IT202100019616A1 - Nuovo metodo - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
Annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo
?Nuovo metodo?
CAMPO DELL?INVENZIONE
La presente invenzione descrive un metodo immunologico per rilevare la presenza degli anticorpi specifici della malattia celiaca estratti da un campione bioptico intestinale ottenuto da un soggetto con sospetto clinico di malattia celiaca.
STATO DELL?ARTE
La celiachia ? una malattia autoimmune glutine-dipendente che pu? presentarsi con sintomi gastrointestinali come la diarrea, la distensione addominale e/o extra-intestinali come arresto della crescita, anemia, osteopenia, artralgie, infertilit?. Interessa l?1-2% della popolazione generale con percentuali pi? elevate tra i gruppi a rischio come familiari di primo grado (8%), soggetti con malattie autoimmuni (4-6%). La diagnosi pu? essere facilmente eseguita per mezzo di un dosaggio degli autoanticorpi anti-transglutaminasi (anti-ttg) e anti-endomisio (EMA) nel sangue, che sono i marcatori specifici e sensibili universalmente utilizzati nella pratica clinica per la diagnostica della celiachia.
Tuttavia, in circa il 10% dei soggetti, i sintomi sono sfumati (dolori addominali ricorrenti) e la diagnosi rimane dubbia perch?, nonostante la positivit? degli auto-anticorpi nel sangue, la biopsia intestinale non mostra il classico quadro di atrofia dei villi che caratterizza la malattia. In questi soggetti il sospetto di celiachia pu? essere confermato o negato con certezza mediante la ricerca degli auto-anticorpi nella mucosa intestinale che ? la sede della produzione di questi anticorpi.
Inoltre, la ricerca di questi anticorpi nella mucosa intestinale ? la chiave diagnostica per risolvere i casi sintomatici con predisposizione genetica alla celiachia, in cui gli auto-anticorpi nel sangue sono assenti o presentano concentrazioni positive molto basse tali da lasciare dubbi sul loro reale valore diagnostico.
Attualmente, questi auto-anticorpi possono essere identificati attraverso due metodiche:
1. gli anti-ttg nella mucosa intestinale sono identificati tramite una metodica complessa d?immunofluorescenza diretta, con doppia colorazione su sezioni congelate di biopsia intestinale, che necessita di attrezzature e supporto informatico al microscopio a fluorescenza per l?elaborazione dell?immagine della doppia colorazione, e operatori esperti.
2. gli EMA sono identificati con la metodica EMA-biopsy che necessita di attrezzature di laboratorio, di personale esperto e di un lungo tempo di incubazione (72 ore a 37?C) in presenza di frazioni solubili di gliadina per favorire il rilascio degli EMA. Dopo 72 ore, il liquido di coltura viene centrifugato e raccolto per essere analizzato con la tecnica d?immunofluorescenza indiretta su sezioni sottili di esofago di scimmia.
Di fatto ? necessaria una metodica analitica affidabile, di facile e rapida esecuzione per la determinazione degli auto-anticorpi intestinali della celiachia in modo che ogni unit? di gastroenterologia sia in grado di completare autonomamente il percorso diagnostico della malattia celiaca in tutte le forme cliniche e biologiche con cui si presenta.
SOMMARIO DELL?INVENZIONE
Un primo aspetto della presente invenzione riguarda un metodo in vitro per valutare la presenza in un individuo della malattia celiaca. In una forma di attuazione, detto metodo comprende le seguenti fasi:
a) frammentare almeno un campione bioptico intestinale ottenuto dall?individuo,
b) mettere in contatto l?almeno un campione ottenuto dalla fase a) con almeno una transglutaminasi umana,
c) rilevare il legame di almeno un anticorpo anti-transglutaminasi nel campione con l?almeno una transglutaminasi umana,
dove il legame di almeno un anticorpo con l?almeno una transglutaminasi umana indica la positivit? dell?individuo alla malattia celiaca.
Un secondo aspetto della presente invenzione riguarda un kit comprendente un supporto, il quale comprende almeno una transglutaminasi umana.
Un terzo aspetto della presente invenzione riguarda l?uso del kit sopra descritto per la rilevazione in vitro della presenza di almeno un anticorpo anti-transglutaminasi.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
La Figura 1 mostra un test eseguito con il metodo della presente invenzione dove: il test ha dato un esito di forte positivit? (Fig. 1 A, linea rossa), un esito di debole positivit? (1B, linea rossa) ed un esito negativo (1C, assenza della linea rossa) per gli anti-ttg intestinali.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
Un primo aspetto della presente invenzione riguarda un metodo in vitro per valutare la presenza in un individuo della malattia celiaca. In una forma di attuazione, detto metodo comprende le seguenti fasi:
a) frammentare almeno un campione bioptico intestinale ottenuto dall?individuo,
b) mettere in contatto l?almeno un campione ottenuto dalla fase a) con almeno una transglutaminasi umana,
c) rilevare il legame di almeno un anticorpo anti-transglutaminasi nel campione con l?almeno una transglutaminasi umana,
dove il legame di almeno un anticorpo con l?almeno una transglutaminasi umana indica la positivit? dell?individuo alla malattia celiaca.
In una forma di realizzazione, detta almeno una transglutaminasi umana ? la transglutaminasi di tipo 2, detta transglutaminasi umana di tipo 2 corrisponde alla SEQ ID NO: 1 riportata in Tabella 1.
Detta almeno una transglutaminasi umana ? preferibilmente utilizzata come proteina ricombinante oppure purificata/isolata.
Preferibilmente, in questo contesto, ci si riferisce all?uso dell?intera proteina transglutaminasi umana, oppure a omologhi, analoghi, varianti, derivati, frammenti della proteina transglutaminasi umana.
In una ulteriore forma di realizzazione dell?invenzione, detta almeno una transglutaminasi umana ? sintetizzata tramite le tecniche convenzionali per la sintesi di proteine note al tecnico esperto. Per esempio, la proteina pu? essere sintetizzata tramite sintesi chimica utilizzando la sintesi peptidica su fase solida.
In una ulteriore forma di realizzazione dell?invenzione, la proteina transglutaminasi umana ? isolata o purificata con metodi noti al tecnico del ramo. Per esempio, la transglutaminasi umana pu? essere purificata con metodi cromatografici (filtrazione-gel, scambio ioni e immunoaffinit?), tramite cromatografia liquida ad alta efficienza (HPLC, RP-HPLC, HPLC a scambio ionico, size-exclusion HPLC) o tramite precipitazione (immunoprecipitazione). Alternativamente, la transglutaminasi umana pu? essere prodotta con tecniche di DNA ricombinante note al tecnico esperto del ramo.
Tabella 1
In una forma di attuazione, l?almeno un anticorpo anti-transglutaminasi appartiene alla classe IgA e/o IgG. In altre parole, il metodo della presente invenzione consente di rivelare la presenza di almeno un anticorpo antitransglutaminasi appartenete alla classe IgA e/o appartenete alla classe IgG. Preferibilmente il metodo permette di rilevare la presenza sia di almeno un anticorpo appartenente alla classe IgA che di almeno un anticorpo appartenente alla classe IgG.
In una forma di realizzazione, l?almeno un campione bioptico ? ottenuto da una pluralit? di prelievi di tessuto intestinale dall?individuo, preferibilmente da almeno due prelievi di tessuto intestinale in almeno due punti dell?intestino diversi tra loro. Preferibilmente, l?almeno un campione bioptico ? ottenuto dal bulbo duodenale e/o dal duodeno distale.
In una forma di attuazione dell?invenzione, il campione ottenuto dalla fase a) viene messo in contatto con la transglutaminasi di tipo 2 umana ricombinante in un test di immunodiffusione. Il test di immunodiffusione ? scelto tra i test di immunodiffusione noti al tecnico del settore.
Il test di immunodiffusione permette la rilevazione del legame tra la transglutaminasi di tipo 2 umana ricombinante e almeno un anticorpo antitransglutaminasi nel campione tramite una reazione colorimetrica visibile. In altre parole, la presenza di almeno un anticorpo anti-transglutaminasi nel campione determina la formazione di un immuno precipitato visibile che pu? essere rilevato nella fase c). La rilevazione avviene tramite osservazione e valutazione della presenza di un precipitato. In una forma di realizzazione, nella fase c) la rilevazione del legame tra almeno un anticorpo e l?almeno una transglutaminasi umana avviene per osservazione diretta, ovvero per osservazione ad occhio nudo e/o con l?ausilio di uno strumento noto al tecnico del settore per rilevare e/o quantificare una reazione colorimetrica.
Preferibilmente, il test di immunodiffusione ? in grado di rilevare la presenza di almeno un anticorpo anti-transglutaminasi appartenete alla classe IgA e/o appartenete alla classe IgG in un?unica reazione colorimetrica. In particolare, il metodo ? in grado di rilevare autoanticorpi anti transglutaminasi umana, ovvero anticorpi prodotti dallo stesso individuo e che sono in grado di legare la transglutamminasi di tipo 2 dell?individuo stesso.
In una forma di realizzazione, nella fase a) il campione viene immerso in una soluzione salina, preferibilmente una soluzione salina fosfato senza calcio e senza magnesio prima di essere frammentato. Preferibilmente, dove nella fase a) il campione viene frammentato per un tempo compreso tra 3 e 10 minuti, pi? preferibilmente viene frammentato fino ad ottenere un liquido biologico. Preferibilmente, il campione viene frammentato meccanicamente utilizzando un pestello od un altro strumento manuale e/o automatico noto al tecnico del settore.
La Richiedente ha sorprendentemente scoperto che il metodo sopra dettagliatamene descritto permette la ricerca simultanea degli anticorpi IgA e IgG anti-transglutaminasi direttamente dalle biopsie intestinali, principalmente grazie all?utilizzo della transglutaminasi umana tipo 2 come antigene in sostituzione del tessuto di esofago di scimmia necessario per la metodica EMA-biopsy.
Inoltre, il metodo della presente invenzione permette una riduzione drastica del tempo per la determinazione di questi anticorpi; infatti, in circa 20 minuti ? possibile ottenere i risultati degli anticorpi antitransglutaminasi intestinali, rispetto alle oltre 72 ore del test EMA-biopsy. Di fatto, gi? alla fine dell?esame endoscopico il metodo rivela se il paziente produce gli anticorpi anti-transglutaminasi intestinali e facilita la diagnosi della malattia celiaca.
Infatti, dalla frammentazione meccanica del campione dell?individuo, preferibilmente di almeno una biopsia, si liberano gli anticorpi antitransglutaminasi senza la necessit? di un laboratorio e di apparecchiature (es. termostato, centrifughe), di lunghe incubazioni e senza l?utilizzo di attivatori antigenici (frammenti di gliadina) che al contrario sono necessari per i test attualmente in uso.
Inoltre, grazie all?utilizzo di almeno due prelievi di tessuto intestinale in almeno due punti dell?intestino diversi tra loro si ottiene una maggiore sensibilit? del metodo.
Un secondo aspetto della presente invenzione riguarda un kit che comprende un supporto, il quale comprende almeno una transglutaminasi umana. Preferibilmente, detta almeno una transglutaminasi umana ? la transglutaminasi di tipo 2, preferibilmente ? la transglutaminasi umana di tipo 2, detta transglutaminasi umana di tipo 2 corrisponde alla SEQ ID NO: 1 riportata in Tabella 1. In una forma di realizzazione preferita, detto supporto ? composto da un materiale scelto tra: cellulosa, nitrocellulosa o nylon, preferibilmente ? composto da nitrocellulosa.
Un terzo aspetto della presente invenzione riguarda l?uso del kit sopra dettagliatamente descritto per la rilevazione in vitro della presenza di almeno un anticorpo anti-transglutaminasi.
ESEMPIO
La presente metodologia identifica rapidamente gli anticorpi antitransglutaminasi di classe IgA e IgG direttamente nelle biopsie intestinali subito dopo il loro prelievo a livello del bulbo duodenale e del duodeno distale. In particolare, la biopsia viene immersa in 400 microlitri di soluzione salina fosfato di Dulbecco senza calcio e magnesio a pH 7.3, e frammentata per 5 minuti mediante l?ausilio di un pestello. Al temine della frammentazione, si ottiene un liquido biologico.
Alcune gocce del liquido biologico ottenuto, circa 90 microlitri, sono stati utilizzati per mettere in evidenza in maniera simultanea le IgA e le IgG anti-transglutaminasi mediante test rapido d?immunodiffusione, che d? una risposta in circa 15 minuti. Il test rapido di immunodiffusione comprende la transglutaminasi umana di tipo 2 come auto-antigene.
La positivit? ? rappresentata da una banda rossa nella finestra T (Figura 1), mentre la banda azzurra nella finestra C, indica il funzionamento del test e per questo deve essere sempre presente. La lettura dei risultati avviene a occhio nudo. La presenza di una banda rossa intensa nella finestra T indica una positivit? per alte concentrazioni degli anti-ttg intestinali(Figura 1A), mentre una banda di colore rosso debole indica una debole concentrazione degli anti-ttg intestinali (Figura 1B). Gli anti-ttg intestinali hanno un elevato valore predittivo positivo per la presenza della malattia celiaca. L?assenza di bande nella finestra T (fondo bianco) indica l?assenza di anti-ttg intestinali. Quest?ultimo risultato ha un elevato valore predittivo negativo per la presenza della malattia celiaca (Figura 1C).
Claims (12)
1. Un metodo per valutare in vitro la presenza in un individuo della malattia celiaca, comprendente le seguenti fasi:
a) frammentare almeno un campione bioptico intestinale ottenuto dall?individuo,
b) mettere in contatto l?almeno un campione ottenuto dalla fase a) con almeno una transglutaminasi umana,
c) rilevare il legame di almeno un anticorpo nel campione con l?almeno una transglutaminasi umana,
dove il legame di almeno un anticorpo con l?almeno una transglutaminasi umana indica la positivit? dell?individuo per la malattia celiaca.
2. Il metodo secondo la rivendicazione 1, dove l?almeno una transglutaminasi umana ? la transglutaminasi umana di tipo 2.
3. Il metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, dove l?almeno un anticorpo anti-transglutaminasi appartiene alla classe IgA e/o IgG.
4. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, dove l?almeno un campione bioptico ? ottenuto da almeno due prelievi di tessuto intestinale in almeno due punti dell?intestino diversi tra loro.
5. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, dove l?almeno un campione bioptico ? ottenuto dal bulbo duodenale e/o dal duodeno distale.
6. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, dove il campione ottenuto dalla fase a) viene messo in contatto con l?almeno una proteina in un test di immunodiffusione.
7. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6, dove nella fase a) il campione viene immerso in una soluzione salina prima di essere frammentato.
8. Il metodo secondo la rivendicazione 7, dove nella fase a) il campione viene frammentato fino ad ottenere un liquido biologico.
9. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8, dove nella fase a) il campione viene frammentato meccanicamente.
10. Un kit per immunodiffusione comprendente un supporto che comprende almeno una tran-glutaminasi umana, dove detto supporto ? composto da un materiale scelto tra: cellulosa, nitrocellulosa e nylon, preferibilmente da nitrocellulosa.
11. Il kit secondo la rivendicazione 10, dove almeno una transglutaminasi umana e la transglutaminasi umana di tipo 2.
12. Uso del kit secondo la rivendicazione 10 o 11 per la rilevazione in vitro della presenza di almeno un anticorpo anti-transglutaminasi intestinale.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| IT102021000019616A IT202100019616A1 (it) | 2021-07-23 | 2021-07-23 | Nuovo metodo |
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| EP1978364A1 (en) * | 2007-04-06 | 2008-10-08 | N-Zyme BioTec GmbH | Transglutaminase 6 as a diagnostic indicator of autoimmune diseases |
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-
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1978364A1 (en) * | 2007-04-06 | 2008-10-08 | N-Zyme BioTec GmbH | Transglutaminase 6 as a diagnostic indicator of autoimmune diseases |
| US20130196336A1 (en) * | 2007-04-06 | 2013-08-01 | Marios Hadjivassilliou | Transglutaminase 6 as a diagnostic indicator of autoimmune diseases |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4123306A1 (en) | 2023-01-25 |
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