IT202300008766A1

IT202300008766A1 - Derivati lipofili dell’Epigallocatechina Gallato

Info

Publication number: IT202300008766A1
Application number: IT102023000008766A
Authority: IT
Inventors: Giovanna Mobbili; Stefano Menzo; Cristina Minnelli; Sara Caucci; Roberta Galeazzi; Emiliano Laudadio; Giulia Sabbatini; Tatiana Armeni
Original assignee: Univ Politecnica Delle Marche
Priority date: 2023-05-03
Filing date: 2023-05-03
Publication date: 2024-11-03

Description

Derivati lipofili dell?Epigallocatechina Gallato Lipophilic derivatives of epigallocatechin gallate

Campo tecnico

La presente invenzione si riferisce all?impiego di derivati lipofili dell?Epigallocatechina Gallato (nel seguito anche indicata come EGCG).

Pi? in particolare l?invenzione si riferisce a derivati lipofili contenenti catene alifatiche connesse al nucleo epigallocatechinico della seguente formula (I) con un legame etereo in posizione 4?.

(I)

I derivati dell?invenzione presentano un?efficace attivit? antivirale, in particolare nei confronti dei virus influenzali come Influenza B e SARS-CoV-2, Herpes Simplex di tipo 1, e HIV con un ottimale Indice di Selettivit? (SI). Generalmente un SI superiore a 10 viene infatti considerato come un indicatore di una molecola bioattiva selettiva [doi.org/10.3390/md16120509; doi.org/10.1016/bs.podrm.2020.07.005].

Arte nota

L?Epigallocatechina gallato (EGCG) ? una catechina di origine naturale, estratta dalle foglie del t? verde. La molecola presenta una pluralit? di gruppi OH ed ? nota l?efficacia di tale molecola nei processi di inibizione delle specie radicaliche.

??

Tuttavia, la presenza di otto gruppi ossidrilici rende la struttura molecolare di EGCG estremamente polare e ne limita l?impiego all?interno di sistemi lipofili, come oli, grassi, formulazioni cosmetiche e compartimenti biologici in generale.

A ci? si aggiunge che la ridotta solubilit? dell?EGCG nei sistemi lipofili incide anche sull?assorbimento in vivo e sulla biodisponibilit? della molecola stessa.

Per ovviare almeno in parte ai suddetti inconvenienti sono state messe a punto numerose metodiche di derivatizzazione descritte in diversi documenti brevettuali.

I metodi di derivatizzazione proposti da alcuni documenti brevettuali permettono di ottenere derivati dell?EGCG di tipo estereo che hanno tuttavia l?inconveniente di essere soggetti ad una facile e rapida degradazione.

EP2543370 illustra composizioni comprendenti un polifenolo del t? verde esterificato con gruppi C1-C30 per l?uso nel trattamento dell'infezione da virus dell?Herpes Simplex (HSV). Polifenoli rappresentativi del t? verde includono l?Epigallocatechina-3-gallato, nonch? polifenoli con uno o pi? acidi grassi legati agli esteri. Non vengono menzionati derivati eterei del dell?EGCG, ma ci si riferisce solamente a derivati esterei. Non vengono menzionate le infezioni da Sars-Cov-2, HIV e influenza.

US20200054595 illustra composizioni polifenoliche di t? verde modificate e i loro metodi di utilizzo nel trattamento dei virus dell'influenza. Un polifenolo esemplificato del t? verde include l?Epigallocatechina-3-gallato che pu? essere esterificato con un gruppo C1-C30 in almeno una posizione. I polifenoli del t? verde modificati possono essere utilizzati per prevenire i virus dell'influenza. Non vengono menzionate le infezioni da Sars-Cov-2, Herpes Simplex e HIV.

WO2022036316 descrive composizioni e metodi per il trattamento delle infezioni virali, come le infezioni da sindrome respiratoria acuta grave Coronavirus-2 (SARS-CoV-2, SARS, MERS). Le molecole descritte permettono di agire anche contro infezioni virali quali virus Herpes

??

Simplex (HSV), virus dell'immunodeficienza umana (HIV), virus del papilloma umano (HPV), norovirus, rinovirus, virus Zika, ebolavirus e virus dell'influenza (tipo B o tipo C). Vengono considerate solamente le molecole estratte da prodotti naturali come t? verde, cacao e uva.

CN111658631 riguarda l?applicazione dell'acido gallico, dei suoi derivati e analoghi strutturali, nella preparazione di farmaci antivirali per coronavirus (inclusi i nuovi coronavirus 2019-nCoV o SARS-CoV-2 e I coronavirus della sindrome respiratoria del Medio Oriente MERS-CoV). Nel documento brevettuale si menzionano anche i derivati sintetici dell?acido gallico (profarmaci, sali, esteri, sali di esteri o qualsiasi altro derivato che pu? essere somministrato direttamente o indirettamente secondo le esigenze del paziente) ma i derivati eterei non sono citati n? in maniera esplicita, n? implicita.

CN111387194 Vengono descritti composti per prevenire e trattare in maniera efficace le infezioni da coronavirus, ma non sono menzionati altri virus come Herpes Simplex, HIV e influenza. I componenti efficaci del composto comprendono l?Epigallocatechina Gallato (EGCG) e modifiche strutturali degli analoghi EGCG, ECG e GCG.

Altri documenti brevettuali menzionano derivati eterei come ad esempio JP5873318. Il documento brevettuale IT2019000019190 descrive anch?esso derivati eterei di EGCG, che sono tuttavia impiegati per contrastare i radicali liberi ed il tumore.

? pertanto particolarmente sentita l?esigenza di ottenere derivati stabili nel tempo in grado di interagire efficacemente con sistemi lipidici, consentendone l?impiego come agenti antivirali pi? efficaci dei derivati descritti nell?arte nota.

Se non specificatamente escluso nella descrizione di dettaglio che segue, quanto descritto nel presente capitolo ? da considerarsi come parte integrante della descrizione dettagliata dell?invenzione.

Sommario dell'invenzione

??

Costituisce pertanto uno scopo della presente invenzione quello di fornire derivati dell?Epigallocatechina Gallato in grado di interagire efficacemente con sistemi lipidici e che sia impiegabile come efficace agente antivirale.

Altro scopo dell?invenzione ? quello di fornire composizioni farmaceutiche per l?uso come antivirali, in particolare nella prevenzione e nel trattamento di infezioni virali. Pi? in particolare si forniscono derivati lipofili di EGCG per contrastare l?infezione da Sars-Cov-2 e Herpes Simplex.

Ancora altro scopo ? l?utilizzo di formulazioni come ad esempio, ma non limitatamente a, formulazioni liposomiali, polimeriche e nanoemulsioni, contenenti derivati lipofili di EGCG nella preparazione di creme e aerosol da utilizzare nel trattamento di infezioni virali, ad esempio, ma non limitatamente a, infezioni da Herpes Simplex e da Sars-Cov-2. Studi preliminari volti a valutare l?efficienza di incapsulamento (EE) dei suddetti derivati lipofili di EGCG in sistemi di trasporto sia liposomiali che polimerici a base di acido poli(lattico-co-glicolico) (PLGA), hanno evidenziato una EE molto elevata e nettamente superiore rispetto alla molecola non funzionalizzata. Gli scopi sopra esposti sono raggiunti dal presente derivato dell?Epigallocatechina gallato avente le caratteristiche di rivendicazione 1.

Altre caratteristiche e vantaggi della presente invenzione risulteranno maggiormente evidenti dalla descrizione di una forma di esecuzione preferita, ma non esclusiva, di un derivato dell?Epigallocatechina gallato, illustrata a titolo indicativo, ma non limitativo, nella descrizione dettagliata e nelle unite tavole di disegni in cui:

Breve descrizione delle Figure

Fig.1. Sintesi di EGCG-Cn con n=6, 10, 18;

Fig.2 A) Iniezione al tempo zero (t=0) del derivato estereo di EGCG (EGCG legato alla catena di 18 atomi di C dell?acido oleico) in PB e acetonitrile. B) Iniezione effettuata dopo 24 h del derivato estereo di EGCG in PB e acetonitrile.

Fig. 3A, 3B, 3C. Effetto di EGCG (A) e EGCG-C18 (B) sulla replicazione virale di Coronavirus 2 da sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-

??

2) e loro efficacia (C) rispetto al controllo non trattato. Le cellule Vero-E6 (ATCC n? CRL-1586)sono state pre-incubate con diluizioni seriali in triplicato dei composti per 24 ore. Le cellule sono state infettate con 100 dosi infettanti il 50% delle colture cellulari (TCID50) di SARS-CoV-2 per pozzetto. La carica virale, espressa come copie virali su ml di surnatante (cp/ml), ? stata quantificata 24 e 48 ore dopo l?infezione (opi) attraverso Real-Time PCR mediante l?utilizzo dello standard internazionale del WHO per l?RNA di SARS-CoV-2 (cat# 20/146), acquistato dal National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) (grafici a sinistra). La concentrazione inibente il 50% della carica virale (IC50) ? stata calcolata 48 ore dopo l?infezione mediante un?analisi di regressione non lineare utilizzando GraphPad Prism (grafici a destra) (A, B). Confronto della riduzione della replicazione virale di EGCG e EGCG-C18 alla concentrazione di 80 ?M dopo 48 ore di infezione. La percentuale viene intesa come il rapporto fra il numero delle copie virali del trattato e del controllo. La significativit? statistica ? stata verificata con un t-test (C).

Fig. 4A, 4B, 4C, 4D. L?effetto antivirale di EGCG-C18 nei confronti di SARS-CoV-2 ? superiore a quello ottenuto con EGCG, EGCG-C6 e EGCG-C10. Le cellule Vero-E6 (ATCC n? CRL-1586) sono state preincubate con diluizioni seriali in triplicato con EGCG (A), EGCG-C6 (B), EGCG-C10 (C) e EGCG-C18 (D) per 24 ore. Successivamente le cellule sono state infettate con 100 TCID50 di SARS-CoV-2 per pozzetto. La carica virale (cp/ml) ? stata quantificata nei surnatanti 48 ore dopo l?infezione attraverso Real-Time PCR mediante l?utilizzo dello standard internazionale del WHO per l?RNA di SARS-CoV-2 (cat# 20/146), acquistato dal National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). La concentrazione inibente il 50% della carica virale (IC50) ? stata calcolata mediante un?analisi di regressione non lineare utilizzando GraphPad Prism.

Fig. 5. Effetto virucida nei confronti del SARS-CoV-2 di EGCG e C18-EGCG. 100 TCID50 di SARS-CoV-2 per pozzetto sono state incubate con diluizioni seriali in triplicato di EGCG e EGCG-C18 per 10 minuti a 37 ?C. Successivamente le cellule sono state infettate con la sospensione virus-

??

derivati per 2 ore. La carica virale (cp/ml) ? stata quantificata nei surnatanti 48 ore dopo l?infezione attraverso Real-Time PCR mediante l?utilizzo dello standard internazionale del WHO per l?RNA di SARS-CoV-2 (cat# 20/146), acquistato dal National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC).

Fig. 6A, 6B. Edaravone-C18, un antiossidante lipofilo sintetizzato dagli inventori che contiene una catena di 18 atomi di C analoga a EGCG-C18 non mostra alcuna capacit? di inibire la replicazione di SARS-CoV-2. Le cellule Vero-E6 (ATCC n? CRL-1586) sono state pre-incubate con diluizioni seriali in triplicato con Edaravone-C18 (A) e EGCG-C18 (B) per 24 ore. Successivamente le cellule sono state infettate con 100 TCID50 di SARS-CoV-2 per pozzetto. La carica virale (cp/ml) ? stata quantificata nei surnatanti 48 ore dopo l?infezione attraverso Real-Time PCR mediante l?utilizzo dello standard internazionale del WHO per l?RNA di SARS-CoV-2 (cat# 20/146), acquistato dal National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). La concentrazione inibente il 50% della carica virale (IC50) ? stata calcolata mediante un?analisi di regressione non lineare utilizzando GraphPad Prism.

Fig. 7A, 7B, 7C. Effetto dei vari composti (EGCG-C6, EGCG-C10, EGCG-C18) sulla replicazione di Herpes Simplex Virus di tipo 1 (HSV-1). Le cellule U87/CXCR4 (HIV reagent program n? ARP-4036) sono state preincubate con diluizioni seriali in triplicato con EGCG-C6 (A), EGCG-C10 (B) e EGCG-C18 (C) per 24 ore. Le cellule sono state infettate con 100 TCID50 di HSV-1 per pozzetto. La carica virale, espressa come copie virali su ml di surnatante (cp/ml), ? stata quantificata 24 e 48 ore dopo l?infezione attraverso Real-Time PCR (grafici in alto). La concentrazione inibente il 50% della carica virale (IC50) ? stata calcolata 48 ore dopo l?infezione mediante un?analisi di regressione non lineare utilizzando GraphPad Prism (grafici in basso).

Fig. 8A, 8B, 8C. Effetto dei vari composti (EGCG-C6, EGCG-C10, EGCG-C18) sulla replicazione del Virus dell?influenza B (InfluB). Le cellule MDCK (ATCC n? CRL-2935)sono state pre-incubate con diluizioni seriali in triplicato con EGCG-C6 (A), EGCG-C10 (B) e C18-EGCG (C) per 24 ore.

??

Le cellule sono state infettate con 100 TCID50 di InfluB per pozzetto. La carica virale, espressa come copie virali su ml di surnatante (cp/ml), ? stata quantificata 24 e 48 ore dopo l?infezione attraverso Real-Time PCR (grafici in alto). La concentrazione inibente il 50% della carica virale (IC50) ? stata calcolata 48 ore dopo l?infezione mediante un?analisi di regressione non lineare utilizzando GraphPad Prism (grafici in basso).

Fig. 9A, 9B, 9C. Effetto dei vari composti (EGCG-C6, EGCG-C10, EGCG-C18) sulla capacit? replicativa del virus dell?immunodeficienza umana (HIV). Le cellule U87/CXCR4 (HIV reagent program n? ARP-4036) sono state pre-incubate con diluizioni seriali in triplicato con EGCG-C6 (A), EGCG-C10 (B) e EGCG-C18 (C) per 24 ore. Le cellule sono state infettate con un surnatante di trasfezione contenente le particelle virali dosate tramite la misurazione dell?antigene p24 mediante un test in immunochemiluminescenza. La carica virale, espressa come valore di fluorescenza relativa (VFR), ? stata misurata 24 e 48 ore dopo l?infezione attraverso l?utilizzo di un fluorimetro per piastre (grafici in alto). La concentrazione inibente il 50% della carica virale (IC50) ? stata calcolata 48 ore dopo l?infezione mediante un?analisi di regressione non lineare utilizzando GraphPad Prism (grafici in basso).

Tabella 1. Concentrazione Citotossica (CC50), Concentrazione Inibente (IC50) e Indice di Selettivit? (SI) delle molecole dimostratesi attive nei confronti dei virus indicati.

Definizioni

Nell?ambito della presente invenzione con la dicitura ?Indice di Selettivit?? si intende un parametro farmacologico volto a valutare la selettiva attivit? biologica di una molecola bioattiva. L?indice di selettivit? (SI) ? stato calcolato per ogni composto antivirale, come il rapporto tra la citotossicit? cellulare espressa come CC50 (concentrazione citotossica in grado di ridurre la vitalit? cellulare del 50%) e l?attivit? antivirale espressa come IC50 (concentrazione inibente la replicazione virale del 50% rispetto al controllo non trattato). Un farmaco ideale dovrebbe avere una

??

concentrazione tossica relativamente alta e una concentrazione attiva molto bassa (SI ? 10).

Nell?ambito della presente invenzione con la dicitura ?circa? si intende un valore numerico uguale al valore riportato ? la sua deviazione standard.

Nell?ambito della presente invenzione con l?intervallo ?C-6 a C-20? o ?C-10 a C-18? si intende identificare ciascuna catena di atomi di carbonio singolarmente indicato come C-6, C-7, C-8, C-9, C-10, C-11, C-12, C-13, C-14, C-15, C-16, C-17, C-18, C-19, C-20.

Nell?ambito della presente invenzione la dicitura ?uso topico? indica un uso esterno o interno non sistemico. Tale uso, pertanto, comprende anche un utilizzo interno per mezzo di creme o gel con applicatore o altri dispositivi medici, come i dispositivi spray.

I termini "prevenire", "trattare" o "migliorare" e termini simili usati nel presente documento includono la profilassi e il trattamento totale o parziale. I termini possono anche includere la riduzione dei sintomi, il miglioramento dei sintomi, la riduzione della gravit? dei sintomi, la riduzione dell'incidenza della malattia o qualsiasi altro cambiamento nelle condizioni del paziente che migliori l'esito terapeutico.

La dicitura ?essere umano? ricomprende il neonato, l?infante, l?adulto e l?anziano.

Descrizione dettagliata

La presente invenzione riguarda un nuovo uso di derivati lipofili dell?Epigallocatechina Gallato (EGCG), ottenuti funzionalizzando la molecola con catene di atomi da C-6 a C-20, preferibilmente da C-10 a C-18. Tali derivati lipofili permettono, oltre che di interagire efficacemente con sistemi lipidici, di avere una funzione antivirale.

Preferibilmente, la presente invenzione riguarda un secondo uso medico dei derivati lipofili dell?Epigallocatechina Gallato (EGCG). Rispetto all?EGCG non derivatizzato con catene di atomi da C-6 a C-20, le molecole derivatizzate proposte hanno una elevata affinit? per i bilayer lipidici e mostrano un effetto antivirale in quanto diminuiscono la replicazione dei

?

virus in genere, in particolare dei virus SARS-CoV-2, Herpes Simplex, Influenza B e HIV con un Indice di Selettivit? superiore a 10.

Nei derivati oggetto dell?invenzione la catena alchilica satura ? legata allo scheletro dell?EGCG tramite un linker etereo. Nelle molecole simili con funzione antivirale dell?arte nota, il linker che lega la catena carboniosa lipofila allo scheletro dell?EGCG ? estereo.

Rispetto ai derivati con legame etereo oggetto della presente invenzione, i derivati con legame estereo si degradano facilmente in vivo producendo un EGCG privo di coda lipofila.

All?instabilit? metabolica dei derivati esterei, che si verifica potenzialmente quando la molecola viene somministrata in vivo e viene trasformata nel precursore EGCG (rendendo inutile la derivatizzazione), si aggiunge un?instabilit? chimica nel momento in cui la molecola viene messa in soluzione, come evidenziato dalle analisi HPLC effettuate sul monoestere (v. Fig.2).

La molecola oggetto dell?invenzione ha la formula di

(I)

in cui R ? alchile, preferibilmente alchile lineare C6-C20, preferibilmente C10-C18

Le strutture rese senza la stereochimica indicata includono tutti i loro stereoisomeri, in qualsiasi rapporto (ovvero enantiomeri e diasteriomeri, loro miscele racemiche o qualsiasi miscela con qualsiasi eccesso

?

enantiomerico/diastereomerico)?

I composti dell?invenzione sono somministrati in una quantit? terapeuticamente efficace per l?essere umano e l?animale mammifero. In una forma di realizzazione preferita, i composti dell'invenzione sono somministrati per via orale o parenterale, sono anche contemplate altre forme di somministrazione come ad esempio creme o aerosol.

Per la somministrazione orale, la quantit? efficace di composti pu? essere somministrata, ad esempio, allo stato solido, semisolido, liquido o gassoso. Esempi specifici includono compresse, capsule, polveri, granuli, soluzioni, sospensioni, sciroppi ed elisir, aerosol e forme nebulizzate. Tuttavia, i composti non sono limitati a queste forme.

Per formulare i composti dell'invenzione in compresse, capsule, capsule molli, ovuli, polveri, granuli, soluzioni o sospensioni, emulsioni, emulsioni sprayzzabili, il composto viene preferibilmente miscelato con un legante, un agente disgregante e/o un lubrificante. Se necessario, la composizione risultante pu? essere miscelata con un diluente, un tampone, un agente infiltrante, un conservante e/o un aroma, utilizzando metodi noti. Esempi di leganti includono, ma non sono limitati a: cellulosa cristallina, derivati della cellulosa, amido di mais, ciclodestrine e gelatine. Esempi di agenti disgreganti includono ma non sono limitati a: amido di mais, fecola di patate e carbossimetilcellulosa. Esempi di lubrificanti includono ma non sono limitati a: talco e stearato di magnesio. Inoltre, possono essere usati anche altri additivi che sono usati convenzionalmente, come lattosio e mannitolo.

Per formulare i composti dell'invenzione in sospensioni, sciroppi o elisir, si pu? utilizzare un solvente farmaceuticamente adatto. Tra questi c'? l'esempio non limitativo dell'acqua.

I composti dell'invenzione possono anche essere usati insieme ad altri composti o composizioni aventi attivit? farmaceuticamente idonea.

I composti dell'invenzione possono anche essere somministrati sotto forma di aerosol o preparato per inalazione caricando i composti sotto forma di liquido o polvere fine, insieme ad un agente di nebulizzazione

???

gassoso o liquido e, se necessario, un agente ausiliario noto come un agente di gonfiaggio, in un contenitore non pressurizzato come un contenitore per aerosol o un nebulizzatore. Un gas pressurizzato, per esempio diclorofluorometano, propano o azoto, pu? essere usato come agente di spruzzatura.

I composti dell'invenzione possono anche essere somministrati sotto forma di creme, gel, lipogel o altro preparato adatto all?applicazione topica e mucosale, sulla pelle e sulle mucose interne ed esterne. Vantaggiosamente ma non limitatamente le formulazioni sono formulazioni liposomiali o nanoemulsioni o formulazioni in sistemi di trasporto con polimeri usati in ambito farmaceutico, ad esempio a base di acido poli(lattico-co-glicolico) (PLGA).

Le formulazioni in crema sono particolarmente adatte nel trattamento di infezioni da Herpes Simplex e le formulazioni nebulizzate sono particolarmente adatte come spray nasali per contrastare l?infezione da SARS-CoV-2.

I composti dell'invenzione possono essere somministrati ad un soggetto (essere umano o animale) che ne abbia bisogno per prevenire, trattare o migliorare le condizioni di un soggetto che ne abbia necessit? in modo da ottenere la riduzione dei sintomi, il miglioramento dei sintomi, la riduzione della gravit? dei sintomi, la riduzione dell'incidenza della malattia o qualsiasi altro cambiamento nelle condizioni del paziente che migliori l'esito terapeutico.

I composti dell'invenzione possono anche essere somministrati ad un soggetto (essere umano o animale) che ne abbia bisogno come additivo nutrizionale, sia come integratore alimentare che nutraceutico.

Le composizioni dell'invenzione possono comprendere un antiossidante in quantit? efficace per aumentare la stabilit? dei composti rispetto all'ossidazione o alla solubilit?.

La quantit? di composto dell'invenzione da somministrare ? qualsiasi quantit? adatta. L?esperto del ramo ? in grado di sviluppare particolari regimi di dosaggio per vari soggetti in base alla gravit? dell?affezione della

???

salute del paziente e della sua et?.

I composti dell?invenzione sono intesi preferibilmente per uso topico o aerosol, cio? sono destinati in particolare a cute o mucose (esterne o interne; dell?animale e dell?essere umano).

I derivati lipofili dell?EGCG secondo l?invenzione possono trovare largo impiego nel settore farmaceutico per il trattamento di infezioni virali.

Esempi non limitativi di infezioni virali includono infezioni da virus della famiglia adenoviridae, come l'adenovirus; virus della famiglia herpesviridae come herpes simplex, di tipo 1, herpes simplex, di tipo 2, virus varicella-zoster, virus epstein-barr, citomegalovirus umano, herpesvirus umano e di tipo 8; virus della famiglia papillomaviridae come il papillomavirus umano; virus della famiglia polyomaviridae come il virus BK e il virus JC; virus della famiglia poxviridae come il vaiolo; virus della famiglia hepadnaviridae come il virus dell'epatite B; virus della famiglia parvoviridae come il bocavirus umano e il parvovirus B19; virus della famiglia degli astroviridae come l'astrovirus umano; virus della famiglia caliciviridae come il norwalk virus; virus della famiglia picornaviridae come coxsackievirus, virus dell'epatite A, poliovirus e rhinovirus; virus della famiglia coronaviridae come il virus della sindrome respiratoria acuta; virus della famiglia flaviviridae come il virus dell'epatite C, il virus della febbre gialla, il virus della dengue e il virus west Nile, virus della famiglia togaviridae come il virus della rosolia; virus della famiglia hepeviridae come il virus dell'epatite E; virus della famiglia retroviridae come il virus dell'immunodeficienza umana (HIV); virus della famiglia orthomyxoviridae come il virus dell'influenza; virus della famiglia arenaviridae come guanarito virus, junin virus, lassa virus, machupo virus e sabi? virus; virus della famiglia bunyaviridae come il virus della febbre emorragica di Crimea-Congo; virus della famiglia filoviridae come il virus Ebola e il virus Marburg; virus della famiglia paramyxoviridae come virus del morbillo, virus della parotite, virus parainfluenzale, virus respiratorio sinciziale, metapneumovirus umano, virus hendra e virus nipah; virus della famiglia rhabdoviridae come il virus della rabbia; virus non assegnati come il virus dell'epatite D; e virus della famiglia reoviridae come rotavirus, orbivirus,

???

coltivirus e banna virus, tra gli altri.

I composti dell?invenzione sono stati saggiati attraverso i modelli cellulari robusti e rilevanti per ogni tipologia di virus. In particolare, Vero E6 (ATCC n? CRL-1586) per SARS-CoV-2, U87/CXCR4 (HIV reagent program n? ARP-4036) per HSV-1 e HIV, e MDCK (ATCC n? CRL-2935) per InfluB. La maggior parte degli studi riportati sull?efficacia di EGCG sono studi computazionali che, come ben noto all?esperto del ramo, sono solo indicativi di un?ipotesi di attivit?, che va confermata da successivi test sperimentali di efficacia. Sulla base dei nostri risultati, EGCG ha una efficacia limitata sulla replicazione virale di SARS-CoV-2 che risulta essere nettamente inferiore alle molecole individuate con la formula (I). La molecola proposta si caratterizza per un legame etereo in sostituzione dei legami esterei proposti dall?arte nota. Nello specifico, i composti recanti legami esterei sono proposti come profarmaci (molecole farmacologicamente inattive che possono attivarsi in vivo a causa di processi metabolici che subiscono per opera dell'organismo ospite). Vengono spesso usati i derivati esterei in quanto vengono facilmente idrolizzati dalle idrolasi che permettono di ?smascherare? la molecola attiva. Gli esperimenti da noi effettuati indicano che l?attivit? di EGCG non derivatizzato ? molto bassa e nettamente inferiore a quella degli eteri, conseguentemente non ha significato terapeutico utilizzare un profarmaco di una molecola con efficacia limitata.

Al contrario, i composti ottenuti secondo la presente invenzione permettono di contrastare i virus e si sono dimostrati particolarmente efficaci non solo nel contrastare l?infezione da SARS-CoV-2 ma sono attivi anche nei confronti di altri virus come HSV-1, HIV e influenza B. L?attivit? dei derivati eterei sembra infatti essere collegata alla capacit? delle catene ioalchiliche di ancorarsi saldamente alla membrana cellulare interferendo con il meccanismo di internalizzazione dei suddetti virus, ? pertanto necessario che la coda alifatica rimanga stabilmente legata alla porzione idrofilica polifenolica e la facilit? con cui gli esteri subiscono il cleavage della coda alifatica potrebbe impedire alla molecola di manifestare la sua efficacia.

???

La presente invenzione viene ora illustrata attraverso gli esempi seguenti che sono da considerare illustrativi e non limitativi della portata dell?invenzione.

ESEMPI

Sintesi di EGCG-C18

Ad una soluzione di EGCG (700 mg, 1.5 mmol) e K2CO3 (1.5 mmol) in dimetilformammide anidra (DMF) ? stato aggiunto lentamente l?opportuno ottadecil-ioduro (1.5 mmol) in cicloesano mantenendo la reazione in atmosfera inerte. La miscela di reazione ? stata riscaldata ad una temperatura di 40?C per 8 ore e successivamente liofilizzata dopo aggiunta di acqua. Il grezzo di reazione ? stato purificato per cromatografia su gel di silice (cicloesano-EtOAc,75:25) per isolare EGCG-C18 (0.8 mmol, 53%) (Fig. 1).

EGCG-C18: <1>H NMR (acetone, 400 MHz): ? = 0.87 (t, J= 7.4 Hz, 3H), 1.23-

1.32 (m, 30H), 1.34-1.45 (m, 1H), 1.67-1.76 (m, 1H), 2.97 (dd, J=2.4,

J=13.9), 3.03 (dd, J=3.9, J=13.9), 4.09 (t, J=2H), 5.05-5.07 (m, 1H), 5.50-

5.54 (m,1H), 6.01(d, J=2.35, 1H), 6.03(d, J=2.35, 1H), 6.62 (s, 2H), 7.00 (s,

2H).

<13>C NMR (acetone, 100 MHz): ? = 14.4, 23.4, 26.6, 32.7, 70.2, 73.3, 78.3,

95.0, 95.9, 96.5, 98.9, 106.8, 109.9, 126.2, 130.5, 133.5, 139.6, 146.6,

151.4, 157.1, 157.5, 157.9, 166.3.

ESI-MS: (m/z.) 823 [M<+ >CF3COO-].

Seguendo la stessa procedura ed utilizzando l?opportuno alchil-ioduro (esil-

ioduro e decil-ioduro) sono stati ottenuti EGCG-C6 ed EGCG-C10 (Fig.1).

EGCG-C6: <1>H NMR (acetone, 400 MHz): ? = 0.87 (t, J= 7.0, 3H), 1.26-1.33

(m, 6H), 1.38-1.42 (m, 1H), 1.67-1.74 (m, 1H), 2.95 (dd, J=2.8, J= 17.2, 1

H), 3.04 (dd, J=4.3, J= 17.2, 1 H), 4.08 (t, J=7.0, 2 H), 5.07-5.08 (m, 1H),

???

5.46-5.49 (m, 1H), 6.02 (d, J=2.3, 1H), 6.04 (d, J=2.3, 1H), 6.65 (s, 2H),

7.03 (s, 2H)

ESI-MS: (m/z.) 655 [M<+ >CF3COO-].

EGCG-C10: <1>H NMR (acetone, 400 MHz): ? = 0.87 (t, J= 7.0 Hz, 3H),1.21-

1.35 (m, 14H), 1.36-1.45 (m, 1H), 1.68-1.75 (m, 1H), 2.98-3.06 (m, 2H),

4.05-4.13(m, 2H), 5.05-5.10 (m, 1H), 5.37-5.42 (m, 1H), 6.0-6.05 (m, 2H),

6.64-6.70 (s, 2H), 7.03-7.08 (s, 2H).

ESI-MS: (m/z.) 711 [M<+ >CF3COO-].

-Colture cellulari

Le linee cellulari Vero E6 (african green monkey kidney; ATCC n? CRL-1586), MDCK (Madin-Darby canine kidney; ATCC n? CRL-2935) e U87/CXCR4 (engineered human glioma cell line; HIV reagent program n? ARP-4036 ) sono state coltivate in DMEM supplementato con siero fetale bovino al 10%, penicillina/streptomicina 100 U/ml e amminoacidi non essenziali (1%, v/v). Nelle U87/CXCR4 (HIV reagent program n? ARP-4036) sono stati aggiunti geneticina (300 ?g/ml) e puromicina (1 ?g/ml). Tutte le linee sono state mantenute in ambiente umidificato a 37?C e 5% CO2.

Stocks virali

L?isolamento di SARS-CoV-2 ? stato fatto sulle cellule Vero E6 (ATCC n? CRL-1586) partendo da un tampone nasofaringeo raccolto presso il Laboratorio di Virologia degli Ospedali Riuniti di Ancona. Per il materiale biologico di origine umana ? stato acquisito il consenso libero e informato della persona alla quale il materiale stesso ? stato prelevato secondo il Comitato Etico Regionale Marche (C.E.R.M.) per lo studio del 17/12/20.. Brevemente, 2x10<6 >cellule in sospensione sono state incubate con 500 ?l di tampone in un volume finale di 2 ml. Dopo un?incubazione di 1 ora a 37?C, sono stati aggiunti 4 ml di terreno di coltura e la sospensione ? stata

???

trasferita in una fiasca per colture cellulari da 25 cm<2>. Tre giorni dopo l'inoculazione, le colture cellulari sono state esaminate con un microscopio ottico per identificare i tipici effetti citopatici (CPE). Il virus isolato (2 ml) ? stato poi inoculato su cellule Vero E6 (ATCC n? CRL-1586) (4x10<6>) seminate il giorno precedente in fiasche da 75 cm<2 >in un volume finale di 13 ml per ottenere uno stock virale pi? grande. Il surnatante delle cellule infettate ? stato raccolto 3 giorni dopo l?infezione, centrifugato a 3000 rpm per 10 minuti, filtrato con filtri da 0.2 ?m, aliquotato e conservato a -80?C. L?isolamento del virus dell?influenza B e dell?herpes simplex di tipo 1 ? stato ottenuto come descritto sopra utilizzando rispettivamente le cellule MDCK (ATCC n? CRL-2935) e U87/CXCR4 (HIV reagent program n? ARP-4036 )

Lo stock virale di HIV, gi? presente in laboratorio e conservato a -80?C, ? stato ottenuto prelevando il surnatante 72 ore dopo una trasfezione di un plasmide (pNL4-3mod) nelle cellule eucariotiche TZM (engineered HeLa cell line) e contiene virus ricombinanti infettanti.

Titolazione degli stock virali

Per determinare le dosi infettanti il 50% delle colture cellulari (TCID50) le cellule (seminate 24 ore prima della titolazione in piastre da 96 pozzetti alla concentrazione di 2.6x10<4 >per pozzetto) sono state incubate con 50 ?l di stock virale (SARS-CoV-2, HSV-1 e InfluB) in diluizioni seriali in terreno di coltura (da 10<-1 >a 10<-8 >per sei volte) per 2 ore. Segue un lavaggio in PBS e l?aggiunta del terreno di coltura. Dopo 72h di incubazione ? stato utilizzato il metodo di Reed e Muench per calcolare le TCID50/ml per ogni stock virale.

Per quantificare le particelle virali di HIV ? stato utilizzato il dosaggio dell?antigene p24 (capside di HIV-1), mediante saggio immunoenzimatico in chemiluminescenza (sistema ARCHITECT, Abbott, USA).

Saggio di citotossicit? cellulare

Le cellule sono seminate in piastre da 96 pozzetti 24 ore prima dei trattamenti alla concentrazione di 1.3x10<4 >(Vero E6, ATCC n? CRL-1586 e MDCK, ATCC n? CRL-2935) e 2.6x10<4 >(U87/CXCR4, HIV reagent

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program n? ARP-4036). Successivamente le cellule sono state sottoposte ad un trattamento con diluizioni seriali dei composti in esame (EGCG-C6, EGCG-12 e EGCG-C18) in terreno DMEM completo ogni 24 ore per 72 ore. La vitalit? cellulare ? stata determinata utilizzando il saggio MTT il quale prevede l?utilizzo del sale 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro, cromogeno di colore giallo solubile in acqua che viene convertito in formazano insolubile e di colore blu-violaceo in una reazione catalizzata da enzimi mitocondriali ed in particolare dalla succinato deidrogenasi. L?enzima mitocondriale succinato deidrogenasi ? attivo, infatti, soltanto nelle cellule vive, permettendo quindi di determinare la vitalit? cellulare a seguito di un determinato trattamento. Nel giorno dell?analisi, il terreno di coltura viene sostituito con terreno fresco contenente il reattivo MTT in modo tale da avere una concentrazione finale nel pozzetto di 0.2 mg/ml. I campioni vengono lasciati ad incubare per 4 ore a 37 ?C, in un?atmosfera al 5 % di CO2. Al termine dell?incubazione, viene aggiunto ad ogni pozzetto 0.2 ml di dimetilsulfossido (DMSO) per solubilizzare il colorante. La densit? ottica (OD), misurata spettrofotometricamente ad una lunghezza d?onda pari a 570 nm, ? direttamente proporzionale alla concentrazione di formazano ed ? quindi espressione della vitalit? cellulare.

La OD nel gruppo di controllo (cellule non trattate) ? stata considerata come il 100% di vitalit?. Ogni prova ? stata effettuata in triplicato e per tre volte. Il grado di vitalit? cellulare e quindi il grado di tossicit? del composto testato, ? esprimibile con la seguente formula:

(OD570 nm dei campioni trattati)/(OD570 nm campioni non trattati) X 100 la concentrazione in grado di ridurre del 50% la vitalit? cellulare (CC50) ? stata calcolata mediante un?analisi di regressione non lineare (Tabella 1).

???

Tabella 1

Saggio di efficacia dei composti in vitro

Le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti 24 ore prima dei trattamenti alla concentrazione di 1.3x10<4 >(Vero E6, ATCC n? CRL-1586 e MDCK, ATCC n? CRL-293) e 2.6x10<4 >(U87/CXCR4, HIV reagent program n? ARP-4036). Una volta aspirato il surnatante, le cellule sono state sottoposte ad un pre-trattamento con diluizioni seriali (1:2) dei composti partendo da una concentrazione di 80 ?M per 24 ore. Successivamente, le cellule sono state infettate con 100TCD50 di stock virale in 50 ?l (SARS-CoV-2, HSV-1 e InfluB) o con 400 di antigene p24 in 50 ?l (HIV) per 2 ore a 37?C. Dopo un lavaggio con PBS le cellule sono state di nuovo trattate con i composti come precedentemente descritto. Dopo 24 e 48 ore, i surnatanti sono stati raccolti per l?estrazione dell?RNA virale di SARS-CoV-2 e InfluB o DNA virale di HSV-1 (Fig. 3, 4, 6, 7, 8). Le particelle virali di HIV producono la proteina di fusione GFP-NEF che rende le cellule infettate fluorescenti dopo 24 e 48 ore (Fig. 9).

Saggio per valutare l?effetto virucida dei composti in vitro Diluizioni seriali (1:2) dei composti EGCG e EGCG-C18 sono state incubate con 100 TCID50 per pozzetto di stock virale di SARS-CoV-2 per 10 minuti. Le cellule Vero E6 (ATCC n? CRL-1586), seminate 24 ore prima

? ?

dei trattamenti in piastre da 96 pozzetti alla concentrazione di 2.6x10<4>, sono state quindi infettate con tale sospensione per 2 ore a 37 ?C. Dopo un lavaggio con PBS le cellule sono state incubate per 48 ore con il terreno di coltura e i surnatanti sono stati raccolti per l?estrazione dell?RNA virale (Fig. 5).

Estrazione genoma virale e quantificazione mediante Real-Time PCR La piattaforma automatizzata QIAsymphony (QIAGEN, Hilden, Germania) ? stata utilizzata per estrarre il genoma virale dai surnatanti utilizzando il kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi utilizzando le istruzioni del produttore. La Real-Time PCR quantitativa ? stata eseguita sullo strumento Applied BiosystemsTM7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Per la Real-Time PCR di SARS-CoV-2 ? stato utilizzato un kit commerciale di primer e sonde (DNA integrato Technologies, cat# 10006770), utilizzando il protocollo emesso dal CDC. La quantificazione in copie virali su ml di surnatante (cps/ml) ? stata ottenuta mediante l?utilizzo di una curva di calibrazione utilizzando diluizioni seriali (da 10<5 >a 10<2 >cps/rct) dello standard internazionale del WHO per l?RNA di SARS-CoV-2 (cat# 20/146), acquistato dal National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC).

Per la Real-Time PCR di HSV-1 e InfluB sono stati utilizzati primers e sonde specifiche per ciascun genoma virale mediante una metodica ?home-made?. La quantificazione in cps/ml ? stata ottenuta mediante l?utilizzo di una curva di calibrazione utilizzando diluizioni seriali di plasmidi ?home-made? contenenti geni specifici.

La valutazione della capacit? replicativa dell?HIV espressa in valori di fluorescenza relativa (VFR) ? stata ottenuta tramite la lettura della fluorescenza mediante lo strumento Fluoroskan Ascent (Thermo scientific), un fluorimetro per micropiaste.

Analisi statistica

Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando GraphPad Prism (Versione 8.4.2, Graphpad Software,San Diego, CA, USA).

? ?

La concentrazione inibente il 50% della carica virale (IC50) (Fig. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9) e la concentrazione in grado di ridurre del 50% la vitalit? cellulare (CC50) ? stata calcolata mediante un?analisi di regressione non lineare (Tabella 1).

La percentuale di riduzione della replicazione virale ? stata calcolata come la percentuale del rapporto fra il numero delle copie virali del trattato e del controllo non trattato. La significativit? statistica ? stata verificata con un ttest.

L?indice di selettivit? (SI) ? stato calcolato come il rapporto tra IC50 e CC50 (Tabella 1).

Risultati e discussione

I derivati lipofili dell?Epigallocatechina Gallato (EGCG) sono stati sintetizzati legando catene sature di atomi di lunghezza C-6, C-10 e C-18 allo scheletro dell?EGCG in posizione 4? tramite un linker etereo. (Fig.1). La presenza della coda alchilica aumenta l?affinit? della molecola nei confronti dei bilayer lipidici rispetto alla molecola EGCG non derivatizzato (doi.org/10.3390/antiox9030208).

I derivati lipofili mostrano un effetto antivirale in quanto diminuiscono la replicazione dei virus testati come SARS-CoV-2, Herpes Simplex, Influenza B e HIV con un Indice di Selettivit? superiore a 10 nella maggior parte dei casi (Fig. 3-9, Tabella 1). Per valutarne l?efficacia in vitro, tali derivati sono stati incubati 24 ore sul monostrato cellulare. Le cellule sono state successivamente infettate e la replicazione virale ? stata valutata dopo 48 ore. L?efficacia sembra essere correlata alla lunghezza della coda alchilica. In generale, i derivati EGCG-C10 e EGCG-C18 mostrano una maggiore capacit? di ridurre la replicazione virale con valori di IC50 nettamente inferiori rispetto a EGCG-C6 e EGCG. L?attivit? dei derivati eterei sembra quindi essere collegata alla capacit? delle catene alchiliche di ancorarsi saldamente alla membrana cellulare interferendo con il meccanismo di internalizzazione dei suddetti virus. A sostegno di questo meccanismo di azione, sia EGCG che C18-EGCG non mostrano alcun effetto virucida nei confronti del SARS-CoV-2 (Fig. 5); infatti, il virus pre-

???

incubato con questi composti non perde la sua capacit? di infettare il monostrato cellulare e non riduce la sua capacit? replicativa

A tal scopo ? pertanto necessario che la coda alifatica rimanga stabilmente legata alla porzione idrofilica polifenolica e la facilit? con cui i corrispondenti derivati esteri subiscono il cleavage della coda alifatica potrebbe impedire alla molecola di manifestare la sua efficacia (Fig.2).

Edaravone-C18, un antiossidante lipofilo da noi sintetizzato che contiene una catena di 18 atomi di C analoga a EGCG-C18, non mostra alcuna capacit? di inibire la replicazione di SARS-CoV-2 nemmeno alle elevate concentrazioni testate (Fig. 6). Questo risultato dimostra come l?effetto antivirale osservato per i derivati EGCG lipofili non sia legato esclusivamente alla presenza di una lunga catena satura alchilica ma alla struttura della molecola in toto.

???

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Epigallocatechina Gallato di formula (I)

in cui R ? alchile C6-C20, per l'uso nella terapia delle infezioni virali nell?animale e nell?uomo.
2. Epigallocatechina Gallato per l?uso secondo la rivendicazione precedente in cui R ? alchile C10-C18.
3. Epigallocatechina Gallato per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-2 in cui R ? scelto fra C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20.
4. Epigallocatechina Gallato per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3 in cui R ? una catena alchilica lineare.
5. Epigallocatechina Gallato per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4 in cui l?infezione virale ? scelta nel gruppo di: infezioni da virus della famiglia adenoviridae, come l'adenovirus; virus della famiglia herpesviridae come herpes simplex, di tipo 1, herpes simplex, di tipo 2, virus varicella-zoster, virus epstein-barr, citomegalovirus umano, herpesvirus umano e di tipo 8; virus della famiglia papillomaviridae come il papillomavirus umano; virus della famiglia polyomaviridae come il virus BK e il virus JC; virus della famiglia poxviridae come il vaiolo; virus della famiglia hepadnaviridae come il virus dell'epatite B; virus della famiglia parvoviridae come il bocavirus umano e il parvovirus B19; virus della famiglia degli astroviridae come l'astrovirus umano; virus della famiglia caliciviridae come il norwalk virus; virus della famiglia picornaviridae come coxsackievirus, virus dell'epatite A, poliovirus e rhinovirus; virus della famiglia coronaviridae come il virus della sindrome respiratoria acuta; ??? virus della famiglia flaviviridae come il virus dell'epatite C, il virus della febbre gialla, il virus della dengue e il virus west Nile, virus della famiglia togaviridae come il virus della rosolia; virus della famiglia hepeviridae come il virus dell'epatite E; virus della famiglia retroviridae come il virus dell'immunodeficienza umana (HIV); virus della famiglia orthomyxoviridae come il virus dell'influenza; virus della famiglia arenaviridae come guanarito virus, junin virus, lassa virus, machupo virus e sabi? virus; virus della famiglia bunyaviridae come il virus della febbre emorragica di Crimea-Congo; virus della famiglia filoviridae come il virus Ebola e il virus Marburg; virus della famiglia paramyxoviridae come virus del morbillo, virus della parotite, virus parainfluenzale, virus respiratorio sinciziale, metapneumovirus umano, virus hendra e virus nipah; virus della famiglia rhabdoviridae come il virus della rabbia; virus non assegnati come il virus dell'epatite D; e virus della famiglia reoviridae come rotavirus, orbivirus, coltivirus e banna virus.
6. Epigallocatechina Gallato per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4 in cui l?infezione virale ? scelta tra: infezione da SARS-CoV-2, Herpes Simplex di tipo 1, HIV.
7. Composizione comprendente Epigallocatechina Gallato di formula (I) per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6.
8. Composizione per l?uso secondo la rivendicazione precedente formulata in forma di compresse, capsule, capsule molli, ovuli, polveri, granuli, soluzioni, sospensioni, emulsioni, emulsioni sprayzzabili, creme, gel, lipogel, formulazioni liposomiali, polimeriche, nanoemulsioni, formulazioni nebulizzate e aerosol.
9. Composizione per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 7-8 precedente per applicazione topica sulla pelle e sulle mucose interne ed esterne.
10. Composizione secondo la rivendicazione precedente per somministrazione sotto forma di aerosol o preparato per inalazione sotto forma di liquido o polvere, preferibilmente insieme ad un agente di nebulizzazione gassoso o liquido e preferibilmente con un agente ??? ausiliario come un agente di gonfiaggio o un agente nebulizzante.
11. Composto o composizione secondo le rivendicazioni precedenti in cui le infezioni virali sono scelte fra SARS-CoV-2, InfluB, HSV-1 e HIV. ???