IT201900000202A1 - Radiofarmaco per utilizzo diagnostico terapeutico in medicina nucleare e medicina radio guidata - Google Patents

Radiofarmaco per utilizzo diagnostico terapeutico in medicina nucleare e medicina radio guidata Download PDF

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Riccardo Faccini
Camillocci Elena Solfaroli
Dante Rotili
Alessia Ciogli
Antonella Cartoni
Ilaria Fratoddi
Iole Venditti
Alessandro Giordano
Daria Maccora
Germano Perotti
Teresa Scotognella
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Univ Degli Studi Roma La Sapienza
Fondazione Policlinico Univ Agostino Gemelli Irccs
Univ Cattolica Del Sacro Cuore
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Description

DESCRIZIONE dell'invenzione avente per titolo:
“Radiofarmaco per utilizzo diagnostico terapeutico in medicina nucleare e medicina radio guidata"
STATO DELL’ARTE
I radio-traccianti (anche detti traccianti radioattivi o radio-farmaci) sono medicinali che includono uno o più radioisotopi in grado di emettere radiazioni.
I radio-traccianti possono essere utilizzati nella chirurgia radioguidata (“radio-guided surgery”, RGS), vale a dire una tecnica chirurgica impiegata nella rimozione di tumori che si avvale delle radiazioni emesse dai radio-traccianti per discriminare il tessuto canceroso dagli organi sani circostanti, migliorando così il processo di rimozione del tumore. Il radio-tracciante è captato preferenzialmente dalle cellule neoplastiche, e tali cellule neoplastiche si identificano mediante un dispositivo, detto sonda, in grado di rilevare la radiazione emessa dal radio-tracciante. La RGS consente al chirurgo di valutare in tempo reale la completezza della resezione del tumore, riducendo al minimo la quantità di tessuto sano rimosso.
La RGS può risultare cruciale per la sopravvivenza dei pazienti oncologici per i quali la rimozione della massa tumorale è l'unica opzione terapeutica.
La RGS si basa convenzionalmente su una combinazione di radio-farmaci che emettono radiazioni γ e sonde specifiche sensibili a tali radiazioni. Benché la RGS con radiazioni γ sia ampiamente validata, le attuali applicazioni cliniche di questa tecnica risultano limitate al cancro del colon (chirurgia radio-immuno-guidata), alla mappatura del linfonodo sentinella nel melanoma maligno e nel carcinoma mammario, all'identificazione dell’adenoma paratiroideo e ad alcuni tumori ossei. Il limite maggiore della RGS con radio-emettitori γ è infatti rappresentato dall’elevato potere di penetrazione dei raggi γ. Dal momento che questi possono attraversare grandi quantità di tessuto, ogni eventuale captazione di radio-tracciante da parte dei tessuti sani limitrofi al tumore può determinare una radiazione di fondo non trascurabile (paragonabile o superiore al segnale proveniente dalle lesioni tumorali) che può precludere l’applicazione della tecnica. Per la stessa ragione, il personale medico può risultare esposto ad una corposa dose di radiazioni, a meno che non si somministri una dose molto bassa di radiotracciante. La RGS con radiazioni γ non può pertanto essere applicata a molti tumori, come ad esempio ai tumori cerebrali (vista l’alta captazione del cervello sano), addominali (specie se in prossimità di reni, vescica e fegato, a causa della grande captazione di tracciante da parte di tali organi) e pediatrici (dove, a seguito delle dimensioni ridotte, le distanze tra gli organi sono molto brevi).
La RGS è stata applicata anche in associazione ad emettitori di radiazioni β<+>. Tuttavia, la realizzazione e l’impiego delle sonde per la tracciabilità dei radio-farmaci emettitori β<+ >risultano complicati, poiché tali sonde devono schermare i raggi γ che comunque vengono prodotti quando il positrone β<+ >emesso annichila per interazione con gli elettroni dei tessuti corporei. Per questo motivo, lo sviluppo di RGS con β<+ >non ha mai superato la fase pre-clinica. Molto recentemente, per superare i suddetti limiti della RGS con radiazioni γ o β<+>, è stato proposto l’uso in RGS di radio-traccianti emettitori puri di elettroni, vale a dire di particelle β-. La radiazione pura β<- >penetra soltanto per pochi millimetri nei tessuti e può risultare, a seconda dei radionuclidi utilizzati, sostanzialmente priva di contaminazione γ. Inoltre, le sonde β-specifiche risultano compatte e facilmente manovrabili. Ancora, la RGS con β<- >è efficace anche con la somministrazione di una quantità di radio-tracciante β<- >di molto inferiore rispetto alla quantità convenzionalmente somministrata di radio-traccianti γ o β<+>, consentendo così di operare con un fondo più basso da parte dei tessuti sani circostanti alla lesione tumorale e fornendo una più chiara delineazione dei margini della stessa. Ciò permette quindi di estendere il campo di applicazione della RGS anche ai casi con una grande captazione da parte degli organi sani circostanti. La dose assorbita più bassa e il corto raggio di azione degli elettroni (radiazioni β-), implicano infine un’esposizione alle radiazioni quasi trascurabile da parte del personale medico.
La validazione e l’applicabilità della chirurgia radioguidata da traccianti β<- >(β--RGS), dipende strettamente dalla disponibilità di radio-farmaci β-, che attualmente risulta molto limitata.
Pertanto, vi è la necessità di sviluppare radio-farmaci in grado di emettere radiazioni β<- >che mostrino una captazione preferenziale da parte dei tessuti/lesioni tumorali che devono andare incontro a resezione mediante RGS e che mostrino un profilo farmacocinetico ottimale per la somministrazione nell’uomo.
SCOPI DELL’INVENZIONE
Scopo della presente invenzione è fornire un radio-farmaco, particolarmente un radio-farmaco β<- >emittente, adatto all’esecuzione della chirurgia radioguidata, della diagnostica per immagini, della terapia radio-metabolica, così come per altre applicazioni.
Scopo della presente invenzione è fornire altresì una composizione che comprenda detto radiofarmaco, in particolare radio-farmaco β<- >emittente.
Scopo della presente invenzione è fornire infine usi e applicazioni per detto radio-farmaco, particolarmente β<- >emittente.
Scopo della presente invenzione è altresì fornire un radio-farmaco ed una composizione che lo comprenda che, cambiando opportunamente il radio-metallo, possa essere utilizzato nella diagnostica per immagini PET e SPECT.
DESCRIZIONE DELL’ INVENZIONE
Questi ed altri scopi sono raggiunti dal composto di Formula I:
in cui A è una porzione di ancoraggio legata alla posizione meta o para della benzilguanidina (BG) in grado di legare L, L è una porzione di collegamento, BFC è un chelante bifunzionale, e Me è un catione metallico emettitore di radiazioni.
Particolarmente preferito è un catione metallico emettitore di radiazioni β-.
In alternativa, detto catione metallico è un catione metallico emettitore di radiazioni γ o β<+>.Ιn particolare, con riferimento alla Formula I:
A è una porzione di ancoraggio che è scelta tra una funzione carbossammidica, anilidica, eterea, amminica e solfonammidica, preferibilmente è una carbossammide legata alla posizione meta o para della BG;
L è una porzione di collegamento che è una catena diamminoalchilica o diamminopolietilenglicolica, preferibilmente è una catena etilendiamminica;
BFC è un chelante bifunzionale scelto dal gruppo che comprende l’acido tetraazaciclo DOdecano-Tetra Acetico (DOTA), l’acido 1,4,7-triazacicloNOnano-N,AN,N"-TriAcetico (NOTA), e l’acido DietilenTriammoPentAcetico (DTP A), preferibilmente è il DOTA;
Me è un catione metallico emettitore di radiazioni. Nel caso in cui il catione metallico sia un emettitore β<' >puro, preferibilmente è 1<,90>Y<3+>. Nel caso il radio metallo sia un emettitore β<- >non puro, è scelto ad esempio il <177>Lu<3+>. Nel caso in cui il catione metallico sia un emettitore β<+>, è scelto ad esempiol'<86>Y<3+ >ed il <68>Ga<3+>. Nel caso in cui il catione metallico sia un emettitore γ, è scelto ad esempio l’<111>In<3+>.
Come sarà osservabile nella sezione sperimentale, il composto di Formula I, vale a dire il composto dell’invenzione, si è rivelato sorprendentemente efficace, soprattutto come radiotracciante β<- >puro, per i tumori iper-secernenti catecolamine che sovra-esprimono il trasportatore della norepinefrina (NET), così come per altre applicazioni (ad esempio, terapeutiche e, cambiando opportunamente il radio metallo, anche diagnostiche).
Il composto dell’ invenzione consta di cinque componenti principali (che verranno ampliamente descritti di seguito): una porzione benzilguanidinica come funzione di selettività per alcuni tipi di cellule tumorali, un catione metallico Me emettitore di radiazioni β-, un chelante bifunzionale (BFC), una porzione di collegamento L (vale a dire, linker) e una porzione di ancoraggio A, questi ultimi due utili a legare la porzione benzilguanidinica al chelante bifunzionale BFC. Il composto dell’invenzione è un radio-emettitore β<- >puro ed è substrato preferenziale del trasportatore assonale della norepinefrina (NE). Pertanto, il composto dell’invenzione sarà captato preferenzialmente dalle cellule tumorali che sovra-esprimono il NET (iper-secernenti catecolamine). Tra questi vi sono molti tumori neuroendocrini, quali feocromocitomi, paragangliomi, tumori carcinoidi e neuroblastomi, che trarrebbero vantaggi significativi dalla resezione completa mediante β--RGS, così come dal monitoraggio mediante imaging diagnostico che sfrutti la tomografia ad emissione di positroni (PET). La captazione preferenziale da parte delle cellule tumorali che sovra-esprimono il NET potrebbe essere dovuta all’analogia strutturale della benzilguanidina, contenuta nel composto dell’invenzione, con il neuro-ormone NE, che è il substrato endogeno del NET.
Il composto dell’invenzione, quando il catione metallico è scelto opportunamente, è in grado di emettere radiazioni β<- >in quanto può possedere un radio-metallo trivalente (Me<3+>) che, decadendo, emette radiazioni β-. Me più preferibilmente è <90>Y<3+ >per le sue caratteristiche di emivita (64 ore), spettro di energia (~ 2MeV) e assenza di decadimenti γ (emettitore puro) che lo rendono ideale per β<'>-RGS. In una forma di realizzazione alternativa, Me può essere un catione metallico che non emette radiazioni β-, ad esempio <89>Y<3+>. Il composto dell’invenzione comprendente tale metallo è così un composto “freddo”, vale a dire non marcato, ed è utile per la caratterizzazione del composto dell’invenzione, in quanto possiede proprietà chimico-fisiche e chimico-biologiche, ad esempio le proprietà farmacocinetiche e farmacodinamiche, coincidenti con quelle dei composti marcati dell’invenzione. Il catione metallico trivalente Me può alternativamente essere rappresentato dal <177>Lu<3+ >per applicazioni teranostiche (terapia radio-metabolica che sfrutta remissione β<' >e contemporaneo imaging SPECT che sfrutta l’emissione γ), dall’<86>Y<3+>e dal <68>Ga<3+ >per applicazioni di imaging PET che sfruttano l’emissione β<+>, dall’<111>In<3+>, per applicazioni di imaging SPECT che sfruttano l’emissione γ.
Il catione metallico Me è legato al composto dell’invenzione tramite legame di coordinazione grazie al legante bifunzionale BFC (“bi-functional chelator”). Per BFC si intende una molecola dotata della duplice funzione di chelare un catione metallico e contemporaneamente di legare vantaggiosamente ed in maniera covalente una porzione funzionale. Nel caso del composto dell’invenzione, la porzione funzionale è la benzilguanidina; tale porzione funzionale è legata al BFC tramite una porzione di collegamento L. Il chelante bifunzionale BFC preferito secondo la presente invenzione è il DOTA (acido tetraaza-ciclododecano tetra-acetico). Altri chelanti bifunzionali BFC vantaggiosi secondo la presente invenzione sono gli analoghi lineari o ciclici del DOTA, così come l’acido 1,4,7-triazacicloNOnano- N, N', N"-TriAcetico (NOTA), l’acido TEtraazaciclotetradecane-1,4,8,11-TetraAcetico (TETA) e l’acido DietilenTriammoPentAcetico (DTPA).
La porzione di collegamento L è una qualsiasi porzione che eviti l’interferenza (ad esempio, l’interferenza sierica e/o funzionale) tra il chelato metallico e la benzilguanidina. Preferibilmente, quando il BFC è il DOTA, la porzione di collegamento L è una porzione etilendiamminica. Altre porzioni di collegamento L possono essere utilizzate secondo il composto dell’invenzione, ad esempio catene diamminoalchiliche con lunghezze variabili dalle 2 alle 6 unità metileniche, catene diamminopolietilenglicoliche con lunghezze variabile dalle 2 alle 6 unità etilenglicoliche. La porzione di collegamento L è legata preferibilmente in modo covalente sia al chelante bifunzionale BFC, sia alla porzione di ancoraggio A, ad esempio tramite legami ammidici quando detta porzione di collegamento L è una porzione etilendiamminica e detto chelante bifunzionale BFC è il DOTA.
La porzione di ancoraggio A è un gruppo funzionale legato in meta o in para alla benzilguanidina del composto dell’ invenzione. La porzione di ancoraggio A lega la porzione di collegamento L alla benzilguanidina. La porzione di ancoraggio A può essere un gruppo chimico di varia natura, e può dipendere dalla porzione di collegamento L. Esempi di porzioni di ancoraggio A utili secondo il composto dell’ invenzione sono gruppi ammidici, anilidici, eteri, amminici e solfonammidici; preferibilmente la porzione di ancoraggio A è un gruppo ammidico.
In una forma di realizzazione preferita, il composto dell’ invenzione è il composto di Formula II
Formula II
in cui Me è il catione metallico emettitore di radiazioni, ad esempio un catione metallico emettitore β<- >puro, quale <90>Y<3+>. In una forma di realizzazione alternativa, Me può essere un catione metallico non radioattivo, ad esempio <89>Y<3+>, che è utile per la caratterizzazione chimicofìsiche e chimico-biologica del composto dell’invenzione. In ulteriori forme di realizzazione alternative Me può essere il catione metallico <177>Lu<3+ >per applicazioni teranostiche (terapia radio-metabolica che sfrutta l’emissione β<- >e contemporaneo imaging SPECT che sfrutta l’emissione γ), l’<86>Y<3+>ed il <68>Ga<3+ >per applicazioni di imaging PET che sfruttano l’emissione β<+>, l’<111>In<3+>, per applicazioni di imaging SPECT che sfruttano l’emissione γ.
Il composto di Formula II rappresenta il composto di Formula I in cui la porzione di ancoraggio A è un gruppo carbossammidico legato in meta alla BG, la porzione di collegamento L è un gruppo etilendiamminico e il legante bifunzionale BFC è il DOTA.
Il composto di Formula si è mostrato particolarmente efficace per il suo uso in tumori sovraesprimenti il NET : difatti, il composto di Formula in cui Me è <89>Y<3+>, è stato testato sulla linea di neuroblastoma umano SK-N-SH in esperimenti di competizione con la <3>H-NE, mostrando una inibizione dose-dipendente della captazione di <3>H-NE (IC50 ~10 μΜ), senza effetti citotossici dose-dipendenti evidenti fino alla massima concentrazione testata (100 μΜ).
Ancora, il composto di Formula II in cui Me <90>Y<3+>, è stato poi preparato con una resa di radiomarcatura >99% ed una purezza radiochimica >99%.
Il composto dell’invenzione pertanto è substrato del NET e può avere applicazioni cliniche molteplici, che ad esempio variano in base al tipo di catione metallico Me scelto. Il composto dell’invenzione, in quanto emettitore β<- >puro, può infatti trovare impiego nella RGS dei tumori neuroendocrini sovra-esprimenti NET, come ad esempio feocromocitomi, paragangliomi, tumori carcinoidi e neuroblastomi. Inoltre, il composto dell’invenzione può essere impiegato anche nella terapia radiometabolica degli stessi tumori neuroendocrini, così come può avere altresì utilizzi in diagnostica, in particolare in diagnostica per immagini. Ad esempio, quando Me è il radio-metallo <68>Ga<3+>, il composto dell’invenzione è utile per l’imaging PET dei tumori neuroendocrini NET positivi, mentre quando Me è <111>In<3+>, il composto dell’invenzione è utile per l’imaging con tomografia computerizzata ad emissione di fotone singolo SPECT. Ancora, quando Me è <177>Lu<3+>, il composto dell’invenzione ha funzione teranostica, vale a dire terapeutica e diagnostica, e può essere utile oltre che per la terapia radiometabolica anche per scopi di imaging (SPECT) e valutazioni dosimetriche.
Pertanto, oggetto della presente invenzione è anche il composto dell’invenzione per il suo uso come medicamento.
Una forma di realizzazione prevede il composto dell’invenzione per il suo uso nella diagnosi e/o nel trattamento di tumori, preferibilmente nel trattamento di tumori neuroendocrini che sovra-esprimono il trasportatore della norepinefrina (NET), ancor più specificamente nel trattamento di un tumore scelto dal gruppo che consiste in feocromocitoma, paraganglioma, tumore carcinoide e neuroblastoma.
Un’ulteriore forma di realizzazione prevede il composto dell’invenzione per il suo uso come radio-tracciante β-, preferibilmente come radio-tracciante β<- >puro.
Ancora, una forma di realizzazione prevede il composto dell’invenzione per il suo uso nella chirurgia radioguidata (RGS).
Oggetto della presente invenzione è anche un metodo di trattamento di un soggetto affetto da tumore che comprende la somministrazione al soggetto di una dose efficace del composto dell’invenzione, in cui il tumore è scelto tra tumori neuroendocrini sovra-esprimenti NET. Tale trattamento può prevedere la chirurgia radioguidata (RGS).
Il composto dell’invenzione può essere sintetizzato mediante tecniche convenzionali. Lo schema generale di sintesi prevede che una benzilguanidina protetta a livello del gruppo guanidinico e opportunamente funzionalizzata in posizione meta o para con una porzione di ancoraggio, venga legata mediante metodiche di coupling convenzionali ad un sintone preparato separatamente che risulta costituito dal BFC opportunamente protetto precedentemente legato alla porzione di collegamento L. Dopo il coupling, il coniugato completamente protetto BFC-L-A-BG viene sottoposto ad uno step di deprotezione finale che porta al legante, cioè il composto di Formula I privo del Me, pronto per la reazione di radiomarcatura conclusiva. Tale reazione è effettuata ad un temperatura di 85-115 °C, preferibilmente 90 °C, per un breve periodo di tempo, compreso tra i 15 e i 40 minuti, preferibilmente 30 minuti, in un tampone di ammonio acetato a pH = 5.5-6 incubando il legante BFC-L-A-BG con un sale opportuno del radio-metallo da complessare. Quando il radio-metallo è <90>Y<3+>, il sale preferito è <90>YCl3
Preferibilmente, è possibile sintetizzare il composto di Formula I in assenza di Me, ovvero prima della radio-marcatura finale. Ciò garantisce grande versatilità nell’ottimizzazione delle caratteristiche farmacocinetiche e farmacodinamiche dei chelati finali, elevate rese/purezze radiochimiche e tempi rapidi, riducendo allo stesso tempo i problemi di radioprotezione e risparmiando molte emivite di radioattività del metallo Me da incorporare che, a parità di chelante bifunzionale BFC, può essere ampiamente variato tra diversi cationi trivalenti
ecc.), includendo anche radio-metalli a breve emivita quali il <68>Ga<3+>.
E infine oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica che comprende il composto dell’invenzione ed eccipienti farmaceuticamente adatti.
Preferibilmente, tale composizione è caratterizzata dal fatto che la soluzione in cui avviene la radio-marcatura viene diluita con una soluzione di ammonio acetato tamponata a pH 7.2-7.4 che contiene un opportuno stabilizzante, quale acido ascorbico (il preferito), acido gentisico, o una soluzione aminoacidica da infusione, che agendo da intercettore di radicali liberi inibisca l’autoradiolisi del composto, e dopo filtrazione su filtri opportuni per garantirne la sterilità viene conservata in fiale pronte per l’infusione endovenosa.
SEZIONE SPERIMENTALE
La preparazione del composto di Formula II (anche indicato come chelato <90>Y-DOTA-BG, composto 1 o MC4324) è stata effettuata come riportato nello Schema 1. Il ciclene commerciale 2 è stato convertito nell’intermedio monoal chilato 3 mediante reazione con bromoacetato di etile in diclorometano (DCM) a temperatura ambiente. La reazione di alchilazione del composto 3 con ieri- butil bromoacetato in presenza di carbonato di potassio anidro in acetonitrile anidro ha poi fornito il tri-tert-butil 2,2',2"-(10-(2-etossi-2-oxoetil)-ciclen-1,4,7-tri-il)triacetato 4 che è stato quindi trattato con un eccesso di etilendiammina pura a temperatura ambiente per dare il sintone A (5) (Schema 1A). La sintesi del sintone B (7) è stata invece effettuata a partire dall’acido 3-(amminometil)-benzoico commerciale 6 mediante reazione di guani dinilazione con N, N'-bis-tert-butossicarbonil-1 H-pirazol-1-carbossamidina in tetraidrofurano (THF) anidro in presenza di trietilammina (TEA) a temperatura ambiente (Schema 1B). Il coupling tra il sintone A (5) ed il sintone B (7) in presenza di N-(3-dimetilamminopropil)- N'-etilcarbodiimide (EDCI), 1-idrossibenzotriazolo idrato (HOBt) e TEA in DCM anidro a temperatura ambiente, seguito da una reazione di deprotezione totale utilizzando una miscela acido trifluoroacetico (TFA):tri-isopropilsilano (TIS):acqua 95/2.5/2.5 (vol/vol/vol) ha poi condotto al legante libero 9 (MC4325) (Schema 1C). Il coniugato DOTA-BG 9 è stato poi complessato a caldo con un leggero eccesso di <89>Y(NO3)3 in presenza di un tampone acetato di ammonio a pH 5.5-6 in fiala chiusa per dare T analogo non radioattivo, detto anche “tracciante freddo”, del composto di Formula II (1, MC4324). Il coniugato DOTA-BG 9 è stato infine utilizzato in largo eccesso per la radio-marcatura a caldo con <90>YCl3 in presenza sempre del tampone acetato di ammonio a pH 5.5-6 (Schema 1C).
Schema 1°
aReagenti e condizioni: (a) bromoacetato di etile, DCM, 2 ore 0 °C -A 22 ore T amb.; (b) tertbutil bromoacetato, carbonato di potassio anidro, acetonitrile anidro, 4 ore, T amb.; (c) etilendiammina pura, 65 ore, T amb.; (d) TEA, N, N'-bis-tert-butossicarbonil- 1 H -pirazol- 1 -carbossamidina, THF anidro, 24 ore, T amb.; (e) EDCI, HOBt, TEA, DCM anidro, 25 ore, T amb.; (f) TFA:tri-isopropilsilano:acqua 95:2.5:2.5, da 0 °C a T amb., 22 ore; g) 89Y(NO3) 3, tampone ammonio acetato 1M (pH = 5.5-6), 3 ore, 90 °C; h) 90YCl3 (soluzione in 0.05M HC1), tampone ammonio acetato 1M (pH = 5.5-6), 30 minuti, 90 °C.
Gli spettri <1>H-NMR e <13>C-NMR sono stati registrati a 400 MHz e 100 MHz, rispettivamente, utilizzando uno spettrometro Bruker AC 400; gli spostamenti chimici sono riportati in unità δ (ppm) rispetto al tetrametilsilano usato come riferimento interno (Me4Si). Gli spettri 'H-NMR e <13>C-NMR del composto di Formula II (<90>Y-DOTA-BG, composto 1 o MC4324) sono stati registrati a 600 MHz e 150 MHz, rispettivamente, utilizzando uno spettrometro Bruker AC 600. Gli spettri di massa a bassa risoluzione sono stati registrati su un API-TOF Mariner Perspective Biosystem (Stratford, Texas, USA), i campioni sono stati iniettati da una pompa Harvard utilizzando una portata di 5-10 μL / min, infusa nel sistema Electrospray. Gli spettri di massa ad alta risoluzione (HR-MS) sono stati registrati su spettrometro Orbitrap Exactive (Thermo Fisher Scientific, Austin, TX USA). Le analisi HPLC analitiche dei composti 8, 9 e del <89>Y-DOTA-BG quale analogo non radioattivo del composto di Formula Π (1 o MC4324) sono state effettuate su:
- cromatografo liquido UHPLC Accela dotato di sistema di pompaggio, autocampionatore e PDA Accela detector accoppiato con spettrometro di massa LTQ ion trap dotato di una interfaccia ESI (Thermo Fisher Scientific, Austin, TX USA); i dati sperimentali sono stati acquisiti, processati e rielaborati mediante software Xcalibur (Thermo Fisher Scientific, Austin, TX, USA);
- cromatografo liquido Shimadzu Nexera dotato di CBM-20A controller, quattro LC-30AD pompe, un degassatore DGU-20 A5R, un rivelatore SPD-M20A PDA (Standard Analytical 2.50 μΐ Semimicro celi), velocità di campionamento: 100 Hertz; risoluzione: 4.0 nm), un alloggiamento colonne termostatato CTO-20AC e un autocampionatore SIL-30AC; al sistema è collegato in serie un rivelatore ELSD (Sedex 90, SEDERE, Francia); i dati sperimentali sono stati acquisiti, processati e rielaborati mediante software LabSolution.
La purificazione del composto <89>Y-DOTA-BG quale analogo non radioattivo del composto di Formula (1 o MC4324) è stata effettuata su cromatografo liquido semipreparativo (RP-HPLC) Waters dotato di pompa Waters 590 model, di iniettore 250 μL e rivelatore spettrofotometrico UV a lunghezza d’onda variabile e registratore su carta Omniscribe.
Tutti i composti sono stati regolarmente controllati mediante TLC e <1>H-NMR. La TLC è stata eseguita su lastre di gel di silice supportate da alluminio (Merck DC, Alufolien Kieselgel 60 F254) con macchie visualizzate mediante luce UV o utilizzando una soluzione alcalina di KMnCL. La concentrazione delle soluzioni dopo reazioni ed estrazioni è stata effettuata mediante l'uso di un evaporatore rotante che opera a una pressione ridotta di ~ 20 Torr. Le soluzioni organiche sono state essiccate su solfato di sodio o di magnesio anidro. Tutti i reattivi chimici sono stati acquistati
ed erano della massima purezza. Di norma, i campioni preparati per test fisici e biologici sono stati essiccati in alto vuoto su P2O5 per 20 ore a temperature comprese tra 25 e 40 °C, a seconda del punto di fusione del campione. Di seguito sono descritte le procedure sperimentali per la preparazione e caratterizzazione chimico-fisica dei composti 1-9.
Sintesi del composto etil 2-(1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1-il)acetato (3). Una soluzione di etil bromoacetato (LO g; 6.0 mmol) in DCM (10 mL) è aggiunta goccia a goccia nell’arco di 10 minuti ad una soluzione di ciclene commerciale 2 (1.36 g, 7.9 mmol) in DCM (16 mL) raffreddata in bagno a ghiaccio. Dopo 2 ore, la miscela di reazione viene portata a temperature ambiente e lasciata a reagire per ulteriori 22 ore. La sospensione risultante viene filtrata e il filtrato è evaporato a pressione ridotta. Il crudo di reazione giallo oleoso è infine purificato mediante cromatografia flash (da 100% DCM a DCM/metanolo/ammoniaca/acqua 70:30:5:5) ottenendo il composto 3 (1.61 g, 79%) sotto forma di olio viscoso bianco. <1 >H-NMR (CDCl3 ) δ ppm: 1.27 (t, J=7.2 Hz, 3H; CH2CH3), 2.84 (m, 8 H, CH2), 2.95 (m, 8H, CH2), 3.49 (m, 2H, NCH2COOCH2CH3), 4.16 (q, J=7.2 Hz, 3H, C(O)OCH2CH3). MS (ESI): 259 [M H]<+>.
Sintesi del tri-tert-butyl 2,2',2"-(10-(2-etossi-2-oxoetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecane-I,4,7-tri-il)triacetato (4). Ad una soluzione di ciclene monoalchilato 3 (0.98 g, 3.8 mmoli) in acetonitrile (35 mL), si aggiunge carbonato di potassio anidro (3.14 g, 22.8 mmoli). A questa sospensione è stata aggiunta goccia a goccia una soluzione di tert- butil bromoacetato (2.22 g, II.4 mmoli) in acetonitrile (10 mL) nell’arco di 20 minuti. La sospensione si lascia in agitazione a temperatura ambiente per 4 ore. Il solido in sospensione è stato poi rimosso mediante filtrazione, il solvente evaporato a pressione ridotta ed il residuo è stato infine purificato mediante cromatografia flash (da 100% DCM a 20% metanolo/DCM) per dare il composto 4 (1.90 g, 84%) sotto forma di una schiuma bianca. <1 >H-NMR (CDCl3 ) δ ppm: 1.15 (t, J=7.2 Hz, 3H, C(O)OCH2CH3), 1.33 (s, 9H, ffiu), 1.34 (s, 9H, iBu), 1.35 (s, 9H, tBu), 1.80-3.70 (set di multipletti molto ampi con integrazione corrispondente a 24H, CH2), 4.04 (q, J=7.2 Hz, 3H, C(O)OCH2CH3). MS (ESI): 623 [M+Na]<+>.
Sintesi del tri-tert-butil 2,2',2"-(10-(2-((2-amminoetil)ammino)-2-ossoetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-l,4,7-triil)triacetato (5, Sintone A). Il composto 4 (1.31 g, 2.18 mmoli) è stato sciolto in etilendiammina pura (2 mL, 29.9 mmoli) e la soluzione risultante è stata posta in agitazione a temperatura ambiente per 65 ore. Al termine della reazione l'etilendiammina è stata rimossa a pressione ridotta ed il residuo essiccato sotto vuoto per dare una schiuma di colore giallo chiaro che è stata infine purificata mediante cromatografia flash (da 100% DCM a DCM/metanolo 1:1) per fornire il composto 5 (1.04 g, 72%) sotto forma di schiuma bianca. <1 >H-NMR (CDCb) δ ppm: 1.38 (s, 27H, 3 x tBu ), 1.48 (m, 2H, NH2), 2.45 (m, 4H, 2 x CH2), 2.63 (m, 4H, 2 x CH2), 2.72 (t, 2H, CH2), 2.77-2.80 (m, 8H, 4 x CH2 ), 2.99 (s, 2H, CH2 ), 3.17 (br s, 4H, 2 x CH2), 3.20 (s, 2H, CH2), 3.21-3.27 (q, 2H, CH2), 8.68 (t, 1H, δ ppm: 27.68, 27.84, 36.60, 40.03, 55.39, 55.51, 55.90, 81.61, 81.70, 172.17, 172.27. MS (ESI): 637 [M+Na]<+>.
Sintesi dell'acido N,N' -bis-tert-butossicarbonil-3-guanidinometil-benzoico (7, Sintone B). Ad una sospensione di acido 3-(amminometil)-benzoico 6 commerciale (1.66 mmol, 250.0 mg) in una miscela di metanolo anidro (16.5 mL) e THF anidro (16.5 mL), sono stati aggiunti in sequenza TEA (6.61 mmol, 669.4 mg, 0.92 mL) e N,N'-bis-tert-butossicarbonil-1//-pirazolo-1-carbossamidina (1.98 mmol, 615.9 mg) e la miscela risultante è stata lasciata in agitazione per 24 ore a temperatura ambiente. Al completamento della reazione, il solvente è stato evaporato a pressione ridotta ed il residuo è stato disciolto in acetato di etile e lavato in successione con bisolfato di potassio 0.1 N e cloruro di sodio soluzione satura. La fase organica è stata quindi anidrificata su solfato di magnesio ed il solvente rimosso a pressione ridotta. Il grezzo di reazione è stato infine purificato mediante cromatografia flash su gel di silice (Biotage Isolera One<®>) eluendo con una miscela cloroformio/metanolo 0 → 6% per fornire l’intermedio 7 come un solido bianco. 1-NMR (DMSO-d6 ) δ ppm: 1.38 (s, 9H, C(CH3)3), 1.49 (s, 9H, C(CH3)3), 4.58 (d, 2H, NHC//2Ph-COOH), 7.45-7.51 (t, IH, CH anello benzenico), 7.54-7.56 (m, 1H, CH anello benzenico), 7.83-7.85 (m, 1H, CH anello benzenico), 7.89 (s, 1H, CH anello benzenico), 8.76-8.79 (t, 1H, NHCH2Ph-COOH), 11.53 (s, 1H, Boc-NH ), 12.98 (br s, IH, COOH ). MS (ESI): 392 [M - H]-Sintesi del tri-tert-butil 2,2',2"-(10-(2-((2-(3-((2,3-bis(tert-butossicarbonil)guanidino) metil)benzammido)etil)ammino)-2-ossoetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecan-l,4,7-triil) triacetato (8). Ad una soluzione di acido N,N'-bis-tert-butossicarbonil-3-guanidinometilbenzoico 7 (0.16 mmol, 64.0 mg) in DCM anidro (1.5 mL), si aggiungono in successione raffreddando in bagno a ghiaccio HOBt (0.21 mmol, 28.6 mg), EDCI (0.21 mmol, 40.5 mg), tri-tert-butyl 2,2', 2' '-(10-(2- ((2-amminoetil)ammino)-2-ossoetil)-ciclen-1,4,7-triil)triacetato 5 (100.0 mg, 0.16 mmol) ed infine TEA (0.58 mmol, 59.2 mg, 81.6 μl). Dopo circa 25 ore a temperatura ambiente, il solvente è rimosso per evaporazione ed il grezzo risultante è stato purificato mediante cromatografia flash su gel di silice (Biotage Isolera One<®>) eluendo con una miscela cloroformio/metanolo 0 → 8% per fornire il composto 8 (70.5 mg, resa = 44%) sotto forma di un solido bianco. H-NMR (CDCl3 ) δ ppm: 1.35 (s, 9H, tBu), 1.39 (s, 27H, 3 x tBu), 1.44 (s, 9H, fBu), 1.85-3.65 (set di multipletti molto ampi con integrazione corrispondente a 28 H, 14 x CH2), 4.60 (d, 2H, NHCH2 ), 7.33-7.36 (m, 2H, CH anello benzenico), 7.99 (s, 1H, CH anello benzenico), 8.15 (d, 1H, CH anello benzenico), 8.49 (m, 1H, N//CH2), 8.81 (m, 1H, CONH) , 9.03 (m, 1H, CONH), 11.5 (s, 1H, BocNH) . MS (ESI): 990 [M+H]<+>.
Sintesi dell’acido 2,2',2"-(10-(2-((2-(3-(guanidinometil)benzamido)etil)ammino)-2-ossoetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano-l,4,7-triil) triacetico (9, anche indicato come MC4325 0 coniugato DOTA-BG). Una miscela di TFA: tri-isopropilsilano:acqua 95:2.5:2.5 v:v:v (6.0 mL) è stata aggiunta all’intermedio 8 (0.091 mmol, 90.0 mg) raffreddando a 0 °C. La reazione di deprotezione è stata seguita via RP-HPLC nelle seguenti condizioni analitiche: colonna: Sunfire C18, 3.5 μm (150*4.6 mm ID); Eluenti: A) H2O/ACN 95/5 0,1%TFA, B) ACN 0,1%TFA. Eluizione in gradiente (start A/B 100/0; 1 min A/B 100/0; 15 min A/B 0/100, 20 min A/B 0/100). Flusso: 1.0 ml/min. Rivelazione: PDA (200-400 nm), ELSD (T: 80°C, P: 4 bar); T col = 30°C; campioni sciolti in MeOH. Dopo circa 22 ore a temperatura ambiente la reazione è risultata completa. Il solvente è stato quindi evaporato ed il residuo co-evaporato più volte con DCM anidro (6 x 3 mL) e dietil etere anidro (5 x 3 mL). Il grezzo così ottenuto è stato poi triturato con dietil etere anidro, filtrato e lavato su filtro con dietil etere anidro per fornire il composto desiderato 9 (88.2 mg, resa = 81%) sotto forma di un solido bianco.1 H-NMR (D2O) δ ppm: 2.90-3.75 (set di multipletti molto ampi con integrazione corrispondente a 28 H, 14 x CH2), 4.41 (d, 2H, NHCH2 ), 7.43 (m, 2H, CH anello benzenico), 7.62 (m, 2H, CH anello benzenico).
HR-MS (ESI): massa calcolata per = 622.3307 m/z; massa determinata: 622.3294 m/z. Parametri della sorgente: capillary temperature 275°C; spray voltage 3.70 kV; sheath gas 6; tube lens voltage 125 V. Resolution input: 100000. Campioni disciolti in MeOH (10<'5>M).
Preparazione del chelato <89>Y-DOTA-BG quale analogo non radioattivo del composto di Formula (1, MC4324). Al legante 9 (36.0 mg, 30.2 μmol) disciolto in 1 mL di un tampone 1M di acetato di ammonio (pH = 5.5-6) è stato aggiunto il sale commerciale <89>Y(NO3)3-4H2O (15.7 mg, 45.3 μmol). La soluzione risultante è stata poi posta in agitazione a caldo (90 °C) in fiala chiusa per 3 ore. Al termine della reazione, la miscela è stata lasciata raffreddare a T ambiente e poi il chelato grezzo è stato purificato dai sali in eccesso mediante HPLC semipreparativa (condizioni: colonna Hypersil ODS GOLD 5μm; 250x10 mm; eluente: MeOH/H2O 5:95 v/v 0.02% TFA, flusso: 4.0 mL/min; rivelazione UV 254nm) fino a fornire, dopo liofilizzazione delle frazioni pulite, il chelato “freddo” <89>Y-DOTA-BG 1 (MC4324) come un solido bianco pulverulento (19 mg, resa = 90%). 1 H-NMR (D2O, 600MHz, T = 5°C) δ ppm: 2.08 (d, 1H, CHH), 2.22-2.33 (m, 5H, 2 x C H2 e CHH), 2.53-2.67 (m, 7H, 3 x C H2 e CHH), 2.98 (d, 1H, CHH), 3.08 (d, 2H, C H2), 3.18-3.40 (m, 6H, 3 x C H2), 3.43-3.56 (m, 4H, 2 x C H2), 3.64 (m, 2H, CH2), 4.38 (d, 2H, -C H2-guanidina), 7.43 (m, 2H, CH anello benzenico), 7.60 (m, 2H, CH anello benzenico). <13>C-NMR (D2O, 150MHz, T = 5°C) δ ppm: 180.29, 179.71, 175.80, 169.98, 156.53, 136.86, 133.23, 130.63, 129.15, 129.13, 126.19, 125.21, 65.46, 65.32, 65.22, 63.04, 55.64, 55.47, 55.46, 55.35, 54.73, 54.72, 54.59, 54.18, 43.75, 39.20, 38.40.
HR-MS (ESI): massa calcolata per [C27H40N9O8Y+H]<+ >= 708.2131 m/z; massa determinata: 708.2124 m/z. Parametri della sorgente: capillary temperature 275°C; spray voltage 3.70 kV; sheath gas 6; tube lens voltage 125 V. Resolution input: 100000. Campioni disciolti in MeOH (10<-5>M).
Preparazione del composto di Formula (1, <90>Y-DOTA-BG, MC4324). Il chelato <90>Y-DOTA-BG di Formula (1) è stato preparato aggiungendo 30 μL di una soluzione commerciale di <90>YC in 0.05 M HCl (1.07 mCi, 22.1 pmol) a 132 μL di una soluzione 0.1 mM di legante 9 (13.2 nmol) in tampone 1M di acetato di ammonio (pH = 5.5-6) e portando al volume finale di 500 μL mediante aggiunta di 338 μL dello stesso tampone 1M di acetato di ammonio (pH = 5.5-6). La soluzione risultante è stata poi incubata in fiala chiusa posta su un blocco riscaldante sotto cappa schermata a 90 °C per 30 minuti. Al termine della reazione, dopo raffreddamento a T ambiente, diverse aliquote della soluzione (2-10 μL) sono state prelevate senza diluizione per valutare la resa di radiomarcatura ed effettuare il controllo di qualità mediante ITLC. I metodi ITLC utilizzati hanno visto l’impiego di lastrine ITLC-SG e ITLC-SA Agilent e di diversi sistemi eluenti quali 1M tampone ammonio acetato (pH = 5.5-6):metanolo (50:50 v/v), 1M tampone ammonio acetato (pH = 5.5-6):metanolo:ammoniaca 33% (50:50:5 v/v/v) e EDTA 50 mM in 0.1 M tampone acetato di ammonio (pH = 6). I risultati delle diverse corse cromatografiche concordemente hanno mostrato una resa di radio-marcatura ed una purezza radiochimica > 99% (Figura 1).
La Figura 1 mostra le corse ITLC-SG relative alla radio-marcatura del legante 9 con <90>YC per la preparazione del chelato <90>Y-DOTA-BG di Formula (1, o MC4324).
Stabilità chimica del chelato <89>Y-DOTA-BG quale analogo non radioattivo del composto di Formula II (1, MC4324) in condizioni fisiologiche.
La stabilità del chelato <89>Y-DOTA-BG (analogo non radioattivo del composto di Formula II, 1 o MC4324) in condizioni fisiologiche è stata valutata mediante analisi con HPLC analitico (cromatografo Shimadzu Nexera dotato di un rivelatore SPD-M20A PDA; colonna Hypersil ODS GOLD 250x4.6 mm; eluente: MeOH/H2O 5:95 v/v 0.02% TFA, flusso: 1.0 mL/min; rivelazione UV 214 nm) ripetuta ad intervalli di tempo regolari dopo averlo solubilizzato in tampone PBS (c = 0.9 mg/mL) e mantenuto alla T = 37°C. Dopo 5 giorni, il chelato è risultato essere ancora perfettamente integro, con una purezza chimica costantemente superiore al 99.5% (vedi Tabella 1). Il chelato <89>Y-DOTA-BG (picco 1 nel cromatogramma in Figura 2A-C) ha rivelato fin da subito la presenza di un picco 2 (inferiore allo 0,1%) che si è mantenuto anch’esso costante nel tempo.
La Figura 2 mostra il tracciato HPLC relativo al composto <89>Y-DOTA-BG (1) solubilizzato in tampone PBS (c = 0.9 mg/mL) ed alla T = 37°C al tempo t = 0 min (A), t = 21 ore (B) e t = 5 giorni (C).
Validazione biologica del chelato <89>Y-DOTA-BG (analogo non radioattivo del composto di Formula II, 1 o MC4324) quale substrato del NET nella linea di neuroblastoma umano SK-N-SH.
La capacità del chelato <89>Y-DOTA-BG (analogo non radioattivo del composto di Formula , 1 o MC4324) di agire da substrato del NET è stata valutata in esperimenti di competizione con il substrato endogeno triziato <3>H-NE per la captazione da parte delle cellule di neuroblastoma umano SK-N-SH, note per esprimere in quantità elevata il trasportatore NET. In questa linea cellulare, il chelato <89>Y-DOTA-BG ha mostrato una inibizione dose-dipendente della captazione/internalizzazione di <3>H-NE (IC50 ~10 μΜ) rivelandosi substrato del NET in maniera analoga alla MIBG, benché con una potenza inferiore (Figura 3) e senza effetti citotossici dosedipendenti evidenti fino alla massima concentrazione testata (100 μΜ). E’ interessante notare come l'analogo del chelato <89>Y-DOTA-BG che non contiene ittrio, il legante libero 9 (MC4325), sia risultato completamente incapace di competere con il <3>H-NE per l'internalizzazione (Figura 3). Questo fornisce la possibilità di preparare versioni radio-marcate del chelato di Formula II (1 o MC4324) con un'attività specifica anche bassa, poiché l'assenza di competizione per il NET tra il chelato 1 (MC4324) ed il legante libero 9 (MC4325) fa sì che la capacità di legame al NET del chelato (composto di Formula II, 1 o MC4324) non sia compromessa anche in presenza di un eccesso di legante libero 9 (MC4325).
La Figura 3 mostra la competizione del chelato <89>Y-DOTA-BG (analogo non radioattivo del composto di Formula , 1 o MC4324) e del legante libero 9 (MC4325) con la <3>H-NE (50 nM, 1 ora di incubazione, T = 37 °C) per la captazione da parte delle cellule SK-N-SH. 1 H-ΝΕ @ 20 μΜ e MIBG @ 2 μΜ sono stati usati come controlli positivi.
Materiali e metodi relativi ai test cellulari
Linee cellulari e condizioni di coltura
La linea cellulare di neuroblastoma umano SK-N-SH è stata acquistata da ATCC. Le cellule sono state mantenute in terreno E-MEM contenente 10% di siero bovino fetale (FBS), 2 mM di L-glutammina e antibiotici in atmosfera umidificata con 5% di CO2 a 37 °C.
Captazione cellulare della <3>H-NE
La <3>H-NE è stata acquistata dalla PerkinElmer. Per misurare le velocità iniziali di captazione cellulare della <3>H-NE, le cellule sono state cresciute per 16 ore in presenza di solo siero, poi incubate con terreno legante (EMEM contenente 0.2% BSA e 20 mM Hepes, pH 7.5) per 10 minuti riscaldando in un bagno ad acqua a 37 °C. Il legame è stato iniziato aggiungendo 0.5 mL per pozzetto di <3>H-NE 50 nM al mezzo legante per diverso tempo, le piastre sono state poi messe su ghiaccio e lavate tre volte con PBS ghiacciato. Quindi, i monostrati cellulari sono stati essiccati e Usati con NaOH-2% SDS IN. I cpm interni sono stati determinati separatamente nei diversi pozzetti in triplicato per ciascun tempo. Il legame di fondo è stato determinato in parallelo in un quarto pozzetto contenente un eccesso molare di 400 volte di NE non marcata. Per lo studio di competizione, le cellule sono state piastrate come sopra, e quindi incubate per 1 ora con <3>H-NE 50 nM in mezzo legante in assenza e presenza del chelato <89>Y-DOTA-BG (analogo non radioattivo del composto di Formula II, 1 o MC4324) e del legante libero 9 (MC4325) a diverse concentrazioni. La radioattività è stata determinata separatamente nei pozzetti in triplicato per ogni valore di concentrazione. La captazione di <3>H-NE è stata espressa come percentuale della radioattività totale normalizzata per mg di proteine.
Stabilità nel siero del chelato <90>Y-DOTA-BG di Formula (1 o MC4324).
La stabilità nel siero del chelato <90>Y-DOTA-BG di Formula (1 o MC4324) è stata valutata misurando il rilascio del catione metallico <90>Y<3+ >dal chelato alle proteine sieriche nel corso di 14 giorni in cui è stato mantenuto in condizioni fisiologiche. In breve, il chelato <90>Y-DOTA-BG di Formula II (1 o MC4324) è stato incubato con il siero umano (32MBq per 16 mL di siero) alla T = 37 °C. Ad intervalli di tempo regolari sono state prelevate delle aliquote di siero e, utilizzando delle provette filtranti da centrifuga (Amicon® Ultra-4 3K, Merck Millipore) e centrifugando a 5500 g, le proteine sieriche sono state separate dalla frazione non proteica del siero e la radioattività di entrambe le frazioni è stata misurata con un contatore β a scintillazione liquida (liquido di scintillazione utilizzato Perkin Elmer ULTIMA GOLD). Nel corso dei 14 giorni di osservazione nessuna perdita misurabile di radioattività (<90>γ<3+>) a favore della frazione proteica del siero è stata riscontrata.

Claims (12)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Composto di Formula I
  2. in cui A è una porzione di ancoraggio scelta nel gruppo costituito da ammide, anilide, etere, ammina e solfonammide, legata alla posizione meta o para della benzilguanidina (BG); L è una porzione di collegamento scelta nel gruppo costituito da catene diamminoalchiliche con lunghezze variabili dalle 2 alle 6 unità metileniche e catene diamminopolietilenglicoliche con lunghezze variabile dalle 2 alle 6 unità etilenglicoliche; BFC è un chelante bifunzionale scelto nel gruppo costituito da DOTA, NOTA, TETA e DTP A; e Me è un catione metallico emettitore di radiazioni. 2. Composto secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto catione metallico emettitore di radiazioni è scelto dal gruppo costituito da
  3. 3. Composto secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto catione metallico è un catione metallico emettitore di radiazioni β<- >puro.
  4. 4. Composto secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto chelante bifunzionale BFC è il DOTA.
  5. 5. Composto secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto detta porzione di collegamento L è un gruppo etilendiamminico.
  6. 6. Composto secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto detta porzione di ancoraggio A è un gruppo ammidico.
  7. 7. Composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti di Formula II:
    in cui Me è un catione metallico radio-emettitore scelto nel gruppo costituito da
    preferibilmente è <90>Y<3+ >o <89>Y<3+>.
  8. 8. Composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti per il suo uso come medicamento.
  9. 9. Composto secondo la rivendicazione precedente per il suo uso come radio-tracciante β<' >puro.
  10. 10. Composto secondo la rivendicazione 8 per il suo uso nella diagnosi e/o nel trattamento di tumori, preferibilmente di tumori neuroendocrini che sovra-esprimono il trasportatore della norepinefrina (NET), preferibilmente nel trattamento di un tumore scelto dal gruppo che consiste in feocromocitoma, paraganglioma, tumore carcinoide e neuroblastoma.
  11. 11. Composto secondo la rivendicazione 8 per il suo uso nella chirurgia radioguidata (RGS).
  12. 12. Composizione farmaceutica che comprende il composto come descritto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8 ed eccipienti farmaceuticamente adatti.
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