specifico ligando contenente una fonte di segnale, quale ad esempio sistemi avidina/ biotina, aptene/anticorpo. Tutti questi metodi richiedono comunque l'introduzione di un agente modificatore nella sonda di DNA che consenta la rivelazione diretta o indiretta dell'ibrido.
Tali approcci richiedono numerosi passaggi sia in fase analitica, sia in fase preparativa; da un lato numerose serie di incubazioni e lavaggi e dall'altro l'accurata scelta e standardizzazione di tutte le componenti del sistema di associazione e di rivelazione del segnale.
Lo scopo della presente invenzione è quello di fornire un metodo che elimini completamente tutte le variabili associate all'incorporazione del segnale e che nel contempo consenta di ottenere livelli di sensibilità confrontabili con quelli raggiugibili con i metodi radioattivi.
Costituisce quindi un oggetto dell'invenzione un metodo per determinare la presenza di una sequenza nucleotidica bersaglio in un campione di materiale genetico comprendente il contattare detto campione, in cui il materiale genetico è stato reso disponibile in forma di monofilamento, con una sonda nucleotidica sostanzialmente complementare a detta sequenza bersaglio, in condizioni di ibridazione e rivelare la formazione di un ibrido sonda/ bersaglio, caratterizzato dal fatto che per la rivelazione dell'ibrido sonda/bersaglio si impiega un anticorpo monoclonale o paliclonale anti acidonucleica, atto a riconoscere elettivamente sequenze nucleotidiche a doppio filamento da sequenze monofilamento.
E' stato riscontrato che è possibile ottenere anticorpi, preferibilmente monoclonali, in grado di discriminare DNA a singolo filamento da quello a doppio filamento e che è passibile utilizzare tali anticorpi per rivelare la formazione di specifici ibridi. Il metodo proposto elimina dunque compietamente tutte le variabili associate all'incorporazione del segnale in quanto il segnale viene fornito dalla sequenza nucleotidica stessa in seguito alla reazione di ibridazione. Il metodo si presta quindi alla rivelazione specifica e quantificazione di acidi nucleici, siano questi DNA di origine sintetica o biologica o RNA di chimica o biologica.
Nell'ambito della presente invenzione è particolarmente preferito l'impiego dell'anticorpo monoclonale anti DNA denominato 27-14-D9, ottenuto dalla Richiedente Tale anticorpo presenta proprietà di riconoscere il DNA a doppio filamento con un'affinità maggiore di 103 rispetto al DNA a singolo filamento. Inoltre, l'anticorpo 27 -14-D9 ha la proprietà molto rara per questo tipo di molecole di non fissarsi in modo aspecifico a proteine, quali l'albumina bovina, che sono normalmente impiegate per saturare le fasi solide. L'insieme di queste proprietà lo rendono quindi un reattivo particolarmente idoneo per l'applicazione proposta. Si intende tuttavia che anticorpi monoclonali anti-DNA utili per l'attuazione del metodo secondo l'invenzione possono essere ottenuti, ad esempio mediante la tecnica descritta nel seguito.
Nell'effettuazione del metodo secondo l'invenzione, preferibilmente la sonda oligonucleotidica specifica per il DNA bersaglio è immobilizzata su di una fase solida o insolubile. L'immobilizzazione della sonda può essere effettuata attraverso metodi fisici a chimici o attraverso interazioni quali avidina/ biotina, streptavidina/biotina e ligandi/ anti-ligandi.
La sonda può essere immobilizzata su di un supporto solido o insolubile, ad esempio costituito da polistirene, polipropilene, polivinile, naylon, borosilicati, cellulosa o derivati di essi, ciascun materiale essendo previsto sotto forma di tubi, pozzetti, macrosfere o microsfere; è tuttavia possibile, in alternativa, effettuare l'immobilizzazione su supporto solido del materiale genetico denaturato.
Il materiale genetico contenente il DNA bersaglio viene amplificato secondo il metodo di amplificazione di per sé noto ed il prodotto di amplificazione è denaturato per via termica o chimica e quindi raffreddato in modo che assuma e mantenga la conformazione a singolo filamento e quindi sottoposto ad incubazione con la fase solida alla quale è fissata la sonda oligonucleotidica.
Nel corso dell'incubazione, se il DNA amplificato è complementare alla sonda immobilizzata, vengono immobilizzati sulla fase solida gli ibridi a doppio filamento tra la sonda ed il DNA bersaglio.
Il DNA non reagito con la sonda viene allontanato mediante lavaggi. In queste condizioni il solo DNA a doppio filamento presente nel sistema è rappresentato dalla specifico ibrido generatosi sulla fase solida.
A questo punto viene aggiunto al sistema un anticorpo anti-DNA in grado di reagire elettivamente o selettivamente con DNA a doppio filamento. L'anticorpo può essere marcato con una sostanza in grado di fornire un segnale misurabile. A questo scopo è preferibile l'impiego di un enzima quale perossidasi, fosfatasi alcalina, ureasi, beta-galattosidasi o sostanze fluorescenti quali fluorescina, rodamina, TeKas-Red o sostanze chemioluminascenti. Si procede alla rimozione dell'anticorpo non fissato e quindi alla rivelazione del segnale associato all'anticorpo che è garanzia dell'avvenuta ibridazione specifica tra la sonda ed il DNA bersaglio.
Alternativamente, qualora l'anticorpo fosse non marcato, si pub procedere mediante addizione di un ligando, in grado di reagire con l'anticorpo stesso, a sua volta marcato con una sostanza in grado di fornire un segnale misurabile, del tipo sopra citato, a cui fa seguito la rimozione del ligando non reagito.
Lo schema analitico precedentemente esposto è stato applicata in particolare alla rivelazione del genoma del virus dell'epatite B (HBV), amplificato in definite regioni, dimostrando la validità del metodo in termini di sensibilità, semplicità, specificità e riproducibilità.
Esempio 1
Il DNA contenuto in sieri di pazienti affetti da epatite B è stato amplificato usando due primers complementari a due segmenti della sequenza del gene "core" distanti 447 basi. Per la reazione di ampiificazione, 1 μl di siero è mescolato in una provetta Eppendorf contenente 10 μl di buffer di amplificazione (670 mM Tris HCL pH 8,8, 166 mM 100 mM beta-mercaptoetanolo, 1mg/ml albumina bovina), 200 μmoli di ciascuno dei quattro nucleotidi, 50 pmoli di ciascuno dei due primers e 5 unità dell'enzima Taq polimerasi. Il DNA viene amplificato per mezzi di cicli termici alternati di ibridazione, elongazione, e di denaturazione. Il DNA amplificato è quindi rivelato per mezzo del metodo oggetto dell'invenzione. Un oligonucleotide complementare ad una porzione interna del segmento amplificato viene biotinilato al fine di essere impiegato come sonda di cattura del DNA amplificato. La reazione di biotinilazione avviene mescolando la sonda denaturata in tampone borato 0,1 M pH 8,5 con biotina-N-idrossi-succinimide in eccesso di 500 moli. La reazione avviene a temperatura ambiente per 16 ore e quindi la sonda biotinilata viene separata dalla biotina libera su colonna di Sephadex G15. Il materiale recuperato viene precipitato con sodio acetato ed etanolo risospesa alla concentrazione desiderata in tampone Tris-EDTA ( 10m Tris 1mM EDTA) pH 7,5. La sonda viene immobilizzata ad una fase solida (pozzetti di polistirene) pre-rivestiti con BSA Streptavidina. I pozzetti sono incubati per 16 ore a temperatura ambiente con 100 μl di soluzione TE contenente 10 ng di sonda. L'eccesso di sonda viene quindi eliminato con due lavaggi in TE, un lavaggio in SSC 0,1x, SDS 0,27., ed un lavaggio finale in TE. I pozzetti così attenuti possono essere utilizzati immediatamente o alternativamente, possono essere conservati per parecchi mesi a 4°C o in ambiente umido.
Per la reazione di ibridazione del DNA amplificato con la sonda immobilizzata in fase solida, il DNA viene denaturato per 10 minuti a 100°C e raffreddato per 10 minuti a 4°C. Il DNA viene quindi diluito alla concentrazione desiderata in soluzione di ibridazione contenente per un ml ESO g Ficoll, E20 g polivinilpirrolidone, 200 Mg BSA, 3,7 mg NaCl e 4,4 mg sodio citrato pH7. La soluzione viene quindi aggiunta ai pozzetti e la reazione di ibridazione avviene a 50°C per 1 ora. L'amplificato non ibridato viene quindi rimosso con 3 lavaggi in SSC 0,1X e SDS 0,2% ed un lavaggio finale in TE.
La rivelazione del DNA ibridato viene quindi effettuata per mezza di un anticorpo monoclonale specifico per il DNA a doppio elica. Tale anticorpo è stato ottenuto fondendo cellule della milza di un topo di razza MRL/lpr dell'età di 12 mesi. La scelta di questo particolare tipo di animale è stata suggerita dal fatto che questa razza di topi sviluppa una malatti geneticamente trasmissibile caratterizzata da una sindrome simile a quella del lupus eritematoso. Quindi, a partire da una certa età, questi animali, sviluppano spontaneamente una grande quantità di autoanticorpi, tra cui quelli specifici per il DNA a doppia elica o a singola elica predominano. Dalla fusione sono stati ottenuti numerosi anticorpi in grado di riconoscere il DNA ma, tra questi, solo 3 erano in grado di discriminare il DNA a doppia elica da quello a singola elica. Tali anticorpi sono stati individuati mediante test di binding diretto utilizzando DNA nativo o denaturato in fase solida. Dopo clonaggio, uno di questi 3 ibridomi denominato 27-14-D9, si è rivelato il più adatto per rivelare il DNA ibridato.
L’anticorpo 27-14—D9 viene quindi fatto incubare per 2 ore a 37°C nei pozzetti contenenti il DNA amplificato. Dopo 4 lavaggi con PBS-Tween 0,05%, l'anticorpo fissato al DNA ibridato viene rivelato per mezzo di un secondo anticorpo specifico per le immunoglobuline di topo marcato con perossidasi. Quest'ultimo passaggio può essere omesso, marcando direttamente l'anticorpo 27-14-D9 con un enzima in grado di sviluppare una reazione colorimetrica. Dopo aggiunta del substrato specifico dell'enzima, la reazione colorimetrica viene letta con uno spettrofotometro. In figura 1 sono mostrati i risultati ottenuti con varie quantità di miscela di ampiificazione da un siero di paziente con epatite e da un siero normale. I risultati sono espressi come densità ottica letta allo spettrofotometro.
Esempio 2
Quantità scalari di DNA genomico umano sono state spottate su due filtri di nitrocellulosa e fissate tramite incubazione a 80°C in forno a vuoto. I filtri sono stati preibridati per 4 ore a 37°C. Uno dei due filtri è stato quindi ibridato per 4 ore a 60°C con un oligonucleotide di 48 basi complementare ad un pezzo della sequenza del gene C alfa del recettore delle cellule T umane.
Il filtro ibridato e quello non ibridato sono stati incubati per 2 ore a 37°C con 10-μg di anticorpo 27-14-D9, lavati e reincubati per 1 ora a 7°C con 100 ng di anticorpi di coniglio marcati con perossidasi specifici per le immunoglòbuline di topo. Dopo 3 lavaggi i filtri sona stati incubati con un substrato colorimetrico precipitante e la reazione è stata arrestata dopo 15 minuti.
La reazione colorimetrica è stata rivelabile solo sui filtri ibridati con l'oligonucleotide. Nessun segnale è stata rivelato sui filtri non ibridati. Il metodo, allo stato attuale è in grado di evidenziare 5pg di DNA genomico.
Rientrano quindi nell'ambito della presente invenzione sia l'uso di un anticorpo policlonale o manoclonale anti acidonucleico in grado di riconoscere elettivamente sequenze nucleotidiche a doppio filamento, per rivelare ibridazione tra sequenze complementari di acidi nucleici a singolo filamento, sia corredi diagnostici comprendenti un anticorpo anti acidonucleico atti all'effettuazione di saggi di ibridazione.
Claims (11)
- RIVENDICAZIONI 1. Metodo per determinare la presenza di una sequenza nucleotidica bersaglio in un campione di materiale genetico comprendente il contattare detto campione, in cui il materiale genetico è stato reso disponibile in forma di monofilamento, con una sonda nucleotidica sostanzialmente complementare a detta sequenza bersaglio, in condizioni di ibridazione, e rivelare la formazione di un ibrido sonda/bersaglio, caratterizzato dal fatto che per la rivelazione dell'ibrido sonda/bersaglio si impiega un anticorpo monoclonale o policlonale anti acidonucleico, atto a riconoscere elettivamente sequenze nucleotidiche a doppio filamento da sequenze monofilamento.
- 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detto anticorpo anti acidonucleico è marcato con una sostanza in grado di fornire un segnale misurabile.
- 3. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detto anticarpo non è marcato e la rivelazione del prodotto di reazione tra ibrido sonda/bersaglio e anticorpo è effettuata mediante addizione di un ligando marcato con una sostanza in grado di fornire un segnale misurabile ed in grado di reagire con l'anticorpo, e successiva rimozione del ligando non reagito. A.
- Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in cui la sequenza nucleotidica bersaglio è una sequenza di DNA virale.
- 5. Metodo secondo la rivendicazione A, in cui la sequenza nucleotidica è una sequenza del virus dell'epatite B.
- 6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui l'anticorpo è un anticorpo monoclonale anti-DNA.
- 7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 2-6 in cui la sostanza in grado di fornire un segnale misurabile è scelta dal gruppo che consiste di isotopi radioattivi, enzimi, sostanze fluorescenti e sostanze chemioluminescenti.
- 8. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la sonda è immobilizzata su di un sopporto solido.
- 9. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 7 in cui il materiale genetico contenente la sequenza bersaglio è denaturato e amplificato preventivamente alla sua incubazione con detta sonda .
- 10. Uso di un anticorpo policlonale o monoclonale ariti acidonucleico in grado di riconoscere elettivanente sequenze ibridate di acidi nucleici a doppio filamento per rivelare ibridazioni tra sequenze complementari di acidi nucleici a singolo filamento .
- 11. Corredo diagnostico per l'effettuazione di saggi di ibridazione tra una sequenza nucleotidica bersaglio ed una sonda nucleotidica, caratterizzata dal fatto che comprende un anticorpo anti acidonuoleico atto a riconoscere elettivamente sequenze nucleotidiche a doppio filamento da sequenze a sin golo filamento.
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