IT201600099384A1 - Uso di emulsionifini per la somministrazione frazionata e il mascheramento organolettico di acidi grassi insaturi - Google Patents

Description

USO DI EMULSIONIFINI PER LA SOMMINISTRAZIONE FRAZIONATA E IL MASCHERAMENTO ORGANOLETTICO DI ACIDI GRASSI INSATURI

Campo di applicazione: le emulsioni fini sono sistemi dispersi costituiti dalla combinazione di due liquidi immiscibili tra di loro, solitamente acqua e olio. Tali sistemi sono ampiamente noti in letteratura ed utilizzati nella pratica corrente per veicolare principi attivi a differente lipofilia migliorandone la capacità di assorbimento attraverso la pelle e le mucose.

Oggetto dell’invenzione: scopo della presente invenzione è la realizzazione di formulazioni farmaceutiche contenenti acidi grassi insaturi ed in particolare polinsaturi adatte alla somministrazione all’uomo e ai mammiferi in generale e che presentino un profilo organolettico accettabile per uso topico, mucosale ed orale. Stato dell’arte: Gli acidi grassi polinsaturi (PUFA) sono coinvolti in numerosi processi metabolici dell’organismo umano ed animale. Tra gli acidi grassi polinsaturi sono presenti anche quelli denominati essenziali che, per definizione, i mammiferi non sono in grado di sintetizzare endogenamente. Tra questi, di particolare interesse terapeutico sono acido linoleico (C18:2n-6) e alfa linolenico (ALA C18:3n-3), che devono essere assunti con la dieta o somministrati esogenamente per svolgere le loro insostituibili azioni metaboliche. ALA può a sua volta essere trasformato endogenamente in acido eicosapentaenoico (EPA C20:5n-3) e acido docosaexaenoico (DHA C22:6n-3), in generale tali acidi grassi polinsaturi vengono denominati omega-3, omega-6 e omega-9 (ω-3; ω-6; ω-9 PUFA). Alla metà degli anni ’50 del secolo scorso venne ipotizzato che la dieta ricca di olio di pesce, che contiene alte concentrazioni di PUFA fosse alla base della ridotta incidenza di malattie cardiovascolari nelle popolazioni eschimesi (Sinclair HM Proc. Nutr. Soc.1953; 12:69-82). Successivamente il gruppo di JR Vane dimostrò come il meccanismo d’azione degli PUFA fosse strettamente correlato con il sistema degli arachidonati (Dyeberg J. et al Lancet 1978; 15 2(8081):117-9). L’importanza metabolica e terapeutica di PUFA è andata crescendo negli anni e le loro concentrazioni nel sangue sono strettamente correlate all’incidenza di malattie croniche (Stark et al Progress Lipid Res.2016; 63:132-52). La somministrazione di composti a base di ω-3, ω-6 e ω-9 PUFA risulta sempre più popolare ed utilizzata per la prevenzione e cura di numerose patologie in particolare di tipo cronico quali ad esempio: malattie cardiovascolari, diabete, malattie infiammatorie, capacità cognitive nel bambino. Tuttavia, a causa del sapore sgradevole dovuto all’intenso odore di pesce l’assunzione di PUFA è poco gradita in particolare ai bambini per cui le potenzialità terapeutiche risultano ridotte. Infatti allo stato attuale per la loro somministrazione orale vengono utilizzate quasi esclusivamente capsule di gelatina molle (soft capsules) che per raggiungere i dosaggi consigliati devono avere un formato molto grosso (circa 1 g) che ovviamente le rende inutilizzabili in bambini, anziani e soggetti con difficoltà di deglutizione. Inoltre tali formulazioni non possono essere opportunamente frazionate per adeguarsi ad un corretto regime posologico. Infatti è noto nell’arte che la somministrazione costante nel tempo rispetto ad una somministrazione intervallata determina dei livelli ematici di PUFA più favorevoli ad una efficacia terapeutica (Browning LM et al. J Nutr.2014; 144:667-72).

Definizioni: qui di seguito vengono elencate le definizioni dei principali termini utilizzati nella presente invenzione 1) emulsioni fini sono emulsioni contenenti particelle con dimensioni comprese tra 1000 nanometri e alcune decine di micron; 2) formulazioni farmaceutiche si intendono preparazioni note nell’arte per la somministrazione di qualsivoglia principio attivo utile per la cura, prevenzione di una malattia e mantenimento delle attività fisiologiche ed anatomiche nell’uomo ed animale. Sono altresì comprese formulazioni utilizzabili per fini cosmetici od alimentari; 3) olio essenziale (EO) si intende una miscela oleosa di sostanze differenti estratte da piante aromatiche.4) PUFA acidi grassi polinsaturi denominati anche omega-3 e omega-6 e omega-9 (ω-3; ω-6; ω-9) sulla base della localizzazione dei doppi legami.

Descrizione: Allo scopo di ottenere formulazioni liquide o semisolide adatte alla somministrazione di adeguati dosaggi di PUFA e che avessero qualità organolettiche accettabili e fossero frazionabili e pertanto adatte ad una personalizzazione individuale della terapia, sono state identificate le emulsioni fini come forma farmaceutica ideale. Inoltre la capacità antiinfiammatoria di PUFA è nota nell’arte e pertanto la loro somministrazione per via topica, attualmente preclusa dalle problematiche organolettiche sopra descritte, rientra altresì nello scopo della presente invenzione.

Per ottenere le emulsioni fini desiderate si è utilizzato come agente stabilizzante un sale di chitosano-oleato già noto nell’arte. Tale agente si è dimostrato efficace nella realizzazione di emulsioni fini contenenti PUFA. Come già noto nell’arte, il metodo preparativo per gocciolamento e successiva evaporazione della fase organica porta a una dispersione particolarmente fine, come illustrato in Tabella 1 di Esempio 1, dove i diametri medi delle gocce di PUFA sono compresi nell’intervallo 300-500 nm a 90° di angolo di lettura, con indice di polidispersione int orno a 0,5 ad indicare una omogeneità accettabile per quanto riguarda la dispersione delle dimensioni.

Tuttavia questo metodo di preparazione prevede di partire da concentrazione di chitosano HCl nella fase acquosa relativamente basse e parallelamente la concentrazione finale di PUFA nella dispersione risulta troppo bassa (0,12-0,6 % p/p) per le possibili applicazioni desiderate.

Per aumentare la concentrazione di PUFA nel formulato, questo è stato sottoposto a liofilizzazione e ridispersione in acqua come descritto in Esempio 1. I metodi precedentemente descritti risultavano non adeguatamente idonei per l’ottenimento di quanto desiderato, sia a causa della procedura complessa necessaria per arrivare a un prodotto liofilizzato da reidratare che per la necessità di aumentare ulteriormente la concentrazione di PUFA fino alla concentrazione del 30% (p/p), e per la scelta di addizionare eventualmente oli essenziali (EO) in rapporto ponderale compreso tra 0,01 e 1% p/p, espandibile fino ad almeno 10% (p/p) di emulsionefine. E’ stato quindi introdotto un metodo preparativo completamente modificato. Si è ricorsi quindi a omogeneizzazione ad alta velocità utilizzando come stabilizzante dell’emulsione chitosano-oleato. Negli Esempi riportati qui di seguito questo veniva precedentemente preparato e liofilizzato.

Le emulsioni-fini così ottenute presentano una considerevole stabilità fisica nel tempo come dimostrato nell’Esempio 2.

Alle emulsioni fini PUFA stabilizzate con chitosano-oleato possono essere aggiunti, se desiderato, altri composti utili all’efficacia del formulato finale. In particolare le emulsioni fini possono essere addizionate con altri principi attivi naturali quali ad esempio estratti vegetali, composti di origine animali e/o di sintesi chimica, inclusi farmaci. Particolarmente preferiti sono gli oli essenziali. L’Esempio 3 descrive una formulazione contenente EO all’1,0 % p/p stabilizzata con chitosano-oleato alla concentrazione del 5,0 %, concentrazioni superiori fino al 10% di EO sono state testate e compatibili con caratteristiche delle formulazioni richieste p/p. Nello stesso esempio sono inoltre riportate formulazioni ottenute con concentrazioni di chitosano-oleato 5,0% e 7,0% p/p nelle quali l’emulsione di EO 1,0% p/p era associata con l’emulsione di PUFA 10%. L’aumento della concentrazione di chitosano oleato se desiderato fino a 15% oltre che aumentare la capacità di stabilizzazione può aiutare ad ottenere un formulato più viscoso adatto anche alla somministrazione topica cutanea. Concentrazioni di EO comprese tra 0.01% e 10% (p/p) risultano pertanto adatte all’ottenimento delle emulsioni-fini rivendicate nella presente invenzione. Analogamente concentrazioni di chitosano-oleato comprese tra 1% e 15% (p/p) e di PUFA comprese tra 0,1 % e 30% (p/p) sono adatte all’ottenimento delle emulsioni-fini rivendicate nella presente invenzione

Come noto nell’arte gli acidi grassi polinsaturi quali gli omega 3 vanno incontro ad una rapida ossidazione che ne pregiudica sensibilmente l’efficacia farmacologica e terapeutica. Le emulsioni-fini rivendicate nella presente invenzione mantengono nel tempo l’efficacia dei principi attivi come ben dimostrato dai risultati ottenuti come in Esempio 4.

L’utilizzo delle emulsioni fini contenenti PUFA da noi rivendicate oltre a non pregiudicare l’efficacia dei principi attivi, come già dimostrato, risulta essere ben tollerato come evidenziato, ad esempio, dai dati sperimentali riportati in Esempio 5 Le emulsioni fini da noi studiate e rivendicate presentano un alto gradiente di bioadesione,a come evidenziato anche da Esempio 6 e pertanto, tali formulazioni possono essere altresì utilizzate per via topica, topica mucosale, cutanea, transdermica, parenterale, orale, ed applicati negli orifizi naturali del corpo in soggetti che lo necessitino per la loro cura, terapia e prevenzione. Ulteriormente se desiderato tali formulazioni potranno adeguatamente essere applicate e/o adese su superfici rigide o flessibili che vengano a contatto con il corpo umano o animale, siamo inseriti negli orifizi naturali od impiantati semi o permanentemente in organi e tessuti umani o animali.

Sorprendente e del tutto inaspettata risulta la capacità delle emulsioni fini di coprire in maniera totale le ben note sgradevoli qualità organolettiche di PUFA ovvero il forte e persistente odore e sapore di pesce insito in questi composti. Come ampiamente evidenziato, anche da Esempio 7 i risultati sperimentali ottenuti evidenziano una qualità organolettica delle emulsioni-fini rivendicate nella presente invenzione nettamente superiori a quelle di PUFA non emulsionati. Tali miglioramenti sostanziali delle caratteristiche organolettiche permettono un loro uso commerciale in formulazioni liquide attualmente precluso, come detto, dalla grave limitazione della loro accettabilità organolettica e palatabilità. Le formulazioni liquide qui rivendicate permettono altresì di istituire una posologia fine e personalizzata non ottenibile con le formulazioni solide orali convenzionali incluse le così dette soft capsules. Pertanto le emulsioni fini qui rivendicate sono particolarmente indicate per la somministrazione orale. Le emulsioni fini contenenti PUFA da noi rivendicate possono essere altresì convenientemente utilizzate in preparazioni ad uso topico cutaneo. In particolare possono essere utilizzate per la cura di patologie cutanee a componente infiammatoria quali ad esempio, ma non solo, acne, eritemi da radiazioni (comprese quelle solari), dermatiti allergiche e da contatto, ecc. L’utilizzo delle emulsioni fini rivendicate nella presente invenzione a scopo cosmetico è ugualmente previsto. Allo scopo, se desiderato, le emulsioni fini contenenti PUFA da noi rivendicate possono essere addizionate convenientemente con altri principi attivi che possano avere effetto sinergico/addittivo con PUFA. A questo riguardo tali principi attivi possono essere di varia natura chimico-fisica purchè compatibili con le emulsioni fini. L’uso di composti naturali è largamente noto nell’arte ed è largamente preferito dalla popolazione; a questo scopo le emulsioni fini contenenti PUFA da noi rivendicate, se desiderato, possono essere convenientemente addizionate oltre a di oli essenziali noti nell’arte, come già descritto, anche di estratti vegetali acquosi, alcolici, idroalcolici, glicolici noti nell’arte.

ESEMPIO 1 Preparazione di emulsioni fini di chitosano-oleato e PUFA Metodo di sgocciolamento

Sono state preparate emulsioni fini mediante un metodo di sgocciolamento precedentemente messo a punto. Le emulsioni fini risultano in questo caso stabilizzate da un sale di chitosano e acido oleico che si forma al momento dell’evaporazione del solvente organico per interazione ionica tra le specie di carica opposta. Le dimensioni medie e l’indice di polidispersione (IP) sono riportati in Tabella 1.

Liofilizzazione e ridispersione del campione

Per aumentare ulteriormente la concentrazione in PUFA del campione ottenuto per sgocciolamento, questo è stato sottoposto a liofilizzazione e ridispersione in acqua. La liofilizzazione condotta sulla dispersione a concentrazione 0,6% di PUFA sia senza aggiunta di crioprotettori che con l’aggiunta di mannitolo (5% p/v) ha portato a un solido facilmente risospendibile in acqua, con dimensioni pari a 1008 (± 76) nm senza crioprotettore e di 702 (± 34) nm in presenza di mannitolo.

Dal prodotto liofilizzato senza aggiunta di crioprotettore sottoposto a minima idratazione, corrispondente a un rapporto 1:3 (1 parte di solido 3 parti di acqua) si è ottenuto un semisolido a consistenza cremosa. La concentrazione di PUFA in questo prodotto risultava pari a 8,3% (p/p).

Omogeneizzazione ad alta velocità

L’Omogeneizzazione ad alta velocità è stata condotta utilizzando un omogeneizzatore a turbina (Ultraturrax T25, IKA, Labortechnik, Germany), a 20500 giri/minuto, per 15 minuti, aggiungendo il chitosano oleato precedentemente preparato e liofilizzato alla fase olio, e portando al volume finale con aggiunta della fase acqua sotto agitazione.

Il chitosano oleato è stato preparato secondo il metodo, noto nell’arte, di seguito descritto a puro titolo esemplificativo. E’ stato preparato chitosano cloridrato per addizione di HCl 0.5N al chitosano base (basso peso molecolare, grado di deacetilazione 80%), in dispersione acquosa fino a completa solubilizzazione, successiva dialisi e liofilizzazione. A una soluzione acquosa 0,05% p/v di chitosano cloridrato è stato aggiunto acido oleico in acetone in rapporto stechiometrico rispetto ai gruppi amminici calcolati del chitosano, L’acetone è stato evaporato in rotavapor, e la dispersione rimanente è stata liofilizzata.

ESEMPIO 2 Influenza della concentrazione di chitosano-oleato sulla stabilizzazione dell’emulsione a base di PUFA

Le emulsioni a base di PUFA e diverse concentrazioni di chitosano-oleato sono state realizzate secondo Esempio 1, mediante metodo di omogenizzazione. Le dimensioni a tempo zero e a tempi definiti fino a 30 giorni di conservazione a 4-8 °C sono riportate in Figura 1. Risultati analoghi sono stati ottenuti mantenendo i campioni a temperatura ambiente e in stress test. Osservando i valori a tempo zero si nota che le dimensioni ottenute crescono passando dai campioni con meno polimero a quelli in cui il polimero è più concentrato fino al 2% p/p, probabilmente per la minore efficienza del sistema di omogeneizzazione dovuta alla viscosità che aumenta con la concentrazione del polimero. Alla concentrazione del 5% tuttavia si osserva una diminuzione delle dimensioni attribuibile alla maggiore capacità stabilizzante del polimero presente in maggiore quantità. Questa ipotesi pare confermata dall’andamento delle dimensioni nel tempo. A 30 giorni infatti i campioni preparati con la concentrazione di chitosano-oleato più bassa (0,2% p/p) mostrano un aumento delle dimensioni molto netto, in quanto il d50 passa da 0,87 (± 0,14) µm a 11,0 (±1,0) µm. Le dimensioni del campione stabilizzato con chitosano-oleato al 5,0% p/p soprattutto come d50 sono nettamente più stabili per tutto il tempo considerato.

ESEMPIO 3 Associazione di emulsione di PUFA con una emulsione di olio essenziale

Il metodo di omogeneizzazione ad alta velocità è stato applicato anche all’emulsione dell’olio essenziale (EO) da associare nella formulazione finale all’emulsione a base di ω-3 e ω-6. I risultati della caratterizzazione dimensionale sono riportati in Figura 2. Anche in questo caso l’emulsione si mantiene stabile a seguito di conservazione a 4-8 °C per almeno quattro mesi, durante i quali è stata valutata la stabilità fisica. La concentrazione di EO nella fase dispersa è stata portata alla concentrazione dell 1% p/p. Risultati analoghi sono stati ottenuti mantenendo i campioni a temperatura ambiente e in stress test. L’associazione di PUFA al 10% e di EO all’1% è stata stabilizzata anche con chitosano-oleato alla concentrazione del 5,0% e del 7,0 % p/p.

In Figura 3 e 4 sono riportate le dimensioni delle due emulsioni in cui PUFA e EO sono associati, stabilizzate con chitosano-oleato 5,0% e 7,0% p/p rispettivamente. Le dimensioni sono riportate come d50 e d90 (diametro corrispondente al 50% e al 90% della distribuzione in volume), a seguito di conservazione a 4-8 °C per 30 giorni. Risultati analoghi sono stati ottenuti mantenendo i campioni a temperatura ambiente e in stress test. La stabilità fisica precedentemente osservata per le emulsioni dei due componenti separatamente è risultata confermata anche per l’associazione con oli essenziali.

ESEMPIO 4 Analisi dei prodotti di ossidazione di PUFA in emulsioni fini stabilizzate con chitosano-oleato

Per quantificare l’ossidazione di PUFA è stato effettuato un saggio basato sull’acido tiobarbiturico (TBA) usando come riferimento una curva di calibrazione ottenuta con uno standard di malondialdeide, prodotto della perossidazione lipidica con il quale il TBA reagisce sviluppando la colorazione su cui si basa il saggio. L’ossidazione di PUFA materia prima e dei campioni in emulsione è quindi riportata in Tabella 2 espressa come equivalenti di malondialdeide dosati in 5,6 mg di PUFA materia prima e in un volume di campione contenente la stessa quantità di PUFA.

La risposta al saggio del TBA è risultata confrontabile per i campioni e per la materia prima, come per il campione a tempo zero e dopo 1 mese di conservazione (4-8 °C), ad indicare che il metodo preparativo e la conser vazione non comportano ossidazione apprezzabile degli ω-3 e ω-6. Risultati analoghi sono stati ottenuti mantenendo i campioni a temperatura ambiente e in stress test.

ESEMPIO 5 Citotossicità e proliferazione su fibroblasti

Il campione contenente PUFA 10% e EO 1%, stabilizzato con chitosano oleato 5,0% p/p è stato valutato su colture cellulari di fibroblasti per determinarne la citotossicità (a 3 ore di contatto). I risultati sono riportati in Figura 5. La concentrazione piuttosto elevata dei campioni ha richiesto diluizioni nell’ordine delle 400-800 volte per ottenere biocompatibilità con le cellule. A queste diluizioni il campione è risultato biocompatibile con i fibroblasti umani.

ESEMPIO 6 Studi di muco adesione

Poiché le emulsioni fini in studio sono stabilizzate da un derivato anfifilico del chitosano, si è ipotizzato che le catene idrofobiche di acido oleico si dispongano verso le gocce della fase olio, lasciando la catena polisaccaridica verso la fase acquosa. Questo comportamento avrebbe il vantaggio di conferire alle gocce di fase dispersa le proprietà di mucoadesione ben note nell’arte che contraddistinguono il chitosano.

Questa ipotesi è verificata nel caso delle emulsioni in studio, come riportato nelle Figure 6 e 7 dove per i sistemi a base di chitosano oleato 5,0% p/p e 7,0% p/p sono illustrate rispettivamente la forza massima di distacco tra campione e substrato (tampone nelle misure di bianco o mucina) e area sottesa alla curva forza verso spostamento, che quantifica il lavoro di mucoadesione. Sia al 5,0 che al 7,0% l’analisi statistica (ANOVA 1 via) ha confermato differenze statisticamente significative tra le misure di bianco (condotte senza mucina) e quelle effettuate in presenza di mucina, indicando positive proprietà di mucoadesione.

ESEMPIO 7 Studi sulle proprietà organolettiche dell’emulsione

In Tabella 3 sono riportati i risultati sperimentali sull’influenza della formulazione sulla percezione dell’odore e sapore propri di PUFA. Le proprietà organolettiche sono state valutate in cieco da un panel di 5 persone che hanno assegnato uno score da 0 (corrispondente ad assenza di odore/sapore) a 5 (corrispondente a odore/sapore marcato) alle emulsioni stabilizzate con concentrazioni crescenti di chitosano oleato da 0,2 a 5,0 % p/p, tutte contenenti PUFA al 10% p/p, senza EO. Sono riportati anche i risultati del test per l’emulsione stabilizzata con 7,0 % di chitosano oleato e associata a olio di bergamotto all’1% p/p e a 2% p/p di EO (1% bergamotto e 1% lavanda).

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI 1) Uso di emulsioni-fini stabilizzate con chitosano-oleato per il mascheramento organolettico di acidi grassi insaturi 2) Uso di emulsioni-fini come da rivendicazione precedente dove chitosanooleato è il sale di chitosano e acido oleico 3) Uso di emulsioni-fini come da rivendicazioni precedenti dove acidi grassi insaturi sono: acido alfa-linolenico (18:3 ALA), acido eicosapentaenoico (20:5 EPA), acido docosaesaenoico (22:6 DHA) in rapporto ponderale compreso tra 0,1% e 30% (p/p) di fase olio nell’emulsione fine 4) Uso di emulsioni-fini come da rivendicazioni precedenti dove chitosanooleato è in concentrazione finale compresa tra 0,1% e 15% (p/p) nell’emulsione fine 5) Uso di emulsioni-fini come da rivendicazioni precedenti addizionate con principi attivi naturali di origine vegetale, animale, di sintesi chimica, inclusi farmaci. 6) Uso di principi attivi di origine vegetale, come da rivendicazione precedente, dove gli oli essenziali sono in concentrazione finale tra 0,01% e 10% (p/p) nell’emulsione fine. 7) Uso di principi attivi di origine vegetale, come da rivendicazioni 5 e 6 dove tali principi attivi sono presenti in estratti acquosi, alcolici, idroalcolici e glicolici. 8) Uso di emulsioni-fini come da rivendicazioni precedenti per la stabilizzazione dei processi di perossidazione lipidica di acidi grassi insaturi. 9) Uso di emulsioni-fini in formulazioni come da rivendicazioni precedenti in formulazioni liquide, semisolide e solide adatte ad essere somministrate per via topica e transdermica, compresa cute integra o lesa e mucose; via orale, via parenterale, e negli orifizi naturali del corpo ad un soggetto umano od animale che lo necessiti. 10) Uso di emulsioni fini come da rivendicazioni precedenti applicate su superfici rigide o flessibili che vengano a contatto con il corpo umano o animale, che siamo inseriti in orifizi naturali od impiantati semi- o permanentemente in organi e tessuti umani o animali. �