IT201800005721A1 - Nuove composizioni per il trattamento di leiomiomi uterini - Google Patents
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Description
"NUOVE COMPOSIZIONI PER IL TRATTAMENTO DI LEIOMIOMI UTERINI"
La presente invenzione riguarda nuovi approcci per il trattamento e la prevenzione dei fibromi uterini, in particolare, riguarda estratti o frazioni di estratto di luppolo e/o carciofo per l’uso nel trattamento e/o nella prevenzione dei fibromi uterini, composizioni comprendenti tale o tali estratti o frazioni d’estratto, metodi terapeutici che comprendono la somministrazione di tali estratti o loro frazioni, o di composizioni che li comprendono per il trattamento o la prevenzione dei leiomiomi uterini.
DESCRIZIONE
STATO DELLA TECNICA ANTERIORE
I leiomiomi uterini (fibromi o miomi) sono tumori pelvici solidi che si riscontrano nel 20-40% delle donne durante l’età riproduttiva. Sono i più diffusi tumori benigni del tratto genitale femminile per le donne in età fertile, associati ad un’alterazione dell’equilibrio ormonale. Interessano fino al 40% della popolazione femminile di età compresa tra i 35 e i 55 anni, tra cui 24 milioni di donne nell’Unione Europea e 20 milioni in Nord America (Gupta S, Jose J., Manyonda I. Best Practice and Research Clinical Obstetrics and Gynaecology. 2008; 22(4):615-626). Inoltre è documentata un’incidenza più elevata di fibromi uterini tra le donne di razza nera rispetto a quelle di razza bianca (Marshall et al. Variations in the Incidence of Uterine Leiomyoma Among Premenopausal Women by Age andRace. Obstet Gynecol.1997;90:967-973).
Sono i più diffusi tumori benigni del tratto genitale femminile per le donne in età fertile, associati ad un’alterazione dell’equilibrio ormonale.
I fibromi si sviluppano nella muscolatura liscia dell’utero sotto l’influenza di stimoli genetici e ormonali. Nel 50% dei casi presentano sintomi che si ripercuotono sulla salute generale e sessuale:
cicli abbondanti fino all’emorragia,
compressione sugli organi vicini (vescica, retto),
dolore durante i rapporti,
complicanze in gravidanza,
infertilità.
Fino a poco tempo fa il leiomioma era considerato come un tumore benigno e pertanto l’aspetto che veniva prevalentemente studiato in vitro era la proliferazione cellulare. L'eziopatologia del fibroma uterino rimane poco chiara, multifattoriale, ed enigmatica. Studi hanno riportato che i leiomiomi mostrano dipendenza da steroidi per la crescita e lo sviluppo. Il background genetico sembra giocare un ruolo importante, con anomalie citogenetiche osservate in circa il 40% dell'utero che presenta fibromi (da Ciavattini A, Di Giuseppe J, Stortoni P, et al. Uterine Fibroids: Pathogenesis and Interactions with Endometrium and Endomyometrial Junction. Obstetrics and Gynecology International.
2013;2013:173184. doi:10.1155/2013/173184.)
Solo recentemente è cambiato completamente il modo di considerare questa patologia considerandola essenzialmente come una fibrosi, per tanto caratterizzata dall’aumento di molecole della matrice extracellulare (ECM), aumento dei fattori di crescita e delle concentrazioni di citochine e chemochine.
Il leiomioma uterino è un tumore benigno caratterizzato da fibrosi aberrante. I leiomiomi contengono il 50% in più di proteine della matrice extracellulare rispetto allo stesso miometrio sano del paziente. La disregolazione della matrice extracellulare è ben documentata nei leiomiomi rispetto al miometrio sano e può essere responsabile della trasformazione delle cellule miometriali in miofibroblasti. La trasformazione cellulare in un fenotipo miofibroblastico è un evento chiave per il ripristino dell'omeostasi tissutale e per la guarigione della ferita. I leiomiomi possono svilupparsi da un disturbo nel processo di guarigione della ferita, simile alla formazione di cheloidi.
La maggior parte di questi tumori è costituita da livelli aberranti di numerose componenti della matrice extracellulare, come la fibronectina, il collagene e i proteoglicani. La fibronectina è una glicoproteina della matrice extracellulare che si lega al collagene e alle integrine. Ha un ruolo centrale nel fenotipo extracellulare e intracellulare delle cellule muscolari lisce. La fibronectina è coinvolta nell'adesione cellulare e nella riparazione dei tessuti e regola l'espressione di altre componenti della matrice extracellulare. Il collagene 1A1, il più abbondante dei collageni di tipo I, contribuisce in modo determinante all'architettura del tumore e ha dimostrato di essere presente in alte concentrazioni nei tessuti di leiomioma. Versican è un proteoglicano le cui proprietà leganti nella matrice extracellulare influenzano la crescita, la migrazione e la differenziazione delle cellule (da Islam MS, Protic O, Ciavattini A, Giannubilo SR, Tranquilli AL, Catherino WH, Castellucci M, Ciarmela P. Tranilast, an orally active antiallergic compound, inhibits extracellular matrix production in human uterine leiomyoma and myometrial cells. Fertil Steril. 2014 Aug;102(2):597-606. doi: 10.1016/j.fertnstert.2014.05.013.)
Inoltre, la matrice extracellulare può servire da riserva per i fattori di crescita, citochine, chemochine, mediatori di risposta angiogenici e infiammatori.
Ad esempio l’activina-A è un membro della superfamiglia del TGF-β e possiede una grande varietà di funzioni biologiche come la regolazione della differenziazione cellulare, l'apoptosi e carcinogenesi inclusa l'inibizione della crescita cellulare di diversi tipi cellulari. L’activina-A possiede anche un effetto stimolante sulla produzione della matrice extracellulare in diverse cellule. In un modello cellulare, è stato trovato che l'activina-A aumenta in modo significativo l’espressione dell’mRNA della fibronectina, del collagene1A1 e del versican sia in cellule di miometrio e di leiomioma immortalizzate che in cellule miometriali e di leiomioma primarie isolate da pazienti.
Recentemente (Cox et al, “Ulipristal Acetate and Extracellular Matrix Production in Human Leiomyomas In Vivo: A Laboratory Analysis of a Randomized Placebo Controlled trial” Reproductive Science 1-92017), è stato dimostrato il ruolo fondamentale della matrice extracellulare nella patogenesi del leiomioma ed è emersa l’importanza delle seguenti molecole proteiche: fibronectina, collagene e versican (proteoglicano associato con la matrice extracellulare).
In particolare è stato dimostrato che il fibroma uterino è una formazione benigna caratterizzata da un’eccessiva produzione di fibronectina.
Alcuni farmaci con una riconosciuta efficacia possiedono questo tipo di meccanismo: Britten e colleghi (Britten JL, Malik M, Levy G, Mendoza M, Catherino WH. Gonadotropinreleasing hormone (GnRH) agonist leuprolide acetate and GnRH antagonist cetrorelix acetate directly inhibit leiomyoma extracellular matrix production. Fertil Steril. 2012 Nov;98(5):1299-307.) riportano che il cetrorelix, antagonista del GnRH, riduce di 1/3 o 2/3 (a seconda del tempo utilizzato per il trattamento) il quantitativo di mRNA della fibronectina in linee cellulari.
La letteratura riporta che Tranilast (acido N-3, 4-dimetossicinnamoilantranilico) farmaco sintetico a bassa tossicità, ampiamente utilizzato in Giappone dagli anni '80, efficace contro malattie allergiche come l’asma bronchiale bronco, rinite allergica, dermatite atopica e allergica congiuntivale, sia in grado di ridurre significativamente l'espressione di fibronectina, collagene 1A1 e livelli di mRNA del versican in cellule miometriali e di leiomioma primarie umane, come così come nella linea cellulare di leiomioma umano immortalizzata. Inoltre, ha mostrato riduzione intracellulare della proteina fibronectina e del collagene 1 in cellule miometriali e di leiomioma primarie. Tranilast esibisce il suo potenziale terapeutico inibendo il rilascio di mediatori chimici da mastociti e basofili e grazie al suo meccanismo viene usato per prevenire i tumori cheloidei (un disordine fibrotico che condivide simili caratteristiche con i leiomiomi) da Islam MS, Protic O, Ciavattini A, Giannubilo SR, Tranquilli AL, Catherino WH, Castellucci M, Ciarmela P. Tranilast, an orally active antiallergic compound, inhibits extracellular matrix production in human uterine leiomyoma and myometrial cells. Fertil Steril. 2014 Aug;102(2):597-606. doi: 10.1016/j.fertnstert.2014.05.013.
Il trattamento di prima scelta per le donne affette da fibromi che desiderano procreare, è la miomectomia effettuata per i fibromi sottomucosi e intramurali. Vi sono poi embolizzazione dell’arteria uterina (procedura meno frequente) e l’isterectomia, la forma di trattamento più invasiva e che non permette più alla donna di procreare.
Per le donne che rifiutano il trattamento chirurgico, sono disponibili pochi trattamenti farmacologici e con risultati non risolutivi. Sono terapie mediche pre-operatorie per il trattamento dei fibromi uterini sintomatici, da Khan et al. Uterine fibroids: current perspectives. International Journal of Women’s Health 2014:695–114.
Trattamenti di tipo ormonale (agonisti/antagonisti /progestinici/androgeni)
- Agonisti dell’ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH). Impiegati prevalentemente per ridurre il volume dei fibromi, tuttavia, questi agonisti hanno effetti collaterali importanti (vampate, demineralizzazione ossea, secchezza vaginale). Due dei farmaci più comunemente prescritti sono leuprolide (Leuprorelina acetato (DCI)) e nafarelin altri sono Triptorelin, Nafarelin, Buserelin e Goserelin. Sono tutti impiegati per ridurre gli estrogeni stimolando la secrezione di GnRH. Gli agonisti agiscono inducendo un abbassamento dei livelli di estrogeni e progesterone tale da provocare nella donna uno stato di menopausa temporanea. Il trattamento non può superare i 6 mesi.
- Antagonisti del GnRH. Recentemente, è stato sperimentato l’utilizzo del Ganirelix (altri farmaci sono Cetrorelix, Abarelix, Iturelix), un antagonista del GnRH, nella terapia pre-chirurgica dei fibromi uterini. Gli antagonisti del GnRH, rispetto agli agonisti, sembrano determinare una più rapida riduzione del volume dell’utero e dei fibromi, con conseguente riduzione della durata del trattamento e minore incidenza di effetti collaterali indesiderati di tipo simil-menopausale.
- Modulatori selettivi del recettore del progesterone (SPRM) come l’Ulipristal Acetato (UPA), si sono recentemente dimostrati promettenti in termini di efficacia terapeutica. Sembra che i progestinici esogeni possono sopprimere, in parte, la stimolazione estrogenica della crescita del fibroma uterino riducendo quindi il volume dei fibromi, dell’utero, controllandone il sanguinamento con un miglior profilo di tollerabilità rispetto agli agonisti del GnRH. La durata del trattamento non può superare i 3 mesi. A Gennaio 2017 Ulipristal acetato alla dose di 5 mg è stato approvato in Italia per il trattamento a lungo termine intermittente dei fibromi uterini sintomatici come 1° scelta di trattamento in donne con uno o più fibromi di cui almeno uno di dimensioni ≥ 3 cm con menometrorragia associata ad almeno una delle seguenti condizioni: livelli di Hb ≤ 10,2 g/dL; distorsione della cavità uterina che impedisce l’inserimento di IUD-Levonorgestrel; dolori da compressione che alterano la qualità di vita in donne non candidabili o che rifiutano la terapia chirurgica; controindicazione, eventi avversi clinicamente rilevanti o fallimento di altre strategie terapeuti-che mediche (LNG-IUD, estroprogestinici/progestinici orali, acido tranexamico, FANS).
Non sono mancati però all’interno degli studi clinici di efficacia e indicazione del trattamento intermittente per Ulipristal acetato, eventi avversi in alcune pazienti. I principali eventi avversi osservati nello studio PEARL IV (trattamento intermittente dei sintomi dei fibromi), che ha valutato fino ad un massimo di 4 cicli con 2 dosaggi di ulipristal (10 mg e 5 mg) sono stati sostanzialmente sovrapponibili a quelli osservati negli studi precedentemente descritti PEARL I ,II e III. Complessivamente, il 6,4% delle pazienti ha interrotto il trattamento a causa degli eventi avversi nel periodo di osservazione dello studio. Complessivamente sono stati segnalati 13 EA gravi considerati farmaco-correlati, di cui: 9 con ulipristal 5 mg [menorragia (5 casi), disturbo bipolare (1 caso), espulsione spontanea del fibroma (1 caso), dolore addominale (1 caso), mal di schiena (1 caso); 4 con ulipristal 10 mg [espulsione spontanea parziale del fibroma (1 caso), espulsione spontanea del fibroma (1 caso), necrosi del fibroma (1 caso), endometriosi (1 caso) da Scheda di Valutazione del farmaco Ulipristal. Doc PTR n. 247, Aggiornamento Gennaio 2017 Recepito con determina n.2560 del 23/02/2017 Direzione Generale Cura della Persona, Salute e Welfare.
- Recentemente è stato approvato, per il controllo del sanguinamento uterino anomalo, dalla FDA un dispositivo intrauterino (Progestin-releasing intrauterine device – IUD) a base di un agonista progestinico Levonorgestrel come valida alternativa all’utilizzo classico dei progestinici. Il dispositivo agisce producendo atrofia endometriale grazie all’erogazione di 20 mg/die di Levonorgestrel per la durata di 5 anni (Islam MS, Protic O, Giannubilo SR, Toti P, Tranquilli AL, Petraglia F, Castellucci M, Ciarmela P. Uterine leiomyoma: available medical treatments and new possible therapeutic options. J Clin Endocrinol Metab. 2013 Mar;98(3):921-34). Il dispositivo viene impiegato anche per il controllo delle nascite. Dopo il primo anno una percentuale di donne va incontro ad amenorrea. Da uno studio randomizzato su un consistente numero di pazienti è risultato che con l’utilizzo del dispositivo a rilascio di Levonorgestrel, il 68% delle donne riesce ad evitare l’intervento chirurgico. L’effetto terapeutico del dispositivo intrauterino è nella maggior parte dei casi preceduto da un periodo di circa 3 mesi caratterizzato da sanguinamenti irregolari.
- Possono essere prescritti altri farmaci quali Zoladex® e Danazol®: il primo è un analogo sintetico dell'LH-RH naturale. La sua somministrazione cronica inibisce la secrezione ipofisaria di LH dall'ipofisi, con conseguente riduzione della concentrazione sierica di testosterone negli uomini e di estradiolo nelle donne. Zoladex® è indicato: 1) nel trattamento del carcinoma della prostata e in altri trattamenti in cui sia indicata la soppressione della produzione di testosterone; 2) Carcinoma della mammella in donne in pre- e peri- menopausa in cui risulta indicato il trattamento ormonale. Endometriosi genitale ed extragenitale (stadi I-IV); 3) Fibromi uterini: Terapia prechirurgica, della durata di tre mesi, degli interventi di miomectomia e isterectomia nella paziente metrorragica; trattamento prechirurgico, della durata di un mese, degli interventi di ablazione endometriale e di resezione dei setti endouterini per via isteroscopia; 4) Trattamento della infertilità della donna in associazione alle gonadotropine (HMG, HCG, FSH) nei protocolli di induzione dell'ovulazione.
Danazol® è uno steroide sintetico che ha effetti androgenici, progestinici e antiestrogenici: inibisce l’ovulazione, al suo uso segue una riduzione drastica dei livelli circolanti di 17 beta estradiolo e progesterone. Il danazolo attiva i recettori per gli androgeni con diminuzione di SHBG, e per il suo effetto progestinico e antiestrogenico induce un’atrofia endometriale. Gli svantaggi del danazolo sono riconducibili all’effetto androginico causa di acne, aumento ponderale viscerale, irsutismo, alterazioni del profilo lipidico e glucidico, e all’effetto ipoestrogenico con vampate di calore, cefalea, sudorazione a cui non si associa rischio di osteoporosi per l’effetto androgenico. Tali effetti sistemici possono essere superati con una diversa via di somministrazione del farmaco. La somministrazione vaginale del danazolo, sia ciclica che continua, permette che l’azione del composto si eserciti a livello endometriale e uterino. Il trattamento con danazolo per via vaginale, ha dimostrato di ridurre l’entità delle metrorragie e delle perdite intermestruali e di aumentare la concentrazione di emoglobina e il benessere della donna. Nonostante ciò, il suo uso è penalizzato da una scarsa compliance.
FANS
- Antinfiammatori non steroidei: l'acido mefenamico viene impiegato per la menorragia in particolare quando è associata a dismenorrea. Acido mefenamico (lysalgo), usato nella dismenorrea per il trattamento del dolore. La posologia è di 500 mg/die in 2 somministrazioni a stomaco pieno.
Agenti fibrinolitici /emostatici
- Acido tranexamico (Ugurol, Lysteda®, Cyklokapron®). Questo farmaco non ormonale viene assunto per facilitare periodi mestruali pesanti. Viene preso solo nei giorni di gravi emorragie. L'acido tranexamico può essere usato per prevenire o per trattare il sanguinamento dovuto a fibrinolisi eccessiva e può essere particolarmente utile in caso di menorragia.
- Tra gli antifibrinolitici vi è pure l’etamsilato (dicynone) che riduce il sanguinamento capillare in presenza di un numero normale di piastrine e si assorbe bene per os. Non agisce tramite la stabilizzazione della fibrina, ma probabilmente correggendo un'anomala adesione piastrinica. L'azione antiemorragica dell'etamsilato è garantita dall'effetto diretto sull'adesività piastrinica, che risulta decisamente potenziata, dall'attivazione piastrinica e dall'aumentata espressione di molecole di adesione indotta dal principio attivo. Questo meccanismo d'azione consente una sensibile riduzione del tempo e del volume dei sanguinamenti, senza aumentare il rischio di trombosi.
Riassumendo, le terapie farmacologiche attualmente utilizzate sono per lo più rivolte al controllo dei sintomi da sanguinamento irregolare, come i contraccettivi orali (estroprogestinici o solo progestinici) e i dispositivi intrauterini (IUD) medicati al progesterone. Gli analoghi (agonisti/ antagonisti) dell’ormone che rilascia la gonadotropina (GnRH) sono utilizzati da molti anni, in particolare in fase preoperatoria allo scopo di ridurre le dimensioni del fibroma e bloccare il sanguinamento ma inducendo un quadro menopausale transitorio. Il beneficio fondamentale delle terapie farmacologiche è la non invasività, ma i principali svantaggi sono: 1- la ricomparsa dei sintomi correlati al fibroma uterino al termine della terapia;2- gli eventi avversi; 3-l’impossibilità di somministrare la terapia a lungo termine (3, 6 mesi massimo).
Da quanto descritto sopra, si comprende come gli effetti avversi dei farmaci, normalmente impiegati prima della rimozione chirurgica, fino ad oggi usati per la riduzione dei fibromi uterini, l’impossibilità di sottoporre le pazienti a trattamenti prolungati per via di tali effetti avversi, la frequente comparsa di recidive, rendono particolarmente importante e necessario l’identificazione di nuove sostanze efficaci per il trattamento, e possibilmente la prevenzione, soprattutto per le recidive, dei leiomiomi uterini.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
Gli autori della presente invenzione hanno scoperto che estratti di Luppolo e/o estratti di carciofo, o loro frazioni, intese anche come fitocomplessi, sono in grado di ridurre l’espressione della fibronectina, del collagene e del versican (proteoglicano associato alla matrice extracellulare), in cellule provenienti da biopsie di tessuto fibrotico di leiomiomi prelevate da pazienti informate, come riportato in letteratura per l’upristal acetato (Cox et al Reproductive Science 2017). Come riportato nella letteratura citata, la diminuzione di espressione delle suddette proteine è risultata essere associata alla diminuzione del volume dei fibromi uterini nelle pazienti trattate con upristal acetato. Tanto maggiore era la diminuzione nell’espressione delle suddette proteine e tanto maggiore era la diminuzione del volume del fibroma nelle pazienti trattate. Come del resto riportato nella stessa pubblicazione, era già stato correlato un aumento di espressione della fibronectina, del collagene e del versican con un meccanismo di crescita fibroide e disfunzione.
Gli autori della presente invenzione, quindi, hanno scoperto che estratti o frazioni di estratti, intese anche come fitocomplessi, di Humulus lupulus e/o Cynara scolimus sono in grado di ridurre l’espressione di fibronectina, collagene e versican in cellule in coltura prelevate da leiomiomi. In particolare, gli autori dell’invenzione hanno anche identificato una specifica frazione di estratto di Humulus lupulus, intesa anche come fitocomplesso derivato da Humulus lupulus, è in grado anche di ridurre l’espressione di fibronectina, collagene e versican nelle cellule uterine sane prelevate da campioni delle stesse pazienti, agendo, di fatto, come agente preventivo per ulteriori sviluppi fibromatosi. Sono quindi oggetto dell’invenzione estratto e/o frazione di estratto (intesa anche come fitocomplesso) di Humulus lupulus e/o Cynara scolimus per uso nel trattamento e/o nella prevenzione dei leiomiomi uterini, una composizione farmaceutica comprendente estratto e/o frazione di estratto di Humulus lupulus e/o Cynara scolimus e uno o più tra eccipienti, scelti tra diluenti, riempitivi, agenti di scorrimento, lubrificanti per forme solide, disgreganti, edulcoranti, conservanti, emulsionanti, lipidi, polimeri naturali e sintetici, modificatori reologici, solubilizzanti, agenti di sospensione, regolatori di pH, coloranti naturali e sintetici, antiossidanti, veicolanti, addensanti, tensioattivi, aggreganti farmaceuticamente accettabili, tale composizione per l’uso nel trattamento e/o la prevenzione dei leiomiomi uterini, un metodo per la preparazione di tali estratti o frazioni o fitocomplessi, un metodo per la preparazione di detta composizione farmaceutica, un metodo terapeutico per il trattamento e/o per la prevenzione (ad esempio di recidive) di leiomiomi uterini comprendente la somministrazione di detti estratti e/o frazioni di estratto (intese anche come fitocomplessi) o di detta composizione farmaceutica, da soli o in associazione ad altri farmaci o attivi noti a pazienti che lo necessitano.
ABBREVIAZIONI
Nelle figure e nella descrizione i codici riportati in tabella corrispondono a quanto indicato nella tabella 1 sotto. L’abbreviazione EL sta per Estratto Liofilizzato.
Tabella 1
NTD= Trattamento con il solo solvente (DMSO), e cioè controllo non trattato.
CN-10= cellule trattate con curcumina 10µM
CN-20= cellule trattate con curcumina 20µM
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE
La figura 1 riporta i dati ottenuti mediante analisi PCR del mRNA e rappresenta l’effetto di estratto di Luppolo, estratto di Carciofo come indicate in tabella 1, e loro frazioni (sempre come indicate in tabella 1) sull’espressione del mRNA della fibronectina in cellule di leiomioma uterino e cellule di miometrio.
I risultati ottenuti mostrano come ABO-AR-2016-027, ABO-AR-2016-015, ABO-AR-2016-026 and ABO-AR-2014-168 riducono l’espressione del mRNA della fibronectina in cellule primarie di leiomioma uterino rispetto al controllo in modo statisticamente significativo.
La figura mostra anche come ABO-AR-2016-014, e in particolare ABO-AR-2016-015, siano in grado di ridurre l’espressione di mRNA della fibronectina anche nelle cellule primarie di miometrio sano di pazienti con leiomiomi.
La figura 2 riporta i dati ottenuti mediante analisi PCR del mRNA rappresenta l’effetto di estratto di Luppolo, estratto di Carciofo come indicate in tabella 1, e loro frazioni (sempre come indicate in tabella 1) sull’espressione del mRNA del collagene 1A1 in cellule di leiomioma uterino e cellule di miometrio di diverse pazienti.
I risultati ottenuti mostrano come ABO-AR-2016-027, ABO-AR-2016-026 and ABO-AR-2014-168 riducono l’espressione del mRNA del collagene 1A1 in cellule primarie di leiomioma uterino rispetto al controllo.
La figura mostra come ABO-AR-2016-015, e in particolare ABO-AR-2016-026, siano in grado di ridurre in modo importante anche l’espressione di mRNA del collagene 1A1 anche nelle cellule primarie di miometrio sano di pazienti con leiomiomi.
La figura 3 riporta i dati ottenuti mediante analisi PCR del mRNA rappresenta l’effetto di estratto di Luppolo, estratto di Carciofo come indicate in tabella 1, e loro frazioni (sempre come indicate in tabella 1) sull’espressione del mRNA del versican in cellule di leiomioma uterino e cellule di miometrio di diverse pazienti.
I risultati ottenuti mostrano come ABO-AR-2016-026 riduce l’espressione del mRNA del versican in cellule primarie di leiomioma uterino rispetto al controllo.
La figura mostra come ABO-AR-2016-026, e in particolare ABO-AR-2016-015, siano in grado di ridurre in modo importante anche l’espressione di mRNA del versican anche nelle cellule primarie di miometrio sano di pazienti con leiomiomi.
La figura 4 riporta i dati ottenuti mediante analisi PCR del mRNA rappresenta l’effetto di estratto di Luppolo, estratto di Carciofo come indicate in tabella 1, e loro frazioni (sempre come indicate in tabella 1) sull’espressione del mRNA del Activina-A in cellule di leiomioma uterino e cellule di miometrio di diverse pazienti.
I risultati ottenuti mostrano come ABO-AR-2016-015, ABO-AR-2016-026 and ABO-AR-2014-168 riducono l’espressione del mRNA dell’Activina-A in cellule primarie di leiomioma uterino rispetto al controllo.
La figura 5 riporta i risultati di un esperimento di western blot che mostrano la riduzione dell’espressione della proteina fibronectina in cellule primarie di leiomioioma uterino non trattate o trattate con ABO-AR-2016-014, ABO-AR-2016-015, ABO-AR-2016-026, ABO-AR-2016-027. Il gene housekeeping utilizzato come controllo era la tubulina.
La figura 6 riporta i dati ottenuti mediante analisi PCR del mRNA rappresenta l’effetto di estratto di Luppolo, estratto di Carciofo come indicate in tabella 1 e della curcumina alla dose di 10 M e curcumina alla dose di 40 M sull’espressione del mRNA della fibronectina in cellule di leiomioma uterino e cellule di miometrio di diverse pazienti. I risultati ottenuti mostrano come ABO-AR-2016-027, ABO-AR-2016-026 riducono l’espressione del mRNA della fibronectina in cellule primarie di leiomioma uterino rispetto al controllo in modo simile al controllo positivo (curcumina 10 M).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
Come precedentemente spiegato, uno dei caratteri distinguibili dei leiomiomi uterini è l’accumulo di quantità eccessive di componenti della matrice extracellulare (ECM) inclusi fibronectina, collagene e versican (Stewart et al.
1994 “Relative overexpression of collagen type I and collagen type III messenger ribonucleic acids by uterine leiomyomas during the proliferative phase of the menstrual cycle” Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 79(3): 900-906;
Arici and Sozen 2000 “Transforming growth factor-beta3 is expressed at high levels in leiomyoma where it stimulates fibronectin expression and cell proliferation” Fertility and Sterility 73(5): 1006-11; Norian et al. 2009 “Transforming growth factor beta3 regulates the versican variants in the extracellular matrix-rich uterine leiomyomas. Reproductive Sciences 16(12):
1153-64”; Malik and Catherino 2012 “Development and validation of a threedimensional in vitro model for uterine leiomyoma and patient-matched myometrium” Fertility and sterility 97(6): 1287-1293”). L’accumulo di componenti ECM può essere sovraregolato da vari fattori di crescita inclusa l’Activina-A. E’ stato anche visto che l’Activina-A può aumentare in modo significativo l’espressione di fibronectina, collagene 1A1 e versican nelle cellule di leiomioma primario (Islam et al 2014, “Use of dietary phytochemicals to target inflammation, fibrosis, proliferation, and angiogenesis in uterine tissues: Promising options for prevention and treatment of uterine fibroids?” Molecular nutrition & food research 58(8): 1667-1684). L’accumulo di componenti ECM è un evento critico nel formare la struttura di base del leiomioma e si pensa che la struttura rigida ECM sia una causa di sanguinamento anomalo e di dolore o pressione pelvici. Quindi, l’inibizione di accumulo di componenti ECM (fibrosi) può essere (come del resto supportato da Cox et al Reproductive Science 2017) una buona soluzione per la terapia contro questo tipo di tumore benigno altresì invalidante. Gli autori della presente invenzione hanno quindi utilizzato analisi dell’espressione dei componenti ECM sopra citati per validare l’efficacia terapeutica degli estratti (o loro frazioni) secondo la presente descrizione.
È quindi un oggetto della presente invenzione un estratto e/o frazione di estratto di Humulus lupulus e/o Cynara scolimus per uso nel trattamento e/o nella prevenzione dei leiomiomi uterini.
Secondo una forma di realizzazione, detto estratto di Cynara scolimus è un estratto, ad esempio da foglie di carciofo, caratterizzato da una concentrazione di acidi caffeoilchinici totali dal 7 al 20% in peso. Un esempio di tale estratto è quello qui descritto come ABO-AR-2016-026.
Tale estratto può essere realizzato mediante estrazione idroalcolica, preferibilmente in etanolo, a 30-60° alcolici. Secondo una forma di realizzazione, quindi, l’estratto di Cynara scolimus può essere un estratto di foglie di carciofo in alcol (soluzione idroalcolica), preferibilmente etanolo, ad una gradazione alcolica da 30 a 60° alcolici, come ad esempio una gradazione alcolica di 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 °C alcolici circa, realizzata con metodi standard. Un esempio non limitante del metodo di estrazione è fornito nella sezione esempi relativamente alla realizzazione del campione ABO-AR-2016-026. La metodologia descritta nella sezione esempi può essere opportunamente modificata nella gradazione alcolica e nelle temperature secondo le normali conoscenze del tecnico medio del settore.
Secondo una forma di realizzazione, l’estratto di Humulus lupulus e/o Cynara scolimus può essere un estratto di coni interi di luppolo o un estratto di foglie di carciofo realizzato mediante tecniche d’estrazione convenzionali con alcol a gradazione alcolica compresa tra i 10 e i 60 ° alcolici. In una forma di realizzazione l’estratto può essere successivamente essiccato o liofilizzato ed essere utilizzato poi tal quale o elaborato per somministrazione in forma liquida, granulare, solida, semisolida. Le forme di realizzazione sopra descritte si applicano a questa definizione.
In una forma di realizzazione, l’alcol utilizzato per l’estrazione può essere etanolo.
Secondo una forma di realizzazione l’estratto di luppolo può essere un estratto di coni di luppolo in alcol (soluzione idroalcolica), preferibilmente etanolo, ad una gradazione alcolica da 10 a 35° alcolici, come ad esempio una gradazione alcolica di 10, 20, 25, 30, 35 ° alcolici circa, realizzata con metodi standard. Un esempio non limitante del metodo di estrazione è fornito nella sezione esempi relativamente alla realizzazione del campione ABO-AR-2016-026. La metodologia descritta nella sezione esempi può essere opportunamente modificata nella gradazione alcolica e nelle temperature secondo le normali conoscenze del tecnico medio del settore.
Altri estratti idroalcolici ottenuti con metodiche standard possono essere utilizzabili per applicare l’invenzione qui descritta.
Secondo una ulteriore forma di realizzazione, invece dell’estratto intero come sopra descritto (e descritto nella sezione esempi come “monoestrazione”) possono essere utilizzate frazioni ottenibili da procedimenti di estrazione da luppolo o carciofo o anche fitocomplessi isolabili sempre dalle parti già indicate sopra (coni di luppolo e foglie di carciofo) di dette piante.
Secondo una forma di realizzazione, la frazione di estratto di carciofo, può essere una frazione di estratto da foglie di Cynara scolimus caratterizzata da una concentrazione di acido clorogenico da 2 a 7% e da una concentrazione di cinaropicrina da 0,5 a 4% in peso.
Un esempio di tale frazione di estratto è rappresentato dalla frazione qui definita come ABO-AR-2014-168.
Tale frazione è ad esempio ottenibile mediante estrazione con etanolo a 96° alcolici. È fornito nella sezione esempi un esempio non limitante di come si possa ottenere una frazione di estratto di carciofo che risponde alle forme di realizzazione sopra descritti e rivendicate.
Secondo una forma di realizzazione dell’invenzione, sono utilizzabili frazioni di estratto di luppolo (intese come frazioni o come fitocomplessi derivanti dai passaggi di estrazione descritti nella presente descrizione e nella sezione esempi) ottenibili ad esempio mediante estrazione con etanolo a 96° alcolici. Un esempio di tale forma di realizzazione è dato dalla frazione qui descritta come ABO-AR-2016-014. Nella sezione esempi è fornito un esempio non limitante di come si può preparare tale frazione. Secondo una ulteriore forma di realizzazione, la frazione di estratto di luppolo può essere una frazione da coni di luppolo ottenibile mediante un secondo passaggio della droga utilizzata durante l’estrazione con etanolo a 96° alcolici (come descritto sopra), in etanolo a 13° alcolici. Un esempio di tale frazione è dato dalla frazione qui definita come ABO-AR-2016-015. Nella sezione esempi è fornito un esempio non limitante di come si può preparare tale frazione.
Come mostrato nelle figure e nella sezione esempi, tutte le forme di realizzazione sopra elencate sono efficaci nel ridurre l’espressione delle proteine EMC testate, avvalorando l’effetto terapeutico degli estratti e delle frazioni di estratto (intese anche come fitocomplessi) qui descritte. Qualsiasi combinazione tra due o più delle forme di realizzazione sopra descritte è oggetto dell’invenzione.
E’ quindi oggetto dell’invenzione il solo estratto di luppolo o il solo estratto di carciofo come sopra descritti per l’uso terapeutico indicato; è anche oggetto dell’invenzione una combinazione tra estratto di luppolo e/o estratto di carciofo come sopra descritti e una o più frazioni di luppolo tra quelle sopra riportate (estrazione con etanolo a 96° alcolici e/o 13° alcolici dopo estrazione con etanolo 96° alcolici come sopra descritte) per l’uso terapeutico indicato; è anche oggetto dell’invenzione una combinazione tra estratto di luppolo e/o estratto di carciofo come sopra descritti e la frazione di estratto di carciofo come sopra definita (estrazione a 96° alcolici) per l’uso terapeutico indicato; è ulteriormente oggetto dell’invenzione una combinazione tra estratto di luppolo e/o estratto di carciofo come sopra descritti e una o più frazioni tra quelle sopra riportate e cioè luppolo: estrazione con etanolo a 96° alcolici, luppolo 13° alcolici dopo estrazione con etanolo a 96° alcolici, carciofo estrazione con etanolo a 96° alcolici come sopra descritte per l’uso terapeutico indicato ed è anche oggetto dell’invenzione è ulteriormente oggetto dell’invenzione una combinazione tra una o più frazioni tra quelle sopra riportate e cioè luppolo: estrazione con etanolo a 96° alcolici, luppolo 13° alcolici dopo estrazione con etanolo a 96° alcolici, carciofo estrazione con etanolo a 96° alcolici come sopra descritte per l’uso terapeutico indicato.
Sono quindi oggetto dell’invenzione le seguenti forme di realizzazione per l’uso nel trattamento e/o nella prevenzione dei leiomiomi uterini:
A: estratto di foglie di Cynara scolimus caratterizzato da una concentrazione di acidi caffeoilchinici totali dal 7 al 20% in peso o anche estratto di foglie di Cynara scolimus ottenibile mediante estrazione soluzione idroalcolica di etanolo a 30-60° alcolici;
B: estratto di coni di Humulus lupulus ottenibile mediante estrazione soluzione idroalcolica di etanolo a 15-30° alcolici;
C: A+B
D: frazione di estratto da foglie di Cynara scolimus caratterizzata da una concentrazione di acido clorogenico da 2 a 7% e da una concentrazione di cinaropicrina da 0,5 a 4% in peso o anche una frazione di estratto idroalcolico da foglie di Cynara scolimus ottenibile da estrazione con etanolo a 96° alcolici;
E: A+D
F: B+D
G: C+D
H: frazione di estratto idroalcolico da coni di Humulus lupulus ottenibile da estrazione con etanolo a 96° alcolici;
I: A+H
J: B+H
K: C+H
L: D+H
M: E+H
N: F+H
O: G+H
P: frazione di estratto idroalcolico da coni di Humulus lupulus ottenibile da estrazione in etanolo a 13° alcolici effettuata sul residuo di pianta prodotto dopo un primo passaggio di estrazione con etanolo a 96° alcolici;
Q: A+P
R: B+P
S: C+P
T: D+P
U: E+P
V: F+P
W: G+P
X: H+P
Y: I+P
a: J+P
b: K+P
c: L+P
d: M+P
e: N+P
f: O+P
Per quanto riguarda tutte le combinazioni A-Z e a-f sopra descritte, in una forma di realizzazione possibile l’estratto da foglie di carciofo caratterizzato da una concentrazione di acidi caffeoilchinici totali dal 7 al 20% in peso, può essere preparato come descritto negli esempi per ABO-AR-2016-026;
in una forma di realizzazione possibile l’estratto di coni di luppolo ottenibile mediante estrazione soluzione idroalcolica di etanolo a 15-30° alcolici può essere preparato come descritto negli esempi per ABO-AR-2016-027;
in una forma di realizzazione possibile la frazione di estratto di estratto da foglie di Cynara scolimus caratterizzata da una concentrazione di acido clorogenico da 2 a 7% e da una concentrazione di cinaropicrina da 0,5 a 4% in peso (anche una frazione di estratto idroalcolico da foglie di Cynara scolimus ottenibile da estrazione con etanolo a 96° alcolici) può essere preparata come descritto negli esempi per ABO-AR-2014-168; in una forma di realizzazione possibile, la frazione di estratto idroalcolico da coni di Humulus lupulus ottenibile da estrazione con etanolo a 96° alcolici può essere preparata come descritto negli esempi per ABO-AR-2016-014;
in una forma di realizzazione possibile, la frazione di estratto idroalcolico da coni di Humulus lupulus ottenibile da estrazione in etanolo a 13° alcolici effettuata sul residuo di pianta prodotto dopo un primo passaggio di estrazione con etanolo a 96° alcolici può essere preparata come descritto negli esempi per ABO-AR-2016-015.
Data la maggiore efficacia della frazione di estratto idroalcolico da coni di Humulus lupulus ottenibile da estrazione in etanolo a 13° alcolici effettuata sul residuo di pianta prodotto dopo un primo passaggio di estrazione con etanolo a 96° (negli esempi ABO-AR-2016-015) nel ridurre l’espressione delle proteine EMC anche nel tessuto uterino sano delle pazienti saggiate, la presenza di questa frazione è maggiomente preferita nella realizzazione dell’invenzione, sono quindi di particolare interesse, al fine di aumentare l’efficacia preventiva dell’uso qui descritto, tutte le combinazioni che comprendono P sopra indicate.
L’invenzione riguarda anche composizioni farmaceutiche comprendenti estratto e/o frazione di estratto di Humulus lupulus e/o Cynara scolimus e uno o più tra eccipienti, scelti tra diluenti, riempitivi, agenti di scorrimento, lubrificanti per forme solide, disgreganti, edulcoranti, conservanti, emulsionanti, modificatori reologici, lipidi, polimeri naturali e sintetici, solubilizzanti, agenti di sospensione, regolatori di pH, coloranti naturali e sintetici, antiossidanti veicolanti, addensanti, tensioattivi, aggreganti. farmaceuticamente accettabili.
Tali composizioni possono essere realizzate per formulazioni a somministrazione orale, sistemica, topica, intranasale come ad esempio in forma di polvere, granulato, capsula, compressa semplice o rivestita, emulsione unguento, gel, cerotto, garza medicata, soluzione, soluzione sterile, aerosol, dispositivi o sistemi di rilascio intrauterino.
In una forma di realizzazione preferita, i soli principi terapeuticamente attivi della composizione sono rappresentati da estratto e/o frazione di estratto di Humulus lupulus e/o Cynara scolimus.
Gli estratti e le frazioni di estratto che possono essere presenti nelle composizioni dell’invenzione sono quelli descritti sopra in qualsiasi delle combinazioni descritte sopra. Tutte le forme di realizzazione descritte per gli estratti e le frazioni di estratto si applicano alle composizioni dell’invenzione.
Questo significa le composizioni farmaceutiche dell’invenzione possono comprendere una o più di qualsiasi degli estratti o delle frazioni qui descritte. In particolare, le composizioni possono comprendere una qualsiasi delle combinazioni A-Z, A-F sopra descritte.
Data la maggiore efficacia della frazione di estratto idroalcolico da coni di Humulus lupulus ottenibile da estrazione in etanolo a 13° alcolici effettuata sul residuo di pianta prodotto dopo un primo passaggio di estrazione con etanolo a 96° (negli esempi ABO-AR-2016-015) nel ridurre l’espressione delle proteine EMC anche nel tessuto uterino sano delle pazienti saggiate, la presenza di questa frazione è maggiormente preferita nella realizzazione dell’invenzione, sono quindi di particolare interesse, al fine di aumentare l’efficacia preventiva delle composizioni qui descritte, tutte le combinazioni che comprendono P sopra indicate.
Tutte le composizioni sopra descritte possono essere limitate nel senso di essere costituite da estratto e/o frazione di estratto di Humulus lupulus e/o Cynara scolimus e eccipienti farmaceuticamente accettabili.
Anche in questo caso gli estratti e le frazioni di estratto che possono essere presenti nelle composizioni dell’invenzione sono quelli descritti sopra in qualsiasi delle combinazioni descritte sopra.
Tutte le forme di realizzazione descritte per gli estratti e le frazioni di estratto si applicano anche a questa forma di realizzazione delle composizioni dell’invenzione.
Questo significa le composizioni farmaceutiche dell’invenzione possono comprendere una o più di qualsiasi degli estratti o delle frazioni qui descritte. In particolare, le composizioni possono comprendere una qualsiasi delle combinazioni A-Z, A-F sopra descritte.
Data la maggiore efficacia della frazione di estratto idroalcolico da coni di Humulus lupulus ottenibile da estrazione in etanolo a 13° alcolici effettuata sul residuo di pianta prodotto dopo un primo passaggio di estrazione con etanolo a 96° (negli esempi ABO-AR-2016-015) nel ridurre l’espressione delle proteine EMC anche nel tessuto uterino sano delle pazienti saggiate, la presenza di questa frazione è maggiormente preferita nella realizzazione dell’invenzione, sono quindi di particolare interesse, al fine di aumentare l’efficacia preventiva delle composizioni qui descritte, tutte le combinazioni che comprendono P sopra indicate.
È ovviamente oggetto dell’invenzione, per tutte le giurisdizioni che lo consentono, un metodo terapeutico che comprende la somministrazione di estratto e/o frazione di estratto di Humulus lupulus e/o Cynara scolimus o di una composizione farmaceutica comprendente estratto e/o frazione di estratto di Humulus lupulus e/o Cynara scolimus a pazienti affette da o a rischio di (ad esempio recidive) leiomiomi uterini. Tutte le forme di realizzazione descritte per estratti e frazioni, e per le composizioni si applicano al metodo terapeutico indicato. Come già detto sopra, data la maggiore efficacia della frazione di estratto idroalcolico da coni di Humulus lupulus ottenibile da estrazione in etanolo a 13° alcolici effettuata sul residuo di pianta prodotto dopo un primo passaggio di estrazione con etanolo a 96° (negli esempi ABO-AR-2016-015) nel ridurre l’espressione delle proteine EMC anche nel tessuto uterino sano delle pazienti saggiate, la presenza di questa frazione è maggiormente preferita nella realizzazione dell’invenzione, sono quindi di particolare interesse, al fine di aumentare l’efficacia preventiva delle combinazioni o delle composizioni qui descritte, tutte le combinazioni che comprendono P sopra indicate.
Inoltre, è anche oggetto dell’invenzione un’associazione farmaceutica che comprende una qualsiasi delle composizioni come sopra definite e un ulteriore farmaco per il trattamento dei leiomiomi uterini o coadiuvante il trattamento dei leiomiomi uterini, per l’uso nel trattamento e/o della prevenzione dei leiomiomi uterini.
ESEMPI
1. Materiali e metodi
1.1 Reagenti chimici
Il Dimetil solfossido (DMSO) e la curcumina sono stati acquistati presso uroclone S.p.A (Milan, Italia) e Sigma-Aldrich (MO, USA) rispettivamente.
1.2 Preparazione degli estratti di Humulus lupulus e/o Cynara scolimus e loro frazioni 1.2.1 Preparazione dell’estratto di luppolo ABO-AR-2016-027
(mono estrazione con etanolo 20%)
I coni interi di luppolo (Humulus lupulus) sono stati sottoposti ad estrazione con etanolo 20%(v/v), utilizzando un rapporto droga:solvente compreso tra 1:15 e 1:30. L’estrazione viene condotta a 50°C per una durata di 8 ore, mediante tecnica della percolo-digestione per mezzo di un estrattore statico munito di una camicia termica.
Dopo tale periodo l’estratto alcolico risultante viene tolto (scaricato), filtrato su filtro a pannello con un cut-off da 25 micron per allontanare tutti i residui di pianta. L’estratto idroalcolico risultante è stato concentrato per evaporazione dell’etanolo mediante utilizzo di impianto di distillazione a strato sottile (thin film) secondo protocollo standard, che prevede l’alimentazione dell’estratto da concentrare ad una portata di circa 500 l/h; si opera impostando un vuoto residuo di 0.6-0.8 bar e il fluido riscaldante le pareti di evaporazione è impostato a 140°C ottenendo in questo modo, dopo l’eliminazione dell’etanolo, un estratto acquoso concentrato che viene essiccato mediante liofilizzazione (drug to extract ratio, DER 5:1-20:1).
L’estratto secco ottenuto in questo modo è stato utilizzato per gli studi e le preparazioni illustrate nella presente descrizione dove è utilizzata la sigla ABO-AR-2016-027.
1.2.2 Preparazione delle frazioni di luppolo ABO-AR-2016-014 e ABO-AR-2016-015 (estrazione con etanolo 13° dopo estrazione con etanolo 96°)
I coni interi di luppolo (Humulus lupulus) sono stati frammentati e sono stati sottoposti ad un primo passaggio di estrazione con etanolo 96%(v/v), utilizzando un rapporto droga:solvente (D/S) 1:10-1:30. L’estrazione è stata condotta a 40°C per una durata di 8 ore, per mezzo di un estrattore munito di agitatore a pala e di una camicia termica. Dopo tale periodo l’estratto alcolico risultante viene tolto (scaricato), centrifugato per allontanare tutti i residui di pianta ed essiccato mediante liofilizzazione dopo evaporazione dell’alcole (drug to extract ratio, DER 4:1-20:1).. L’estratto secco risultante ed è utilizzabile per altri scopi.
La pianta residua (dopo tale primo passaggio) è sottoposta ad un secondo passaggio di estrazione con una miscela idroalcolica contenente etanolo 13% (v/v), utilizzando un rapporto droga:solvente 1:10-1:30. L’estrazione viene condotta a 40°C per una durata di 8 ore, per mezzo di un estrattore munito di agitatore a pala e di una camicia termica. Dopo tale periodo l’estratto alcolico risultante viene tolto (scaricato), centrifugato per allontanare tutti i residui di pianta. L’estratto idroalcolico risultante è stato concentrato per evaporazione dell’etanolo mediante rotavapor ottenendo in questo modo, dopo l’eliminazione dell’etanolo, un estratto acquoso concentrato che viene essiccato mediante liofilizzazione (drug to extract ratio, DER 5:1-20:1).
Le frazioni ottenute in questo modo è stata utilizzata per gli studi e le preparazioni illustrate nella presente descrizione dove è utilizzata la sigla ABO-AR-2016-015 e ABO-AR-2016-014.
1.2.3. Preparazione dell’estratto di carciofo ABO-AR-2016-026
(mono estrazione con etanolo 50%)
Foglie di carciofo (cynara scolimus) sono state frammentate e sono state sottoposte ad estrazione con etanolo 50%(v/v), utilizzando un rapporto droga:solvente 1:10. L’estrazione viene condotta a 50°C per una durata di 6-8 ore, mediante tecnica della percolo-digestione per mezzo di un estrattore statico munito di una camicia termica. Dopo tale periodo l’estratto alcolico risultante viene tolto (scaricato), filtrato su filtro a pannello con un cutoff da 25 micron per allontanare tutti i residui di pianta. L’estratto idroalcolico risultante è stato concentrato per evaporazione dell’etanolo mediante utilizzo di impianto di distillazione a strato sottile (thin film) secondo protocollo standard, che prevede l’alimentazione dell’estratto da concentrare ad una portata di circa 500 l/h; si opera impostando un vuoto residuo di 0.6-0.8 bar e il fluido riscaldante le pareti di evaporazione è impostato a 140°C ottenendo in questo modo, dopo l’eliminazione dell’etanolo, un estratto acquoso concentrato che viene essiccato mediante liofilizzazione (drug to extract ratio, DER 5:1-20:1).
L’estratto secco ottenuto in questo modo è stato utilizzato per gli studi e le preparazioni illustrate nella presente descrizione dove è utilizzata la sigla ABO-AR-2016-026.
In generale, l’estratto ottenuto con la metodica sopra descritta è caratterizzato da una concentrazione di acidi caffeoilchinici totali di 7-20% in peso.
1.2.4. Preparazione dell’estratto di carciofo ABO-AR-2014-168
(mono estrazione con etanolo 96%)
Le foglie di carciofo (cynara scolimus) sono state frammentate e sono state sottoposte ad estrazione con etanolo 96%(v/v), utilizzando un rapporto droga:solvente 1:7-1:30. L’estrazione è stata condotta a 40°C per una durata di 5-6 ore, mediante naviglio estrattore con 45 cicli di estrazione. Dopo tale periodo l’estratto alcolico risultante viene tolto (scaricato) e filtrato su filtro da 50 micron. L’estratto idroalcolico risultante è stato concentrato per evaporazione dell’etanolo mediante rotavapor ottenendo in questo modo, dopo l’eliminazione dell’etanolo, un estratto acquoso concentrato che viene essiccato mediante liofilizzazione (drug to extract ratio, DER 5:1-20:1). In alternativa, il medesimo estratto può essere ottenuto utilizzando le seguenti condizioni di estrazione: estrazione con etanolo 96%(v/v), utilizzando un rapporto droga:solvente 1:7-1:30. L’estrazione viene condotta a 40-50°C per una durata di 8 ore, mediante tecnica della percolo-digestione per mezzo di un estrattore statico munito di una camicia termica. Dopo tale periodo l’estratto alcolico risultante viene tolto (scaricato), filtrato su filtro a pannello con un cutoff da 25 micron per allontanare tutti i residui di pianta. L’estratto idroalcolico risultante è stato concentrato per evaporazione dell’etanolo mediante utilizzo di impianto di distillazione a strato sottile (thin film) secondo protocollo standard, che prevede l’alimentazione dell’estratto da concentrare ad una portata di circa 500 l/h; si opera impostando un vuoto residuo di 0.6-0.8 bar e il fluido riscaldante le pareti di evaporazione è impostato a 140°C ottenendo in questo modo, dopo l’eliminazione dell’etanolo, un estratto acquoso concentrato che viene essiccato mediante liofilizzazione.
L’estratto secco ottenuto in questo modo è stato utilizzato per gli studi e le preparazioni illustrate nella presente descrizione dove è utilizzata la sigla ABO-AR-2016-168.
In generale, l’estratto ottenuto con la metodica sopra descritta è caratterizzato da una concentrazione di acido clorogenico 2-7% in peso e cinaropicrina 0.5-4% in peso.
1.3 Raccolta dei tessuti
Il leiomioma uterino umano ei tessuti miometriali sono stati ottenuti da donne in premenopausa caucasica (fascia di età: 41-49) con fibromi uterini sintomatici al momento dell'isterectomia. Sono stati prelevati quindi, per ciascuna paziente, tessuti sani e tessuti fibrotici. Tutte le pazienti hanno dato il loro consenso informato ed è stato concesso il permesso del comitato investigativo umano. Queste pazienti non stavano ricevendo alcun tipo di terapia ormonale. I fibromi erano intramurali e il loro intervallo di dimensioni era di 3-15 cm di diametro.
1.4 Colture cellulari
I campioni di leiomioma e miometrio sono stati raccolti in soluzione salina bilanciata (HBSS) di Hanks (Euroclone, Milano, Italia) al momento dell'intervento. I campioni sono stati tagliati in piccoli pezzi con soluzioni di collagenasi di tipo 8 (Serva) allo 0,1% [Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) privo di siero (Sigma-Aldrich) contenente penicillina-streptomicina all'1% (EuroClone, Italia), 50 μg/L di gentamicina (Lonza, Walkersville, MD USA) e 1% amfotericina B (Lonza)]. I tessuti sono stati incubati a bagnomaria a 37 °C per 5-6 ore e agitati manualmente fino a completa digestione. Le sospensioni cellulari digerite sono state quindi centrifugate a 1200 rpm per 10 minuti e lavate con terreni normali [(DMEM contenente 10% siero bovino fetale (FBS) (Sigma-Aldrich), 1% penicillina-streptomicina (EuroClone), 50 mg/L gentamicina (Lonza), 1% amfotericina B (Lonza)]. Le cellule sono state piastrate in piastre di plastica T75 e incubate a 37 °C in aria al 5% di CO2 al 95%. Il terreno di crescita è stato cambiato dopo 24 ore o 48 ore per rimuovere cellule non attaccate e quindi successivamente due volte a settimana.
1.5 Isolamento del RNA e PCR Real-Time
Sia le cellule di leimioma che le cellule miometriali sono state trattate con ABO-AR-2016-027 e ABO-AR-2016-026 e/o le loro frazioni attive come riportato nelle figure 1-4 (Tabella 1), nonché curcumina (come controllo positivo) (Malik et al., 2009) e non trattati per 48 ore. Alla fine del trattamento, le cellule sono state sciacquate con PBS e lisate usando il reagente TRIzol (Invitrogen Life Technologies) e conservate a -80 °C. L'RNA totale (fase acquosa superiore incolore) è stato separato usando cloroformio secondo le istruzioni del produttore. Successivamente, l'RNA è stato purificato e concentrato utilizzando il sistema ReliaPrep™ RNA Cell Miniprep System e i livelli di mRNA della fibronectina sono stati determinati utilizzando la PCR Real-Time eseguita su StepOnePlus versione 2.2.2 (Applied Biosystems, Life Technologies). Il DNA complementare (cDNA) è stato generato da 1 μg di RNA utilizzando il kit high-capacity cDNA reverse transcriptase (RT) (Applied Biosystems, Foster City, USA) e il cDNA di nuova sintesi è stato utilizzato per la PCR Real-Time. La PCR Real-Time è stata eseguita in piastre di reazione ottica a 96 pozzetti con 50 ng di cDNA in un volume finale di 10 μl, contenente 1X Taqman Universal Master Mix, concentrazioni ottimizzate di sonde marcate con 6 carbossi trifluoresceina (FAM) e primer specifici avanti e retromarcia per fibronectina (Hs00365052_m1), collagene1A1 (Hs00164004_m1), versicano (Hs00171642_m1), attivina-A (Hs00170103_m1), e ipoxantina fosforibosiltransferasi 1 (HPRT1) (Hs99999909_m1) (gene housekeeping) (Applied Biosystems) . Sono stati inclusi controlli con RNA sottoposti a RT-PCR senza trascrittasi inversa.
1.6 Western blotting
Il leiomioma primario e le cellule miometriali sono stati trattati con ABO-AR-2016-027 e ABO-AR-2016-026 e/o le loro frazioni attive come riportato in figura 5 e la curcumina per 48 ore, mentre sono state utilizzate cellule non trattate come controllo. Le cellule sono state sciacquate in PBS e solubilizzate nel reagente TRIzol® (Invitrogen Life Technologies). L'estrazione delle proteine è stata eseguita secondo le istruzioni del produttore. La proteina solubile è stata quantificata usando un Bradford protein assay (Bio-Rad, Germania), e quantità uguali di proteine sono state caricate su gel NuPAGE al 4-12% (Invitrogen Life Technologies) e risolte mediante SDS-PAGE in condizioni riducenti. Le proteine sono state quindi trasferite a membrane di nitrocellulosa da 0,2 μm in un apparato X-cell II (Invitrogen). La soluzione di Ponceau S (Euroclone) è stata utilizzata per la rilevazione di proteine sulle membrane. Dopo aver bloccato la membrana con 5% (peso/volume) di latte scremato in polvere in soluzione salina tamponata tris con Tween 20 (TBST) [Tris-HCl 50 mm (pH 7,4), NaCl 150 mm, Tween 20 0,05%], le membrane sono state incubate tutta la notte con anticorpi primari come diluizioni 1: 10000 di monoclonale murino anti-fibronectina umana (Sigma-Aldrich) o diluizioni 1: 3000 di tubulina monoclonale di topo (Sigma-Aldrich). Il giorno dopo, le membrane sono state lavate quattro volte (10 min ciascuna) in TBST e incubate con diluizioni 1: 1000 di IgG anti-topo legata a perossidasi di rafano (Amershan) contro anti-fibronectina umana e tubulina per 2 ore. Le membrane sono state quindi lavate quattro volte (10 min ciascuna) con TBST e le proteine immunoreattive sono state visualizzate utilizzando il substrato chemiluminescente Super Signal West Pico (Pierce) tramite ChemiDoc ™ MP System (Bio-Rad). Le bande sono state quantificate mediante scansione e analisi utilizzando il programma di elaborazione delle immagini basato su Java, ImageJ1.49n (National Institutes of Health, USA; http: //imagej.nih.gov/ij).
1.7 Analisi dei dati
I dati sono presentati come media ± SD. Il test di classificazione di Wilcoxon è stato utilizzato per l'analisi dei dati utilizzando GraphPad Prism versione 4.01 per Windows (GraphPad, San Diego, CA). Le differenze sono state considerate significative quando p <0,05.
1.8 metodo per la determinazione quantitativa degli acidi caffeolchinici totali
Sono stati pesati accuratamente 0.30 g di campione. Sono stati aggiunti 40 ml di H2O ultra pura e il tutto è stato posto sotto agitazione magnetica alla temperatura di 95°C. Raggiunta la temperatura di ebollizione, la miscela è stata filtrata attraverso cotone in una provetta da centrifuga da 50ml. Alla soluzione ancora calda sono stati aggiunti 2 ml di una soluzione satura di piombo acetato. La miscela è stata raffreddata, centrifugata ed è stato eliminato il surnatante. Sono stati aggiunti al residuo 5 ml di H2O ultra pura e la provetta da centrifuga è stata agitata. Il campione è stato centrifugato nuovamente è stato eliminato il surnatante. Il residuo è stato estratto con 70 ml di acido acetico diluito (11.4 ml portati a 100ml con H2O ultra pura) ed è stato portato ad ebollizione sotto lenta agitazione. La miscela ancora calda è stata filtrata attraverso cotone s sono stati aggiunti 2 ml di una soluzione di acido solforico (200 ml/l). La soluzione è stata centrifugata e decantata in un matraccio tarato da 100 ml. Sono stati aggiunti al residuo 5ml di acido acetico diluito. La soluzione limpida è stata centrifugata e decantata nello stesso matraccio da 100 ml. A temperatura ambiente, la miscela è stata portata a volume di 100 ml con acido acetico diluito.
Soluzione test: è stato prelevato 1 ml di soluzione. Mediante matraccio tarato, è stato portato a 25 ml con metanolo e agitato.
Soluzione di riferimento: è stato prelevato 1 ml di acido acetico. Mediante matraccio tarato, è stato portato a 25 ml con metanolo e agitare.
È stata misurata l’assorbanza a 325 nm della soluzione test utilizzando la soluzione di riferimento come bianco.
Assumendo che il valore di A1%,1cm dell’acido clorogenico a 325 nm è 485, la percentuale di acidi caffeilchinici, espressi come acido clorogenico, si calcola con la formula:
% dei derivati caffeolchinici totali = (AxVexVf)/(pxVpxA1%,1cm dell’acido clorogenico a 325 nm)
Dove:
A = assorbanza del campione a 325 nm.
Ve = volume finale dell’estratto.
Vf = volume finale della diluizione.
p = peso del campione in grammi.
Vp = volume di campione prelevato per la diluizione finale.
1.9 Metodo per la determinazione quantitativa di acido clorogenico e cinaropricrina in HPLC
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
Tutte le operazioni descritte di seguito sono eseguite mantenendo il campione al riparo dalla luce.
Pesare accuratamente 0.25 g di estratto liofilizzato. Estrarre per 15 min con 50 ml di MeOH 75% HCOOH 0.1% in ultrasuoni a 35°C. Filtrare per cotone in un matraccio tarato da 100 ml. Sul filtro e sul residuo ripetere una seconda estrazione nelle medesime condizioni. Filtrare per cotone nello stesso matraccio tarato da 100 ml. Portare gli estratti riuniti al volume di 100 ml con lo stesso solvente d’estrazione. Filtrare con filtro in acetato di cellulosa da 0.45 µm e iniettare in HPLC.
PREPARAZIONE DEGLI STANDARD:
Standard: Cinaropicrina
Solvente di solubilizzazione e di diluizione: MeOH per HPLC
Concentrazione di lavoro: da 0.004 a 0.03 mg/ml
Conservazione: soluzioni standard e polvere madre conservati a -20°C
Tempo di ritenzione: 14.3 min
Standard: Acido Clorogenico
Solvente di solubilizzazione e di diluizione: MeOH 50% per HPLC
Concentrazione di lavoro: da 0.01 a 0.05 mg/ml
Conservazione: soluzioni standard e polvere madre conservati a -20°C
Tempo di ritenzione: 34.75 min
CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE:
Colonna: Luna C18 (phenomenex), 150x4.6mm, 5µm
temperatura colonna: 30°C±0.8°C
Rivelatore: DAD
λ Ac. Clorogenico = 325nm – bandwidth 4, ref. off.
λ Cinaropicrina = 212nm – bandwidth 4, ref. off.
flusso: 0.5ml/min
volume iniettato: 10µl
fase mobile: A = H2O ultrapura 0.1 % HCOOH; B = CH3CN 0.1 % HCOOH schema di eluizione:
CALCOLI
Il contenuto percentuale di Acido Clorogenico nei prodotti solidi si calcola con la seguente formula:
Ac. Clorogenico % = (AC x conc. St x V x F) /(ASt x p x 10)
Dove: AC = area dell’Acido Clorogenico nel campione; F = eventuale diluizione del campione; ASt = area dell’Acido Clorogenico nello standard; conc.St = concentrazione dell’Acido Clorogenico nello standard, espresso in mg/ml; V = volume totale dell’estratto espresso in ml; p = peso del campione in grammi;
Il contenuto percentuale di Cinaropicrina nei prodotti solidi si calcola con la seguente formula: Cinaropicrina % = (AC x conc. St x V x F) /(ASt x p x 10)
Dove: AC= area della Cinaropicrina nel campione; F = eventuale diluizione del campione; ASt = area della Cinaropicrina nello standard; conc.St = concentrazione della Cinaropicrina nello standard, espresso in mg/ml; V = volume totale dell’estratto.
ESPERIMENTI
1. Primo screening
Come descritto sopra, recentemente in letteratura è stato dimostrato il ruolo fondamentale della matrice extracellulare nella patogenesi del leiomioma ed è emersa l’importanza delle seguenti molecole proteiche: fibronectina, collagene e il versican (proteoglicano associato con la matrice extracellulare).
Il fibroma uterino è una formazione benigna caratterizzata da un’eccessiva produzione di fibronectina.
È stato quindi valutato l’effetto antifibrotico, in termini di riduzione dei livelli di fibronectina, di estratti Humulus lupulus e Cynara scolymus, (ABO-2016-027 e ABO-2016-026) su cellule primarie di miometrio sano e di fibroma uterino prelevate da biopsie di pazienti informate come descritto sopra che si sottoponevano a interventi di rimozione dell’utero.
Come controllo positivo è stata inserita la curcumina e non i farmaci con azione ormonale comunemente usati poiché tale modello ex vivo, non sembra essere particolarmente idoneo alla valutazione di campioni con azioni di tipo ormonali, in quanto è stato riscontrato che dopo prelievo da biopsia, le cellule possono facilmente perdere i recettori per gli ormoni.
Sono stati valutati i livelli di espressione genica (mRNA) della fibronectina in cellule provenienti da biopsia da tessuto sano e da tessuto fibrotico dello stesso soggetto. La sostanza capace di ridurre la quantità di fibronectina accumulata nei fibromi uterini (vs non trattato) potrà molto verosimilmente ridurre la massa dei fibromi. Come controllo positivo è stata inserita la curcumina a 2 concentrazioni (10 microM e 20 microM). Tutti gli estratti sono stati testati alla concentrazione di 100 microg/ml per 48 ore.
Risultati
Dai dati ottenuti è emerso che i fitocomplessi testati riescono ad abbattere l'mRNA della fibronectina rispetto al non trattato e rispetto anche al trattamento con la curcumina (dose a 10 µM) sia nelle cellule di leiomioma che nelle cellule di miometrio. Gli estratti abbattevano la fibronectina in maniera statisticamente positiva e con andamento similare sia sulle cellule sane che sulle cellule malate prelevate dallo stesso paziente.
La riduzione che si osserva per i 2 estratti è all’incirca del 50% sulle colture primarie ottenute da 6 diversi pazienti affette dai leiomiomi.
Carciofo e luppolo hanno abbassato i livelli di espressione della fibronectina, nei confronti del non trattato, in modo simile al controllo positivo (curcumina 10 µM) sia nelle cellule derivanti da miometrio fibromatoso che sano, provenienti dalla stessa paziente. Per la curcumina alla dose di 40 µM si osserva una maggiore efficacia nelle cellule malate (l’abbattimento dell’mRNA della fibronectina è quasi totale) sia rispetto al non trattato ma anche rispetto al trattamento con carciofo e luppolo, mentre per le cellule sane si osserva un andamento similare al carciofo e luppolo (figura 6).
Considerazione dei risultati da letteratura
Recentemente è stato dimostrato che anche farmaci con una riconosciuta efficacia possiedono questo tipo di meccanismo: Britten e colleghi (Britten et al., 2012 Gonadotropin-releasing hormone (GnRH) agonist leuprolide acetate and GnRH antagonist cetrorelix acetate directly inhibit leiomyoma extracellular matrix production. Fertil Steril.2012 Nov;98(5):1299-307) riportano che il cetrorelix, antagonista del GnRH, riduce di 1/3 o 2/3 (a seconda del tempo utilizzato per il trattamento) il quantitativo di mRNA della fibronectina in linee cellulari; inoltre la curcumina secondo Malik e colleghi (Malik et al., 2009 Curcumin, a nutritional supplement with antineoplastic activity, enhances leiomyoma cell apoptosis and decreases fibronectin expression. Fertil Steril.
2009 May;91(5 Suppl):2177-84) porta ad una riduzione dell’espressione dell’mRNA della fibronectina che va dal 40 al 50% in linee cellulari.
2. Secondo screening
Sono state trattate cellule di fibromi uterini e cellule di miometrio sano (da 5 pazienti) con Luppolo EL ABO-AR-2016-027 e relative frazioni (luppolo estratto con etanolo 96 gradi ABO-AR-2016-014; luppolo estratto 13 gradi ABO-AR-2016-015) e Carciofo EL ABO-AR-2016-026 e relative frazioni (estratto con etanolo 96 gradi ABO-AR-2014-168, estratto acquoso ABO-AR-2014-169, primo precipitato ABO-AR-2014-171, secondo precipitato ABO-AR-2014-176, adsorbito da resina ABO-AR-2014-178, frazione polare ABO-AR-2014-185, non adsorbito da resina ABO-AR-2014-186).
Sono stati testati dei marker di proliferazione della matrice extracellulare:
Fibronectina: fattore della matrice extracellulare che risulta alterato nei fibromi uterini. La fibronectina e il collagene 1 si legano e formano uno scaffold che promuove l’eccessiva fibrosi nel leiomioma.
Collagene 1A1: fattore della matrice cellulare che risulta alterato nei fibromi uterini legandsosi alla fibronectina. Tra tutti i tipi di collagene è l’unica forma la cui espressione genica risulta significativamente aumentata nel leiomioma. Versican: è un proteoglicano della matrice extracellulare che contribuisce al legame con lo ialuronano e ai glicosaminoglicani della matrice. È implicato nel rimodellamento del tessuto connettivo che è alterato in presenza di leiomioma. Activina-A: marker di infiammazione, proliferazione e induzione di deposizione della matrice extracellulare e quindi fibrosi nei miofibroblasti attivati all’interno dei tessuti di leiomioma o fibroma uterino.
Risultati
I risultati del secondo screening sono riassunti nelle tabelle 2 e 3, la X nella casella significa una corretta modulazione del gene (e cioè una diminuzione del mRNA):
Tabella 2
Tabella 3
Commento ai risultati
I risultati hanno mostrato che il Luppolo EL e frazione 13°, il Carciofo EL e il carciofo frazione 96° sono in grado di ridurre l’espressione dell’mRNA di fibronectina, collagene1A1, versican e activina-A in cellule di leiomioma primarie.
Luppolo EL, Luppolo etanolo 13 e Carciofo EL riducono anche la proteina fibronectina nelle cellule di leiomioma.
Nelle cellule di miometrio sane, Luppolo etanolo 13 in modo particolare, è capace di ridurre l’espressione della fibronectina, collagene 1A1, versican e activina-A.
In conclusione:
-Per il carciofo non ci sono differenze tra il totale e la frazione 96°.
-Per il luppolo sembra migliore la frazione etanolo 13 gradi che agisce anche sulle cellule sane di miometrio supportando il fatto che possa agire anche mediante un meccanismo di tipo preventivo della trasformazione del tessuto normale in fibroma. Questa attività è particolarmente interessante per la prevenzione delle recidive.
I risultati sono riportati anche nelle figure 2 e 3.
Considerazione dei risultati da letteratura
Recentemente anche Ulipristal acetato ha dimostrato di essere in grado in un trial clinico controllato con placebo, in donne che l’assumevano, di ridurre la dimensione del leiomioma. Campioni di tessuto uterino prelevati dalle pazienti che avevano assunto per os il farmaco hanno dimostrato che Ulipristal acetato è capace di svolgere questa funzione attraverso la modulazione di elementi della matrice extracellulare del fibroma. Rispetto al placebo i campioni chirurgici delle pazienti trattate hanno mostrato per l’80% dei casi una diminuzione della proteina versican e nel 60% dei casi una riduzione della proteina fibronectina (Coxe t al. Reproductive Sciences 2017).
Claims (20)
- RIVENDICAZIONI 1. Estratto e/o frazione di estratto di Humulus lupulus e/o Cynara scolimus per uso nel trattamento e/o nella prevenzione dei leiomiomi uterini.
- 2. Estratto e/o frazione di estratto di Humulus lupulus e/o Cynara scolimus per l’uso secondo la rivendicazione 1 in cui detto estratto e/o frazione di estratto è somministrato ad una paziente che ne abbia bisogno in combinazione con almeno un farmaco nel trattamento e/o nella prevenzione dei leiomiomi uterini.
- 3. Estratto per l’uso secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui detto estratto di Cynara scolimus è caratterizzato da una concentrazione di acidi caffeoilchinici totali dal 7 al 20% in peso.
- 4. Estratto per l’uso secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui detto estratto di Humulus lupulus è un estratto da coni di Humulus lupulus ottenibile mediante estrazione in soluzione idroalcolica di etanolo a 15-30° alcolici e in cui detto estratto di Cynara scolimus è un estratto da foglie di Cynara scolimus ottenibile mediante estrazione soluzione idroalcolica di etanolo a 30-60° alcolici.
- 5. Frazione di estratto per l’uso secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui detta frazione è una frazione di estratto da foglie di Cynara scolimus caratterizzata da una concentrazione di acido clorogenico da 2 a 7% e da una concentrazione di cinaropicrina da 0,5 a 4% in peso.
- 6. Frazione di estratto per l’uso secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui detta frazione è una frazione di estratto idroalcolico da foglie di Cynara scolimus ottenibile da estrazione con etanolo a 96° alcolici.
- 7. Frazione di estratto per l’uso secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui detta frazione è una frazione di estratto idroalcolico da coni di Humulus lupulus ottenibile da estrazione con etanolo a 96° alcolici.
- 8. Frazione di estratto per l’uso secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui detta frazione è una frazione di estratto idroalcolico da coni di Humulus lupulus ottenibile da estrazione in etanolo a 13° alcolici effettuata sul residuo di pianta prodotto dopo un primo passaggio di estrazione con etanolo a 96° alcolici.
- 9. Composizione farmaceutica comprendente estratto e/o frazione di estratto di Humulus lupulus e/o Cynara scolimus e uno o più tra eccipienti, scelti tra diluenti, riempitivi, agenti di scorrimento, lubrificanti per forme solide, disgreganti, edulcoranti, conservanti, emulsionanti, modificatori reologici, lipidi, polimeri naturali e sintetici, solubilizzanti, agenti di sospensione, regolatori di pH, coloranti naturali e sintetici, antiossidanti, veicolanti, addensanti, tensioattivi, aggreganti farmaceuticamente accettabili.
- 10. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 9 in cui i soli agenti farmacologicamente attivi sono estratto e/o frazione di estratto di Humulus lupulus e/o Cynara scolimus.
- 11. Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 9 o 10 in cui detto estratto di Cynara scolimus è caratterizzato da una concentrazione di acidi caffeoilchinici totali dal 7 al 20% in peso.
- 12. Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 11 in cui detto estratto di in cui detto estratto di Humulus lupulus è un estratto da coni di Humulus lupulus ottenibile mediante estrazione soluzione idroalcolica di etanolo a 15-30° alcolici e in cui detto estratto di Cynara scolimus è un estratto da foglie di Cynara scolimus ottenibile mediante estrazione con soluzione idroalcolica di etanolo a 30-60° alcolici.
- 13. Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 12 in cui detta frazione è una frazione di estratto da foglie di Cynara scolimus caratterizzata da una concentrazione di acido clorogenico da 2 a 7% e da una concentrazione di cinaropicrina da 0,5 a 4% in peso.
- 14. Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 13 in cui detta frazione è una frazione di estratto idroalcolico da foglie di Cynara scolimus ottenibile da estrazione con etanolo a 96° alcolici.
- 15. Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 14 in cui detta frazione è una frazione di estratto idroalcolico da coni di Humulus lupulus ottenibile da estrazione con etanolo a 96° alcolici.
- 16. Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 15 in cui detta frazione è una frazione di estratto idroalcolico da coni di Humulus lupulus ottenibile da estrazione in etanolo a 13° alcolici effettuata sul residuo di pianta prodotto dopo un primo passaggio di estrazione con etanolo a 96° alcolici.
- 17. Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 16 per somministrazione orale o sistemica.
- 18. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 17 in forma di polvere, granulato, capsula, compressa semplice o rivestita, emulsione unguento, gel, cerotto, garza medicata, soluzione, soluzione sterile, aerosol.
- 19. Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 18 per l’uso nel trattamento e/o nella prevenzione dei leiomiomi uterini.
- 20. Composizione farmaceutica per l’uso secondo la rivendicazione 19 in cui detta composizione è somministrata ad una paziente che ne abbia bisogno in combinazione con almeno un farmaco nel trattamento e/o nella prevenzione dei leiomiomi uterine.
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