IT202100001463A1 - Peptidi per l’inibizione dell’angiogenesi - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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-
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Description
PEPTIDI PER L?INIBIZIONE DELL?ANGIOGENESI
DESCRIZIONE
CAMPO DELL?INVENZIONE
La presente invenzione pertanto concerne peptidi di origine sintetica e biologicamente attivi nell?inibizione del legame tra i recettori VEGFR-1 e VEGFR-2 e i loro ligandi, ed il loro uso come medicamento.
Viene inoltre descritto l?uso come medicamento di una composizione farmaceutica comprendente uno o pi? di tali peptidi, uguali o diversi tra loro.
I peptidi e le composizioni farmaceutiche trovano inoltre applicazione nella prevenzione delle patologie tumorali, dell?angiogenesi e della neovascolarizzazione.
STATO DELLA TECNICA
I recettori del fattore di crescita vascolare endoteliale strettamente coinvolti nella formazione di nuovi vasi del sangue, VEGFR-1 (anche conosciuto come Flt-1) e VEGFR-2 (anche conosciuto come KDR) sono entrambi riconosciuti dal fattore di crescita vascolare endoteliale A (VEGF-A), che gioca un ruolo centrale nell?angiogenesi. Gli altri due membri pro-angiogenici della famiglia del VEGF, il fattore di crescita placentale (PlGF) ed il VEGF-B, interagiscono specificamente con il VEGFR-1 ( Experimental Molecular Medicine 44:1-9). Il legame dei fattori ai recettori induce la dimerizzazione del recettore con conseguente autofosforilazione ed attivazione del signaling intracellulare.
Numerosi dati, sia di inattivazione genica che di uso di inibitori dei ligandi o dei recettori della famiglia del VEGF hanno evidenziato come l?inibizione dell?attivazione dei due VEGFRs si traduca in una potente inibizione della neoangiogensi patologica in diversi contesti, quali il cancro e le malattie neovascolari dell?occhio, in particolare la degenerazione maculare senile e la retinopatia diabetica ( The Korean Journal of Internal Medicine 29: 1-11).
Il blocco specifico del VEGF-A mediante l?uso di un anticorpo neutralizzante (bevacizumab) che previene l?attivazione del VEGFR-2 ed in parte del VEGFR-1, ha rappresentato la prima strategia di terapia anti-angiogenica approvata per la cura del cancro ( New England Journal of Medicine 350:23352342). Il secondo approccio efficace sempre per la terapia del cancro ? rappresentato dall?utilizzo di inibitori dei recettori tirosina-chinasi (TKI) (ad esempio sorafenib e sunitinib) capaci di bloccare l?attivazione di entrambi i recettori del VEGF, e contemporaneamente di altri recettori data la generale bassa specificit? dei TKI che riconoscono seppur con diverse affinit? pi? di un recettore (
New England Journal of Medicine 356:125-134; 2006 J Clin Oncol 24:16-24).
Per quel che concerne la terapia anti-angiogenica nelle malattie neovascolari dell?occhio, il frammento Fab del bevacizumab (ranibizumab) ? stato approvato per la terapia della forma umida della degenerazione maculare senile (Rosenfeld PJ, et al. 2006, New England Journal of Medicine 355:1419-1431). Successivamente, l?anticorpo intero ? stato utilizzato per lo stesso fine terapeutico, in un primo momento in modo off-label, poi approvato in maniera ufficiale CATT Research Group, Martin DF, et al. 2011, New England Journal of Medicine 364:1897-1908). Pi? di recente un nuovo farmaco (aflibercept), costituito da una proteina ricombinante composta da due domini della porzione extracellulare dei recettori VEGFR-1 e VEGFR-2 responsabili del legame ai ligandi VEGF-A, VEGF-B e PlGF, fusi alla porzione Fc di IgG1 umana, ed efficace nel prevenire l?interazione dei tre ligandi con i due recettori VEGFR-1 e VEGFR-2, ? stato approvato per la terapia della forma umida della degenerazione maculare senile (Heier JS, et al. 2012, Ophthalmology 119:2537-2548).
Inoltre, diversi studi clinici hanno evidenziato la capacit? terapeutica di queste molecole anche in altri contesti patologici oculari, quali la retinopatia da occlusione della vena centrale, la retinopatia diabetica, la retinopatia del prematuro (Diabetic Retinopathy Clinical Research Network, Wells JA, et al.2015, New England Journal of Medicine 372:1193-203; Mintz-Hittner HA, et al.; BEATROP Cooperative Group.
2011, New England Journal of Medicine 364:603-615). Tutti e tre i farmaci, bevacizumab, ranibizumab ed aflibercept sono somministrati mediante iniezione intravitreale.
L?approvazione di questi farmaci ha definitivamente validato i tre membri proangiogenici della famiglia del VEGF ed i due relativi recettori come target preferenziali per la terapia anti-angiogenica.
Visto l?elevato numero di patologie che richiedono di prevenire l?attivazione dei recettori VEGFR-1 e VEGFR-2, ? prevedibile una forte richiesta di inibitori dell?interazione ligando recettore. I farmaci attualmente disponibili, essendo di origine biologica, possono presentare lo svantaggio della contaminazione risultante dalle fasi di preparazione, oltre ad avere costi di produzione elevati.
Scopo della presente invenzione ? pertanto lo sviluppo di peptidi sintetici adatti ad interferire nell?interazione tra i ligandi VEGF-A, VEGF-B e PLGF, ed i due recettori VEGFR-1 e VEGFR-2, che non presentano gli svantaggi noti per i farmaci attualmente disponibili.
SOMMARIO DELL?INVENZIONE
La presente invenzione pertanto concerne peptidi di origine sintetica e biologicamente attivi nell?inibizione del legame tra i recettori VEGFR-1 e VEGFR-2 e i loro ligandi, e conseguentemente della cascata di reazioni risultante da tale legame.
I peptidi dell?invenzione sono capaci di prevenire l?interazione VEGF-A/VEGFR-2 con una IC50 di circa 10 ?M e l?interazione tra VEGF-A e VEGFR-1, nonch? quella tra PlGF e VEGFR-1, con una IC50 di poco inferiore ai 20 ?M.
L?attivit? dei composti ? stata valutata in saggi su cellule primarie endoteliali in coltura, dove sono in grado di prevenire la fosforilazione del VEGFR-1 e VEGFR-2 indotta da VEGF-A, nonch? la formazione di strutture simili ai capillari indotta da VEGF-A. In vivo, i peptidi sono in grado di inibire l?angiogenesi nel modello murino della neovascolarizzazione della coroide indotta da laser, che ricapitola la degenerazione maculare senile umida dell?uomo.
In un primo aspetto, la presente invenzione pertanto concerne un peptide o suoi sali, detto peptide avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO:1 e la formula generale (I):
{{{[Y1 ? R-Glu ? S-Cys(Bzl) ? S- Cys(Bzl)]2 ? Z1}i ? Z2 }j ? Z3 }q ? Y2 ? Y3 (I) in cui:
- Y1 ? scelto dal gruppo consistente in gruppo amino terminale, oppure un aminoacido scelto dal gruppo consistente in D-Alanina, Acido D-Aspartico, D-Valina, Acido D-Glutammico, L-Cicloesil-alanina, D-Fenilalanina, D-Treonina, D-Metionina, D-Lisina, D-Cisteina(S-acetamidometile), D-Tirosina, D-Prolina, DLeucina, D-Arginina, D-Asparagina, D-Isoleucina, D-Arginina(N-Tosile), D-Serina, L-Cisteina(S-benzile), L-Cisteina(S-acetamidometile), D-Istidina, D-Glutamina, D-Triptofano, Acido L-Glutammico -(?-allile), ?-Alanina, L-Cisteina(S-p-metil-benzile), L-Cisteina(S-tert-butile), L-Metionina-solfone, L-Metionina-solfossido, Glicina o loro combinazioni;
- R-Glu indica l?acido glutammico in configurazione assoluta R sul C? dell?aminoacido (R-acido glutammico);
- S-Cys(Bzl) indica la benzilcisteina in configurazione assoluta S sul C? dell?aminoacido (S-benzil-cisteina) recante un gruppo benzilico legato allo zolfo della catena laterale dell?aminoacido;
- Z1, Z2 e Z3: se indipendentemente presenti, sono una molecola di formula (II) in configurazione assoluta R o S:
(II)
in cui:
- k ? un numero intero da 1 a 4,
- A ? un gruppo amminico;
- i ? un numero scelto dal gruppo consistente in 1, 2 e 4;
- j ? un numero scelto dal gruppo consistente in 1 e 2;
- q ? 1;
con le condizioni che:
quando i = 4, j = 2, q = 1
quando i = 2, j = 1, q = 1, e Z3 ? assente
quando i = 1, j = 1, q = 1, e Z2 e Z3 sono assenti;
- Y2 ? scelto dal gruppo consistente in: Glicina, Beta-alanina e Acido ?-amino caproico;
- Y3 ? scelto dal gruppo consistente in: un gruppo carbossi terminale, un gruppo carbossiamide, un gruppo carbossiamide N-metil sostituito N,N-dimetil di-sostituito, un gruppo idrossile e un idrogeno, per l?uso come medicamento.
Sotto un secondo aspetto viene descritta una composizione farmaceutica comprendente uno o pi? peptidi, uguali o diversi tra loro, secondo la presente invenzione ed eccipienti farmacologicamente accettabili, per l?uso come medicamento.
Sotto un terzo aspetto la presente invenzione descrive l?impiego dei peptidi o della composizione farmaceutica nell?inibizione dell?angiogenesi o della neovascolarizzazione.
Sotto un quarto aspetto la presente invenzione descrive l?impiego dei peptidi o della composizione farmaceutica nell?inibizione del legame tra i recettori VEGFR-1 e VEGFR-2 e i loro ligandi.
Sotto ancora un altro aspetto, la presente invenzione riguarda un metodo per il trattamento di una patologia neovascolare o del cancro.
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
L?invenzione verr? ora descritta in dettaglio e facendo riferimento alle Figure allegate.
FIGURA 1 mostra i risultati di un saggio ELISA che conferma che il peptide di formula (IV) secondo la presente invenzione, inibisce la fosforilazione di VEGFR-1 e VEGFR-2 indotta da VEGF-A.
Analisi mediante western blot della fosforilazione di VEGFR-2 e VEGFR-1 indotta con 50 ng/ml di VEGF-A, rispettivamente in cellule HUVEC e 293-VEGFR-1. iVsB ? stato aggiunto contemporaneamente al VEGF-A alla concentrazione di 25?M. Come controllo negativo, ? stato utilizzato DMSO, come descritto nell?Esempio 2. FIGURA 2 mostra immagini rappresentative della inibizione dose-dipendente esercitata dal peptide di formula (IV), denominato d?ora in poi iVsB, sulla formazione di strutture simili a capillari ottenute inducendo le HUVEC coltivate su matrigel con VEGF-A alla concentrazione di 100ng/ml. VEGF-A ? in grado di indurre la formazione delle strutture ad un livello comparabile a quello del controllo positivo rappresentato dal mezzo completo EGM-2. Il mezzo privo di fattori di crescita EMB ? stato utilizzato come controllo negativo. Il peptide iVsB ? stato utilizzato a concentrazioni comprese tra 10 e 50 ?M. Il peptide controllo (PC) ? stato valutato alla concentrazione di 50 ?M, come dettagliato nell?Esempio 3.
FIGURA 3 mostra i dati che confermano che il peptide iVsB inibisce la neovascolarizzazione della coroide (CNV) indotta da laser, come descritto nell?Esempio 4. L?iniezione intravitreale di 50 ?g del peptide dell?invenzione iVsB determina la riduzione della neovascolarizzazione della coroide indotta da laser di circa il 40% rispetto all?iniezione del PC o del veicolo (DMSO). La quantizzazione del volume di neovascolarizzazione ? stata effettuata su n=9 spot per PI, n=6 spot per PC, e n=9 spot per il veicolo. I dati sono rappresentati nel grafico (Figura 3A) come media ? SEM rispetto al controllo. *p=0.028 vs DMSO. Le immagini (Figura 3B) sono rappresentative della CNV, la barra all?interno dell?immagine di iVsB rappresenta 100?m.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
La presente invenzione pertanto concerne peptidi di origine sintetica e biologicamente attivi nell?inibizione del legame tra i recettori VEGFR-1 e VEGFR-2 e i loro ligandi, e conseguentemente della cascata di reazioni risultante da tale legame.
In un primo aspetto, la presente invenzione pertanto concerne l?impiego di un peptide o suoi sali come medicamento, detto peptide avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO:1 e la formula generale (I):
{{{[Y1 ? R-Glu ? S-Cys(Bzl) ? S- Cys(Bzl)]2 ? Z1}i ? Z2 }j ? Z3 }q ? Y2 ? Y3 (I) in cui:
- Y1 ? scelto dal gruppo consistente in gruppo amino terminale, oppure un aminoacido scelto dal gruppo consistente in D-Alanina, Acido D-Aspartico, D-Valina, Acido D-Glutammico, L-Cicloesil-alanina, D-Fenilalanina, D-Treonina, D-Metionina, D-Lisina, D-Cisteina(S-acetamidometile), D-Tirosina, D-Prolina, D-Leucina, D-Arginina, D-Asparagina, D-Isoleucina, D-Arginina(N-Tosile), D-Serina, L-Cisteina(S-benzile), L-Cisteina(S-acetamidometile), D-Istidina, D-Glutamina, D-Triptofano, Acido L-Glutammico -(?-allile), ?-Alanina, L-Cisteina(S-p-metil-benzile), L-Cisteina(S-tert-butile), L-Metionina-solfone, L-Metionina-solfossido, Glicina o loro combinazioni;
- R-Glu indica l?acido glutammico in configurazione assoluta R sul C? dell?aminoacido (R-acido glutammico);
- S-Cys(Bzl) indica la benzilcisteina in configurazione assoluta S sul C? dell?aminoacido (S-benzil-cisteina) recante un gruppo benzilico legato allo zolfo della catena laterale dell?aminoacido;
- Z1, Z2 e Z3: se indipendentemente presenti, sono una molecola di formula (II) in configurazione assoluta R o S:
(II)
in cui:
- k ? un numero intero da 1 a 4,
- A ? un gruppo amminico;
- i ? un numero scelto dal gruppo consistente in 1, 2 e 4;
- j ? un numero scelto dal gruppo consistente in 1 e 2;
- q ? 1;
con le condizioni che:
quando i = 4, j = 2, q = 1
quando i = 2, j = 1, q = 1, e Z3 ? assente
quando i = 1, j = 1, q = 1, e Z2 e Z3 sono assenti;
- Y2 ? scelto dal gruppo consistente in: Glicina, Beta-alanina e Acido ?-amino caproico;
- Y3 ? scelto dal gruppo consistente in: un gruppo carbossi terminale, un gruppo carbossiamide, un gruppo carbossiamide N-metil sostituito N,N-dimetil di-sostituito, un gruppo idrossile e un idrogeno.
La Tabella 1 riporta gli amino acidi che possono essere impiegati quali Y1: Tabella 1:
La Tabella 2 riporta gli amino acidi che possono essere impiegati quali Y2: Tabella 2:
Gli aminoacidi vengono riportati con il loro nome triviale, che pu? essere sostituito dal loro nome sistematico secondo la nomenclatura IUPAC come riportato in: Nomenclature and Symbolism for Amino Acids And Peptides IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN), Pure & Appl. Chem., Vol. 56, No. 5, pp. 595?624, 1984.
Secondo una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, Z1, Z2 e Z3 sono unite tra di loro da legami ammidici in modo da formare una struttura ramificata;
Le notazioni R/S che definiscono la configurazione assoluta dei centri chirali presenti nei gruppi riportati nelle due tabelle, sono intercambiabili con la notazione L/D seguendo regole riportate in letteratura e come ? noto agli esperti del settore (vedere ad esempio: Rules for the nomenclature of organic chemistry section E: stereochemistry (Recommendations 1974), collators: ; Pure & Appl. Chem., Vol. 45, pp. 11?30. Pergamon Press, 1976. Printed in Great Britain.).
In una ulteriore forma di realizzazione, nel peptide secondo la presente invenzione, quando:
- i ? 4; j ? 2; e q ? 1;
oppure
quando:
- i ? 2; j ? 1; e q ? 1 e Z3 ? assente
oppure
quando:
- i ? 1; j ? 1, q ? 1, e Z2 e Z3 sono assenti.
In una forma di realizzazione, nel peptide secondo la presente invenzione:
- i ? 2;
- j ? 1;
- q ? 1; e
- Z3 non ? presente (ovvero ? assente),
e detto peptide avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO:2 e la formula generale (III)
In un?ulteriore forma di realizzazione, nel peptide secondo la presente invenzione: - Y1 ? un gruppo amino terminale (NH2); e
- Z1 e Z2 sono S-Lisina.
Il peptide avente la SEQ ID NO: 2 e la formula generale (III) pu? essere rappresentato dalla formula semplice:
Y1-[ R-Glu ? S-Cys(Bzl) ? S-Cys(Bzl)]4-Z12-Z2-Y2-Y3-COOH (SEQ ID NO:3).
In ancora un?ulteriore forma di realizzazione, nel peptide secondo la presente invenzione:
- Y1 un gruppo amino terminale (NH2);
- Z1 e Z2 sono S-Lisina;
- Y2 ? Glicina; e
- Y3 ? un gruppo carbossi terminale (COOH),
detto peptide avente la SEQ ID NO: 3 e la formula generale (IV)
Il peptide avente la SEQ ID NO: 3 e la formula generale (IV) pu? essere rappresentato dalla formula semplice:
H2N-[ R-Glu ? S-Cys(Bzl) ? S-Cys(Bzl)]4-Lys2-Lys-Gly-COOH (SEQ ID NO:3), equivalente a:
H2N-[ D-Glu ? L-Cys(Bzl) ? L-Cys(Bzl)]4-Lys2-Lys-Gly-COOH (SEQ ID NO:3).
La molecola peptidica di formula IV pu? essere convenzionalmente definita iVsB, (Inhibitor of VEGFRs Binding).
Nei peptidi secondo la presente invenzione, i tripeptidi (R-Glu)?(S-Cys(Bzl))?(S-Cys(Bzl)) sono legati attraverso la porzione C-terminale o al gruppo ?-amminico oppure al gruppo ?-amminico della lisina. Nel peptide di formula (IV), la S-lisina (SLys) ? intercambiabile con la R-lisina (R-Lys) ed il gruppo Gly-COOH ? intercambiabile con il gruppo Gly-CONH2 oppure con il gruppo COOH, intendendo con ci? che la glicina pu? essere omessa e che il gruppo C-terminale pu? essere intercambiabilmente un gruppo carbossiammidico CO-NH2.
Sorprendentemente il peptide di formula (IV), secondo la presente invenzione, ? stato ulteriormente caratterizzato per la capacit? di legare VEGFR-1 e VEGFR-2. In particolare, il Tripeptide Tetramerico di formula (IV) denominato iVsB blocca il legame di VEGF-A ai recettori VEGFR-2 e VEGFR-1 e quello di PlGF al recettore VEGFR-1. Esso ? capace di produrre una inibizione dell?interazione tra VEGF-A e VEGFR-2 del 50% (IC50) ad una concentrazione di poco inferiore a 10 ?M, ed una inibizione dell?interazione tra VEGF-A e PlGF con il VEGFR-1 sempre del 50% (IC50) ad una concentrazione di poco inferiore a 20 ?M.
Vantaggiosamente, i peptidi descritti nella presente invenzione sono stati ulteriormente caratterizzati per la capacit? di inibire la fosforilazione del VEGFR-1 e VEGFR-2 indotta da fattori di crescita, preferenzialmente da VEGF-A.
Sotto un secondo aspetto viene descritta una composizione farmaceutica comprendente uno o pi? peptidi, uguali o diversi tra loro, secondo la presente invenzione ed eccipienti farmacologicamente accettabili, per l?uso come medicamento. Tali eccipienti possono essere, per esempio, almeno uno o pi? diluenti, carrier o adiuvanti adatti.
Un ?diluente, carrier o adiuvante? ? un qualsiasi eccipiente, diluente e/o adiuvante adatto che di per s? non induce la produzione di anticorpi dannosi per l?individuo che riceve la composizione n? annulla l?effetto della composizione.
Un carrier o adiuvante (accettabile da un punto di vista farmaceutico) pu? migliorare la risposta sollecitata dai peptidi oggetto dell?invenzione, ad esempio determinando un rilascio continuo dei peptidi o della composizione farmaceutica oggetto dell?invenzione per un periodo di tempo prolungato (formulazione a rilascio lento). Carriers o adiuvanti adatti tipicamente sono formati da uno o pi? composti inclusi nella seguente lista se pur non esaustiva, carrier di tipo microparticellare lipidico quali: Nanoparticelle lipidiche solide (SLN), Carrier Lipidici Nanostrutturati (NLC), Microparticelle Solide Lipidiche (SLM), liposomi, emulsione W/O/W. Oppure microparticelle costituite da polimeri biodegradabili e biocompatibili (PLGA, PLA o PHEA/PEG).
Il peptide e la composizione farmaceutica comprendente uno o pi? peptidi, uguali o diversi tra loro, possono essere per l?uso come medicamento sia nell?uomo che nell?animale (uso veterinario). L?animale pu? essere un qualunque animale in grado di formare nuovi vasi sanguigni; in particolare un tale animale pu? essere un mammifero come un essere umano. ? atteso che la dose effettiva della sostanza attiva descritta nell?invenzione ricade in un intervallo sufficientemente ampio da poter essere determinato mediante prove di routine. In genere, la dose varia tra 4% e 0,001%.
In una forma di realizzazione, l?uso di uno o pi? peptidi o della composizione farmaceutica secondo la presente invenzione ? un uso per somministrazione oftalmica, o topico oftalmico.
Detta composizione pu? essere in forma di un collirio, polvere, granuli, crema o gel, inserti oculari erodibili, o polvere o in forma liquida di sospensione, emulsione, microemulsioni, soluzione, spray oculare, bagno oculare, oppure una composizione iniettabile. Quando la composizione farmaceutica ? in forma iniettabile, essa pu? essere una soluzione liquida oppure una sospensione, e detta iniezione pu? essere realizzata per via intravitreale.
Inoltre, ? fortemente avvertita una formulazione per uso oftalmico che sia ben tollerata dall?occhio, stabile che migliori la solubilit? e la biodisponibilit? dell?attivo. In particolare, sistemi carrier quali, le microemulsioni migliorano la solubilit? di molecole poco solubili e le stabilizzano migliorandone la biodisponibilit?, ottimizzando le possibilit? di raggiungere la parte posteriore dell?occhio.
Sotto un terzo aspetto la presente invenzione descrive l?impiego dei peptidi o della composizione farmaceutica nell?inibizione dell?angiogenesi o della neovascolarizzazione. In una forma di realizzazione, la neo-vascolarizzazione pu? essere dipendente da VEGFR-1 e VEGFR-2. In particolare, alla neovascolarizzazione dell?occhio dipendente da VEGFR-1 e VEGFR-2 Sorprendentemente i Tripeptidi Tetramerici di Formula (I), (III) e (IV), descritti dalla presente invenzione, sono stato ulteriormente caratterizzati per la capacit? di inibire la formazione di strutture simili ai capillari da parte di cellule endoteliali primarie cresciute su estratto di matrice extracellulare indotta da fattori di crescita, preferenzialmente da VEGF-A.
I Tripeptidi Tetramerici di formula (I), (III) e (IV) sono stati ulteriormente caratterizzati per essere modulatori della neovascolarizzazione dipendente da VEGFR-2 e VEGFR-1, o dell?angiogenesi dipendente da VEGFR-2 e VEGFR-1.
L?invenzione riguarda anche la forma coniugata dei Tripeptidi Tetramerici di formula (I), (III) e (IV), con un polimero idrofilico non immunogenico. Questo aspetto cerca di risolvere il problema di migliorare la solubilit? in acqua o nei buffer acquosi del peptide tetramerico. I polimeri idrofilici sono scelti tra il polietilene-glicole, i polivinilpirrolidoni, i carboidrati con un peso molecolare compreso tra 100 e 20000 Dalton. In una forma di realizzazione, nell?impego dei peptidi o della composizione farmaceutica, detta inibizione dell?angiogenesi e detta neo-vascolarizzazione sono nel trattamento del cancro (crescita tumorale) o di una patologia neovascolare. Detta patologia neovascolare pu? essere una patologia delle ossa o delle articolazioni, dei vasi sanguigni, della pelle, oppure angiogenesi derivante da patologie del tessuto adiposo, diabete e/o sue conseguenze o malattie di ematopoiesi.
Preferibilmente detta patologia neovascolare ? una patologia da edema neovascolare dell?occhio.
In una forma di realizzazione pi? preferita detta patologia neovascolare dell?occhio ? la degenerazione maculare senile, una patologia neovascolare della superficie dell?occhio conseguente ad infezione, infiammazione, ipossia, trauma o degenerazione/perdita della barriera limbare, la retinopatia diabetica, l?occlusione della vena centrale retinica, la retinopatia da del prematuro, l?edema maculare e l?infiammazione ad esse associata, la retinopatia da occlusione venosa retinica (ad esempio della vena centrale retinica), emorragia vitreale, distacco della retina, la corioretinopatia sierosa centrale, la degenerazione maculare legata all?et? (forma essudativa), e la degenerazione maculare miopica (neovascolarizzazione coroideale) o loro combinazioni.
Esempi di patologie che possono essere associate a neovascolarizzazione della cornea sono le cheratiti batteriche, virali, micotiche o parassitiche, il rigetto del trapianto di cornea, la malattia del trapianto verso l?ospite (GvDH), la congiuntivite atopica, la sindrome di Turner, la degenerazione marginale di Terrien, lo pterigio, l?ulcera corneale sterile, la sindrome dell?occhio secco.
L?impiego dei peptidi o della composizione farmaceutica, per l?inibizione dell?angiogenesi e della neo-vascolarizzazione nel trattamento del cancro ? prevista nel trattamento dei tumori solidi, liquidi e/o metastatizzazione tumorale, preferibilmente detti tumori essendo scelti tra: leucemie e linfomi, preferibilmente leucemia acuta linfocitaria, leucemia acuta non-linfocitaria, leucemia, linfocitaria cronica, mieloma multiplo, linfoma di Hodgkin, malattia di Hodgkin, tumori solidi infantili o adulti, tumori del cervello, neuroblastoma, retinoblastoma, tumore di Wilms, osteosarcomi e condrosarcomi, tumori del polmone, tumore del colon e retto, tumore del seno, tumore della prostata, cancro dell?utero, cancro ovarico, cancro del sistema urinario, cancro della vescica, tumore della cavit? orale, tumore del pancreas, melanoma e tumori della pelle, tumore dello stomaco, tumore del cervello, tumore della tiroide, tumore della laringe, tumore del fegato, tumore dei testicoli.
L?impego dei peptidi o della composizione farmaceutica secondo la presente invenzione per l?inibizione dell?angiogenesi e della neo-vascolarizzazione, pu? essere nel trattamento delle:
- patologie delle ossa o delle articolazioni, preferibilmente scelte tra: artrite reumatoide, sinovite, distruzione della cartilagine e/o dell?osso, osteomielite, ipertrofia e/o iperplasia del tessuto sinoviale, formazione di osteofiti, neoplasmi e/o metastasi e loro combinazioni; e/o
- patologie dei vasi sanguigni, preferibilmente scelte tra: aterosclerosi, emangioma, emangioendotelioma e loro combinazioni; e/o
- patologie della pelle, preferibilmente scelte tra: psoriasi, verruche, granulomi piogenici, crescita di peli, sarcoma di Kaposi, cheloidi di ferite, edema allergico, neoplasmi e loro combinazioni; e/o
- angiogenesi osservata in patologie del tessuto adiposo, preferibilmente obesit?; e/o
- diabete e/o sue conseguenze, preferibilmente la retinopatia e/o il piede diabetico; e/o
- malattie di ematopoiesi, preferibilmente AIDS e/o sarcoma di Kaposi.
In malattie ischemiche della retina l?apporto di sangue e ossigeno alla retina ? ridotto, la porzione periferica della retina perde la sorgente di nutrimenti e smette di funzionare in maniera appropriata. Le cause comuni di retinopatia sono l?occlusione della vena retinica centrale, la stenosi della arteria carotidea, il diabete (retinopatia diabetica) e la retinopatia da anemia falciforme. La retinopatia si osserva anche in neonati prematuri (retinopatia dei prematuri). La retinopatia diabetica ? la causa principale di perdita della vista in pazienti diabetici. Nella retina ischemica avviene una crescita di nuovi vasi sanguigni (neovascolarizzazione). Questi vasi spesso crescono dalla superficie della retina, invadendo il vitreo. Questi nuovi vasi non sono in grado di sostituire il flusso di nutrienti necessari ma, al contrario, possono causare molteplici problemi come emorragia vitreale, distacco della retina, e glaucoma incontrollato. Questi problemi compaiono perch? i nuovi vasi sono fragili e proni al sanguinamento. Altre malattie dell?occhio in cui si ritiene che l?angiogenesi giochi un ruolo fondamentale, includono disordini intraoculari e della coroide, la leucomalacia, neoplasmi e metastasi. La neovascolarizzazione della coroide (CNV) ? la crescita di nuovi vasi sanguigni che si originano dalla coroide attraverso una rottura della membrana di Bruch nell?epitelio del pigmento sub-retinale (sub-RPE) o spazio subretinale. La localizzazione, il pattern di crescita, il tipo (1 o 2) di CNV dipende dall?et? del paziente e dal caso specifico. Sanguinamento ed essudazioni avvengono provocando ulteriore crescita di vasi, producendo i sintomi visivi negativi. CNV ? la principale causa di perdita della vista. Si stima che la CNV ? presente nel 5-10% di miopi e occorre praticamente in tutte le rotture coroidali durante la fase di rimarginazione. Nella maggior parte dei casi recede spontaneamente, ma in un 15-30% di pazienti si pu? ripresentare e portare a emorragia e distacchi seri della macula con concomitante perdita della vista.
I peptidi e la composizione farmaceutica secondo la presente invenzione possono anche essere utilizzati per la fabbricazione di un medicinale che possa essere incluso in un regime di trattamento per condizioni associate alla neovascolarizzazione dipendente da VEGFR-1 e VEGFR-2. Il citato regime di trattamento pu? includere altri composti o medicinali che agiscono sulla neovascolarizzazione dipendente da VEGFR-1 e VEGFR-2 o che determinano un miglioramento degli effetti collaterali di detto trattamento. In detto regime di trattamento possono essere presenti altri composti o medicinali che includono un anticorpo neutralizzante PlGF e/o un anticorpo anti-VEGFR e/o un anticorpo anti-VEGF-A.
Sotto un quarto aspetto la presente invenzione descrive l?impiego dei peptidi o della composizione farmaceutica nell?inibizione del legame tra i recettori VEGFR-1 e VEGFR-2 e i loro ligandi.
Sotto ancora un altro aspetto, la presente invenzione riguarda un metodo per il trattamento del cancro o di una patologia neovascolare, mediante la fase di impiegare i peptidi o della composizione farmaceutica dell?invenzione.
In una forma di realizzazione del metodo di trattamento, nell?impego dei peptidi o della composizione farmaceutica, viene inibita l?angiogenesi e la neovascolarizzazione, e preferibilmente detta patologia neovascolare ? una patologia neovascolare dell?occhio. In una forma di realizzazione pi? preferita detta patologia neovascolare dell?occhio ? la retinopatia diabetica.
In una ulteriore forma di realizzazione preferita, detta patologia neovascolare dell?occhio ? la degenerazione maculare legata all?et? oppure una patologia neovascolare della superficie dell?occhio conseguente ad infezione, infiammazione, ipossia, trauma o degenerazione/perdita della barriera limbare. La presente invenzione riguarda peptidi in grado di interagire con i due recettori del VEGF coinvolti nella formazione dei vasi del sangue, VEGFR-1 e VEGFR-2, mediante l?attivazione indotta dal ligando comune VEGF-A, e da PlGF che lega specificamente VEGFR-1. Come evidenziato nell? Esempio 1 questi composti sono in grado di competere con VEGF-A nel legame ai due recettori, e con PlGF nel legame a VEGFR-1, in maniera dose-dipendente. Essi sono in grado di pervenirne l?attivazione inibendo la fosforilazione dei due recettori indotta dal VEGF-A (Esempio 2). I risultati riportati nell?Esempio 3 mostrano come questi composti hanno la capacit? di inibire la formazione di strutture simili ai capillari da parte di cellule endoteliali primarie cresciute su estratto di matrice extracellulare indotta da fattori di crescita, preferenzialmente da VEGF-A. Inoltre, come descritto nell?Esempio 4, questi composti sono capaci di inibire in vivo la neovascolarizzazione della coroide indotta da laser, un modello sperimentale che ricapitola la forma umida della degenerazione maculare senile.
L?insieme dei risultati consente di definire i peptidi dell?invenzione, come inibitori della neovascolarizzazione o angiogenesi dipendente da VEGFR-1 e VEGFR-2. In particolare, i risultati degli Esempi 1-4 permettono di concludere che il peptide tetramerico di formula (IV), in dipendenza dei livelli di espressione di VEGFR-2, VEGFR-1 e della sua variante solubile, ? in grado di inibire un processo di neovascolarizzazione. Questo peptide pu? essere dunque definito inibitore della neovascolarizzazione o dell?angiogenesisi, o pi? in particolare inibitore della neovascolarizzazione o dell?angiogenesisi dipendente da VEGFR-2 e VEGFR-1. Si riportano di seguito Esempi di realizzazione della presente invenzione forniti a titolo illustrativo.
ESEMPI
Esempio 1: Inibizione dose dipendente dell?interazione VEGF-A/VEGFR2, VEGF-A/VEGFR-1 e PlGF/VEGFR-1
La formula schematica del peptide identificato con la formula generale (IV) e la SEQ ID NO:3, chiamato peptide inibitore (iVsB) ?:
H2N-[ D-Glu ? L-Cys(Bzl) ? L-Cys(Bzl)]4-Lys2-Lys-Gly-COOH (SEQ ID NO:3).
Come peptide di controllo (PC) ? stato utilizzato lo stesso peptide con una D-Ala al posto di L-Cys(Bzl) al C terminale della sequenza tripeptidica:
H2N-[ D-Glu ? L-Cys(Bzl) ? D-Ala]4-Lys2-Lys-Gly-COOH (SEQ ID NO:4).
Il saggio di binding del VEGF-A con i recettori VEGFR-1 e VEGFR-2 ed il PlGF con il recettore VEGR-1 ? basato sulla metodica ELISA ed ? stato effettuato utilizzando reagenti acquisiti dalla R&D Systems. I recettori ricombinanti umani VEGFR-2 (R&D Systems, cat N? 357-KD) e VEGFR-1 (R&D Systems, cat N? 321-FL) (costituiti dai sette domini extracellulari fusi al dominio Fc di IgG umane), sono stati fatti aderire nei pozzetti di micropiastre da 96 alla concentrazione di 1 ?g/ml. Dopo aver bloccato i siti aspecifici di legame ai pozzetti utilizzando una soluzione tampone contenente BSA al 3%, ? stato aggiunto il VEGF-A umano (R&D Systems, cat N? 293-VE), alla concentrazione di 10 ng/ml. Anche per il PlGF umano (R&D Systems, cat N? 264-PG) la concentrazione utilizzata ? stata di 10 ng/ml. Contemporaneamente ai fattori di crescita sono state aggiunte dosi scalari di iVsB o PC comprese tra 1,25 e 50 ?M. Al termine della fase di competizione, ? stato aggiunto un anticorpo biotinilato antihVEGF-A (R&D Systems, cat N? BAF293) o anti-hPlGF (R&D Systems, cat N? BAF264), seguito da un sistema avidina-streptavidina coniugato con HRP (Vectastain elite ABC kit) ed un substrato per HRP (orto-fenilen-diamina - Sigma, cat N? P1526). La quantizzazione ? stata effettuata determinando l?assorbanza a 490 nm. L?eventuale attivit? inibitoria delle miscele ? stata espressa in termini di % di binding, comparando i dati ottenuti del legame di VEGF-A o PlGF ai recettori in presenza del peptide con quelli in assenza degli stessi.
Come riportato nelle Tabelle 3 e 4, iVsB ? in grado di inibire in maniera dose dipendente sia l?interazione VEGF-A/VEGFR-2 con una IC50 di poco inferiore a 10 ?M, che l?interazione VEGF-A/VEGFR-1, pur se con efficienza minore (IC50 circa 20?M). Esso ? anche in grado di inibire l?interazione PlGF/VEGFR-1, sempre ad una concentrazione di poco inferiore a 20 ?M. Per contro, il PC ? incapace di inibire il legame tra i fattori di crescita ed i due recettori.
Tabella 3 ? Inibizione dose-dipendente dell?interazione VEGF-A/VEGFR-2 e VEGF-A/VEGFR-1
Tabella 4 ? Inibizione dose-dipendente dell?interazione PlGF/VEGFR1
Esempio 2: Inibizione della fosforilazione di VEGFR-1 e VEGFR-2 indotta da VEGF-A
Per valutare la capacit? inibitoria del peptide iVsB in termini funzionali, ? stato messo a punto il saggio di fosforilazione dei recettori VEGFR-1 e VEGFR-2 indotta da VEGF-A. Per l?attivazione del VEGFR-2 sono state utilizzate le cellule endoteliali umane primarie HUVEC, nelle quali e ben rilevabile tale recettore. Per il VEGFR-1 ? stata invece utilizzata una linea cellulare over-esprimente il recettore le 293-VEGFR-1, ottenute per trasfezione stabile a partire dalle cellule HEK-293.
A tale scopo le cellule HUVEC e 293-VEGFR-1 sono state coltivate fino alla subconfluenza. Si ? quindi proceduto alla ?starvation? delle cellule, incubando le 293-VEGFR-1 in mezzo di coltura senza siero mentre le HUVEC, normalmente coltivate in presenza di 2% siero ed un cocktail di fattori di crescita, sono state incubate in mezzo di coltura con siero all?1%, per almeno 16 ore.
Al termine della ?starvation?, il mezzo di coltura ? stato rimosso ed i monostrati cellulari sono stati incubati con Na3VO4 100 ?M per 5 minuti allo scopo di inibire l?attivit? della fosfatasi endogene. Le cellule sono state quindi stimolate con VEGF-A a 50 ng/ml nei mezzi utilizzati per la ?starvation? per 10 minuti a 37?C. iVsB ? stato aggiunto contemporaneamente al VEGF-A alla concentrazione di 25?M. Come controllo negativo, ? stato utilizzato DMSO. Terminata l?incubazione, le cellule sono state lavate con Na3VO4 100 ?M freddo e quindi lisate nel buffer composto da TrisHCl 20 mM pH 8, EDTA 5 mM, NaCl 150 mM, Triton-X100 1%, glicerolo 10%, zinco acetato 10 mM, Na3VO4 100 ?M ed una miscela di inibitori di proteasi, incubando per 1 ora a 4?C in leggera agitazione.
Al termine, i lisati cellulari sono stati centrifugati a 12,000xg per 15 minuti per allontanare i detriti cellulari. Si ? proceduto alla quantizzazione degli estratti con il metodo di Bradford utilizzando il reagente delle BioRad. 100?g di ogni estratto proteico ? stato caricato su SDS-PAGE riducente all?8,5%, e si ? poi proceduto alla metodica standard per analizzare le proteine mediante western blot.
Per rilevare i due recettori fosforilati, sono stati utilizzati i due anticorpi specifici antip-VEGFR-1 (R&D Systems, cat. N? AF4170) diluito 1:500 e anti-p-VEGFR-2 (Cell Signaling) diluito 1:1000, mentre la normalizzazione ? stata eseguita rilevando le forme non fosforilate dei recettori utilizzando l?anticorpo anti-VEGFR-1 (Sigma-Aldrich, cat. N? V4262) diluito 1:500, e l?anticorpo anti-VEGFR-2 (Santa Cruz Biotechnology) diluito 1:500.
Come mostrato in Figura 1, iVsB ? in grado di determinare l?inibizione della fosforilazione di entrambi i recettori, confermando che all?inibizione dell?interazione osservata nel saggio ELISA in vitro corrisponde una inibizione funzionale dell?attivazione del recettore.
Esempio 3: Inibizione della formazione di strutture simili a capillari indotta da VEGF-A
La formazione di strutture simili a capillari (CTF) da parte di cellule endoteliali primarie, opportunamente coltivate su un supporto di matrice extracellulare (Matrigel, BD cat. N?.354230), in seguito a stimolazione con fattori pro-angiogenici, ? un saggio comunemente accettato per valutare l?attivit? anti-angiogenica dei composti.
Sono state utilizzate le cellule HUVEC, con il mezzo di coltura EGM-2, composto dal mezzo di base EBM integrato con siero al 2% ed un cocktail di fattori di crescita. Il matrigel ? stato stratificato nei pozzetti di una piastra da 24-pozzetti per colture cellulari. Per ogni pozzetto sono stati aggiunti 230 ?l di matrigel a freddo, e poi la piastra ? stata incubata per 30 minuti a 37?C per permettere la solidificazione del matrigel. Cellule HUVEC in fase esponenziale di crescita sono state staccate dalle piastre, lavate, e risospese in EBM ad una densit? di 120.000 cellule /ml. Per ogni pozzetto contenente il matrigel sono state utilizzate 60.000 cellule in 0.5 ml di mezzo.
Le cellule semplicemente risospese in EBM sono state utilizzate come controllo negativo dell?esperimento. Per il controllo positivo dell?esperimento, le cellule sono state risospese nel mezzo EGM-2 completo. Per verificare l?efficacia del VEGF-A nella stimolazione dei CTF, VEGF-A ? stato aggiunto alla concentrazione di 100 ng/ml alle cellule risospese in EBM immediatamente prima di seminarle nei pozzetti. Per verificare la capacit? del peptide iVsB di inibire questo processo, ? stato effettuato un esperimento di dose dipendenza a concentrazioni comprese tra 10 e 50?M. ? stata anche valutata l?attivit? del PC alla massima concentrazione utilizzata per iVsB. I due peptidi sono stati aggiunti alla miscela HUVEC in EBM VEGF-A 100 ng/ml immediatamente prima di seminare le cellule nei pozzetti in cui era stato stratificato il matrigel.
Dopo sei ore di incubazione, la formazione del CTF ? stata valutata mediante osservazione al microscopio. L?esperimento viene bloccato mediante fissazione delle cellule con 0.2% gluteraldeide e 1% paraformaldeide in PBS. Per ogni campione l?esperimento ? stato effettuato in triplicato.
Come mostrato in Figure 2, il VEGF-A stimola il CTF in maniera paragonabile al controllo positivo (EGM-2), mentre nel controllo negativo (EBM) le cellule restano disperse sul matrigel. IL PC non ? in grado di inibire il CTF, mentre iVsB ? attivo in maniera dose-dipendente. A 50 ?M le cellule sono disperse come nel controllo negativo, a 20?M l?inibizione ? ancora consistente anche se si nota l?inizio della formazione delle strutture simili ai capillari, fenomeno ancor pi? presente alla concentrazione di 10?M del peptide.
Esempio 4: Inibizione della neovascolarizzazione della coroide mediante somministrazione intravitreale di iVsB.
Il modello sperimentale della neovascolarizzazione della coroide indotta da laser prevede la generazione di un danno a livello della membrana di Bruch che separa la coroide dall?epitelio pigmentato della retina (RPE). Il danno viene provocato mediante una bruciatura indotta con il laser che determina la perforazione della membrana di Bruch attivando cos? la vascolarizzazione corioretinica, la crescita di nuovi vasi che a partire dalla coroide invadono il tessuto retinico sovrastante.
Questo modello murino ricapitola le principali caratteristiche della forma essudativa della maculopatia degenerativa senile umana (AMD) ed ? infatti comunemente utilizzato come modello preclinico della AMD. Esso consente di valutare l?attivit? anti-angiogenica delle molecole di interesse.
Per poter visualizzare il fondo oculare del topo ed indurre il danno con il laser ? stato utilizzato il sistema Micron IV ed eseguita la procedura sperimentale di seguito descritta.
Si induce la dilatazione della pupilla prima che si proceda all?anestesia dell?animale. A tale scopo sono state applicate per via topica gocce oculari di Tropicamide 0.5%. Si ? poi proceduto ad anestetizzare l?animale mediante iniezione intraperitoneale di una soluzione di ketamina e xilazina (80 mg/Kg e 10 mg/Kg, rispettivamente). Una volta sedato, l?animale ? stato posto sullo stativo ed ? stata applicata su entrambi gli occhi una soluzione acquosa di idrossi-propil-metilcellulosa al 2,5%. Essa ha la doppia funzione di prevenire la disidratazione della cornea e di migliorare la visualizzazione del fondo oculare ponendo in contatto con la soluzione la lente della camera del Micron IV (una procedura simile a quella utilizzata in microscopia con gli obiettivi ad immersione).
Per indurre il danno con il laser, si attiva innanzitutto il puntatore laser e si procede alla messa a fuoco per applicare il raggio laser utilizzando come riferimento il layer delle RPE. L?area dove applicare il raggio laser deve essere distante dai principali vasi della retina per prevenire eventuali emorragie. L?efficienza della bruciatura a livello della membrana di Bruch ? confermata dalla formazione di una bolla immediatamente dopo l?applicazione del raggio laser. Le condizioni sperimentali utilizzate negli esperimenti sono state ricavate 100 msec e 200mW.
Da dati presenti in letteratura, ben riassunti nell?articolo di Lambert et al. (Nature Protocols, 2013, 8:2197) ? noto che il massimo di neo-vascolarizzazione in questo modello sperimentale si ottiene sette giorni dopo il danno.
Topi C57Bl6/J, n=5 per gruppo, sono stati sottoposti ad anestesia ed ? stata poi eseguita la procedura per effettuare il danno con il laser come appena descritto. Al termine della procedura, ? stata immediatamente eseguita l?iniezione intravitreale, utilizzando una siringa hamilton con ago 32g, somministrando 50?g di iVsB o di PC in 1?L di DMSO, nell?occhio sinistro. Come controllo ? stato iniettato il solo DMSO.
Dopo sette giorni, gli animali sono stati sacrificati, gli occhi sono stati enucleati e fissati in 4% paraformaldeide. Successivamente, allo stereomicroscopio ? stato rimosso il segmento anteriore dell?occhio costituito da: cornea, iride e cristallino. La parte restante definita ?eye-cups? o segmento posteriore costituito da: sclera, coroide, RPE e retina ? stato incubato in presenza di 0.7% FITC?Griffonia simplicifolia Isolectin B4 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) per sedici ore. Dopo una serie di lavaggi la retina viene rimossa e sulla RPE/coroide vengono effettuati quattro tagli che ne consentono il montaggio su vetrino per l?osservazione al microscopio a fluorescenza. La quantizzazione della CNV viene effettuata in termini di volume. Per valutare il volume di ogni spot, viene acquisita una serie di immagini (Z-Satcks, circa 20-25 immagini) ognuna dello spessore di 1-?m, partendo dalla superficie superiore fino al piano focale pi? profondo, a livello delle cellule RPE. Il volume della fluorescenza ? misurato tramite il programma ImageJ (NIH, Bethesda, MD) sommando l?area della fluorescenza di ogni singolo piano.
La quantizzazione della CNV ? stata effettuata su n=9 spot per iVsB, n=6 per PC, e n=9 spot per il veicolo, ed il risultato ? riportato nella Figura 3. I risultati mostrano una significativa capacit? inibitoria di iVsB (~ 40%) rispetto al veicolo ed al peptide di controllo PC.
Dalla descrizione dettagliata e dagli Esempi sopra riportati, risultano evidenti i vantaggi conseguiti mediante i peptidi e la composizione farmaceutica della presente invenzione. In particolare, tali peptidi si sono mostrati sorprendentemente e vantaggiosamente adatti al trattamento delle patologie tumorali, dell?angiogenesi e della neo-vascolarizzazione.
Claims (13)
- RIVENDICAZIONI 1. Un peptide o suoi sali, detto peptide avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO:1 e la formula generale (I) {{{[Y1 ? R-Glu ? S-Cys(Bzl) ? S- Cys(Bzl)]2 ? Z1}i ? Z2 }j ? Z3 }q ? Y2 ? Y3 in cui: - Y1 ? scelto dal gruppo consistente in gruppo amino terminale (NH2), oppure un aminoacido scelto dal gruppo consistente in D-Alanina, Acido D-Aspartico, D-Valina, Acido D-Glutammico, L-Cicloesil-alanina, D-Fenilalanina, D-Treonina, D-Metionina, D-Lisina, D-Cisteina(S-acetamidometile), D-Tirosina, D-Prolina, D-Leucina, D-Arginina, D-Asparagina, D-Isoleucina, D-Arginina(N-Tosile), D-Serina, L-Cisteina(S-benzile), L-Cisteina(S-acetamidometile), D-Istidina, D-Glutamina, D-Triptofano, Acido L-Glutammico -(?-allile), ?-Alanina, L-Cisteina(S-p-metilbenzile), L-Cisteina(S-tert-butile), L-Metionina-solfone, L-Metionina-solfossido, Glicina o loro combinazioni; . - R-Glu indica l?acido glutammico in configurazione assoluta R sul C? dell?aminoacido (R-acido glutammico); - S-Cys(Bzl) indica la benzilcisteina in configurazione assoluta S sul C? dell?aminoacido (S-benzil-cisteina) recante un gruppo benzilico legato allo zolfo della catena laterale dell?aminoacido; - Z1, Z2 e Z3: se indipendentemente presenti, sono una molecola di formula (II) in configurazione assoluta R o S:
- in cui: - k ? un numero intero da 1 a 4, - A ? un gruppo amminico; - i ? un numero scelto dal gruppo consistente in 1, 2 e 4; - j ? un numero scelto dal gruppo consistente in 1 e 2; - q ? 1 con le condizioni che: quando i = 4, j = 2, q = 1 quando i = 2, j = 1, q = 1, e Z3 ? assente quando i = 1, j = 1, q = 1, e Z2 e Z3 sono assenti; - Y2 ? scelto dal gruppo consistente in: Glicina, Beta-alanina e Acido ?-amino caproico; - Y3 ? scelto dal gruppo consistente in: un gruppo carbossi terminale, un gruppo carbossiamide, un gruppo carbossiamide N-metil sostituito N,N-dimetil disostituito, un gruppo idrossile e un idrogeno, per l?uso come medicamento. 2. L?uso del peptide secondo la rivendicazione 1, in cui: - i ? 2; - j ? 1; - q ? 1; e - Z3 non ? presente, detto peptide avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO:2 e la formula generale (III)
- 3. L?uso del peptide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 o 2, in cui: - Y1 ? un gruppo amino terminale; e - Z1 e Z2 sono S-Lisina.
- 4. L?uso del peptide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui: - Y1 ? un gruppo amino terminale; - Z1 e Z2 sono S-Lisina; - Y2 ? Glicina; e - Y3 ? un gruppo carbossi terminale, detto peptide avente la SEQ ID NO: 3 e la formula generale (IV)
- 5. Una composizione farmaceutica comprendente uno o pi? peptidi, uguali o diversi tra loro, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 ed eccipienti farmacologicamente accettabili, per l?uso come medicamento.
- 6. La composizione farmaceutica per l?uso secondo la rivendicazione 5, in cui detta composizione ? somministrata per via oftalmica.
- 7. La composizione farmaceutica per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5 e 6, in cui detta composizione ? in forma di un collirio, polvere, granuli, crema o gel, inserti oculari erodibili, o polvere o in forma liquida di sospensione, emulsione, microemulsione, soluzione, spray oculare, bagno oculare, oppure un iniettabile.
- 8. La composizione farmaceutica per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 7, in cui detta composizione in forma iniettabile ? una soluzione liquida oppure una sospensione, e in cui detta iniezione ? realizzata per via intravitreale.
- 9. Il peptide per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 o composizione farmaceutica per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 8, in cui detto uso ? nell?inibizione dell?angiogenesi o della neovascolarizzazione.
- 10. Uso secondo la rivendicazione 9, in cui detta inibizione dell?angiogenesi e detta neo-vascolarizzazione sono nel trattamento del cancro o di una patologia neovascolare, in cui detta patologia neovascolare ? una patologia delle ossa o delle articolazioni, dei vasi sanguigni, della pelle, angiogenesi derivanti da patologie del tessuto adiposo, diabete e/o sue conseguenze o malattie di ematopoiesi.
- 11. Uso secondo la rivendicazione 10, in cui detta patologia neovascolare ? una patologia neovascolare dell?occhio.
- 12. Uso secondo la rivendicazione 10, in cui detta patologia neovascolare dell?occhio ? la degenerazione maculare senile, la retinopatia diabetica, l?occlusione della vena centrale retinica, la retinopatia del prematuro, l?edema maculare e l?infiammazione ad esse associata, l?occlusione venosa retinica, la corioretinopatia sierosa centrale, la degenerazione maculare legata all?et? (forma essudativa), una patologia neovascolare della superficie dell?occhio conseguente ad infezione, infiammazione, ipossia, trauma o degenerazione/perdita della barriera limbare o la degenerazione maculare miopica (neovascolarizzazione coroideale).
- 13. Il peptide per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 o composizione farmaceutica per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 8, in cui detto uso ? nell?inibizione del legame tra i recettori VEGFR-1 e VEGFR-2 e i loro ligandi.
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Also Published As
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