HUT76355A - Plant gene-expression vector family based on dna fragments regulating alfalfa h3 histon gene variant (ms h3g1) - Google Patents
Plant gene-expression vector family based on dna fragments regulating alfalfa h3 histon gene variant (ms h3g1) Download PDFInfo
- Publication number
- HUT76355A HUT76355A HU9503352A HU9503352A HUT76355A HU T76355 A HUT76355 A HU T76355A HU 9503352 A HU9503352 A HU 9503352A HU 9503352 A HU9503352 A HU 9503352A HU T76355 A HUT76355 A HU T76355A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- gene
- expression vector
- gus
- plant
- promoter
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Description
A találmány tárgyát a lucerna (Medicago sativa) H3gl-génjének génkifejeződés szabályozásában szerepet játszó régióit (promóter, intronok, 3’-végi nem-transzlálódó régió) tartalmazó, nagymértékű expressziót biztosító, széles gazdaspektrumú, konstitutív expressziós vektorok képezik. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti expressziós vektorokat tartalmazó transzformáit sejtek, transzgenikus növények és azok részei.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható idegen gének expresszáltatására különböző egy- és kétszikű növényekben, valamint növények saját génjei expressziója mértékének és/vagy térbeli és időbeli mintázatának megváltoztatására.
A leírás vonatkozásában az alábbi szakkifejezéseket az itt megadott értelemben fogjuk használni, még abban az esetben is, amennyiben a szakirodalomban használatos lenne valamely más, a megadottól eltérő értelemzés is.
Valamely szekvencia “homológján” vagy “variánsán” a vele legalább 50 %-ban azonos szekvenciákat értjük.
Egy szekvencia “működőképes” variánsa vagy részlete a szekvencia minden olyan variánsa vagy részlete, mely az illető szekvenciával azonos típusú biológiai aktivitással bír, abban az esetben is, ha a variáns biológiai aktivitásának mértéke az eredeti szekvenciáétól eltérő (egy promóter funkcionális variánsának lehet például az eredeti promótemél kisebb vagy nagyobb mértékű transzkripciós aktivitása is).
A jelen találmányi leírás vonatkozásában akkor mondjuk, hogy egy promóter, vagy az általa biztosított expresszió “szignifikánsan erősebb” egy másik promótemél vagy az általa biztosított expressziónál, ha az első promóter aktivitása valamely reprodukálható in vitro vagy in vivő kísérleti rendszerben legalább tíz független kísérlet átlagában meghatározva - legalább körülbelül 1520%-kal nagyobbnak adódik a második promóter aktivitásánál.
·
Idegen gént hordozó, transzformációval előállított ún. transzgenikus növényekről az első tudományos közlemények a 80-as évek első felében jelentek meg [Fraley, R.T., Rogers, S.G., Horscb, R.B., Sandos, P.R. and Flinck J.S. Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 4803-4807 (1983)]. Azóta majd minden fontos gazdasági növény esetében kidolgozásra került a transzformáció módszere [összefoglalóként lásd: Hinchee és mtsai. “Plánt Cell and Tissue Culture”, 231270 old, szerk.: J.K. Vasil és T.A. Thorpe, Kluwer Academic. (1994)]. A transzgenikus technológia egyrészt mindennapos módszerré vált a kísérletes növénybiológiában, másrészt világszerte megindult és állandóan bővülő kapacitásokkal folyik a transzformáns növények felhasználása a növénynemesítésben illetve a vetőmagiparban. 1993-ban 320 bejelentett szabadföldi kísérletről adnak bírt a statisztikák, amelyek a transzgenikus növények széleskörű felhasználását készítik elő. Az Amerikai Egyesült Államokban ma már üzletekben kapható egy olyan transzgenikus paradicsom, amely kedvező tárolhatósága és jobb íze miatt jobban értékesíthető.
A transzformáns növények sikeres felhasználását meghatározó nagyszámú tényező közül a technológiai megalapozás szempontjából kiemelt jelentősége van a pozitív hatású, ún. agronómiái géneknek illetve az azok működését biztosító szabályozó elemeknek, például promóter-, intron- vagy 3’-végi szekvenciaszakaszoknak. Napjainkig az idegen gének kifejeztetéséhez a promóterek igen szűk körét használták. Leggyakrabban a karfíolmozaikvírusból származó ún. CaMv35S-promóter került beépítésre a transzformációs vektorokba. Tekintettel e rendszer korlátáira egyre nő, és sürgetően jelentkezik a piaci igény további vektorok előállítása iránt. A hasznosítási lehetőségek széles köre esetén különösen fontos lenne a növény valamennyi sejtjében, szövetében magas kifejeződést mutató, ún. konstitutív vektorkonstrukciók előállítása. Előnyös volna továbbá víruseredetű promóter helyett növényi erede• · · · tü promóter alkalmazása, az esetleges biológiai kockázat elkerülése céljából. A géntermékek mennyiségét többszintű molekuláris folyamatrendszer befolyásolja. Ezek közül meghatározó szerepe van a transzkripció mértékének, az mRNS molekulák életidejének, stabilitásának. E paraméterek függnek az 5’-végi promóterszakasz sajátosságaitól, illetve módosító hatása lehet az intronoknak valamint a 3’-végi nem-transzlálódó régióknak. így egy gén említett szerkezeti elemei egyaránt felhasználhatók agronómiái gének magas szintű megnyilvánulását biztosító transzformációs vektorok kialakításához.
A konstitutív promóterek izolálásához célszerű a sejtek alapfunkcióihoz szükséges géneket figyelembe venni. Ezek közé tartoznak a hisztongének is, amelyeket laboratóriumunk a 80-as évek közepétől kezdve vizsgál, elsősorban lucernára alapozott kísérleti rendszerekben. 1988-ban jelent meg a közleményünk, amelyben igazoltuk H3 hiszton-génvariánsok meglétét lucernában [Wu,
S.C., Bögre, L., Vincze, E., Kiss, G.B. és Dudits, D.: Plánt Mól. Bioi. 1±: 641650], Ekkor cDNS-klónok birtokában igazolni lehetett egy sejtciklus függő (H3.1) variáns és egy konstitutív (H3.2) variáns meglétét. A H3.1 variáns genomikus kiónját a génbankból izoláltuk, és igazoltuk az osztódási állapottól függő promóter működést [Kapros, T., Bögre, L., Német, K., Bakó, L., Györgyey, J., Wu, S.C., Dudits, D. Plánt Physiol. 98; 621-625 (1992)]. A konstitutív cDNS-variáns genomikus megfelelőjét izolálva lehetővé vált e gén működését befolyásoló elemek jellemzése és felhasználása új transzformációs vektormolekulák kifejlesztésére.
Az elmondottak értelmében célul tüztük ki, hogy az általunk izolált MsH3gl-génvariáns szabályozó régióinak felhasználásával széles gazdaspecifítású, konstitutív expressziót biztosító növényi expressziós vektorcsaládot állítsunk elő.
• · · · · ·
J · · · · · · ··· ···* ·.·*
- 5 A kitűzött cél megvalósítása érdekében meghatároztuk tehát az MsH3glgén teljes nukleotidsorrendjét. A szekvencia adatok alapján elkülöníthető az 5’végi promóterrégió (a transzkripció kezdőpontjához viszonyítva -482 és -1 bázispárok között, mely szekvenciarészletet az 1 .A ábrán mutatunk be, számozása: 1-482), három intron (+555 és 668; 746 és 962; 1053 és 1174 bázispárok között; l.B ábra) valamint a 3'-végi nem-transzlálódó régió (1346 és 1676 bázispárok között; l.C). Az említett szabályozó régiók egyenként és kombinációkban alkalmasak új vektormolekulák kifejlesztésére, amelyek lehetővé teszik idegen gének működtetését a növények sejtjeiben, szöveteiben valamint a növények saját génjei expressziója mértékének vagy térbeli és időbeli mintázatának megváltoztatására.
A találmány tárgyát képezik tehát olyan új konstitutív expressziós vektorok egy- vagy kétszikű növényi sejtek (például kukorica- vagy dohánysejtek) transzformálására, melyek
i) az expresszáltatni kívánt gén(ek)hez funkcionálisan kapcsolva tartalmazzák a lucerna (Medicago sativa) H3gl-génjének (az MsH3gl-gén) l.A ábrán bemutatott szekvenciájú promóterét vagy annak működőképes mutánsát vagy variánsát, vagy azok működőképes részleteit, ii) kívánt esetben tartalmazzák az MsH3gl-gén l.B és/vagy l.C ábrán bemutatott szekvenciájú intronjai és 3’-végi nem-transzlálódó régiója közül egyet vagy többet vagy azok működőképes mutánsait vagy variánsait, vagy azok működőképes részleteit, és iii) a találmány szerinti expressziós vektorokba klónozott GUS-riportergén a vektort genomjukban véletlenszerűen beépülve tartalmazó regenerált transzformáns dohánynövények leveleiben - legalább tíz transzformáns átlagában tekintve - szignifikánsan erősebben expresszálódik (azaz a GUS-enzim specifikus aktivitása szignifikánsan nagyobb), mint az MsH3gl-promóter he·· · · .: :··· .·· • ··· ··· • · · · ! ·
........
- 6 lyett CaMV35S-promótert tartalmazó, egyébként azonos szekvenciájú vektorral azonos módon transzformált regenerált dohánynövények leveleiben.
A találmány szerinti expressziós vektorok előnyösen tartalmaznak az l.B ábrán bemutatott szekvenciájú I-III. intronok közül egyet vagy többet, vagy tartalmazzák azok működőképes mutánsait, variánsait vagy azok működőképes részleteit. A találmány szerinti megoldás egyik legelőnyösebb megvalósítási módja szerint az expressziós vektorok az említett I. intront tartalmazzák, a promóterrégió és a többszörös klónozóhely közé beépítve.
A találmány szerinti expressziós vektorok transzkripciós terminátorként az
l.C ábrán bemutatott 3’-végi nem-transzlálódó régió mellet vagy ahelyett előnyösen egyéb növényi sejtekben működőképes terminátort (például NOSterminátort) is tartalmaznak.
A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti expressziós vektorokat vagy azok működőképes részleteit tartalmazó transzformált növényi sejtek és transzgenikus növények, valamint azok hasznosítható vagy szaporításra alkalmas részei is.
A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások a találmány szerinti transzgenikus növényi sejtek, növények és növényi szaporító anyagok előállítására, mely eljárások szerint növényi sejteket találmány szerinti expressziós vektorral transzformálunk, a transzformált növényi sejtből transzgenikus növényt regenerálunk vagy növényi szaporító anyagot állítunk elő.
A találmány tárgyát képezi a találmány szerinti expressziós vektorok alkalmazása is, növényi sejtek transzformálására.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.
Az 1. ábrán az MsH3gl-gén szabályozó régióinak szekvenciáit láthatjuk (l.A ábra: a promóter szekvenciája, l.B ábra: az I., II. és III. intron szekvenciája, l.C ábra: a 3’-végi nem-transzlálódó szekvencia).
-7 A 2. ábrán a találmány szerinti szabályozó régiók alkalmazásával előállított vektorkonstrukciók vázlatát láthatjuk (lásd 2 példa).
A 3. ábrán a találmány szerinti pHEX-G-vektorral stabilan transzformált dohánynövény egy levelét látjuk X-Gluc-szubsztráttal megfestve (lásd 4. példa). Az ábrán látható, hogy a levél sötétkékre színeződött, ami a pHEX-Gvektorban kódolt GUS-riportergén erős expresszióját jelzi.
A 4. és 5. ábrákon további találmány szerinti vektorkonstrukciók vázlatait mutatjuk be (lásd 5. példa).
Az alábbiakban a találmány szerinti megoldást kísérleti példák bemutatásával kívánjuk részletesebben szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.
1. példa
A lucernából (Medicago sativa) izolált MsH3gl-gén nukleotidszekvenciáiának meghatározása, az egyes funkcionális elemek azonosítása
Lucerna DNS-t hordozó λ-fágklónok közül kiválasztásra került az MsH3gl-klón a szakirodalomból ismert kolónia hibridizáció módszerével [Sambrook, J., Fritsch, F.F. és Maniatis: “Molecular Cloning, A Laboratory Manual” 2. kiadás Cold Spring Harbor Ν. Y. (1989)]. Hibridizációs próbaként a PvuII-HindlII 3’-végi szakasz került felhasználásra a korábban izolált pH3clljelü cDNS-klónból [Wu, S.C., Györgyey, J., Dudits, D.: Nucleid Acid Rés. 17: 3057-3063 (1989)]. Az izolált H3-hisztongén nukleotidsorrendjének meghatározása a széleskörűen alkalmazott szekvenálási eljárásokkal történt [Schuwmann, R. and Kenlen, W. Biotechniques 10: 185 (1991); Seto, D.: Nucleid Acid. Rés. 18: 5905- 5906 (1990); Manfíoletti, G. és Schneider, C.: Nucleid Acid. Rés. 16: 2873-2884 (1988)]. Az izolált lucerna H3-hisztongén 5’-végi promóterrégiójának nukleotidszekvenciáját, -482 és -1 bázispárok kö-8-
• ♦ · · zött, az l.A ábra ismerteti (az ábrán a szekvenciarészlet számozása: 1-482). Ez a DNS-szakasz rendelkezik egy adott gén működtetéséhez szükséges funkcionális elemekkel. Az izolált lucemahisztongén 3 nem-kódoló intron régiót tartalmaz, amely szekvenciáját az l.B ábra mutatja be. A 3’-végi nemtranszlálódó szakasz 230 nukleotidot tartalmaz (l.C ábra).
2. példa
Az MsH3gl-gén 5’-végi promóterrégióját hordozó expressziós vektorok előállítása, a promóter működőképességének igazolása céljából
Az MsH3gl genomikus klónból az AccI-5'/NcoI-3' restrikciós hasítóhelyekkel határolt H3.2-promóterszakaszt izoláltuk, és szakember számára jól ismert genetikai manipulációs lépések alkalmazásával összeépítettük a Bglükoronidáz (GUS) riportergénnel, melyet NcoI/SacI-fragmensként izoláltunk a pLP140-plazmidból [Szczyglowski, K. és mtsai.: The Plánt Cell 6, 317 (1994)]. A kapott Acél- és Sacl-hasítóhelyekkel határolt fragmenshez a kívánt orientációban hozzáépítettük nopalin szintetáz gén [Depicker és mtsai.: J. Mól. Appl. Génét. 1, 561 (1982)] Sacl-fragmensen izolált 3’-végi transzkripciós terminátorát (NOS-terminátor). Az így kialakított, AccI és SacI (SstI) restrikciós hasítóhelyekkel határolt H3.2-promóter / GUS-gén / NOS-terminátor expressziós egységet a BamHI- és Sacl-enzimekkel hasított pUC19-vektorba (Stratagene, La Jolla, CA) ligáltuk úgy, hogy a ligálást először a SacI (SstI) ragadós végeken hajtottuk végre, majd a kialakított BamHI- és Accl-végekkel rendelkező lineáris plazmidot Klenow-enzimes feltöltés után cirkularizáltuk. így állítottuk elő a pHEX-G-vektort. Az előállított expressziós vektor vázlatát a
2. ábra mutatja.
A promótererősség értékeléséhez, és a teljes hatékonyságú promóterszakasz behatárolása céljából referenciaként előállítottuk a H3-hisztongén ; ··· ··· ···
-9promóterének egy rövidített változatát (AH3.2-promóter). A rövidített változat a -193 nukleotiddal kezdődő régiót hordozza, és BamHI/NcoI fragmensként izoláltuk az MsH3gl genomi kiónból. Az izolált promóterfragmens alkalmazásával pontosan a fent leírtak szerint előállítottuk a BamHI- és Sstl-enzimekkel határolt AH3.2-promóter/GUS-gén/NOS-terminátor expressziós egységet, amit BamHI- és Sstl-enzimekkel hasított pUC19-vektorba klónozva előállítottuk a pHEXd-G-vektort (2. ábra).
A következő példában ismertetett expressziós kísérletekben a találmány szerinti vektorok által biztosított GUS-expresszió mértékét összehasonlítottuk a pIDS211-vektor [Stefanov és mtsai.: Acta Biologica Hungarica 42, 323 (1991)] által biztosított expresszió mértékével amely a karfiol-mozaikvírus 35Spromóter (a CaMV35S-promóter) szabályozása alatt expresszálja a GUS-gént.
3. példa
A pHEX-G és pHEXd-G expressziós vektorok működése lucerna protoplasztok transzformációja után végzett tranziens kísérletben
A kísérlethez A2-lucemasejtszuszpenzióból izolált protoplasztok kerültek felhasználásra. 2xl06 protoplaszthoz 20 pg plazmid-DNS-t adva a felvételt 40 %-os PEG-kezeléssel indukáltuk [S. Oznirulleh, S. Mórocz és D. Dudits: “Gene Transfer to Plants” szerk.: I. Potrykus és G. Spangenberg, Springer 99105. old. (1995)]. A kezelt protoplasztokat K3-tenyészoldatban tenyésztettük [Nagy, J. I. és Maliga, P.: 2. Pflanzenphysiol. 78: 453- 455 (1976)]. A tenyésztés 1, 2, 3. napján 4x10^ protoplaszt került felhasználásra a B-glükoronidáz enzim aktivitásának méréséhez. [T. Martin, R.V. Wöhner, S. Hűmmel, L. Willmitzer, W.B. Frommer “GUS Protokols”, Academic Press 23-59 (1992)]. Az 1. táblázat két független kísérlet méréseiből származó specifikus aktivitási értékeket tartalmazza. Ezek alapján megállapítható, hogy az általánosan alkal- tornázott víruseredetű konstitutív promóterhez (35S-N) viszonyítva a pHEX-G vektor lényegesen magasabb kifejeződési szintet biztosított. A rövidített promóter elemmel rendelkező referenciavektor működése gyengébbnek bizonyult.
1. táblázat
| í | 1. nap | 2. nap | 3. nap | |||
| Kontroll | 0 | 0 | 1122 | |||
| 35S-N | O | 0 | 2148 | A kísérlet | ||
| - | HEX-N | 7500 | 2260 | 10658Í __ | ||
| HEXd-N | 144 | 50 | 2151 | |||
| I | ||||||
| Kontroll | 333 1 | 530 | 903 | |||
| i | 35S-N | 1708; | 2012 | 2064Ϊ 1 | B kísérlet | |
| HEX-N | 3027· | 10963; | I | |||
| HEXd-N | 399; | 856; | 471 | 1 ι | ||
| 1 | ! | ί | I | i |
Tranziens expressziós GUS aktivitások s i l(nmól MU/mg fehérje/óra) I
4. példa
A pHEX-G-vektor stabil transzformálása dohánynövénybe
A találmány szerinti pHEX-G-vektorral önmagában ismert eljárással dohányleveleket transzformáltunk, majd a transzformánsokból teljes növényeket regeneráltunk és X-Gluc-festéssel vizsgáltuk bennük a GUS-riportergén expressziójának mértékét [az alkalmazott módszerek megegyeztek az alábbi közleményben ismertetett módszerekkel. Jefferson, R.A.: EMBO J. 6: 39013907 (1987)]. A 3. ábrán egy tipikus regenerált transzformáns növény X-Gluc- 11 festett fényképét mutatjuk be, amelyről jól látható, hogy a találmány szerinti vektorok stabilan transzformált növényben is erős riportergén-expressziót biztosítanak.
5. példa
Az MsH3gl-gén szabályozó régióinak felhasználásával kialakított további expressziós vektorok
A találmány szerinti megoldás előnyeinek szemléltetésére további expressziós vektorokat állítottunk elő az MsH3gl-gén szabályozó régióinak felhasználásával.
A 4. és 5. ábrákon látható vektormolekulákat a szakember számára jól ismert DNS-manipulációs eljárások alkalmazásával hoztuk létre [Sambrook és mtsai.: „Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, szerk. Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Az ábrákon látható vektormolekulák előállításához az MsH3gl genomi klón következő fragmenseit használtuk fel: az 5’-AccI- és 3’-NcoI restrikciós hasítóhelyek által határolt promóterrégiót, az Nsil/NcoI-helyek által határolt, I. intront tartalmazó fragmenst, valamint a SacI/Notl-hasítóhelyek által határolt, transzkripciós terminációs régiót hordozó fragmenst. Az expressziós vektorok kialakításához használt többszörös klónozóhelyet (MCS) a pBluescriptII-SK+-plazmidból izoláltuk [Stratagene, La Jolla, Kalifornia; GenBank #X52328 [SK(+)], az ebből a plazmidból származó szekvenciákat az ábrákon pBSK rövidítéssel jelöljük]. A pHEX-N- és pHEXl 10-vektorok előállításához felhasználtuk a bakteriális nopalinszintáz-gén (NOS-gén) transzkripciós terminátorát is [Depicker és mtsai.: J. Mól. Appl. Génét, i, 561 (1982)].
.: :··· .·· ? · ·· ···
- 12Az említett vektormolekulák kialakítását az alábbi klónozási lépésekben hajtottuk végre.
1. A 2. ábrán látható pHEX-N-plazmidkonstrukcióból Acél- és Ncolrestrikciós enzimekkel végrehajtott hasítással izoláltuk a promóter-régiót, a túlnyúló végeket Klenow-enzimel feltöltöttük (E.coli DNS polimeráz-I nagy fragmense), majd az izolált promóter-fragmenst a Xbal- és BamHI-enzimekkel hasított pBluescriptII-SK+-vektorba ligáltuk, a hasított plazmid túlnyúló végeit is Klenow-enzimmel töltöttük fel. így állítottuk elő a pBH-plazmidot.
2. A NOS-terminátort egy Kpnl/SacI-fragmensen izoláltuk, és beépítettük a pBH-plazmid KpnI/SacI-hasítóhelyeire, előállítva ily módon a pBHNplazmidot. A pBHN-plazmid a következő konstrukciót tartalmazza: NotI / Xbal / H3.2-promóter / Ncol / pBluescript-II-MCS (BamHI-től KpnI-ig) / SacI / NOS-terminátor / NotI.
3. A pBluescript-II-SK+-plazmidot KpnI- és Sacl-enzimekkel elhasítottuk, majd a hasított plazmidba egy szintetikus Notl-linkert építettünk be, így állítottuk elő a pBNot-plazmidot. A beépített Notl-linker szekvenciája a következő volt:
felső szál: 5’-CCCGCGGCCGCCCCAGCT-3, alsó szál: 3’-CTAGGGGCGCCGGCGGGG-5
4. A pBHN-plazmidot elhasítottuk Notl-enzimmel, és az izolált Notlfragmenst, amely a H3.2-promóter / MCS / NOS-terminátor konstrukciót tartalmazta, beligáltuk a pBNot-plazmid Notl-hasítóhelyére, előállítva ily módon a pHEX-N2-plazmidot.
5. A pHEXN2-plazmidot Ncol- és Sacl-enzimekkel elhasítottuk, majd a pLP140 [Szczyglowski, K.: The Plánt Cell 6, 317 (1994)] Ncol/Saclfragmensét építettük bele, amely a GUS-gén kódolószekvenciáját tartalmazta.
-13·*· így állítottuk elő a pHEX-N;;GUS-plazmidot.
6. A H3.2-genomi klónból az I. intront PCR-es amplifikálás útján izoláltuk, és az amplifikált fragmenst a pBHN2-plazmid Ncol-helyére építettük be, előállítva ily módon a pHEXl 10-plazmidot.
7. Az NcoI/SacI-fragmensen található GUS-kódolószekvenciát ezután beépítettük a pHEXl 10-plazmid NcoI/SacI-hasítóhelyeire, előállítva ily módon a pHEXl 10::GUS-plazmidot. A pHEXl 10-vektorban található NOSterminátort ezután kicseréltük a H3.2-terminátorra, melyet a H3.2 genomi kiónból (az MsH3gl-kiónból) állítottunk elő PCR-amplifikáció útján, a technika állása szerint jól ismert eljárások alkalmazásával, így állítottuk elő a pHEXl 11-plazmidot. A PCR-reakcióban használt láncindító oligonukleotidok szekvenciája a következő volt;
5’-végi láncindító:
5’-GAG CTC TAG GTA GGT AGC ATT CGC GGT GAA CGT GCT-3’
3’-végi láncindító:
5’-GCG GCC GCT GTC ACC GAT AGA CAA ACT ACC-3
A PCR-terméket ezután Klenow-enzimmel „políroztuk”, majd a pBluescriptSK+-plazmidba klónoztuk, melyet előzőleg KpnI- és Sacl-restrikciós enzimekkel emésztettünk, és T4-polimerázzal tettünk tompavégűvé. Az így kialakított plazmidból izoláltuk a SacI/SacI-fragmenst, és ezt a fragmenst a pHEXl 10vektor SacI/SacI-hasítóhelyeire inszertáltuk, miáltal a NOS-terminátort a lucemahiszton terminátorára cseréltük. Az így kapott konstrukciót pHEXl 11nek neveztük el.
9. Ezután a GUS-kódolórégiót hordozó NcoI/SacI-fragmenst beépítettük a pHEXl 11-plazmid NcoI/SacI-helyeire, és így előállítottuk a pHEXl 11 ::GUSplazmidot.
···· ·· • · ··· ···
...·
-146. példa
A pHEX expressziós vektorok működése tranziens rendszerben, lucerna- és kukorica-protoplasztokban
Az előállított, találmány szerinti expressziós vektorok megfelelő működésének ellenőrzése céljából az előző példában leírtak szerint előállítottuk a vektorok riportergént hordozó variánsait is. A β-glükoronidáz (GUS) riportergént hordozó plazmidok vázlatát az 5. ábrán láthatjuk.
Az alábbiakban ismertetett tranziens expressziós kísérletekben A2lucemasejtszuszpenzióból [Magyar és mtsai.; The Plánt Journal, 4, 151 (1993)], valamint HE89-kukoricasejtszuszpenzióból [Mórocz és mtsai.: Theor. Appl. Génét. 80, 721 (1990)] izolált protoplasztokat használtunk. 2x106 protoplaszthoz 20 pg plazmid-DNS-t adtunk, és a DNS-felvételt 40 %-os PEG hozzáadásával indukáltuk [Oznirulleh, S. és mtsai.: Gene transfer to plants, szerk.: Potrykus and Spangenberg, G., Springer, 99-105 old. (1995)]. A kezelt protoplasztokat K3-tápközegben tenyésztettük [Nagy, J. I. és mtsai.: 2. Pflanzenphssiol. 78, 453 (1976)]. A β-glükoronidáz enzim aktivitásának meghatározásához 4x105 protoplasztot használtunk fel, az enzimaktivitást meghatároztuk a tenyésztés 1., 2. és 3. napjain is [Martin, T. és mtsai.: GUS Protocols, Academic Press, 23-59. old. (1992)]. A kukorica-sejtszuszpenzió esetén az 1. napon meghatározott GUS-aktivitásértéke nem tért el szignifikánsan a háttérzaj értékétől. A 2. táblázatban két egymástól független transzformálás után végrehajtott enzimaktivitás-mérési kísérletek eredményeit láthatjuk. A táblázatban lucema-protoplasztokban mért specifikus aktivitási értékeket adunk meg (a táblázat adatai három párhuzamos mérés átlagát jelentik). A víruseredetű konstrukcióhoz (CaMV35S::GUS) viszonyítva egyértelműen kimutattuk, hogy a pHEX expressziós vektorok nagyobb promóteraktivitást képesek biztosítani.
- 15 • ·· · ··♦«
Különösen a pHEX110::GUS expressziós vektor esetén mértünk rendkívül nagymértékű expressziót. A referenciaként használt virális vektort (pIDS211) Stefanov és mtsai. írták le [Acta Biologica Hungarica 42, 323 (1991)].
A kukorica-protoplasztokban végrehajtott kísérletek eredményei a fentiekhez rendkívül hasonlóak voltak. A kapott kísérleti adatokat a 3. táblázatban foglaljuk össze (a táblázatban megadott enzimaktivitási értékeket három párhuzamos mérés átlagaként kaptuk).
Az ismertetett vektorok megfelelő működését dohányprotoplasztokból előállított sejtszuszpenzióban is kimutattuk (kísérleti adatokat nem közlünk).
2. táblázat
Lucemaprotoplasztokból előállított sejtszuszpenzióban meghatározott tranziens
GUS-aktivitási értékek (pmól MU / mg fehérje / perc)
| 1. kísérlet | 1. nap | 2. nap | 3. nap |
| kontroll | 0 | 0 | 0 |
| pHEX-N;;GUS | 301.4 | 2457.8 | 5270.0 |
| pHEX110::GUS | 4573.6 | 18831.7 | 44434.0 |
| pHEXllluGUS | 434.5 | 5384.6 | 16028.8 |
| PIDS211 (35S::GUS) | 57.8 | 783.2 | 565.7 |
*··· »»* ·
| -16- 2. táblázat (folyt.) | |||
| 2. kísérlet | 1. nap | 2. nap | 3. nap |
| kontroll | 1,5 | 0 | 0 |
| pHEX-N::GUS | 353.8 | 6287,7 | 15984,8 |
| pHEX110::GUS | 1335,9 | 23441,0 | 42570,2 |
| pHEXlll::GUS | 208,8 | 5268,4 | 13891,4 |
| pIDS211 (35S::GUS) | 22,3 | 665,2 | 1044,0 |
3. táblázat
Kukoríca-protoplasztokból előállított seitszuszpenzióban mért tranziens GUS-
| aktivitási értékek (pmól MU / mg fehérje / perc) | ||
| 1. nap | 2. nap | |
| kontroll | 0,47 | 0,49 |
| pHEX-N::GUS | 0,46 | 0,99 |
| pHEX110::GUS | 62,51 | 50,90 |
| pHEXlll.OUS | 6,64 | 15,81 |
7. példa pHEX expressziós vektorokat tartalmazó transzgenikus növények előállítása, a
GUS-expresszió mértékének és szövetspecifitásának vizsgálata
A találmány szerinti expressziós vektorokat az általánosan használt Agrobacterium -közvetítette transzformációs rendszer alkalmazásával dohánysejtekbe juttattuk. Az alkalmazott EHAlOl-jelű Agrobacterium-pXaznÁéi leírá**»» sát megtalálhatjuk Hood és mtsai. publikációjában [J. Bacteriol. 168, 1291 (1986)]. Az előállított transzgenikus növényeket szintén a fenti közleményben leírtak szerint regeneráltuk. Röviden: a dohánylevéllemezkékkel együtt tenyésztett Agrobacterium-tenyészetet tovább tenyésztettük növényi regenerációs táptalajon. A baktériumok eltávolítása után a növényeket in vitro üvegházban növesztettük, majd a termelődött magvakat begyűjtöttük. A találmány szerinti vektorok megfelelő működését GUS-aktvitásméréssel igazoltuk, mind az elsődleges transzformánsokban, mind a leszármazott magoncokban. A GUSaktivitást Jefferson és mtsai. [EMBO J. 6, 3901 (1987)] által kifejlesztett hisztokémiai festési eljárással mutattuk ki, levélszövetekben. A pHEX-N-vektorral transzformált dohánynövények leveleiben 1968-3891 pmól MU (metilumbelliferon) / mg fehérje / perc GUS-aktivitási értékeket mértünk, mely eredmény világosan mutatja, hogy a találmány szerinti vektorok a várakozásnak megfelelően működnek transzgenikus növényekben. A pHEX110::GUSvektorkonstrukciót hordozó transzgenikus növényekben 1598-4634 pmól MU / mg fehérje / perc GUS-aktivitási értékeket mértünk.
A találmány szerinti pHEX110::GUS-vektor által biztosított expresszió mértékét transzgenikus dohánynövényekben is összehasonlítottuk a CaMV35Spromóter / GUS-gén konstrukciót tartalmazó pROK2::GUS-vektor [Pellegrineschi A. és mtsai.: Plánt Peroxidases, Structure and Molecular Biology, 23, 247 (1995)] által biztosított expresszió mértékével. A kísérlet eredményeit az alábbi 4. táblázatban foglaljuk össze. A kísérlet során 9 transzgenikus pHEXl 10::GUS-dohányklónban és 7 transzgenikus pROK2::GUS-dohányklónban határoztuk meg a GUS-aktivitási értékeket, és az tapasztaltuk, hogy a H3.2-promótert tartalmazó találmány szerinti vektor át• ···· ·· « ···· • · · · · · · • ··· · · · · ·
- 18• · · ··· ·· lagosan több mint kétszeres mértékű expressziót biztosított, mint a CaMV35Spromótert tartalmazó vektor.
4. táblázat
A H3.2- és CaMV35-promóterek aktivitásának összehasonlítása transzgenikus dohánynövényekben (első generáció, teljesen kifejlődött levelek)
| klón | pmól MU / mg fehérje / perc | átlag |
| pHEXl 10: :GUS/1 | 2970.4 | |
| pHEXl 10: :GUS/2 | 1324.0 | |
| pHEXl 10::GUS/6 | 3988.4 | |
| pHEXl 10: :GUS/7 | 996.4 | |
| pHEXl 10: :GUS/8 | 660.8 | |
| pHEXl 10: :GUS/9 | 419.2 | |
| pHEXl 10::GUS/10 | 1809.3 | |
| pHEXl 10::GUS/12 | 840.7 | |
| pHEXl 10::GUS/13 | 2022.8 | 1670.2 |
| pROK2:GUS/2 | 239,6 | |
| pROK2:GUS/3 | 834,9 | |
| pROK2:GUS/4 | 621,6 | |
| pROK2:GUS/5 | 653,9 | |
| pROK2:GUS/7 | 1474,7 | |
| pROK2:GUS/8 | 617,4 | |
| pROK2:GUS/10 | 1180,6 | 803,2 |
A pHEXl 10: :GUS-vektort hordozó transzgenikus dohánynövények gyökerekben is nagy mértékű GUS-expressziót tudtunk kimutatni (kísérleti adatokat nem közlünk), ami azt bizonyítja, hogy a találmány szerinti vektorok szövettípustól független, konstitutív expressziót biztosítanak.
Az elmondottakból kitűnik, hogy a találmány szerinti expressziós vektorok alkalmasak mind egy-, mind pedig kétszikű növényekben idegen gének - és természetesen a növény saját génjei - magas szintű (a CaMV35S-promóterrel elérhető mértéket meghaladó mértékű), konstitutív expressziójának biztosítására, ezért a találmány szerinti növényi expressziós vektorcsalád nagy gyakorlati jelentőségű transzgenikus haszonnövények kifejlesztését teszi lehetővé.
Claims (10)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Konstitutív expressziós vektor gének egy- vagy kétszikű növényi sejtekben (például kukorica- vagy dohánysejtekben) történő kifejeztetésére, azzal jellemezve, hogyi) az expresszáltatni kívánt gén(ek)hez funkcionálisan kapcsolva tartalmazza a lucerna (Medicago sativa) H3gl-génjének (az MsH3gl-gén) l.A ábrán bemutatott szekvenciájú promóterét vagy annak működőképes mutánsát vagy variánsát, vagy azok működőképes részleteit, ii) kívánt esetben tartalmaz az MsH3gl-gén l.B és/vagy l.C ábrán bemutatott szekvenciájú intronjai és 3’-végi nem-transzlálódó régiója közül egyet vagy többet vagy azok működőképes mutánsait vagy variánsait, vagy azok működőképes részleteit, és iii) az expressziós vektorba klónozott funkcionális GUS-riportergén a vektort genomjukban véletlenszerűen beépülve tartalmazó, regenerált transzformáns dohánynövények leveleiben - legalább tíz transzformáns átlagában vizsgálva - szignifikánsan erősebben expresszálódik (azaz a GUS-enzim specifikus aktivitása a levelekben szignifikánsan nagyobb), mint az MsH3glpromóter helyett CaMV35S-promótert tartalmazó, egyébként azonos szekvenciájú vektorral azonos módon transzformált regenerált dohánynövények leveleiben.
- 2. Az 1. igénypont szerinti expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy tartalmaz az 1 .B ábrán bemutatott szekvenciájú I-III. intronok közül egyet vagy többet, vagy azok működőképes mutánsait, variánsait vagy azok működőképes részleteit tartalmazza.-21
- 3. A 2. igénypont szerinti expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy azl.B ábrán bemutatott szekvenciájú I. intront vagy annak működőképes mutánsát vagy variánsát, vagy azok működőképes részletét tartalmazza.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy transzkripciós terminátorként a NOS-terminátort vagy annak működőképes mutánsát vagy variánsát, vagy azok működőképes részleteit tartalmazza.
- 5. Transzformált növényi sejt, amely 1-4. igénypontok bármelyike szerinti expressziós vektort vagy annak működőképes részletét tartalmazza.
- 6. Transzgenikus növény vagy annak bármely hasznosítható vagy szaporításra alkalmas része, amely 1-4. igénypontok bármelyike szerinti expressziós vektort vagy annak működőképes részletét tartalmazza.
- 7. Eljárás transzgenikus növényi sejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy növényi sejtet 1-4. igénypontok bármelyike szerinti expressziós vektorral transzformálunk.
- 8. Eljárás transzgenikus növény előállítására, azzal jellemezve, hogy 7. igénypont szerint előállított transzformált növényi sejtből transzgenikus növényt regenerálunk.
- 9. Eljárás transzgenikus növényi szaporító anyag előállítására, azzal jellemezve, hogy 7. igénypont szerint előállított transzformált növényi sejtből transzgenikus növény regenerálása után - vagy regenerálás nélkül - szaporításra alkalmas növényi anyagot állítunk elő.
- 10. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti expressziós vektor alkalmazása növényi sejtek transzformálására.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9503352A HUT76355A (en) | 1995-11-24 | 1995-11-24 | Plant gene-expression vector family based on dna fragments regulating alfalfa h3 histon gene variant (ms h3g1) |
| PCT/HU1996/000070 WO1997020058A2 (en) | 1995-11-24 | 1996-11-22 | PLANT GENE EXPRESSION VECTOR FAMILY BASED ON THE REGULATORY DNA SEQUENCES OF AN ALFALFA H3 HISTONE GENE VARIANT (MsH3g1) |
| AU77052/96A AU7705296A (en) | 1995-11-24 | 1996-11-22 | Plant gene expression vector family based on the regulatory dna sequences of an alfalfa h3 histon gene variant (msh3g1) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9503352A HUT76355A (en) | 1995-11-24 | 1995-11-24 | Plant gene-expression vector family based on dna fragments regulating alfalfa h3 histon gene variant (ms h3g1) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9503352D0 HU9503352D0 (en) | 1996-02-28 |
| HUT76355A true HUT76355A (en) | 1997-08-28 |
Family
ID=10987390
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9503352A HUT76355A (en) | 1995-11-24 | 1995-11-24 | Plant gene-expression vector family based on dna fragments regulating alfalfa h3 histon gene variant (ms h3g1) |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| AU (1) | AU7705296A (hu) |
| HU (1) | HUT76355A (hu) |
| WO (1) | WO1997020058A2 (hu) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9923306D0 (en) | 1999-10-01 | 1999-12-08 | Isis Innovation | Diagnostic and therapeutic epitope, and transgenic plant |
| US7122721B1 (en) | 1999-10-05 | 2006-10-17 | Basf Aktiengesellschaft | Plant gene expression under the control of constitutive plant V-ATPase promoters |
| GB0212885D0 (en) | 2002-06-05 | 2002-07-17 | Isis Innovation | Therapeutic epitopes and uses thereof |
| US10105437B2 (en) | 2004-04-28 | 2018-10-23 | Btg International Limited | Epitopes related to coeliac disease |
| CA2564521C (en) | 2004-04-28 | 2017-04-11 | Btg International Limited | Epitopes related to coeliac disease |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE68918494T2 (de) * | 1988-05-17 | 1995-03-23 | Lubrizol Genetics Inc | Pflanzliches Ubiquitinpromotorsystem. |
| FR2673642B1 (fr) * | 1991-03-05 | 1994-08-12 | Rhone Poulenc Agrochimie | Gene chimere comprenant un promoteur capable de conferer a une plante une tolerance accrue au glyphosate. |
| FR2706909B1 (hu) * | 1993-06-25 | 1995-09-29 | Rhone Poulenc Agrochimie |
-
1995
- 1995-11-24 HU HU9503352A patent/HUT76355A/hu unknown
-
1996
- 1996-11-22 AU AU77052/96A patent/AU7705296A/en not_active Abandoned
- 1996-11-22 WO PCT/HU1996/000070 patent/WO1997020058A2/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1997020058A3 (en) | 1997-07-17 |
| AU7705296A (en) | 1997-06-19 |
| WO1997020058A2 (en) | 1997-06-05 |
| HU9503352D0 (en) | 1996-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU1855700A (en) | Novel expression cassette for expressing genes in plant seed | |
| US5538879A (en) | Expression cassette and plasmids for a guard cell specific expression and their use for the introduction of transgenic plant cells and plants | |
| AU728100B2 (en) | Shoot meristem specific promoter sequences | |
| JP5774809B2 (ja) | 種子収量が向上した植物 | |
| AU672017B2 (en) | Dna sequences and plasmids for the preparation of plants with changed sucrose concentration | |
| WO2006036864A2 (en) | Promoter, promoter control elements, and combinations, and uses thereof | |
| EP1026249B1 (en) | GENE ENCODING alpha-SUBUNIT OF RICE ANTHRANILATE SYNTHASE AND DNA RELATING THERETO | |
| JP2005506034A (ja) | 植物ｇａｂａ産生を調節する方法 | |
| CN112011557B (zh) | 一种水稻基因OsRMT1及其在制备具有高温胁迫耐性转基因植物中的用途 | |
| US20060206964A1 (en) | Method for enhancing cellulose and modifying lignin biosynthesis in plants | |
| JPH09504171A (ja) | アンモニウム輸送体、該輸送体を含有するプラスミド、細菌、酵母、植物細胞および植物 | |
| HUT76355A (en) | Plant gene-expression vector family based on dna fragments regulating alfalfa h3 histon gene variant (ms h3g1) | |
| AU5026200A (en) | Method for enhancing cellulose and modifying lignin biosynthesis in plants | |
| EP1111051B1 (en) | Promoter for guard cell-specific gene expression in plants | |
| WO1996030509A1 (fr) | Promoteur vegetal et expression genetique l'utilisant | |
| CN114716522B (zh) | Kin10蛋白及其相关生物材料在植物耐盐碱中的应用 | |
| JP2003511049A (ja) | プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子を利用した作物の収量またはバイオマスの増大方法 | |
| AU593296B2 (en) | A method for the expression of genes in yeast, and DNA fragments as well as plasmids comprising said DNA fragments to be used when carrying out the method | |
| KR101918590B1 (ko) | 식물의 가뭄 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도 | |
| JP4651410B2 (ja) | イネのアントラニル酸合成酵素遺伝子ｏａｓａ２の新規改変遺伝子およびその利用 | |
| CN110194791B (zh) | Spl3蛋白在调控植物花序或果柄发育中的用途 | |
| CN114752620B (zh) | ZmGW3蛋白及其基因在调控玉米籽粒发育中的应用 | |
| JP3772974B2 (ja) | 植物由来のプロモーター | |
| JP2002527039A (ja) | Ａｍｐデアミナーゼ | |
| JP4097227B2 (ja) | ユビキチン融合遺伝子プロモーター、およびその利用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFC4 | Cancellation of temporary prot. due to refusal |