IT9020528A1 - Procedimento per la identificazione di sequenze polinucleotidiche e dispositivo relativo - Google Patents
Procedimento per la identificazione di sequenze polinucleotidiche e dispositivo relativoInfo
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Description
DESCRIZIONE
Settore tecnico
La presente invenzione si riferisce a un procedimento per la identificazione di sequenze polinucleotidiche consistente nell 'effettuare in un unica capsula l'ibridazione delle molecole polinucleotidiche contenenti dette sequenze con almeno un reagente pure di tipo polinucleotidico, avente sequenza complementare a quella contenuta nel polinucleotide sotto esame. Tipicamente il procedimento dell'invenzione viene attuato mediante l'impiego di un kit che contiene tutti i materiali e le istruzioni d'uso necessari per la realizzazione del procedimento anche da parte di persone non particolarmente esperte e al di fuori dei laboratori specializzati ed attrezzati.
E’ noto che i saggi di ibridazione si basano sull'uso di almeno un reagente analitico di tipo polinucleotidico, che nel presente testo verrà indicato con il termine sonda, avente sequenza complementare a quella presente nel polinucleotide analita o bersaglio. La presenza del polinucleotide bersaglio nel campione è evidenziata dalla reazione di ibridazione con la sonda polinucleotidica.
Le applicazioni di saggi di ibridazione con sonde ad acidi nucleici nella diagnostica clinica sono ampiamente documentate in letteratura {Matthews J. A. and Kricka L., Analytical Biochemistry 169. 1-25 (1989)).
I saggi di ibridazione di sequenze polinucleotidiche, oltre che essere importanti strumenti per la ricerca di base, stanno rivelandosi potenzialmente utili anche in numerosi campi applicativi, tra i quali la diagnosi prenatale di malattie genetiche su campioni ottenuti mediante amniocentesi o da campioni di sangue periferico, l'identificazione di individui a partire da reperti medico-legali e l'identificazione di agenti patogeni presenti in campioni biologici di origine umana, animale e vegetale, o presenti negli alimenti e nell'ambiente. A questo proposito è importante sottolineare che i livelli di sensibilità e specificità raggiungibili consentono l'identificazione di agenti patogeni batterici e virali anche a livelli non consentiti dai tradizionali test immunologici.
Tecnica anteriore
Nonostante l'indiscussa importanza dei saggi di ibridazione con acidi nucleici nella diagnostica clinica, veterinaria ed ambientale, il loro uso è ancora poco diffuso.
Le ragioni di ciò sono riconducibili principalmente alla difficoltà tecnica di esecuzione dei saggi di ibridazione, tale da impedire il loro impiego in laboratori non specializzati.
Sono state descritte in letteratura numerose tecniche, ciascuna caratterizzata da vantaggi o svantaggi relativi alla sensibilità, specificità, semplicità di esecuzione, rapidità e sicurezza per l'operatore e per l'ambiente.
In particolare sono state ampiamente descritte varie tecniche re lative a:
a) la preparazione del campione analitico {estrazione, purificazione ed amplificazione del nucleotide bersaglio) ;
b) la strategia di marcatura della sonda necessaria per la rivelazione della reazione di ibridazione; c) la strategia di ibridazione.
In particolare un'ampia descrizione di queste strategie è riportata da Matthews J. A, and Kricka L., Analytical Biochemistry 169, 1-25 (1989).
La maggior parte delle tecniche descritte si basa sull'uso di sistemi analitici eterogenei nei quali il polinucleotide bersaglio è immobilizzato su un supporto solido in modo da consentire la separazione tra sonda ibridata e sonda non ibridata. Lo svantaggio principale di questa tecnica è legato ai lunghi tempi di analisi dovuti a cinetiche di ibridazione estremamente lente e a complicate operazioni di separazione della sonda ibridata dalla sonda non ibridata.
Tale svantaggio è stato parzialmente superato con lo sviluppo di tecniche di ibridazione in fase omogenea, basate su reazioni di ibridazione molto più rapide. Tuttavia le notevoli complicazioni dovute alla necessità di particolari strumentazioni per la misura del rapporto "libero/legato", non hanno tuttora consentito una larga diffusione di questo tipo di metodologia.
Questa mancata diffusione dei metodi di ibridizzazione è particolarmente sentita nel campo dell 'infettivologia, nel quale vengono invece comunemente impiegati saggi immunologici relativamente più semplici, che consentono anche letture visuali dei risultati.
La recente descrizione del sistema di marcatura del DNA mediante reazione di polimerizzazione a catena (PCR) {Saiki et al., Science 230, 1350 (1985)) ha drasticamente ridotto la necessità di sviluppare saggi altamente sensibili in quanto poche coppie del polinucleotide bersaglio possono essere amplificate migliaia di volte. Nonostante ciò permane la necessità di sviluppare sistemi semplici e rapidi che consentano l'identificazione inequivocabile del prodotto amplificato attraverso reazioni di ibridazione con sonde specifiche.
Problema tecnico
Da quanto detto sopra appare evidente come sia difficile utilizzare le tecniche di ibridazione in ambienti diversi da laboratori specializzati e con personale altamente specializzato.
Il problema fondamentale da risolvere è quindi quello di poter fornire a chi ne abbia necessità una metodologia semplice e sicura che non richieda apparecchiature costose o di difficile uso fuori dai laboratori, come si è ad esempio già realizzato in campo immunologico.
Il problema è particolarmente aggravato dal noto fatto che la sensibilità del saggio dipende dal tempo di ibridazione e dalla concentrazione della sonda e richiede quindi normalmente un ambiente adatto come è un laboratorio attrezzato.
D. Descrizione particolareggiata dell'invenzione Si è ora trovato che è possibile attuare l'ibridazione tra coppie polinucleotidiche complementari nel quale un membro della coppia, non marcato, è immobilizzato in fase solida, mentre l'altro, marcato con gruppi aptenici, è libero di diffondere in soluzione utilizzando un'unico ambiente di reazione nel quale vengono successivamente eseguite tutte le fasi del procedimento di identificazione.
In particolare il procedimento per la identificazione di sequenze polinucleotidiche secondo l'invenzione consiste nell 'effettuare in un unica capsula racchiudente una membrana microporosa sovrapposta ad un cilindro di materiale assorbente e solidale con detta membrana, detta capsula avendo i bordi superiori leggermente rilevati rispetto a detta membrana in modo da formare un pozzetto per i liquidi immessi, le seguenti fasi essenziali:
a) immissione sulla membrana di una soluzione delle molecole polinucleotidiche bersaglio non marcate che si intendono identificare in modo da fissare dette molecole a detta membrana;
b) ibridazione ad una temperatura compresa fra 20° e 70°C per un tempo compreso fra 5 minuti e 24 ore delle molecole polinucleotidiche fissate a detta membrana con una soluzione di molecole polinucleotidiche sonda marcate;
c) lavaggio della membrana mediante una o più soluzioni tampone comunemente note in modo da spostare dalla membrana il polinucleotide sonda marcato non reagito;
d) reazione colorimetrica con una soluzione di sostanza rivelatrice reagente con le molecole polinucleotidiche ibridate nella fase b).
In ogni caso, l'unico ambiente di reazione nel quale si eseguono tutte le fasi del procedimento secondo l'invenzione ha le seguenti caratteristiche essenziali:
a) uno strato di materiale microporoso di spessore compreso fra 0,1 e 0,3 mm avente essenzialmente le funzioni di:
fissare le molecole polinucleotidiche non marcate da sottoporre ad ibridizzazione;
- fungere da camera d'ibridazione tra polinucleotide marcato e polinucleotide non marcato;
- permettere la lettura dei risultati, dopo aver sviluppato la reazione colorimetrica con la sostanza rivelatrice delle molecole ibridate;
b) uno strato di materiale assorbente sottostante a quello microporoso e a stretto contatto con lo stesso, avente un volume globale compreso fra 2 e 10 cm , in grado di assorbire tutte le soluzioni impiegate per l'esecuzione del procedimento dell'invenzione (soluzioni per le reazioni di ibridazione, i lavaggi e la rivelazione) e di mantenere lo strato di materiale microporoso sufficientemente impregnato con dette soluzioni consentendo cinetiche di ibridazione lunghe e concentrazioni elevate delle sonde;
c) un contenitore solido che racchiude i due strati a) e b) ed impedisce qualsiasi immissione nell'ambiente dei materiali utilizzati durante il procedimento secondo l'invenzione.
Tipicamente la realizzazione del procedimento secondo l'invenzione prevede la deposizione sequenziale, l'assorbimento e l'incubazione in detto unico ambiente di reazione di:
a) una soluzione contenente il polinucleotide non marcato ;
b) una soluzione di preibridizzazione;
c) una soluzione contenente il polinucleotide preferibilmente marcato con gruppi aptenici;
d) soluzioni di lavaggio per la separazione del "libero" dal "legato";
e) soluzioni contenenti molecole in grado di legare specificatamente i gruppi aptenici coniugati al polinucleotide ibridato, opportunamente marcate con sistemi per la rivelazione visuale delle aree che hanno reagito nello strato microporoso dell'ambiente di reazione.
Il procedimento secondo l’invenzione permette di ottenere l'agevole identificazione delle sequenze polinucleotidiche presenti nella sostanza sottoposta ad esame semplicemente depositando le varie soluzioni sulla parte microporosa dell'ambiente di reazione e lasciando incubare per un tempo opportuno, variabile da pochi minuti a molte ore in funzione della sensibilità richiesta, indipendentemente da strumentazioni ed operazioni complesse.
E' un importante aspetto della presente invenzione il fatto che la reazione di ibridazione può, inaspettatamente, continuare per diverse ore anche dopo il completo assorbimento della soluzione contenente il polinucleotide marcato nella parte microporosa dell 'ambiente di reazione.
Si presume, senza con questo voler in alcun modo dare una interpretazione vincolante della scoperta effettuata, che la presenza dello strato assorbente sottostante, impregnato di soluzione di preibridizzazione, contribuisca al mantenimento dello stato umido dell'ambiente di reazione facilitando la mobilità delle molecole e consentendo la reazione di ibridazione per tempi altrimenti raggiungibili solo con sistemi più complicati basati sull'uso di membrane completamente immerse nella soluzione di ibridizzazione.
La presente invenzione consente quindi di raggiungere elevate sensibilità, grazie alla possibilità di estendere i tempi di ibridazione, senza penalizzare la semplicità di esecuzione del saggio.
Il presente procedimento consente inoltre l'uso di volumi di reagenti e polinucleotidi marcati ridotti e con concentrazioni elevate.
Questa caratteristica, oltre ad incrementare la sensibilità dei saggi, è particolarmente vantaggiosa per la realizzazione di kits.
Fra i materiali adatti per la realizzazione dello strato microporoso dell'ambiente di reazione, ricordiamo la nitrocellulosa o il nylon.
La porosità di detti materiali è preferibilmente compresa fra 0,4 ed 1,2 μm.
Fra i materiali adatti per la realizzazione dello strato assorbente dell'ambiente di reazione, ricordiamo i materiali idrofili, in particolare l'ovatta di cotone e la carta bibula o da filtro.
Si possono anche utilizzare dispositivi già commercialmente disponibili e normalmente impiegati per l'esecuzione di test immunologici.
Come già detto sopra, è possibile utilizzare le tecniche per marcare sequenze polinucleotidiche con apteni già note e ampiamente descritte (Matthews J. A. and Kricka L., Analytical Biochemistry 169. 1-25 (1989))·
Altrettanto noti sono i sistemi di marcatura e rivelazione non radioattiva di acidi nucleici che includono la marcatura diretta con enzimi (perossidasi, fosfatasi alcalina, etc.) o indiretta con biotina (marcatura primaria) rivelabile da marcatori secondari come avidina, streptavidina e anticorpi anti-biotina coniugati con enzimi (fosfatasi alcalina, betagalattosidasi , glucosio ossidasi, perossidasi, complessi enzima biotinilato/avidina) oppure coniugati con metalli colloidali, che sono facilmente utilizzabili con il procedimento secondo l'invenzione.
Altri apteni comunemente impiegabili per la marcatura di sequenze polinucleotidiche includono digossigenina, gruppi sulfonicl, gruppi dinitrofenilici, N-2-acetilaminofluorene , N-2-acetilamino-7-iodofluorene, etidio, 5-bromodeossiuridina, rivelabili con anticorpi/antiaptene direttamente o indirettamente marcati come descritto per gli anticorpi anti-biotina.
Alternativamente è noto l'uso di sistemi di rivelazione basati sulla marcatura primaria del polinucleotide con gruppi glicosilici rivelabili con concanavalina A coniugata ad enzimi, oppure con poly(dA) rivelabile con poly(dT)coniugato con perossidasi.
Un ulteriore reagente necessario, nel caso di uso di sistemi enzimatici per la rivelazione delle reazioni di ibridazione, è costituito da un substrato enzimatico insolubile in grado di depositarsi sullo strato microporoso dell'ambiente di reazione senza fenomeni di diffusione. Esempi di substrati insolubili per la fosfatasi alcalina e per la perossidasi includono bromo-cloro-indolil fosfato/nitro blu tetrazolio (BICP/NBT), 4-cloro-l-naftolo, 3-amino-9-etilcarbazolo e diaminobenzidina.
Una forma preferita dalla presente invenzione prevede l'immobilizzazione del polinucleotide analita sullo strato microporoso di nitrocellulosa dell'ambiente di reazione seguita da ibridazione diretta con la sonda polinucleotidica biotinilata o coniugata con digossigenina diluita in tamponi impiegati normalmente per le ibridazioni su membrane di nitrocellulosa contenenti, ad esempio, sodio citrato, formammide, N-laurilsarcosina sodio dodecilsolfato, caseina etc.. Al termine della reazione di ibridazione, la rivelazione è ottenuta con streptavidina o con anticorpi antidigossigenina marcati con fosfatasi alcalina, seguita da reazione enzimatica con BICP/NBT. Tale forma preferita dell'invenzione offre la possibilità di analizzare diversi polinucleotidi analiti mediante un singolo strato microporoso dell'ambiente di reazione, essendo possibile immobilizzare diversi campioni in forma di piccole macchie di 1-2 mm di diametro su superfici dello strato microporoso di circa 1-2 cm di diametro.
Inoltre, tale forma preferita dell'invenzione, consente l'inserimento di controlli positivi e negativi (polinucleotidi marcati e polinucleotidi non omologhi alla sonda, immobilizzati su strato microporoso dell'ambiente di reazione) permettendo cosi il controllo simultaneo dei reagenti e dell'esecuzione del saggio. Un'altra forma preferita di realizzazione del procedimento secondo l'invenzione si basa sull'immobilizzazione della sonda polinucleotidica sullo strato microporoso dell'ambiente di reazione e sull'ibridazione con il polinucleotide analita in fase liquida (ibridazione inversa) marcato enzimaticamente mediante reazione di amplificazione con PCR in presenza di dUTP-Biotina o dTTP-Digossigenina. In tal modo il polinucleotide analita viene contemporaneamente amplificato e marcato con gruppi aptenici e facilmente rivelato mediante il metodo della presente invenzione.
In tal caso si ha l'ulteriore vantaggio di poter immobilizzare diverse sonde polinucleotidiche, ad esempio dirette contro diversi agenti patogeni virali potenzialmente presenti nel campione, ed ibridare il polinucleotide bersaglio con il materiale amplificato e marcato mediante PCR in un singolo saggio, completo anche in questo caso di controlli negativi e positivi.
Secondo una ulteriore forma preferita di realizzazione della presente invenzione tutti i materiali ed i reagenti necessari per l'attuazione del procedimento sono contenuti in un unico kit, che permette di realizzare facilmente detto procedimento anche al di fuori di laboratori attrezzati.
In particolare il kit si compone delle seguenti parti essenziali:
a) una capsula racchiudente una membrana microporosa sovrapposta ad un cilindro di materiale assorbente e solidale con detta membrana, detta capsula avendo i bordi superiori leggermente rilevati rispetto a detta membrana in modo da formare un pozzetto per i liquidi immessi;
b) un flacone contenente una soluzione di molecole polinucleotidiche sonda marcate;
c) tre flaconi contenenti i reagenti necessari per la preparazione di una soluzione tampone scelta nel gruppo costituito da 5xSSC, pH 7.0. contenente formammide 50% v/v (Fluka), N-lauril-sarcosina 0,1% p/v, sodio dodecilsolfato 0,02% ρ/v, blocking reagent 1096176 5% p/v (Boehringer Mannheim), DNA di sperma di aringa o di salmone 10 μg/ml;
d) un flacone contenente una soluzione di sostanza rivelatrice costituita da anticorpi antidigossigenina coniugati a fosfatasi alcalina;
e) due flaconi contenenti i substrati per la fosfatasi alcalina BICP/NBT;
f) una micropipetta da 100-400 μl;
g) un foglio di istruzioni riportante le modalità di prelevamento dei campioni da analizzare e delle operazioni da effettuare con i vari componenti del kit per identificare le sequenze polinucleotidiche dei campioni sottoposti ad esame.
ESEMPIO 1
Determinazione di sequenze di DNA plasmidico pBR328. Le seguenti soluzioni sono state depositate mediante l’ausilio di normali micropipette sulla superficie dello strato microporoso di un ambiente di reazione costituito da un filtro assorbente messo in commercio con il marchio Porex Format System dalla Porex Technologies. Ine. Fairburn, GA 30213, lasciate assorbire ed incubate come sotto indicato:
a) acqua distillata, 100 μl, (30 secondi a temperatura ambiente, (T.A.));
b) sodio cloruro 3 M, sodio citrato 0,3 M, pH 7,0 (20xSSC), 100 μl, (5 min a T.A.);
c) polinucleotide bersaglio (DNA plasmidico pBR328 denaturato a 100°C per 10 minuti, diluito a varie concentrazioni con una soluzione di DNA di sperma di aringa o di salmone 50 ng/ml), 1 μl per macchia, sei diluizioni (90 minuti a 80°C);
d) soluzione di preibridizzazione filtrata su filtri da 0,22 μm (5xSSC, pH 7,0, contenente formammide 50% v/v (Fluka), N-lauroil-sarcosina 0,1% p/v, sodio dodecilsolfato 0,02% ρ/v, blocking reagent 1096176 3% p/v (Boehringer Mannheim)), 400 μl, (4 minuti a 42°C);
e) sonda polinucleotidica (DNA pBR328 marcato digossigenina (Boehringer Mannheim) diluito a 100 ng/ml in soluzione di preibridizzazione contenente 10 pg/ml di DNA di sperma di aringa o di salmone), 100 μl, (da 15 minuti a 6 ore in funzione della sensibilità necessaria, a 42°C).
A questo punto i filtri Porex vengono avvolti in ParafilmR ;
f) soluzione di lavaggio (0,1xSSC contenente sodio dodecilsolfato 0,1% (p/v)), 100 μl, (quattro volte, 30 secondi ciascuna, a 42°C);
g) soluzione di lavaggio (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7.5 (TBS)), 100 μl, (30 secondi a T.A.); h) Blocking reagent 1096I76, 0,5% p/v (Boehringer Mannheim), 200 μl, (2 min a T.A.);
i) anticorpo anti-digossigenina coniugato con fosfatasi alcalina (Boehringer Mannheim), 1:200 in TBS, 100 μl (4 min a T.A.);
l) soluzione di lavaggio (TBS), 100 μl, (tre volte, 30 secondi ciascuna a T.A.);
m) soluzione di lavaggio (Tris-HCl 10 mM, NaCl 100 mM, MgCl2, pH 9.5), 100 μl, (30 secondi a T.A.); n) substrato croniogeno per fosfatasi alcalina BICP/NBT (Biorad Kit), 400 μl, (1 ora a T.A.).
I risultati ottenuti in forma di macchie grigiobluastre su fondo chiaro sono stati valutati visualmente e riportati in tabella 1.
Come si può osservare macchie visibili sono state ottenute con quantità di DNA pBR328 omologo (polinucleotide bersaglio) variabili tra 10 pg e 4 ng in funzione dei tempi di ibridizzazione in accordo al principio della tecnica della presente invenzione. Nessuna macchia è stata osservata con DNA di sperma di aringa o di salmone (DNA non omologo) anche in quantità decisamente superiori (50 ng) suggerendo che nel corso del saggio sono avvenute solo ibridazioni tra filamenti di DNA omologhi.
TABELLA 1 - Determinazione di DNA plasmidico pBR328 mediante la tecnica della presente invenzione a vari tempi di ibridazione.
ESEMPIO 2
Determinazioni di sequenze Alu-1 in campioni di DNA genomico estratto da ibridi somatici uomo-topo.
Campioni di DNA genomico (1 μg/μl) sono stati estratti da cellule umane, da cellule murine, e da ibridi somatici uomo-topo.
Aliquote da 1 μl per ciascun campione sono state seminate ed immobilizzate su filtri PorexR Format System (Porex Technologies, Inc. Fairburn, GA 30213) ed analizzati mediante ibridazione mediante una sonda polinucleotidica Alu-1-Digossigenina (tempo di ibridazione di 4 ore) come descritto nell'esempio 1. La sonda Alu-1 (0,3 kb) era stata precedentemente marcata con digossigenina mediante il kit "DNA labeling and detection Nonradioactive" (Boehringer Mannheim) in accordo con le istruzioni del produttore del kit.
I risultati ottenuti sono riportati nella tabella 2. Come si può osservare solamente DNA estratto da cellule contenenti cromosomi umani (cellule umane ed ibridi uomo-topo) è risultato positivo al saggio come del resto atteso in quanto è ben noto che le sequenze ripetute Alu-1 sono caratteristiche del genoma umano. La specificità del saggio è quindi ulteriormente confermata dalla assenza di reazione con DNA estratto da cellule murine.
TABELLA 2 - Determinazione di sequenze Alu-1 nel DNA genomico di varie linee cellulari mediante la tecnica della presente invenzione.
Claims (11)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la identificazione di sequenze polinucleotidiche consistente nell'effettuare in un unica capsula racchiudente una membrana microporosa sovrapposta ad un cilindro di materiale assorbente e solidale con detta membrana, detta capsula avendo i bordi superiori leggermente rilevati rispetto a detta membrana in modo da formare un pozzetto per i liquidi immessi, le seguenti fasi essenziali: a) immissione sulla membrana di una soluzione delle molecole polinucleotidiche bersaglio non marcate che si intendono identificare in modo da fissare dette molecole a detta membrana; b) ibridazione ad una temperatura compresa fra 20° e 70°C per un tempo compreso fra 5 minuti e 24 ore delle molecole polinucleotidiche fissate a detta membrana con una soluzione di molecole polinucleotidiche sonda marcate; c) lavaggio della membrana mediante una o più soluzioni tampone comunemente note in modo da spostare dalla membrana il polinucleotide sonda marcato non reagito; d) reazione colorimetrica con una soluzione di sostanza rivelatrice reagente con le molecole polinucleotidiche ibridate nella fase b).
- 2. Procedimento come rivendicato in 1. caratterizzato dal fatto che la marcatura di dette molecole polinucleotidiche sonda è ottenuta direttamente mediante enzimi.
- 3. Procedimento come rivendicato in 1. caratterizzato dal fatto che la marcatura di dette molecole polinucleotidiche sonda è ottenuta direttamente mediante perossidasi o fosfatasi alcalina.
- 4 . Procedimento come rivendicato in 1. caratterizzato dal fatto che la marcatura di dette molecole polinucleotidiche sonda è ottenuta indirettamente mediante modificazione chimica o enzimatica con gruppi aptenici o biotina.
- 5. Procedimento come rivendicato in 1. caratterizzato dal fatto che la marcatura di dette molecole polinucleotidiche sonda è ottenuta indirettamente mediante modificazione chimica o enzimatica con gruppi aptenici o biotina e la marcatura primaria viene rivelata con avidina, streptavidina, anticorpi anti-biotina coniugati con enzimi scelti nel gruppo costituito da fosfatasi alcalina, betagalattosidasi, glucosio ossidasi, perossidasi, complessi enzima biotinilato/avidina o anticorpi anti-biotina coniugati con metalli colloidali.
- 6. Procedimento per la identificazione di sequenze polinucleotidiche consistente nell'effettuare in una unica capsula racchiudente una membrana microporosa sovrapposta ad un cilindro di materiale assorbente e solidale con detta membrana, detta capsula avendo i bordi superiori leggermente rilevati rispetto a detta membrana in modo da formare un pozzetto per i liquidi immessi, le seguenti fasi essenziali: a) immissione sulla membrana di una soluzione delle molecole polinucleotidiche sonda non marcate che si utilizzano per ibridare le molecole polinucleotidiche bersaglio che si intendono identificare in modo da fissare dette molecole a detta membrana; b) ibridazione ad una temperatura compresa fra 20° e 70°C per un tempo compreso fra 5 minuti e 24 ore delle molecole polinucleotidiche sonda fissate a detta membrana con una soluzione di molecole polinucleotidiche bersaglio marcate; c) lavaggio della membrana mediante una o più soluzioni tampone comunemente note in modo da spostare dalla membrana il polinucleotide bersaglio marcato non reagito; d) reazione colorimetrica con una soluzione di sostanza rivelatrice reagente con le molecole polinucleotidiche marcate ibridate nella fase b).
- 7. Procedimento come rivendicato in 6. caratterizzato dal fatto che la marcatura di dette molecole polinucleotidiche bersaglio è ottenuta mediante reazione di polimerizzazione a catena (PCR).
- 8. Procedimento come rivendicato in 6. caratterizzato dal fatto che la marcatura di dette molecole polinucleotidiche bersaglio marcate è ottenuta mediante l'incorporazione di nucleotidi modificati con gruppi aptenici o biotina.
- 9. Procedimento come rivendicato in 6. caratterizzato dal fatto che la marcatura di dette molecole polinucleotidiche bersaglio è ottenuta mediante l'incorporazione di nucleotidi modificati con gruppi aptenici o biotina e la marcatura primaria viene rivelata con avidina, streptavidina, anticorpi antibiotina coniugati con enzimi scelti nel gruppo costituito da fosfatasi alcalina, betagalattosidasi, glucosio ossidasi, perossidasi, complessi enzima biotinilato/avidina o anticorpi anti-biotina coniugati con metalli colloidali .
- 10. Kit per identificare sequenze polinucleotidiche costituito da: a) una capsula racchiudente una membrana microporosa sovrapposta ad un cilindro di materiale assorbente e solidale con detta membrana, detta capsula avendo i bordi superiori leggermente rilevati rispetto a detta membrana in modo da formare un pozzetto per i liquidi immessi ; b) un flacone contenente una soluzione di molecole polinucleotidiche sonda marcate; c) tre flaconi contenenti i reagenti necessari per la preparazione di una soluzione tampone scelta nel gruppo costituito da 5xSSC, pH 7.0, contenente formammide 50% v/v (Fluka), N-lauril-sarcosina 0,1% p/v, sodio dodecilsolfato 0,02% p/v, blocking reagent 1096176 5% P/v (Boehringer Mannheim), DNA di sperma di aringa o di salmone 10 μg/ml; d) un flacone contenente una soluzione di sostanza rivelatrice costituita da anticorpi antidigossigenina coniugati a fosfatasi alcalina; e) due flaconi contenenti i substrati per la fosfatasi alcalina BICP/NBT; f) una micropipetta da 100-400 μl; g) un foglio di istruzioni riportante le modalità di prelevamento dei campioni da analizzare e delle operazioni da effettuare con i vari componenti del kit per identificare le sequenze polinucleotidiche del campioni sottoposti ad esame.
- 11. Kit per identificare seguenze polinucleotidiche costituito da: a) una capsula racchiudente una membrana microporosa sovrapposta ad un cilindro di materiale assorbente e solidale con detta membrana, detta capsula avendo i bordi superiori leggermente rilevati rispetto a detta membrana in modo da formare un pozzetto per i liquidi immessi, ed avendo già immobilizzati i polinucleotidi sonda e di controllo non marcati ed i polinucleotidi di controllo marcati; b) un flacone contenente una soluzione di nucleotidi marcati con apteni per amplificazione e marcatura di sequenze polinucleotidiche mediante PCR; c) tre flaconi contenenti i reagenti necessari per la preparazione di una soluzione tampone scelta nel gruppo costituito da 5XSSC, pH 7.0, contenente formammide 50% v/v (Fluka), N-lauril-sarcosina 0,1% p/v, sodio dodecilsolfato 0,02% p/v, blocking reagent 1096176 5% p/v (Boehringer Mannheim), DNA di sperma di aringa o di salmone 10 μg/ml; d) un flacone contenente una soluzione di sostanza rivelatrice costituita da anticorpi antidigossigenina coniugati a fosfatasi alcalina; e) due flaconi contenenti i substrati per la fosfatasi alcalina BICP/NBT; f) una micropipetta da 100-400 μl; g) un foglio di istruzioni riportante le modalità di prelevamento dei campioni da analizzare e delle operazioni da effettuare con i vari componenti del kit per identificare le sequenze polinucleotidiche dei campioni sottoposti ad esame.
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1991
- 1991-06-03 EP EP91109023A patent/EP0460569A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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