HUT76089A - Antibodies with bind to insect gut proteins and their use - Google Patents

Antibodies with bind to insect gut proteins and their use Download PDF

Info

Publication number
HUT76089A
HUT76089A HU9603526A HU9603526A HUT76089A HU T76089 A HUT76089 A HU T76089A HU 9603526 A HU9603526 A HU 9603526A HU 9603526 A HU9603526 A HU 9603526A HU T76089 A HUT76089 A HU T76089A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
plant
dna sequence
antibody
monoclonal antibody
toxin
Prior art date
Application number
HU9603526A
Other languages
English (en)
Inventor
Nadine Barbara Carozzi
Michael Gene Koziel
Original Assignee
Ciba Geigy Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ciba Geigy Ag filed Critical Ciba Geigy Ag
Publication of HUT76089A publication Critical patent/HUT76089A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

A találmány tárgya rovar bél proteinekhez kötődő antitestek és alkalmazásuk, különösen új hibrid toxin molekulák előállítására. A találmány továbbá az említett antitesteket illetve hibrid toxinokat előállító mikroorganizmusokra, növényi sejtekre és növényekre vonatkozik. A találmány inszekticid készítményeket is magában foglal és ezek alkalmazását növények növényi kártevők elleni védelmére.
A különböző kártevők biológiai molekulák alkalmazásával történő megfékezése edig az esetek korlátozott számában volt lehetséges. A legismertebb példa a peszticidként alkalmazott biológiai molekulákra a Bacillus thuringiensisből (Bt) származó δendotoxinok. Ismeretes, hogy a Bt különböző törzsei inszekticid proteineket, δ-endotoxinokat állítanak elő a sporuláció alatt. Ezek közül némelyiknek hasznosítható inszekticid aktivitása van különböző rovarkártevők ellen. A δ-endotoxinok alkalmazása azonban igen korlátozott, mivel a számos rovarkártevő közül csak igen kevéssel szemben hatásosak.
A Bt endotoxinjainak a korlátozott specifitása legalább részben a toxinnak a rovar belében történő aktiválódásától (Haider, Μ. Z. és mtsai., 1986, Eur J. Biochem. 156:531-540) és attól függ, hogy képes-e kötődni a rovar középbelének epitéliális sejtjein jelenlévő specifikus receptorokhoz (Hofmann, C. P. és mtsai, 1988, PNAS 85:7844-7848). Azok között a tényezők között, amelyek megakadályozzák bizonyos δ-endotoxinoknak egy specifikus rovarral szembeni aktivitását, megtalálható a megfelelő receptorok
-2hiánya a rovar belében, vagy a δ-endotoxinnak az esetlegesen jelenlévő receptorral szembeni affinitásának hiánya, melyek így azt eredményezik, hogy a δ-endotoxin nem kötődik a bélbolyhokat határoló sejtmembránokhoz. Ezért jelenleg egy specifikus rovarkártevő Bt δ-endotoxinokkal történő megfékezése a megfelelő, kívánt aktivitással rendelkező δ-endotoxin megtalálásán múlik. Sok esetben az ilyen δ-endotoxin nem ismert, és nem biztos, hogy egyáltalán létezik ilyen. Például Bt törzsek ezreit vizsgálták nyugati gabona gyökérféreggel (WCRW) szembeni aktivitásra, amely a kukorica legnagyobb kártevője. Azonban a mai napig nem számoltak be olyan Bt törzsről, amely a WCRW-vel szemben igazán hatásos δendotoxint termelne.
Jellemzően az egyes δ-endotoxinoknak nagyon szűk a hatásspektrumuk, mindegyik csak egy vagy néhány rovarkártevővel szemben hatásos. Továbbá a δ-endotoxinok csupán a rovarok kevés rendjének néhány tagjával szemben hatásosak. Az a képesség, hogy további egyedi peszticid hatással rendelkező proteineket állítsunk elő, további lehetőségeket nyújt a mezőgazdasági kártevők, különösen a rovarok biológiai molekulák alkalmazásával történő megfékezésére, és egyben magas szintű védelmet biztosít a nem cél szervezeteknek. Tehát szükség van olyan kötő proteinekre, amelyek úgy választhatók ki, hogy egy bizonyos rovarkártevőt célozzanak meg.
Enélfogva a találmány antitestekre, különösen monoklonális antitestekre vagy fragmenseikre vonatkozik, melyek a rovar bélboholy határ membránjának vezikulumaihoz kötődnek, valamint arra a génre vagy azokra a génekre vonatkozik, mely(ek) ezeket a proteineket kódolják. A találmány szerinti antitestek egy cél • · · · ·
J
-3rovar belében lévő proteinekhez kötődnek, különösen a Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera és Trichoptera rendekből kiválasztott cél rovarhoz, de nem kötődik az emlősök bélboholy határoló membránjához vagy a növények mikroszómáihoz. Előnyösen a találmány egy olyan monoklonális antitestre vagy fragmensére vonatkozik, mely a nyugati gabona gyökérféreg beléhez kötődik. A találmány egy előnyös kiviteli módjában a 2B5, 3B1, 10B6, 17F6, 14G1 és 16E4 monoklonális antitestek valamelyikére vonatkozik.
A találmány magában foglalja azokat a hibridóma sejtvonalakat is, melyek a találmány szerinti antitesteket termelik, különösen az ATCC HB 11616, HB11617, HB11618, HB11619 és HB 11620 deponálási számon letétbe helyezett hibridóma sejtvonalakat.
A találmány további tárgya a találmány szerinti monoklonális antitesteket vagy ezeknek a monoklonális antitesteknek a kötőhelyét kódoló DNS-szekvencia. Előnyösen a találmány egy olyan monoklonális antitestet vagy fragmensét kódoló DNS-szekvenciára vonatkozik, mely az 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13., 15., 17., 44. vagy 46. azonosítószámú szekvenciák valamelyike. A találmány magában foglal egy olyan DNS-szekvenciát is, mely működőképesen kapcsolódik egy toxinrészhez, különösen ahol az említett toxinrész a Bacillus toxinok, Pseudomonas exotoxin, fitolakcin, gelonin, ribonukleázok vagy riboszóma inaktiváló peptidek közül került kiválasztásra. Az antitestek és az ezeket kódoló gének hasznosak lehetnek a rovarkártevők megfékezésére szolgáló hibrid toxinok előállítására. Tehát a találmány további tárgya egy olyan hibrid toxin molekula, mely a találmány szerinti monoklonális antitestet »111 · i
-4vagy kötőfragmensét tartalmazza, működőképesen kapcsolva egy toxinrésszel. A találmány egy előnyös megvalósítási módjában az említett toxinrész a Bacillus toxinok úgymint például Bacillus endotoxinok közül kerül kiválasztásra, különösen BT endotoxin, vegetatív inszekticid proteinek, Pseudomonas exotoxin, fitolakcin, gelonin, ribonukleázok és riboszóma inaktiváló proteinek közül.
Továbbá a találmány egy olyan hibrid toxinra is vonatkozik, mely egy monoklonális antitestet vagy ennek kötőrégióját tartalmazza, mely kötődik a cél rovar beléhez, különösen a rovar bélboholy határoló membránjához és nem kötődik az emlősök bélboholy határoló membránjaihoz vagy a növényi mikroszómákhoz, és működőképesen kapcsolódik egy toxinrészhez, ahol az említett toxinrész a Bacillus toxinok, úgymint például Bacillus endotoxinok közül kerül kiválasztásra, különösen BT endotoxin, vegetatív inszekticid proteinek, Pseudomonas exotoxin, fitolakcin, gelonin, ribonukleázok és riboszóma inaktiváló proteinek közül.
A találmány továbbá magában foglal egy olyan DNS-szekvenciát is, amely a találmány szerinti hibrid toxint kódolja, mely hibrid toxin egy olyan monoklonális antitestből vagy kötőrégiójából áll, mely egy cél rorvar beléhez kötődik, de nem kötődik az emlősök bélboholy határoló membránjaihoz vagy a növényi mikroszómákhoz, működőképesen összekapcsolva egy toxinrésszel.
A találmány továbbá magában foglal egy olyan vektorral transzformált mikrobiális gazdasejtet, melybe egy, a találmány szerinti hibrid toxint kódoló DNS-molekula van integrálva. A mikroorganizmus gazdán különösen baktériumok, algák és gombák értendőek.
-5A találmány továbbá magában foglal egy, legalább egy találmány szerinti
DNS-szekvenciával transzformált mikroorganizmust, különösen mely baktériumok, úgymint Bacillus,
Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Streptomyces, Rhisobium,
Agrobacterium, Acetobacter,
Azotobacter, Leuconostoc és
Caulobacter, Agmenellum, Klebsiella, Xanthomonas,
Rhodopseudomonas, Methylius,
Lactobacillus, Arthrobacter,
Alcaligenes; gombák, különösen élesztő, úgymint Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula és Aureobasidium, és vírusok, úgymint Autographica californica nukleáris polihedrózis vírus közül kerül kiválasztásra.
A találmány különösen egy olyan rekombináns mikroorganizmusra vonatkozik, mely legalább egy olyan hibrid toxint kódol, mely egy olyan monoklonális antitestből vagy kötőrégiójából áll, mely egy célorvar beléhez kötődik, de nem kötődik az emlősök bélboholy határoló membránjaihoz vagy a növényi mikroszómákhoz, működőképesen összekapcsolva egy toxinrésszel, ahol az említett, monoklonális antitestet kódoló DNS az 1., 3., 5., 7., 9., 11.,
13., 15., 17., 44. vagy 46. azonosítószámú szekvenciák valamelyikét tartalmazza.
A találmány továbbá magában foglal egy olyan rovarellenes készítményt, mely a fentebb említett rekombináns mikroorganizmusok valamelyikét tartalmazza inszekticid hatású mennyiségben egy alkalmas hordozóval együtt.
A találmány továbbá magában foglal egy olyan rovarellenes készítményt, mely egy találmány szerinti izolált hibrid toxinmolekulát tartalmaz inszekticid hatású mennyiségben egy alkalmas hordozóval együtt.
-6A találmány továbbá egy DNS-szekvenciára vonatkozik, mely egy olyan DNS-szekvenciát tartalmazó első expressziós kazettát tartalmaz, mely egy növényben történő expresszió irányítására képes promotert kódol működőképesen összekapcsolva egy első DNSszekvenciával, mely egy monoklonális antitest könnyű láncát vagy az antitest kötődoménjét kódolja, ahol a monoklonális antitest egy célrovar beléhez kötődik. Egy további megvalósítási módban az említett kazetta egy második DNS-szekvenciát is tartalmaz, mely egy toxinrészt kódol működőképesen összekapcsolva az említett első DNS-szekvenciával, mely a monoklonális antitest könnyű láncát vagy az antitest kötődoménjét kódolja. Különösen előnyös egy olyan expressziós kazetta, ahol a második DNS-szekvencia egy, a Bacillus toxinok, a Pseudomonas endotoxin, fitolakcin, gelonin, ribonukleázok és riboszóma inaktiváló peptidek közül kiválasztott toxinrészt kódol.
A találmány továbbá egy DNS-szekvenciára vonatkozik, mely egy olyan DNS-szekvenciát tartalmazó második expressziós kazettát tartalmaz, mely egy növényben történő expresszió irányítására képes promotert kódol működőképesen összekapcsolva egy első DNSszekvenciával, mely egy monoklonális antitest nehéz láncát vagy az antitest kötődoménjét kódolja, ahol a monoklonális antitest egy célrovar beléhez kötődik. Egy további megvalósítási módban az említett kazetta egy második DNS-szekvenciát is tartalmaz, mely egy toxinrészt kódol működőképesen összekapcsolva az említett első DNS-szekvenciával, mely a monoklonális antitest nehéz láncát vagy az antitest kötődoménjét kódolja. Különösen előnyös egy olyan expressziós kazetta, ahol a második DNS-szekvencia egy, a Bacillus toxinok, a Pseudomonas endotoxin, fitolakcin, gelonin, • · · · · • ·
-7* *«* · ribonukleázok és riboszóma inaktiváló peptidek közül kiválasztott toxinrészt kódol.
A találmány szerinti DNS-szekvencia izolált és lényegében tisztított formában vagy egy növény genomjának részeként lehet jelen.
A találmány továbbá olyan növényi sejtekre és növényekre vonatkozik, amelyek az utódokat is magukban foglalják, de különösen kukorica növényekre, mely növényi sejtek vagy növények egy találmány szerinti DNS-szekvenciával, különösen egy találmány szerinti növényi expressziós kazettával vannak transzformálva. A találmány továbbá magában foglalja azokat a transzgén növényi sejteket vagy növényeket, melyekbe az utódok is beletartoznak, és különösen azokat a kukorica növényeket, melyek kifejezik a találmány szerinti hibrid toxint, különösen megfelelő mennyiségben ahhoz, hogy a növényi sejteket illetve a növényt a rovarkártevőkkel szemben toleránssá vagy rezisztenssé tegyék. A találmány szerinti növények előnyösen hibrid növények.
Szintén a találmány körébe tartoznak azok a növényi szaporítóanyagok, különösen növényi magvak, melyekre egy védő fedőréteg van felvíve.
A találmány továbbá olyan hibridoma sejtvonal előállítási eljárására vonatkozik, mely egy találmány szerinti antitestet vagy monoklonális antitestet termel, és a következőkből áll:
a) rovar belek, különösen rovar bélboholy határmembránok alkalmazása antigénként;
b) egy donor állat immunizálása az említett antigénnel;
c) egy immunkompetens B-sejt izolálása az immunizált donor állatból;
t
-8d) az említett immunkompetens B-sejt fuzionálása egy folyamatos sejtosztódásra képes tumor sejtvonallal;
e) a kapott fúziós termék izolálása, tenyésztése egy alkalmas tápközegben, és a pozitív hibrid sejtek további klónozása; és
f) a klónozott hibrid sejtek szkrínelése a kívánt tulajdonságú monoklonális antitestek termelésére.
A találmány továbbá egy antitest, különösen egy, a rovar bélbolyhok határoló membránjához kötődő momnoklonális antitest vagy fragmensei előállítási eljárására vonatkozik, mely az említett antitesteket termelő hibridóma sejtvonalak alkalmas tenyésztőközegben történő in vivő vagy in vitro tenyésztéséből és az így nyert antitestek izolálásából áll.
A találmány továbbá olyan hibrid toxinok előállítási eljárására vonatkozik, melyek egy találmány szerinti monoklonális antitestet vagy monoklonális antitest kötőfragmenst tartalmaznak működőképesen összekapcsolva egy toxinrésszel, és amelyek a rovar bélbolyhait határoló membránvezikulumokhoz kötődnek, mely eljárás az említett antitestek variábilis régiójának klónozásából és az említett régió toxinrészhez történő kötéséből áll.
A találmány továbbá magában foglal egy találmány szerinti monoklonális antitestet kódoló DNS-szekvencia előállítási eljárását, mely a hibridóma sejtekből származó megfelelő antitest gének klónozásából áll a konstans régiókon belüli konzervatív DNS-szekvenciákhoz illeszkedő primereket és a variábilis régiók leolvasási kereteit alkalmazva.
A találmány továbbá magában foglal egy transzgén növényi sejt vagy növény előállítási eljárását, mely az említett növényi sejtnek vagy növénynek egy fentebb említett, találmány szerinti
-9·· ···· · • · · • ♦ · · · · ·· · · hibrid toxint kódoló DNS-szekvenciával történő transzformálásából áll, mely hibrid toxin egy monoklonális antitestet vagy ennek kötőrégióját tartalmazza, mely kötődik a célrovar beléhez és nem kötődik az emlősök bélbolyhait határoló membránokhoz vagy a növényi mikroszómákhoz, működőképesen összekapcsolva egy toxinrésszel.
A találmány olyan antitesteket és monoklonális antitesteket nyújt, beleértve ezek fragmenseit is, melyek képesek antitest vagy monoklonális antitest specifikusságukon keresztül a rovarbélben megtalálható proteinekhez kötődni. Ezek az antitestek kötődnek a célrovar beléhez de nem kötődnek az emlősök bélbolyhait határoló membránokhoz (BBMV-k) sem a növényi mikroszómákhoz.
A találmány szerinti antitestek magukban foglalnak poliklonális és monoklonális antitesteket és ezek azon fragmenseit is, melyek megőrizték azon képességüket, hogy kötődnek a célrovar belében lévő proteinekhez. Egy antitestről, monoklonális antitestről vagy ezek fragmenseiról akkor mondjuk, hogy képes egy molekulához kötődni, ha képes specifikusan reagálni a molekulával, és ezáltal az antitesthez, monoklonális antitesthez vagy ezek fragmenséhez kötni. Az antitest (Ab) vagy monoklonális antitest (Mab) kifejezés jelentése magában foglalja az intakt molekulákat és azokat a fragmenseit vagy kötőrégióit is, vagy ezek doménjeit (úgymint például Fab és F(ab)2 fragmensek), melyek képesek a haptén kötésére. Ezek a fragmensek jellemzően proteolitikus hasítással, úgymint papainos vagy pepszines hasítással állíthatók elő. Illetve a hapténkötő fragmensek előállíthatóak rekombináns DNS technika vagy szintetikus kémia alkalmazásával is.
-10A találmány szerinti antitestek előállítási eljárásai a szakterületen általánosan ismertek. Például lásd Antitestek, Laboratóriumi Kézikönyv (Antibodies, A Laboratory Manual), Ed Harlow és Dávid Lane szerkesztésében, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988), valamint e könyvben lévő hivatkozások. Az immunológia általános alapelveit rögzítő standard referenciamunkák: Klein, J. Immunológia: A Sejt-Nemsejt Megkülönböztetés
Tudománya (Immunology: The Science of Cell-Noncell
Discrimination), John Wiley & Sons, NY (1982); Dennett, R., és mtsai, Monoklonális Antitestek, Mibridóma: Egy Új Dimenzió a Biológiai Vizsgálatokban (Monoklonal Antibodies, Mybridoma: A New Dimension in Biological Analyses), Plenum Press, NY (1980); és Campbell, A., Laboratóriumi Technikák a Biokémiában és a Molekuláris Biológiában : Monoklonális Antitest Technológia (Monoklonal Antibody Technology, In Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology) 13. kötet, Burdon et al . (szerk.), Elsevier, Amsterdam (1984). Lásd még a 4 609 893, 4 713 325, 4 714 681, 4 716 111, 4 716 117 és 4 720 459 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírásokat.
A találmány szerinti antitest és monoklonális antitest rovarbél, különösen rovar bélboholy határmembránok antigénként történő alkalmazásával állítható elő. Ilyen rovar bél membránok a szakterületen ismert eljárásokkal állíthatók elő. Általánosságban a bélboholy-határoló membránok a rovarlárvákból izolálhatok a belek kimetszésével és homogenizálásával, majd a membránok ezt követő kalcium-kloridos kicsapásával. Lásd például Wolfersberger (1986) Comp. Biochem. Phisiol. 86A: 301-308.
··· · ·
-11Felismertük, hogy az itt leírt eljárást alkalmazva adott célrovarra specifikus antitestek állíthatók elő. Célrovaron olyan rovart értünk, melyben a találmány szerinti antitestek a bélben jelenlévő proteinhez vagy proteinekhez kötődnek. Azaz olyan antitestek állíthatók elő, melyek csak a célrovar belében jelen lévő proteienekhez képesek kötődni.
A célrovar lehet bármely a Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera és Trichoptera, stb. rendekhez tartozó rovar. Tehát bármelyik rovarkártevő kiválasztható, és erre a rovarra specifikus antitest állítható elő. Különösen érdekesek azok a rovarkártevők, amelyekre nincs Bt protein, mely képes lenne megkötődni és megölni a rovart, ilyen a nyugati gabona gyökérféreg.
Amikor az MAb-vonalakat rovar bélboholyhokat határoló membránvezikulumainak (BBMV-k) antigénként történő felhasználásával állítjuk elő, a találmány szerinti, sejtvonalak által termelt antitest és monoklonális antitest az összes monoklonális antitestnek egy szubklónja. A kívánt, sejtvonal által termelt monoklonális antitest kötési tulajdonságait a célrovar BBMV-i ellen termelt különböző monoklonális antitest mindegyikének megkülönböztető szkrínelésével határozzuk meg.
A találmány szerinti megkülönböztető szkríneléssel azonosíthatóak azok az antitesttermelő vonalak, melyek az emlős BBMV-khez és/vagy a növények mikroszómáihoz is kötődnek. Az emlős BBMV-khez vagy a növények mikroszómáihoz kötődő MAb sejtvonalakat eltávolítjuk. Egy megkülönböztető szkríneléssel azok az MAb sejtvonalak is azonosíthatók, melyeknél az MAb-k a célrovartól· t
-12a klónozandó láncreakció
DNS :pcr) eltérő fajhoz tartozó rovarok BBMV-jét kötik. Tehát a találmány szerinti antitestek azok, melyek csak a célrovarokhoz, különösen egy célrovar bélrendszeréhez nagy szelektivitással kötődnek.
Az MAb-k kívánt kötési specifitással rendelkező alklónja messzendzser RNS forrásként alkalmazható az adott monoklonális antitest cDNS-ének klónozásához. A hibridóma sejtekből antitest gének klónozhatok a konstans régiókon belüli konzervatív DNSszekvenciákhoz illeszkedő primereket és a variábilis régiók leolvasási kereteit alkalmazva. Ezt amplifikációja követheti polimeráz alkalmazásával. Kábát et al. által rendelkezésre bocsátott egér nehéz és könnyű lánc szekvenciák adatbázisát sikeresen alkalmazzák mindkét izotípus specifikus és degenerált primereinek előállítására antitest gének klónozása céljából (Kábát, E. A. et al. , 1987, US Dept Health and Humán Services, US Government Printing Offices és Jones, S. T. and Bending, M., 1991, Bio/technology 9:88-89). Továbbá bőséges ismeretanyag áll rendelkezésünkre az antitestek olyan kisebb fragmenseinek előállításáról, melyek az eredeti antitest kötési tulajdonságaival rendelkeznek.
A klónozott DNS ezután a szakterületen ismert módszerekkel szekvenálhatók. Lásd például Sambrook et al., Molekuláris Klónozás: Laboratóriumi Kézikönyv (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989) 1-3. kötet, és az itt említett hivatkozások. A nukleinsavszekvenciából a kiválasztott MAb-ból származó kötőrégió proteinszekvenciája levezethető.
• · 9
-13molekulák -on
A találmány szerinti antitestek és monoklonális antitestek hibrid toxinmolekulák előállításában alkalmazhatók. Hibrid toxin vagy hibrid toxinok-on proteinek vagy immunotoxinok olyan fúzióját értjük, mely egy monoklonális antitestből vagy antitest fragmensből áll működőképesen összekapcsolva egy toxinrésszel, és amely képes egy rovar bélrendszeréhez kötődni. Azaz összekapcsolódva a monoklonális antitest vagy antitest fragmens megőrzi kötési tulajdonságait, és a toxinrész megőrzi citotoxikus tulajdonságait.
Toxinrészként számos citotoxikus protein alkalmazható. Ezek magukban foglalják, de nem korlátozódnak a Bacillus toxinokra, ideértve az endotoxinokat és vegetatív inszekticid proteineket. Lásd például a 08/037,057 sorozatszámú 1993 március 25-én bejelentett amerikai egyesült államok-beli bejelentést és a WO93/07278 számú közzétételi iratot, mely a bejelentésbe referenciaként van beépítve. Más toxinok például a katalitikus riboszóma inaktivátorok, úgymint a gelonin, a Pseudomonas exotoxin A vagy a fitolakcin (a Pseudomonas exotoxin szerkezetét jól jellemezték a következő cikkben: Chaudhary et al., (1990) J. Bioi. Chem. 265:16303-16310); sejt-anyagcsere károsítok, úgymint ribonukleázok (lásd például Mariani et al. (1990) Natúré 347:737741); Barnase toxin (vagy PE-Bar), Pseudomonas exotoxin A-ból és egy ribonukleázból származó kiméra toxin (lásd Prior et al . (1991) Cell 64:1017-1023); a sejtmembránon pórusokat létrehozó hidrofil peptidek (lásd Frohlich és Wells (1991) Int. J. Peptide Protein Rés . 37:2-6); stb.
A találmány szerinti hibrid toxinmolekulák tehát tartalmaznak egy olyan régiót, amely lehetővé teszi a molekula kötődését a ···· · « · t
-14rovar beleihez (antitest régió) és tartalmaz egy toxikus régiót is, amely a megcélzott sejt és végső soron a célrovar megölését eredményezi. A hibridtoxinokban monoklonális antitesteket vagy fragmenseit alkalmazva a hibrid toxinok egy célrovar bélrendszeréhez kötődnek, és csak erre a rovarra gyakorolnak toxikus hatást. Az ilyen hibrid toxinok kötődési tulajdonságai az MAb kötőrégiójából, míg a toxikus hatásuk az alkalmazott toxikus részből származnak.
Az antitestnek vagy antitest fragmenseknek a toxinokhoz történő kapcsolására szolgáló eljárások a szakterületen ismertek. Ezek az eljárások magukban foglalják az egyláncú antitest immunotoxinokban alkalmazott linkereket (Chaudhary et al. (1989)
Natúré 339:394-397; Chaudhary et al. (1990 PNAS 87:9491-9494;
Batra et al . 1991, Mól. and Cellular Bioi.
Brinkmann, et al. (1991), PNAS 88:8616-8620; Bri (1992), PNAS 89:3075-3079; Whitlow et al. (1993)
Engineering 6:989-995). Egy különösen hasznos linkért humán IgAl kapocsrégióján alapul, ismeretet Hallewel) (1989) J. Bioi. Chem. 264:5260-5268, és amelyet azonosítószámú szekvenciaként írunk le.
A hibrid toxinmolekulák aktivitása több tényezőtől függhet, melyeket optimalizálni lehet. Az aktivitás átmenetileg expresszáló kukorica protoplasztok által termelt proteint alkalmazva vizsgálható meg. íly módon a hibrid toxinokat expresszáló kukorica protoplasztok beépíthetőek a rovar étrendjébe az aktivitási vizsgálatok céljából. Általános rovar vizsgálatokat :2200-2205,-
Brinkmann, et al .
(1993) Protein
linkért, mely a
Hallewell et al.
amelyet a 43 .
is lásd Marrone (1985) J. Econ. Entomolo. 78:290-293, Macintosh et
I í t • · · · · • ·
-15al. (1990) j. of Invertebrate Pathology 56:258-266, és az itt hivatkozott irodalmi helyek.
Tehát a hibrid toxin szerkezetek a számunkra érdekes célkártevővel szembeni inszekticid aktivitásra tesztelhetők. Ezek az aktivitást mutató szerkezetek mezőgazdasági alkalmazásra továbbfejleszthetők.
Felismertük továbbá, hogy a hibrid toxinok különböző szerkezetei állíthatók elő. Például a hibrid toxint két expressziós kazetta kódolhatja, amelyek az antitest molekula könnyű- illetve nehézláncát kódolják. Ez a binér hibrid toxin in vivő összerakható a sejt normális processzálási mechanizmusát alkalmazva az antitest kötőhely kialakítására. A hibrid toxin része működőképesen hozzákapcsolható a könnyű- vagy nehézlánc N vagy C terminálisához vagy alternatív megoldásként bármelyik lánc valamelyik konstans régiója vagy annak egy része kicserélhető vele. A toxin részt az antitest láncok egyik konstans régiójába vagy a konstans régiók közé is be lehet illeszteni. Ezeket a szerkezeteket standard molekuláris technikákkal lehet előállítani.
Lásd például Sambrook et al. , Molekuláris Klónozás: Laboratóriumi Kézikönyv (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989) 1-3. kötet, és az itt említett hivatkozások.
A találmány szerinti hibrid toxinok magukban foglalják azokat a binér toxinokat is, melyeket növényekben lehet előállítani. így az antigéneket oly módon lehet klónozni és a növényben expresszálni, hogy funkcionális antitestek alakuljanak ki. Lásd például Hiatt et al. (1989) Natúré 342:76-78; During et al. (1990)
J. Plánt Molecular Biology 15:281-293 és a WO 91/06320 számú PCT • Ml · • «
I • «· • · · • · » · • · · · · « • ··
-16PCT közzétételi irat. A bivalens antitest expresszié szintjéről úgy számoltak be, hogy az a szolubilis proteinek 1%-a dohányban. Felismertük, hogy mind az antitest molekulák, mind az antitest fragmensek, úgymint az Fab és Fv fragmensek alkalmazhatóak. A kisebb Fab és Fv antigénkötő fragmensekről (12kDa-50kDa) kimutatták, hogy megőrzik teljes kötési affinitásukat. Egyszálú Fv-fragmenseket (scFv), melyekben a Vh és VI domének egy hidrofil és flexibilis peptiddel vannak összekapcsolva, sikeresen alkalmaztak enzimek és toxinok specifikus sejtekhez történő irányításához (Bírd (1988) Science 423:423-426 és Huston (1988) PNAS 85:5879-5883). Antigén kötésére szintén alkalmaztak egyszálú Vh doméneket (Dabs) és egyszálú, komplementer meghatározó régiókat, melyek olyan kicsik mint 20 aminosav (aa), és legkisebb felismerési egységeknek (mru )nevezik őket (Ward (1989) Natúré 341:544-546 és Taub (1989) J. Bioi. Chem 264:259-265 és Williams (1989) PNAS 86:5537-5541). Ezeknek az antitest fragmenseknek az alkalmazása lehetőséget nyújt egy MAb-ből származó rovarspecifikus kötődőmén nagyon kis méretűvé történő csökkentésére.
A találmány szintén magában foglalja a rovarok beléhez kötődő antitesteket vagy az antitestek régióit kódoló DNS-fragmenseket. Egy előnyös megvalósítási módban ezek a DNS-fragmensek olyan kötő régiókat kódolnak, amelyek egy kívánt célrovar BBMV-ivel szemben termelt monoklonális antitestekből származnak, és megvizsgáltuk őket azon célból, hogy biztosak legyünk benne, hogy nem kötődnek emlős BBMV-hez vagy növényi mikroszómákhoz. Az ilyen DNS fragmenseket a fentebb ismertetett új hibrid toxin molekulákat kódoló gének előállítására lehet felhasználni.
I
-17A hibrid toxinok toxinrészét kódoló DNS-szekvenciák a szakterületen ismertek. Lásd Lamb et al. (1985) Eur. J. Biochem.
148:275-170 (Ricin) ; Gray et al . (1984) PNAS 81:2645-2649 (Pseudomonas toxin DNS-szekvencia); Hindley és Berry (1988) Nuc. Acids Rés. 16:4168 (B. sphaericus toxin gén); Bauman et al . (1988)
J. Bacteriol. 17 0:2 045-2050, Baumann et al. (1987) J. Bacteriol.
169:4061-4067; Berry and Hindley (1987) Nucleic Acids Rés. 15:5891, Berry et al . (1989) Nucleic Acids Rés. 17:7516 (B. sphaericus); WO 9309130-A sz. PCT közzétételi irat (gelonin); EP 466222-A sz. közrebocsátási irat, 5 128 460 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás (ribozim-aktiváló protein); EP 412911-A sz. közrebocsátási irat (barnáz); Heernstadt et al. (1987) Gene 57:37-46 (crylIIA); Brizzard és Whiteley (1988)
Nucleic Acids Rés 16:2723-2724 (crylB); és Geiser et al. (1986)
Gene 48:109-118 (crylA(b)). Lásd még Porter et al. (1993)
Microbiological Reviews 57:838-861; Hofte és Whiteley (1989) Microbiological Reviews 53:242-255; és WO 93/07278 sz. PCT közzétételi irat.
A találmány hibrid toxin génjeit optimalizálni lehet a növényekben történő fokozott expresszió érdekében. Lásd például WO 93/07278 sz. PCT közzétételi irat; EPA 0359472 és EPA 0385962 sz.
közrebocsátási irat; WO 91/16432 sz. PCT közzétételi irat; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3328; és Murray (1989)
Nucleic Acids Research 17:477-498. így a gének a növények által előnyben részesített kodonok felhasználásával szintetizálhatok meg. Azaz egy bizonyos gazdanövény számára azt a kodont tekintjük előnyős kodonnak, amely a leggyakrabban kódolja azt az aminosavat ebben a gazdaszervezetben. Például egy adott aminosav kukorica • · · · ·
I
-18által preferált kodonját ismert, kukoricából származó génszekvenciákból nyerhetjük. Kukorica kodonok használatát ismerteti Murray kukorica növényekből származó 28 génnél (Murray, (1989), Nucleic Acids Research 17:477-498, mely referenciaként a leírás részét képezi). Egy adott aminosavra egy bizonyos gazdasejt által használt kodonok megoszlása alapján szintetikus gének is készíthetők.
Ezt a megközelítést követve a nukleottidszekvencia bármely növényben történő expresszióhoz optimalizálható. Felismertük, hogy a génszekvencia egésze vagy valamely része optimalizált vagy szintetikus lehet. Azaz szintetikus, részben optimalizált vagy natív szekvenciákis alkalmazhatóak.
A növényi sejtek transzformálásának és a transzformált növény regenerálásának módszerei a szakirodalomból ismertek. Általánosságban az idegen DNS-nek a növényekbe történő bevezetésére Ti plazmidvektorokat valamint közvetlen DNSbevitelt, liposzómákat, elektroporációt, mikro-injektálást és mikrolövedéket alkalmaznak. Ezeket az eljárásokat már publikálták. Lásd például Guerche et al. , (1987) Plánt Science 52:111-116; Neuhause et al., (1987) Theor. Appl. Génét. 75:30-36; Klein et al. , (1987) Natúré 327:70-73; Howel et al., (1980) Science
208:1265'; Horsch et al., (1985) Science 227:122 9-1231; DeBlock et al., (1989) Plánt Phisiology 91:694-701; Methods fór Plánt Molecular Biology (Weisbach és Weisbach, szerk.) Academic Press, Inc. (1988). Lásd még EPA 0193259 és ΕΡΑ 0451878A1 közrebocsátási iratok. Köztudott, hogy a transzformáció módja a transzformálandó növényi sejttől függ.
• · • · · · ·
I
-19Továbbá ismeretes, hogy a számunkra érdekes szekvenciát tartalmazó expressziós kazetta alkotórészei módosíthatók abból a célból, hogy a növényben vagy a növényi sejtben fokozzuk az expressziót. Például csonkolt szekvenciákat, nukleotid szubsztitúciókat vagy más módosításokat lehet alkalmazni. Lásd például Perlak et al . (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:33243328; Murray et al. (1989) Nucleic Acid Research 17:477-498; és WO
91/16432 sz. PCT közzétételi irat.
A szerkezet tartalmazhat egyéb szükséges regulátorokat, úgymint terminátorokat (Guerineau et al . (1991) Mól. Gén. Génét.,
226:141-144; Proudfoot (1991) Cell, 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev., 5:141-149; Morgen et al. (1990), Plánt Cell,
2:1261-1272; Munroe et al . (1990) Gene, 91:151-158; Ballas et al.
(1989) Nucleic Acids Research, 17:7891-7903; Joshi et al. (1987)
Nucleic Acid Rés., 15:9627-9639); növényi transzlációs konszenzus szekvenciákat (Joshi, C.P. (1987) Nucleic Acids Research, 15:66436653), intronokat (Luehrsen and Walbot, (1991) Mól. Gén. Génét., 225:81-93) és hasonlóakat működőképesen összekapcsolva a nukleotid szekvenciával. Hasznos lehet, ha az expressziós kazettaszerkezet 5'vezérszekvenciákat (leader) is tartalmaz. Az ilyen vezérszekvenciák képesek a transzláció fokozására. A szakterületen ismert transzlációiokozók közé tartoznak a következők:
Pikornavírus vezérek, például EMCV vezér (Encephalomyocarditis 5'nemkódoló régió) (Elroy-Stein, 0., Fuerst, T.R., and Moss, B. (1989) PNAS USA 86:6126-6130);
Potyvírus vezérek, például TEV vezér (Dohány Etch Vírus) (Allison et al., (1986); MDMV vezér (Kukorica törpe mozaik vírus);
Virology, 154:9-20), és • · · · · • ·
-20Humán immunglobulin nehézlánckötő protein (BiP), (Macejak,
D.G., és Sarnow,P., (1991), Natúré, 353:90-94);
Alfalfa mozaik vírus burokproteinje mRNS-ének nem transzlálódó vezére (AMV RNS 4), (Jobling, S. A., és Gehrke, L., (1987), Natúré, 325:622-625);
Dohány mozaik vírus vezér (TMV) , (Gallie, D. R. et al . , (1989), Molecular Biology of RNS, 237-256); és
Kukorica klorotikus foltosodás vírus vezér (MCMV) (Lömmel, S. A. et al., (1991) Virology, 81:382-385. Lásd még Della-Cioppa et al . (1987), Plánt Phisiology, 84:965-968.
Az expressziós kazettában egy növényi terminátort is alkalmazhatunk. Lásd Rosenberg et al. (1987) Gene, 56:125;
Guerineau et al. (1991) Mól. Gén. Génét., 226:141-144; Proudfoot (1991) Cell, 64:671-674; Sanfacon et al . (1991), Genes Dev.,
5:141-149; Mogen et al . (1990) Plánt Cell, 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene, 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids
Rés., 17:7 8 91-7 903: Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Rés.,
15:9627-9639.
Szövetspecifikus nukleotidszekvenciát a találmány szerinti össze lehet kapcsolni expresszióhoz működőképesen szövetspecifikus promoterekkel. Lásd például a WO/07278 számú közzétételi iratot, mely referenciaként épül be a leírásba.
Továbbá a találmány körébe tartoznak azok a transzgén növények, különösen transzgén fertilis növények, melyek a fentebb leírt eljárások szerint transzformáltak, és ezek ivartalan és/vagy ivaros úton nyert utódjai, melyek továbbra is tartalmaznak egy találmány szerinti monoklonális antitestet vagy hibrid toxint kódoló DNS-molekulát. A kifejlett növényeket, melyeket a találmány • ·
-21szerinti transzformált növényi anyagból neveltünk fel, önmegtermékenyített vagy keresztezésből származó magvak előállítására alkalmazhatunk.
A találmány szerinti transzgén növény lehet egyszikű vagy kétszikű növény. Előnyösek a a Graminaceae család egyszikű növényei, ide értve a Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale és Serratia növényeket.
Különösen előnyös a transzgén kukorica, búza, árpa, cirok, rozs, zab, pázsitfüvek és rizs.
A kétszikűek közül különösen a szójabab, gyapot, dohány, cukorrépa, olajosmagvu repce és napraforgó előnyös.
Az utód kifejezés felöleli a transzgén növény mind ivartalanul, mind ivarosán létrejövő utódait. A meghatározás úgy értendő, hogy magában foglalja az összes, ismert módszerekkel, úgymint például sejtfúzióval vagy mutánsszelekcióval kapott mutánst és variánst is, melyek a kezdeti transzformált növény jellemző tulajdonságait még kifejezik, valamint a transzformált növényi anyag összes keresztezés! és fúziós termékét.
A találmány másik tárgya a transzgén növények szaporítóanyaga.
A transzgén növények szaporítóanyaga a találmánnyal kapcsolatban úgy határozható meg, hogy az bármely olyan növényi anyag, amely ivartalanul vagy ivarosán, in vivő vagy in vitro szaporítható. A találmány körében különösen előnyösek a protoplasztok, sejtek, kalluszok, szövetek, szervek, magok, embriók, pollen, petesejtek, zigóták, gumók, szemtermés, gyümölcs, • · · · ·
-22együtt egyéb más, a transzgén növényekből származó szaporítóanyaggal.
A növények részei, úgymint például azok a virágok, szárak, gyümölcsök, levelek, gyökerek, melyek olyan transzgén növényből vagy utódjából származnak, melyet korábban a találmány szerinti eljárás anyagaival transzformáltak, és ezért legalább egy részük transzgén sejteket tartalmaz, szintén a találmány tárgyai.
Mielőtt a növényi szaporítóanyag (gyümölcs, gumó, szemtermés, mag), különösen a mag kereskedelmi termékként eladásra kerül, azt szokásosan herbicideket, inszekticideket, gomba-, baktérium-, féreg-, puhatestűellenes szereket vagy ezen néhányának keverékét, kívánt esetben további készítmények hordozókat, felületaktív adj uvánsokat anyagokat vagy az alkalmazásukat elősegítő is tartalmazó védő bevonattal látjuk el a szakterületen szokásos módon, hogy védelmet biztosítsunk a bakteriális, gomba vagy állati kártevőkkel szemben.
A magvak kezelése céljából a védőréteget a gumók vagy szemtermések folyékony készítménnyel történő impregnálásával vagy kombinált nedves vagy száraz készítménnyel történő fedéssel visszük fel a magvakra. Továbbá speciális esetekben más alkalmazási eljárások és lehetségesek, például a bimbó vagy a gyümülcs kezelése.
A találmány szerinti monoklonális antitestet vagy hibrid toxint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó növényi mag magkezelő vegyületet, úgymint például kaptánt, karboxint, thiramot (TMTD®) , metalaxilt (Aprón®) és pirimifosz-metilt (Actellic®) és más a magvak kezelésére általánosan alkalmazott vegyületeket tartalmazó magvédő bevonattal látható el.
Β · · • · · · · • ·
-23Tehát a találmány további tárgya olyan növényi szaporítóanyag, különösen mag biztosítása a termesztett növényekhez, melyek a magkezelésben szokásosan alkalmazott védő bevonattal vannak ellátva.
A találmány szerinti hibrid toxinproteinek mezőgazdasági termények és termékek kártevőkkel szembeni védelmére alkalmazhatók. Altenatív megoldásként a hibrid toxint kódoló gén egy megfelelő vektor segítségével bejuttatható egy mikrobiális gazdasejtbe, és az említett gazdasejt eljuttatható a környezetbe, a növényhez vagy az állathoz. A gazdamikroorganizmusokat azon mkroorganizmusok közül választjuk ki, amelyek a számunkra érdekes egy vagy több termény fitoszféráját (filloplana, filloszféra, rizoszféra és/vagy rizoplana) betöltik. Ezeket a mikroorganizmusokat úgy választjuk ki, hogy képesek legyenek sikeresen felvenni a versenyt egy adott környezetben a vad típusú mikroorganizmusokkal, biztosítsák a polipeptid-peszticidet kifejező gén stabil fennmaradását és kifejeződését, és kívánatos, hogy biztosítsák a peszticid javított védelmét a környezeti degradációval és inaktivációval szemben.
Ilyen mikroorganizmusok lehetnek baktériumok, algák és gombák. Számunkra különösen érdekes mikroorganizmusok a Agmenellum,
Xanthomonas,
Methylius, Arthrobacter, baktériumok,
Pseudomonas,
Streptomyces, Agrobacterium,
Acetobacter, például Bacillus, Caulobacter,
Erwinia, Serratia, Klebsiella,
Rhisobium, Rhodopseudomonas,
Lactobacillus,
Azotobacter, Leuconostoc és Alcaligenes; gombák, különösen élesztő, például Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces,
Sporobolomyces, Rhodotorula és Aureobasidium. Különösen érdekesek • ·
-24az olyan fitoszféra baktériumfajok mint a Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marescens, Acetobacter xilinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhisobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli és Azotobacter vinlandii; fitoszféra élesztőfajok, úgy mint Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae és Aureobasidium pollulans. Különösen érdekesek számunkra a pigmentált mikroorganizmusok.
Új, rekombináns mikroorganizmus törzsben jelenlévő hibrid toxin gének alkalmazását mutatjuk be a 7. példában. Méltányolandó, hogy a találmány szerinti izolált új hibrid toxin gént valamely mikrobiális gazdába be lehet juttatni és így az inszekticid tulajdonságait az adott gazdába átvinni. A találmány szerinti új hibrid toxin gén számára helyettesítő gazdák választhatók klónozás céljából, a gének vagy a kódolt proteinek kialakításának vagy funkciójának jellemzése céljából, fermentációs gazdaként történő alkalmazásra a hibrid toxin protein termelésének fokozása érdekében, abból a célból, hogy legalább egy hibrid toxin protein hatékonyabb legyen a cél rovarkártevővel szemben, vagy az új hibrid toxin gén bejuttatására rovar patogénekbe, úgymint bakulovírusba (nukleáris polihedrózis vírus, például Autographica californica) a hatékonyság javtása érdekében.
Az új hibrid toxin génekkel vagy rekombináns formáival az ilyen helyettesítő gazdákat a szakterületen ismert eljárások valamelyikével transzformálhatjuk. Ilyen előnyös eljárás a mikrobiális sejtek elektroporációja, melyet például
Dower • · • ·
-25eljárásában írtak le (5 186 800 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Egy másik előnyös eljárás Schurter et al. eljárása (Mól. Gén. Génét. 218:177-181 (1989)), melyet az EP-A 0342 633 számú európai közrebocsátási iratban is ismertetnek, mely referenciaként teljes terjedelmében beépül a leírásunkba.
Nyilvánvaló, hogy az említett helyettesítő gazdasejt eljuttatható a környezetbe vagy a növényhez vagy az állathoz a rovarok megfékezésére. A gazdamikroorganizmusokat azon mikroorganizmusok közül választjuk ki, amelyek a számunkra érdekes egy vagy több termény fitoszféráját (filloplana, filloszféra, rizoszféra és/vagy rizoplana) betöltik. Ezeket a mikroorganizmusokat úgy választjuk ki, hogy képesek legyenek sikeresen felvenni a versenyt egy adott környezetben a vad típusú mikroorganizmusokkal, biztosítsák a polipeptid-peszticidet kifejező gén stabil fennmaradását és kifejeződését, és kívánatos, hogy biztosítsák a peszticid javított védelmét a környezeti degradációval és inaktivációval szemben.
A találmány továbbá egy olyan rovarellenes készítményt biztosít, mely aktív hatóanyagként legalább egy találmány szerinti új hibrid toxint vagy legalább egy új, rekombináns hibrid toxint kódoló gént tartalmazó rekombináns mikroorganizmust tartalmaz egy mezőgazdasági adjuvánssal, úgymint egy hordozóval, oldószerrel, felületaktív anyaggal vagy egy alkalmazást elősegítő adjuvánssal együtt. A készítmény további biológiailag aktív vegyületeket is tartalmazhat. Az említett vegyület lehet egy műtrágya vagy nyomelem donor vagy más olyan készítmény, mely befolyásolja a növény növekedését. Ez lehet egy szelektív herbicid, inszekticid, gomba-, baktérium-, fonálféreg-,
-26• « w ·<*♦ • · · · ····· · · ···· • »· · · puhatestűellenes szer vagy ezen készítmények néhányának keveréke, kívánt esetben további mezőgazdaságilag elfogadható hordozókkal, felületaktív anyagokkal vagy az alkalmazásukat elősegítő adjuvánsokkal, melyeket szokásosan alkalmaznak a formulázás szakterületén belül. Az alkalmas hordozók és adjuvánsok lehetnek szilárdak vagy folyékonyak, és melyek megfelelnek a formulázási technológiában szokásosan alkalmazott anyagoknak, például természetes vagy regenerált ásványi anyagok, oldószerek, diszpergálók, nedvesítő ágensek, ragasztóanyagok, kötőanyagok és trágyák.
A készítmény 0,1-99 tömeg% hatóanyagot, 1-99,9 tömeg% szilárd vagy folyékony adjuvánst és 0-25 tömeg% felületaktív anyagot tartalmazhat. A hatóanyaggal, mely legalább egy találmány szerinti új hibrid toxint vagy legalább egy találmány szerinti új rekombináns hibrid toxint tartalmazó rekombináns mikroorganizmust tartalmaz, vagy az aktív hatóanyagot tartalmazó készítménnyel növényeket vagy szemtermést lehet kezelni, bizonyos más inszekticidekkel vagy vegyszerekkel (1993 Crop Protection Chemicals Reference, Chemical and Pharmaceotical Press, Canada) együtt anélkül, hogy hatóerejét elveszítené. Adagolható porként, szuszpenzióként, nedvesedő porként vagy más egyéb mezőgazdasági felhasználásra alkalmas formában.
A találmány továbbá eljárást nyújt a rovarkártevők korlátozására és meggátlására egy olyan hatóanyag, mely legalább egy találmány szerinti új hibrid toxint vagy legalább egy találmány szerinti új rekombináns hibrid toxint tartalmazó rekombináns mikroorganizmust tartalmaz, vagy az aktív hatóanyagot tartalmazó készítmény alkalmazásával (a) a környezetben, melyben a ·· · ·
-27rovarkártevő előfordul, (b) növényben vagy növényi részben, hogy a növényt vagy növényrészt megvédjük egy rovarkártevő által okozott károsodástól, vagy (c) a magban, hogy megvédjük az említett magból kifejlődött növényt egy rovarkártevő által okozott károsodástól.
A növény védelmi területen történő alkalmazás egyik előnyös módja a növények lombozatára történő kijuttatás (lombkezelés), számos alkalmazással együtt, és az alkalmazás mértéke a védendő növénytől és a kérdéses kártevővel történő fertőződés kockázatától függ. A hatóanyag bejuthat a növényekbe a gyökereken keresztül (szisztémás hatás), ha a növények élőhelyét folyékony készítménnyel itatjuk át, vagy ha a hatóanyagot szilárd formában a növények élőhelyére visszük, például a földbe, például granulátum formájában (talaj kezelés) .
A találmány szerinti készítmények alkalmasak a növény szaporítóanyagának, pélául magnak, gyümölcsnek, gumóknak vagy szemterméseknek, növénydaraboknak rovarkártevőkkel szembeni védelmére. A szaporítóanyagot a készítménnyel kezelhetjük a vetés, ültetés előtt: a magokat például a havazás beállta előtt. A találmány szerinti hatóanyagot alkalmazhatjuk a szemterméseknél (fedés), vagy a szemtermések folyékony készítménnyel történő impregnálásával vagy szilárd készítménnyel történő bevonással. A készítmény alkalmazható a vetési területen is, a szaporítóanyag vetésekor, például a vetés folyamán a barázdákban. A találmány a növényi szaporítóanyag kezelési eljárásaira és az így kezelt szaporítóanyagra is vontkozik.
A találmány szerinti készítmény, amely hatóanyagként legalább egy, új rekombináns hibrid toxint tartalmazó rekombináns mikroorganizmust tartalmaz, bármely, a magok vagy a talaj • · · ·
-28baktériumtörzses kezelésére ismert módszer szerint alkalmazható.
Lásd például a 4 863 866 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírást. Ezek a törzsek még akkor is hatékony biológiai gátlók, ha már nem élnek. Azonban előnyösebb az élő mikroorganizmus alkalmazása.
A találmány körébe tartozó védendő termések például a következő növényfajokhoz tartoznak:
gabonafélék (búza, árpa, rozs, zab, rizs, cirok és rokonai), répa (cukorrépa és takarmányrépa),takarményfüvek (csomós ebír, csenkesz,- és hasonlóak), csonthélyas gyömölcsök, almafélék és lágy gyümölcsök (alma, körte, szilva, őszibarack, mandulák, cseresznye, eper, málna és szeder), hüvelyes növények (bab, lencse, borsó, szójabab), olajosmagvú növények (repce, mustár, mák, olajbogyó, napraforgó, kókusz, ricinus, kakaóbab, földimogyoró), uborkafélék (uborka, tök, dinnye), rostos növények (gyapot, len kender, juta), citromfélék (narancs, citrom, grépfruit, mandarin), zöldségfélék (spenót, sárgarépa, saláta, spárga, káposzta és más Brassicaebe tartozó növény, hagyma, paradicsom, burgonya, paprika), babérfélék (avokádó, fahéj, kámfor), lombhullató fák és tűlevelűek (például hárs, tiszafa, tölgy, éger, nyárfa, nyírfa, erdei fenyő, vörösfenyő, luc fenyő), vagy olyan növények mint a kukorica, dohány, dió, kávé, cukornád, tea, szőlő, komló, banán és természetes gumifák, valamint dísznövények ( beleértve ezek keverékét).
Új rekombináns hibrid toxint tartalmazó rekombináns mikroorganizmus általánosan rovarellenes készítmények formájában alkalmazható, és a termésterület vagy a növény kezelésére alkalmazható egyidőben vagy sorozatosan, további biológiailag • · · · · ·
-29hatékony vegyületekkel együtt. Ezek a vegyületek lehetnek műtrágyák vagy mikroelem donorok vagy más, a növény növekedését serkentő készítmények. Ezek lehetnek szelektív herbicidek, inszekticidek, gomba-, baktérium-, fonálféreg-, puhatestűellenes szerek vagy ezen készítmények néhányának keveréke, kívánt esetben további mezőgazdaságilag elfogadható hordozókkal, felületaktív anyagokkal vagy az alkalmazásukat elősegítő adjuvánsokkal, melyeket szokásosan alkalmaznak a készítményformulázás szakterületén belül.
A találmány szerinti hatóanyag módosítatlan formában vagy más alkalmas mezőgazdaságilag elfogadható hordozóval együtt használható fel. Ilyen hordozók a mezőgazdasági készítmények területén hagyományosan alkalmazott adjuvánsok, mely készítmények tehát ismert módon emulgeálható koncentrátumokká, bevonásra alkalmazható pasztákká, közvetlenül kipermezhető vagy hígítható oldatokká, híg emulziókká, nedvesedő porokká, oldható porokká, porokká, granulátumokká alakíthatók, és kapszulázhatok például polimer anyagokba. A készítmény milyensége szerint az alkalmazás módját, mely permetezés, porlasztás, behintés, kiszórás, öntözés lehet, a tervezett objektív és a fennálló körülmények függvényében választjuk meg. Az alkalmazás átlagos mértéke normális esetben körülbelül 50 g-tól körülbelül 5 kg hatóanyagig terjed hektáronként (ha, mely hozzávetőleg 2,471 négyszögyard), előnyösen körülbelül lOOg- 2kg hatóanyag/ha. Az alkalmazás jelentős mértéke körülbelül 200g-lkg hatóanyag/ha és 200g-500g hatóanyag/ha. A magok kezelésének átlagos alkalmazási mértéke
0,5g-l OOOg hatóanyag per lOOkg mag, előnyösen 3g-100g hatóanyag per lOOkg mag vagy 10g-50g hatóanyag per lOOkg.
I
-30Az alkalmas hordozók és adjuvánsok lehetnek szilárdak vagy folyékonyak, és melyek megfelelnek a formulázási technológiában szokásosan alkalmazott anyagoknak, például természetes vagy visszanyert ásványi anyagok, oldószerek, diszpergálók, nedvesítő ágensek, ragasztóanyagok, kötőanyagok és műtrágyák. A készítményeket, azaz rovarellenes kompozíciókat, készítményeket vagy keverékeket, melyek hatóanyagként rekombináns hibrid toxint tartalmazó rekombináns mikroorganizmust vagy ezek kombinációját tartalmazzák, és szükség esetén szilárd vagy folyékony adjuvánst, ismert módon állítjuk elő, például keveréssel történő homogenizálással és/vagy az a hatóanyag töltőanyagokkal, például oldószerekkel, szilárd hordozókkal és egyes esetekben felületaktív vegyületekkel történő őrléssel.
Alkalmas oldószerek: aromás szénhidrátok, előnyösen 8-12 szénatomot tartalmazó frakciók, például xilén keverékek vagy szubsztituált naftalinok, ftalátok, úgymint dibutil-ftálát vagy dioktil-ftalát, alifás szénhidrátok úgymint ciklohexán vagy paraffinok, alkoholok és glikolok és étereik és észtereik, úgymint etanol, etilén-glikol-monometil vagy monoetil-éter, ketonok úgymint ciklohexanon, erősen poláros oldószerek, úgymint N-metil2-pirrolidon, dimetil-szulfoxid vagy dimetil-formamid, valamint növényi olajok vagy epoxidizált növényi olajok azaz epoxidizált kókuszolaj vagy szójaolaj; vagy víz.
Alkalmazott szilárd hordozók például porokhoz vagy diszpergálható porokhoz, általában ásványi töltőanyagok, úgymint kalcit, talkum, kaolin, montmorillonit vagy attapulgit. A fizikai tulajdonságok javítására erősen diszpergált kovasav vagy erősen diszpergált adszorbens polimer adható. Az alkalmas granulált • · · · · • · • ·
-31adszorpciós hordozók porózus felépítésűek, például habkő, összeaprított tégla, szepiolit, bentonit; alkalmas nem adszorbens hordozók az olyan anyagok mint a kalcit vagy a homok. Továbbá előgranulált szervetlen vagy szerves természetes anyagok nagy száma alkalmazható, például különösen a dolomit vagy a porrá tört növényi maradványok.
A készítményekké alakítandó hatóanyag természetétől függően alkalmas felületaktív anyagok az olyan nemionos, kationos és/vagy anionos felületaktív anyagok, melyeknek jó emulgeáló, diszpergáló vagy nedvesítő tulajdonságai vannak. A felületaktív anyag kifejezés úgy is értendő, hogy az felületaktív anyagok elegyét tartalmazza. Alkalmas anionos felületaktív anyagok lehetnek mind vízoldékony szappanok mind vízoldékony szintetikus felületaktív vegyületek. Alkalmas szappanok az alkáli-fémsók, alkáli-földfémsók, vagy a nagyobb szénatomszámú zsírsavak (10-22 szénatomos) szubsztituálatlan vagy szubsztituált ammóniumsói, például az olajvagy sztearinsav vagy természetes zsírsavkeverékek, például melyek kókuszolajból vagy faggyúból származnak, nátrium- vagy káliumsói. További alkalmas felületaktív anyagok a zsírsav-metiltaurin-sók valamint a módosított és módosítatlan foszfolipidek.
Bár méggyakrabban az úgynevezett szintetikus felületaktív anyagot alkalmazzuk, különösen a zsír-szulfonátokat, zsírszulfátokat, szulfonált benzimidazol-származékokat vagy alkilaril-szulfonátokat. A zsír-szulfonátok vagy -szulfátok általában alkáli fémsók, alkáli földfémsók vagy szubsztituálatlan vagy szubsztituált ammóniumsók formájában vannak, és általában 8-22 szénatomszámú alkilgyököt tartalmaznak, mely szintén acilgyökök alkilrészét, például lignoszulfonsav nátrium- vagy kalciumsóit
-32• ·· · tartalmazza, vagy dodecilszulfát vagy természetes zsírsavakból származó zsírsav-alkohol-szulfátok keverékének formájában. Ezek a vegyületek állhatnak a zsír alkohol/etilén oxid adduktok kénsavésztereinek és szulfonsavainak sóiból is. A szulfonált benzimidazol származékok előnyösen 2 szulfonsav-csoportot és egy, körülbelül 8-22 szénatomot tartalmazó zsírsavgyököt tartalmaznak. Alkil-aril-szulfonátokra példa a dodecil-benzol-szulfonsav, dibutil-naftalin-szulfonsav vagy egy naftalinszulfonsav/formaldehid kondenzációs termék nátrium-, kalcium- vagy trietanolamin sói. Szintén alkalmasak a megfelelő foszfátok, például egy p-nonilfenol 4-14 mól etilénoxiddal alkotott addukt foszforsavészterének sója.
Nemionos felületaktív anyagok előnyösen alifás vagy cikloalifás alkoholok vagy telített vagy telítettlen zsírsavak és alkilfenolok poliglikol-éter származékai, ahol a származékok 3-30 glikol-éter csoportot és az (alifás) szénhidrátrészen 8-20 szénatomot és az alkilfenolok alkilrészében 6-18 szénatomot tartalmaznak.
További megfelelő nemionos felületaktív anyagok a polietilénoxidnak a polipropilén-glikollal, etilén-diamino-polipropilénglikollal vagy az alkilláncon 1-10 szénatomot tartalmazó alkilpropilén-glikollal alkotott vízben oldódó adduktjai, melyek 20-250 etilén-glikol-éter csoportot és 10-100 propilén-glikol-éter csoportot tartalmaznak. Ezek a vegyületek általában 1-5 etilénglikol egységet tartalmaznak egy propilén-glikol egységre nézve. A nemionos felületaktív anyagra jellemző példák a nonil-fenolpolietoxi-etanolok, ricinus ólaj-poliglikol éterek, polipropilén/polietilén-oxid adduktok, tributil-fenoxi-polietoxi• · • · · · ·
-33etanol, polietilénglikol és oktil-fenoxi-polietoxi-etanol. A polioxi-etilén-szorbitán zsírsav észterei, úgymint a polioxietilén-szorbitán-trioleát szintén megfelelő nemionos felületaktív anyagok.
A kationos felületaktív anyagok előnyösen kvaterner ammóniumsók, melyek N-szubsztituensként legalább egy 8-22 szénatomszámú alkil gyököt és további szubsztituensekként alacsony szénatomszámú szubsztituálatlan vagy halogénezett alkilt, benzil, vagy hidroxil-alacsony szénatomszámú-alkil gyököket tartalmaznak. A sók előnyösen halogenidek, metil-szulfátok vagy etil-szulfátok, például sztearil-trimetil-ammónium-klorid vagy benzil-di-(2klóretil)-etil-ammónium-bromid.
A kész!tményformulázási szakterületen szokásosan alkalmazott felületaktív anyagokat írnak le például McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual, MC Publishing Corp. Ridgewood, N.J.,
1979; Dr. Helmut Stache, Tensid Taschenbuch (Handbook of Surfactants), Cári Hanser Verlag, München/Bécs.
A találmány szerinti rovarellenes készítmény egy másik különösen előnyös tulajdonsága a hatóanyag tartóssága a növénynél vagy talajnál történő alkalmazáskor. Az aktivitás elvesztésének lehetséges okai között van az ultraibolya sugárzás, hőhatás, kiválasztott levélnedvek és pH általi inaktiválódás. A találmány szerinti rovarellenes készítmény megfelelő kiszerelése megoldhatja ezeket a problémákat azáltal, hogy vagy olyan adalékokat tartalmaz, mely segít meggátolni a hatóanyag elveszítését vagy az anyag kapszulázásával megvédve a hatóanyagot az inaktiválódástól. A kapszulázás végrehajtható kémiai (McGuire és Shasha, J Econ Entomol 85:1425-1433, 1992) vagy biológiai úton • ·
-34(Barnes és Cummings, 1986; EP-A 0192319). A kémiai kapszulázás egy olyan eljárásból áll, melyben a hatóanyagot egy polimerrel vonjuk be, míg a biológiai kapszulázás a a hibrid toxin géneknek egy mikrobában történő kifejezéséből áll. Biológiai kapszuiázáshoz a hibrid toxin proteint tartalmazó intakt mikrobát alkalmazzuk hatóanyagként a készítményben. UV-védőanyag hozzáadása hatásosan csökkentheti a sugárkárosodást. A hőhatás okozta inaktiváció szintén meggátolható egy megfelelő adalékanyaggal.
A találmányban az olyan kiszerelésű készítmények előnyösek, melyek hatóanyagként élő mikroorganizmusokat tartalmaznak vagy vegetatív sejt, vagy mégelőnyösebben spórák formájában, ha ez lehetséges. A megfelelő kiszerelésű készítmények állhatnak például polivalens kationokkal keresztkötött polimer gélekből, melyek ezeket a mikroorganizmusokat tartalmazzák. Ezt leírta például D. R. Fraval et al. , Phytopatology, vol. 75, No. 7, 774-777, polimer anyagként alginátra. Ebből a publikáciból az is ismert, hogy hordozóanyagokat is lehet alkalmazni. Ezek a készítmények általában természetes vagy szintetikus gélképző polimerek oldatainak, például alginátoknak és polivalens fémionok vizes sóoldatának elegyítésével állíthatóak elő egyedi cseppecskék formájában, ahol a mikroorganizmusokat az egyik vagy mindkét reakcióoldatba szuszpendálni lehet. A gélképződés a csepp alakban történő összekeveréssel kezdődik meg. Ezt követően lehetővé válik a gélrészecskék szárítása. Ezt az eljárást ionotróf gélesedésnek nevezik. A száradás mértékétől függően a polivalens kationokkal szerkezetileg keresztkötött, és a mikroorganizmusokat tartalmazó kompakt és kemény polimerrészecskék és a hordozó túlnyomóan egységesen oszlik el. A részecskék mérete 5 mm-ig terjedhet.
• « • · · · · ····· · · ···· • · · · ·
-35A részlegesen keresztkötött poliszacharid alapú készítmények, melyek egy mikroorganizmus mellett hordozóanyagként finoman szétoszlatott sziliciumsavat is tartalmaznak, például Ca'*'ionokkal lehetnek keresztkötve, ahogy azt az EP-A1-097 571 sz.
európai közrebocsátási iratban leírták. A készítmények vízaktivitása 0,3-nál nem több. W. J. Cornick és munkatársai áttekintő cikkükben ( Őj irányok a biológiai védekezésben, A mezőgazdasági Kártevők és betegségek megfékezésének alternatívái (New Directions in Biological Controls, Alternatives fór Suppressing Agricultural Pests and Diseases), 345-372, Alán R.
Liss, Inc. (1990)) különbüző készítménykiszerelési rendszereket
írnak le, granulátumokat vermikulit hordozóval, az említett
ionotróf gélesítő eljárással előállított kompakt alginát
gyöngyöket . D. R. Fravel a Peszticid készítmények és alkalmazási
rendszerek (Pesticide Formulations and Application Systems): 11.
kötet,ASTM STP 1112 American Society fór Testing and Materials,
Philadelphia, 1992, 173-179 oldalain ilyen készítményeket ismertet, és ezek a találmány szerinti rrekombináns mikroorganizmusok készítménnyé alakításánál alkalmazhatóak.
A találmány szerinti rovarellenes készítmény általában
körülbelül 0,1-99%, előnyösen körülbelül 0,1-95%, legelőnyösebben
körülbelül 3-90% hatóanyagot, körülbelül 1-99,9%, előnyösebben
körülbelül 1-99%, legelőnyösebben körülbelül 5-95% szilárd vagy
folyékony adjuvánst, körülbelül 0-25%, előnyösen 0,1-25%,
legelőnyösebben 0,1-20% felületaktív anyagot tartalmaz.
A találmány egyik előnyös kiviteli módjában a rovarellenes készítmény általában 0,1-99%, előnyösen 0,1-95%, az új gének közül legalább egyet rekombináns formában tartalmazó rekombináns
-36mikroorganizmust vagy más hatóanyagokkal alkotott kombinációját ,
1-99,9% szilárd vagy folyékony adjuvánst és 0-25%, előnyösen 0,120% felületaktív anyagot tartalmaz.
Mivel a kereskedelmi termékek előnyösen koncentrátumokként kerülnek kiszerelésre, a végső felhasználó normális esetben egy lényegesen alacsonyabb koncentrációjú hígított készítményt fog alkalmazni. A rovarellenes készítmény további alkotóelemeket, úgymint stabilizálókat, habzásgátlókat, viszkozitásszabályozükat, kötőanyagokat, ragasztóanyagokat valamint műtrágyákat vagy más hatóanyagokat tartalmazhat a speciális hatás elérése érdekében.
A hibrid toxint expresszáló gén mikroorganizmus gazdába juttatásána számos módja alkalmazható olyan körülmények mellett, melyek lehetővé teszik a gén stabil fennmaradását és expresszióját. Például olyan expressziós kazetták szerkeszthetők, melyek a számunkra érdekes DNS-szerkezeteket a DNS-szerkezet transzkripciós és működőképesen és tartalmaz egy, a gazdaszervezetben lévő homológ DNS-szekvenciát, mely segítségével és/vagy tartalmaz a gazdában funkcionális replikációs rendszert, mely segítségével integrálható vagy stabilan fenntartható.
A transzkripciós és regulációs szignálok közé tartozik, de nem korlátozó jelleggel a promoter, transzkripciós iniciációs starthely, operonok, aktivátorok, fokozok, más szabályozó elemek, riboszómakötő helyek, egy iniciációs kodon, terminációs szignálok és hasonlóak. Lásd például 5,039,523 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást, 4,853,331 számú amerikai egyesült expressziójához szükséges regulációs szekvenciákkal tartalmazza, s zekvenciával integrálódhat, transzlációs összekapcsolva
-37 ·« · · * · « · · · · államokbeli szabadalmi leírást, EP 0480762 A2 sz. európai közrebocsátási iratot; Sambrook et al., fentebb; Molekuláris klónozás, Laboratóriumi Kézikönyv (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Maniatis et al . (szerk.) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980); és a bennük felsorolt referenciák.
Az ábra rövid ismertetése:
l.ábra: A monoklonális antitestek kötődésének western folt analízise a gabona gyökérféreg bélboholy határmembrán vezikulumaihoz akrilamid gél elektroforézis után. A vizsgálatban a 3B1, 2B5, 17F6 és 10B6 sejtvonalak antitestjeit alkalmaztuk. MW = molekulatömeg standardok.
A következő példák bemutatásként szolgálnak, és nem jelentik az itt leírt találmány korlátozását.
1.Példa: Monoklonális antitest létrehozása
1.1. Immunizálás:
Az antigén megfelelő mennyiségeit (a gabona gyökérféreg (BBMV-k) körülbelül 50 mikrogrammj át) egy nem olaj alapú adjuvánsban emulgeáltuk, és 10 Balb/c egérből álló csoport immunizálására alkalmaztuk. Az egereken kéthetes intervallumokban emlékeztető immunizálást hajtottunk végre. A harmadik emlékeztető injekció után hét nappal szérummintát vettünk az egerektől, és enzimmel kapcsolt immunadszorbens vizsgálattal (ELISA) meghatároztuk a relatív szérum-antitest titereket. A legmagasabb titereket mutató négy egérnek egy utolsó alacsony dózisú emlékeztető injekciót adtunk (hozávetőleg a rendszeres immunizálás alatt alkalmazott adag egytizedét) háromnap múlva, és lépdonorként használjuk fel őket a következőkben leírt fúzionálásnál.
r · ···· ·
-38« · ν · ···· · · · • · · *
1.2. Fuzionálás:
Négy, l:5000-nél nagyobb specifikus antitest-titerű egeret választottunk ki a két fuzionáláshoz. A lépeket sterilen kimetszettük, mechanikusan disszociáltuk, és a limfocitákat a következők szerint izoláltuk. A vörösvérsejteket 0,017 M TRIZMA bázisban, pH 7,2-n (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) 0,155 M ammónium-klorid oldattal történő inkubálással lizáltuk. A sejteket kétszer mostuk foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS), és a limfocitákat tovább tisztítottuk sűrűséggradiens centrifugálással a következők szerint. A sejteket óvatosan 1,065 gravitációjú Ficoll oldatra (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) rétegeztük (Van Mourik et al., Meth. in Enzymology, 121:174-182 (1986), 450x g-vel 20 percig centrifugáljuk. A pelletet, mely az 1,065-nél nagyobb sűrűségű sejteket tartalmazta, és limfocitákban nagyon feldúsult, mielóma sejtekkel fuzionáltuk.
A polietilénglikol közvetített fuzionálást izolált limfocitákat és Balb/c eredetű, HGPRT-re (hipoxantin guanin foszforibozil transzferáz) hiányos SP2/0 plazmacitóma sejtvonal alkalmazásával hajtottuk végre. A limfocitákat a mielóma sejtekkel 4:1 arányban összekevertük. A sejtelegyet alaposan felkevertük, centrifugáltuk és a fuzionálást a következők szerint hajtottuk végre (Oi et al., Selected Methods in Cellular Immunology, szerk: Michell, Β. B. és Shiigi, S.M. (Freeman, San Francisco) 351-371 (1980), Fazekas et al., J. Immunoi. Meth., 35:1-21 (1980)). A sejtpelletet óvatosan 1 ml 50%-os polietilénglikolba (PEG) szuszpendáltuk folyamatos keverés mellett egy egyperces időtartam alatt. A PEG koncentrációt fokozatosan csökkentettük a sejteket szérummentes RPMI tápközeggel (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) • ·
-39tápközeget a növekvő hígítva. A fúzió után a fúzionált sejteket 80 x g-vel 5 perc alatt kicsaptuk, újra szuszpendáltuk, és 96 lukas lemezre vittük 10s10- összes sejt per üreg sűrűségben. Lép táplálósejteket adtunk hozzá, melyeket a nem immun szplenociták 20pg/ml mitomicin C-vel történő kezelésével állítottunk elő, hogy a fúzionált setek számára biztosítsuk a kiegészítő növekedési faktorokat. Az ezt követő néhány napra a hibridomákat 17,6pg/ml aminopterint tartalmazó HAT (Hipoxantin Aminopterin Timidin) használva szelektáltuk. Inverz mikroszkóp alatt kolóniákat 3-4 nappal a fuzionálás után már láttuk. Azonban a makroszkopikus kolóniák a fúziót követő 10-14 napig nem voltak láthatóak. Ebben az állapotban specifikus antitest kiválasztásra megvizsgáltuk minden üreg felülúszóját.
1.3. Szkrinelés:
A HAT szelekciót túlélő életképes hibridoma kolóniák kimutatása után a felülúszókat enzimmel kapcsolt immunadszorbens esszét (ELISA) alkalmazva vizsgáltuk (Engvall, Meth. Enzymology, 70:419 (1980), Engvall et al., Immunochemistry, 8:871 (1971)).
Igen röviden, a hibridoma felülúszókat 96 üreges mikrotitráló lemezek üregeiben inkubáltuk, melyek hozzávetőleg 500ng antigénnel voltak fedve sejtenként. A megfelelő mosási lépések után, amelyet a hivatkozott Engvall et.al. cikkben leírtak szerint hajtottunk végre, a kötött antitesteket egy második, torma peroxidázzal (HRP) konjugált kecske anti-egér antitesttel azonosítottuk. További mosási lépések után az enzimaktivitást minden üregben kromogén szubsztráttal mértük. A 492 nm-nél (OD 492) kapott abszorbanciát egy automata ELISA-leolvasóval mértük, hogy azonosítsuk a pozitív kolóniákat. A gabona gyökérféreg BBMV-khez erősen kötődő
-40hibridómavonalakat tovább szkríneltük további ELISA szűrésekkel, hogy megsemmisítsük azokat a kolóniákat, melyek vagy emlős vagy növényi proteinekhez kötődnek. Pontosabban ELISA-kat hajtunk végre nyúl bélboholyhatároló membránokat és kukorica levél és gyökér mikroszómális membránkészítményeket alkalmazva. Szintén elvégeztünk egy ELISA szűrést, hogy azonosítsuk az európai gabonaféreg BBMV-kkel keresztreaktív vonalakat.
Azokat a kolóniákat, melyek olyan antitesteket szekretáltak, melyek kötik a gabona gyökérféreg BBMV antigént, és nem kötik az emlős és növényi proteineket a következőkben leírt módon klónoztuk.
1.4. Klónozás:
Ebben a szakaszban azokat a hibridómákat, melyek az antigénre nyilvánvalóan specifikus antitesteket szekretáltak, felszaporítottuk és klónoztuk 96 üreges lemezeken 0,5, 1 és 5 sejt/üreg célkoncentrációnál. A növekedési faktorokat (Sugasawara et al. , J. immunoi. Meth., 79:276-275 (1985)) biztosítottuk, hogy elősegítsük a korlátozott sűrűségű hibridómasejtek növekedését. 23 hét elteltével, mikor a kiónok elég nagyok voltak, ismét azonosítottuk őket ELISA-kat alkalmazva a Szkrínelés-nél leírtak szerint. A jellegzetes kiónokat antitesttermelés céljából felszaporítottuk.
1.5. Aszcítesz termelés:
A megfelelő monoklonális antitestek nagy méretekben történő előállítását hajtottuk végre a hibridómák aszcítesz tumorokként történő növesztésével prisztánnal injektált Balb/c egerekben (Brodeur et al . , J. Immunoi. Meth., 71:265-272 (1984)). Az aszciteszfolyadékot összegyűjtöttük, és az antitesteket a • · ·
-41dializált aszciteszből Protein A kromatográfiával részlegesen tisztítottuk. A kapott antitestkészítményeket alikvot részekre osztottuk és lefagyasztottuk.
A találmányban hasznosítható monoklonális antitesteket termelő sejtvonalakat az 1. Táblázatban mutatjuk be. A
hibridómasej teket , melyek ATCC számát az 1 . táblázatb
feltüntettük, az American Type Culture Collection -nál, 123
Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 USA, 1994. április 19-
letétbe helyeztük • 1. Táblázat
CRW BBMV monoklonális vonalak
Sejt- ECB Kereszt- Western Izotípus ATCC
vonal reakció folt szám
1A4 igen 2 CRW sáv IgM-k
IA11 nem 2 CRW sáv IgM-k
1F51 igen 2 CRW sáv IgM-k
2B5 igen 2 CRW sáv IgM-k HB11619
3B1 igen 1 CRW sáv IgGI-k HB11617
7G6 nem >5 sáv IgM-k
10A1 nem nincs jel IgM-k
10B6 nem >5 C sáv IgG3-k HB11618
10F9 nem >5 B sáv IgM-k
12G4 nem nem mértük IgM-k
14G1 nem >5 sáv IgG2B-K
I • · · · · • ·
17F6 nem >5 A sáv IgGl-K HB11620
17H6 nem >5 A sáv IgG2A-K
18A7 nem >5 B sáv IgGl-K
16E4 igen >5 sáv IgM
2. példa: Bélboholy határoló membrán vezikulumok (BBMV) izolálása
2.1. Gabona gyökérféreg BBMV izolálása:
Wolfersberger et al. eljárása alapján (Comp. Biochem. Phisyol. 86A:301-308 (1987), melyet English és Readdy módosított (Insect Biochem. 19:145-152 (1989)) vezikulumokat preparáltunk. A harmadik lárvaállapotú gabona gyökérféreg lárvák beleit jéghideg 50ml szacharóz, 2mM Tris-Cl (pH 7,4), 0,lmM fenil-metil-szulfonilfluorid tartalmú oldatban egy Potter-Elvenhem homogenizátort alkalmazva homogenizáltuk. lOmM kalcium-kloridot adtunk hozzá, és a homogenátumot jégen 15 percen át kevertük. A homogenátumot 4300xg-vel 10 percig 4°C-on centrifugáltuk, és a pelletet 0,32M szacharózban reszuszpendáltuk. A szuszpenziót egy 27-es méretű tűn keresztül passzáltuk és -70°C-on tároltuk.
2.2. Európai gabonaféreg BBMV izolálása:
Ötödik lárvaállapotban lévő európai gabonaféreg (ECB) beleit kimetsszük, és hosszirányban felvágtuk, hogy eltávolítsuk a béltartalmat és a peritrofikus membránt. Az ECB BBMV-k izolálását a fentebb leírt módon hajtottuk végre.
2.3. Növényi mikroszómák izolálása:
Búza növények (72 órán át 28°C-on sötétben növesztett) levelét és gyökerét egy mozsárba tettük és szétmorzsoltuk azonos • · · · • · • ·
-43térfogatú 0,3M nátrium-foszfátot, pH 7,4, 5mM DTT-t, és 1%(vegyes) PWP-t tartalmazó oldattal. Az elegyet négy réteg tüllön átszűrtük, melyet 15 perces 10 OOOx g-n történő centrifugálás követett. A felülúszót 10 lllx g-nél 60 percig centrifugáltuk, és a pelletet O,1M kálium-foszfátban, pH 7,4-n reszuszpendáltuk.
2.4. Emlős bél BBMV izolálása:
Emlős bélboholy határmembránokat preparáltunk nyúl nyombélbél nyálkahártyájából és strómából (Kessler et al . BBA 506:136-154 (1978)) a rovarbélből származó bélboholy határmembrán izolálásához hasonló eljárást alkalmazva. A friss nyúl nyomból és a gyomor alsó részét bélelő nyálkahártyát mostuk, és a nyálkáhártyaréteget elkülünítettük az alatta elhelyezkedő strómától. Az anyagot 10szeres térfogatú jéghideg 50mM szacharózt, 0,lmM PMFS-t, 2mM TrisHCl-t tartalmazó oldatba (pH 7,4) szuszpendáltuk, és 15 lökettel jégen homogenizáltuk. A homogenátumot 4300x g-vel 10 percig 4°C-on centrifugáltuk. A pelletet 0,32M szacharózban reszuszpendáltuk, és -70°C-on lefagyasztottuk.
3.példa: A CRW BBMV monoklonális vonalak jellemzése:
Azokat a monoklonális vonalakat, melyek az ELISA alapján erősen kötődnek a CRW BBMV-khez, tovább szkríneltük, hogy kiválogassuk azokat a kiónokat, melyek nem mutattak keresztreaktivitást sem a kukorica sem az emlős mikroszómákkal.
További ELISA-kat hajtottunk végre gabona levél és gyökér mikroszómákat és nyúl bélmembrán vezikulumokat alkalmazva. Ezzel egyidőben minden vonalat az európai gabona BBMV proteinekre is szkríneltük. A megvizsgált hetvennyolc vonal közül tizenegy, gabona gyökérféregre specifikus vonalat izoláltunk. Továbbá a • · · · · • · · I I f ···« • · · i ·
-44tizenegy CRW BBMV-specifikus vonal mellett négy olyan vonalat is izoláltunk, mely keresztreaktivitást mutatott az ECB BBMV-vel. A monoklonális vonalakat képviselő tizenöt vonal IgGl-t IgG2a-t, IgG2b-t, IgG3-t és IgM-t szekretált. A monoklonális antitesteket western folt analízisét elvégeztük, hogy igazoljuk a CRW specifitást és a keresztreaktivitás hiányát a nyúl vagy gabona mikroszómákkal. Szintén jellemeztük az antitestek specifikus kötődését a különböző CRW BBMV proteinekhez, ezt az ábrán mutatjuk be
Öt különböző kötési mintázatot találtunk; két mintázat egy vagy két proteinhez, a másik három 7-15 protenhez történő kötődést mutatott. A kötési mintázat alapján a 7-15 proteint kötő csoportot további A, B, C alosztályokba soroltuk.
3.1. A monoklonális vonalak western analízise:
A bélboholy határmembrán vezikulumokat a fentebb leírt módon akrilamid SDS protein géleken CA). A proteineket , Western Blotting,
112:195 (1981), és hagytuk, hogy a hibridóma vonalak felülúszóihoz kötődjenek. Az antitestek kötődését a rögzített proteinekhez standard módszerekkel láthatóvá tettük (lásd például Antitestek: Laboratóriumi Kézikönyv (Antibodies:A Laboratory Manual, E. Harlow és D. Lane, Cold Spring Harbor, 1988, és az itt található referenciák).
preparáltuk, és 8-16%-os elektroforetizáltűk (Novex, San Diego, nitrocellulózra vittük át (Burnette, W.N
4. példa: CRW kötő antitestdomének klónozása:
Különböző módszerek ismertek a gabona gyökérféregre specifikus gének kinyerésére. Az egyik módszer szerint az antitest gének random könyvtárát fágba klónozzuk, és a könyvtárat a gabona • ·
-45gvökérféreg bél (CRW) proteinek kötési képességére szkríneljük. Egy másik megközelítés szerint olyan antitesteket állítunk elő, melyek a CRW bélproteinekhez kötődnek, és az ilyen vonalakból klónozzuk az antiteslgéneket. Ebben a példában a második módszert alkalmaztuk. Az antitestgének a hibridóma sejtekből a konstans régiókon belüli konzervatív DNS-szekvenciákhoz illeszkedő primereket és a variábilis régiók leolvasási területeit alkalmazva klónozhatok, és a klónozáshoz polimeráz láncreakcióval(PCR) amplifikálhatók. Lásd általában Mullis et al . Meth. Enzymol., 155:335-350 (1937); Erlich (szerk.) PCR Technology, Stockton Press (New York 1989). Kábát et al. által rendelkezésre bocsátott egér nehéz- és könnyűlánc szekvenciák adatbázisát (US Dept Health and Humán Services, US Government Printing Offices (1937))sikeresen alkalmazzák mindkét izotípus specifikus és degenerált primereinek előállítására antitestgének klónozása céljából (Jones, S. T. and Bending, M., 1991, Bio/technology 9:88-89) .
Továbbá bőséges ismeretesek az antitestek olyan kisebb fragmensei (Fab) előállításának technikái, melyek az eredeti antitest kötési tulajdonságaival rendelkeznek. A teljes antitestek nagy molekulák (150kDa), de a sokkal kisebb Fab és Fv antigénkötő fragmensekről (12kDa-50kDa) is kimutatták, hogy megőrzik a teljes kötési affinitást. Egyszálú Fv-fragmenseket (scFv), melyekben a Vh és VI domének egy hidrofil és flexibilis peptiddel vannak összekapcsolva, sikeresen alkalmaztak arra, hogy az enzimek és toxinok a specifikus sejteket megcélozzék (Bírd (1988) Science 423:423-426 és Huston (1988) PNAS 8 5:5879-5883) . Antigén kötésére alkalmaztak egyszálú Vh doméneket (Dabs) és egyszálú, komplementer meghatározó régiókat is, melyek olyan kicsik mint 20 • ·
-46aminosav (aa), és legkisebb felismerési egységeknek (mru )nevezik őket (Ward (1989) Natúré 341:544-546 és Taub (1989) J. Bioi. Chem
264:259-265 és Williams (1989) PNAS 86:5537-5541). Tehát ez lehetőseget nyújt egy CRW specifikus kötődőmén nagyon kis méretűvé történő csökkentésére.
4.1. Antitest gének klónozása PCR-rel:
Polimeráz láncreakció eljárást és specifikus oligonukleotid primereket alkalmaztunk, hogy klónozzuk az immunglobulin géneket vagy az immunglobulingénekből származó régiókat. A fentebb leírt Kábát adatbázisból olyan PCR primereket választunk, melyek az IgMnek és a három IgG izotípusoknak mind a könnyű, mind a nehézláncára specifikusak. Az érett variábilis régió NH terminálisát kódoló régióhoz való primereket terveztünk az első leolvasási régió iniciálására, és néhány degenerálást hajtottunk végre, hogy univerzális primerek-et lehessen alkalmazni. A variábilis régiók specifikus PCR amplifikációjára alkalmazott 3'primereket mind a könnyű mind a nehéz láncok első konstans doménjének (CH1) konzervatív szekvenciáiból választottuk ki. Egy eltérő 3' prímért alkalmaztunk az IgGl (3B0 és 17F6), IgG3 (10B6) és IgM (2B5) immunglobulin izotípusokhoz. Az IgG2A és IgG2B izotípusokhoz az IgG-hez használt primerrel azonos prímért alkalmaztunk. Az antitest variábilis régióit olyan könnyű(pCIB4612) és nehézlánc (pCIB4611) expressziós plazmidba klónoztuk, mely endoplazmatikus retikulum szignálpeptidet és az IgGl könnyű illetve nehéz láncainak konstans régióit kódoló szakaszokat tartalmazott.
Az egér immunglobulin könnyű- és nehézláncok variábilis régióinak PCR klónozásához alkalmazott primerek szerkezetét a 2.
I
-47Táblázat mutatja. Alternatív lehetőségként olyan pnmerszekvenciák is alkalmazhatóak, melyek a megjelent irodalmi helyeken hozzáférhetőek (Coloma et al. Bio/Techniques 11:152-156, 1991;
Jones et al. Bio/Technology 9:88-89, 1991). Az oligonukleotidokat
Applved Biosystem DNS 380B szintetizálóbán (Applied Biosystems, Foster City, CA) állítottuk elő, standard körülményeket alkalmazva, melyeket alább ismertetünk. A PCR primerek restrikciós helyeket is tartalmaztak, és az amplifikáció és hasítás után egy növényi expressziós vektorba klónoztuk a CaMV promoter szabályozása alá. Olyan restrikciós helyeket választottunk, melyekről tudtuk, hogy a szekvenált antitestgénekben nem fordulnak elő .
2. Táblázat
Antitest gének amplifikálására alkalmazott PCR primerek
3B1, 2B5,. 10B6, 14G1 és 17F6 könnyűlánc variábilis régiók a pCIB4614, pCIB4616, pCIB4625, pCIB4636 és pCIB4617 plazmidokban:
NC92: 5' Primer 5'-GTC TCG AGG AYA TYS WGM TSA CCC ART CT-3' (A szekvencia azonosítószáma:37.)
NC130: 3' Primer 5'-GCA GAT CTA GTT GGT GCA GCA TCA GCC CG-3' (A szekvencia azonosítószáma:38.)
3B1 és 17F6 nehézlánc variábilis régió a pCIB4613 és pCIB4609 plazmidban:
NC91: 5' Primer 5'-GTC TCG AGC AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG-3' (A szekvencia azonosítószáma:39.)
NC114:3'Primer 5'-GCA GAT CTA GAT CCA GGG GCC AGT GGA TA-3' (A szekvencia azonosítószáma:40.)
2B5 nehézlánc variábilis régió a pCIB4615 plazmidban:
-48NC91: 5' Primer 5'-GTC TCG AGC AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG-3' (A szekvencia azonosítószáma:39.)
NC111: 3' Primer 5'-GCA GAT CTG CAG GAG ACG AGG GGG AAG ACA TT-3' (A szekvencia azonosítószárna:41.)
10B6 nehézlánc variábilis régió a pCIB4637-ban:
DB91: 5' Primer 5'-ACG TCT CGA GGA RGT GAA GCT KRW KGA RWC TG-3'
NC117:3'Primer 5'-GCA GAT CTG CAG CCA GGG ACC AAG GGA TA-3' (A szekvencia azonosítószáma:42.)
14G1 nehézlánc variábilis régió a pCIB4635-ben:
DB91: 5' Primer 5'-ACG TCT CGA GGA RGT GAA GCT KRW KGA RWC TG-3' (A szekvencia azonosítószáma:48.)
DB114: 3' Primer 5'-CAA TTC GCA TAT GAG ATC CAG GGG CCA GTG GAT A0 I
-J (A szekvencia azonosítószáma:49.)
Y= C vagy T; S = C vagy G; W= A vagy T; M= C vagy A; R= A vagy G
A hibridóma vonalakból izolált poly-A+ RNS-t használtunk az első cDNS vonal létrehozására az ezt követő PCR reakciókban történő alkalmazáshoz. ICC hibridómasejtből poly-A+ RNS-t extraháltunk a guanidinium-tiocianát lízisen és az oligo(dT) cellulóz tisztításon alapuló eljárást alkalmazva Fást Track mRNS Isolaton Kittel (Invitrogen Corp., San Diego, Ca). Hozzávetőleg a 10” sejtből izolált RNS egytizedét (vagy kb. 500ng-t) alkalmaztuk az első cDNS lánc előállítására. Az RNS-t 42°C-on 30 percig inkubáltuk, majd 5 percre 95°C-ra hevítettük dezoxinukleotidok (0,2 mM minden dNTP-ből) keverékével, 5pg random pd (N6) hexamerrel (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Prscataway,
NJ.), mint primerrel, 50 egység Moloney rágcsáló leukémia vírus • · · · ·
-49reverz transzkriptázzal (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) és lx PCR pufferral ΙΟΟμΙ reakciótérfogatban. Az egyszálú cDNS reakcióelegyet fenol-kloroformmal kivontuk és ke résztülcetrifugáitűk egy méretkizárásos spin oszlopon (Chroma Spin 30, Clontech Laboratories, Inc., Paolo Alto, CA), hogy eltávolítsuk a random hexamereket. Ezt követően egytized (vagy
10μ1) egyláncú cDNS reakcióelegyet adtunk 50μ1, immunglobulin specifikus primereket tartalmazó PCR reakcióelegyhez a PerkrnElmer Cetus Amplification Kit útmutatásait követve. Az elegyet Perkin-Elmer Cetus Thermal Cycler-t alkalmazva 20 cikluson át amplifikáltűk. A PCR-hez alkalmazott hőmérsékletek és időtartamok a következők voltak: denaturálás 94°C-on 1 percig; hőkezelés 52°Con 1 perc 30 másodpercig; kiterjesztés 72°C-on 1 percig. A PCR termékeket 6%-os akrilamidgéleken (Novex, Encinatis, CA) elektroforetizáltuk, és a DNS-t a gélszeletekből tisztítottuk. A géldarabokat 200μ1 TE-ben összezúztuk, és Ultrafree-MC Millipore oszlopokon (Millipore, Bedford, MA) keresztül centrifugálva tisztítottuk. Az eluátumot 50pg/ml proteináz K-val kezeltük 37°Con 30 percen át, fenol-kloroform-izoamillal (50:48:2) extraháltuk, melyet egy további kloroformos extrakció és etanolos kicsapás követett. A DNS-t 40μ1 TE-ben reszuszpendáltuk, és megfelelő restrikciós enzimmel hasítottuk. Az antitest variábilis régiók PCR termékeit Xhol-gyel és BglII-vel hasítottuk, és 6%-os akrilamid gélen újratisztítottuk a fentebb leírt módon. Végül az Xhol/Bgill fragmenseket vagy a könnyű (pCIB4612) vagy a nehéz antitestlánc (pCIB4611) expressziós vektorba ligáltuk, melyeket Xhol-gyel és BglII-vel hasítottunk. A pCIB4612 expressziós vektor CaMV 35S promotert és terminátor szekvenciát tartalmaz egy 19 aminosavból
-50álló szignálpeptidszekvenciával és a könnyűlánc CH1 konstans régiójával együtt. A teljes könnyűlánc kifejezése céljából a variábilis könnyűlánc régiókat a XhoI/BglII helyre klónoztuk.
Az összes antitestgént a fenti eljárás szerint klónoztuk a
10B6 nehézlánc és a 14G1 nehéz- és könnyűláncok kivételével. Ezeket az antitestgéneket is PCR-termékékből klónoztuk, de 6%-os akrilamid TBE géleken történő elektroforézissel különítettük el, és a fragmenseiet kivágtuk a gélből, és 0,7 M LiCl és 2mM EDTA elegyébe oldottuk. A fragmenseket precipitáltuk, és 10mM Tris és 2mM EDTA-ba, pH 7,5-n reszuszpendáltuk. Az izolált PCR termékeket közvetlenül egy pUC-ból származó klónozó vektorba, a pT&Blue T-be (Novagen, Inc.)ligái tűk. Mivel a Taq DNS-polimeráz a ceakciótermékeken hagy egy túllógó egyszálú 3'A-nukleotidőt (Clark, Nucl. Acids Rés. 16:9677 (1988)), ezek a termékek közvetlenül klónozhatok egy illeszkedő, túllógó egyszálú Tnukleotidokat tartalmazó vektorba (Marchuk et al. Nucl. Acids Rés.
19:1154 (1990)).
A pCIB4612 vektort egy egér kappa lánc (Schuze-Gahmen et al.,
1988, J. Bioi. Chem. 2 63:1710-17106; Kábát et al. , US Dept Health and Humán Services, US Government Printing Offices (1987)) 155 bázispár hosszú Dde I/StyI könnyúlánc konstans régiójának négyféle ligálásával a pCIB4610 egy 71 bp Xhol/Dde I fragmenshez, égy 101 bp hosszú Sty I/BglII fragmenshez, és egy 3,8kb hosszú Xhol/Bgl II vek.torf ragmenshez . A KE 109A28 és KE110A28 oligonukleotidokat hibridizáltuk, hogy a StyI és BamHI ragadós végekkel rendelkező 101 bp-os fragmenst létrehozzuk.
KE109A28: 5'-CAA GGA CGA GTA TGA ACG ACA TAA CAG CTA TAC
CTG TGA GGC CAC TCA CAA GAC ATC AAC TTC ACC CAT TGT CAA • *
-51GAG CTT CAA CAG GAA TGA GTG TTA GG-3' (a szekvencia azonosítószáma: 19.)
KE110A28: 5'-GAT CCC TAA CAC TCA TTC CTG TTG AAG CTC TTG
ACA ATG GGT GAA GTT GAT GTC TTG TGA GTG GCC TCA CAG GTA
TAG CTG TTA TGT CGT TCA TAC TCG TC-3' (a szekvencia azonosítószáma: 20.)
A KE111A28 és KE112A28 oligonukleotidokat hibridizáltűk, hogy Xho I és Dde I ragadós végekkel rendelkező 71 bp-os fragmenst állítsuk elő.
KE111A28: 5'-TCG AGG GTA CCG AGC TCT AGA TCT GTA TCC ATC .
TTC CCA CCA TCC AGT GAG CAG TTA ACA TCT GGA GGT GCC-3' (a szekvencia azonosítószáma: 21.)
KE112A28: 5'-TGA GGC ACC TCC AGA TGT TAA CTG CTC ACT GGA
TGG TGC GAA GAT GGA AGA TCT AGA GCT CGG TAC CC-3' (a szekvencia azonosítószáma: 22.)
A pCIB4611 expressziós vektor a CH1-CH3 nehézlánc konstans régiókat tartalmazza, és hasonlóképpen a variábilis nehézlánc régiókat a teljes hosszúságú nehézlánc kifejezéséhez a Xho I/BglII helyre lehet klónozni. A pCIB4611 vektort úgy állítottuk elő, hogy egy egér IgGl gamma lánc NcoI/BstXI 902 bp hosszúságú nehézlánc konstans régióját (Honjo et al. 1979, Natúré 277:627-633; US Dept
Health and Humán Services, US Government Prínting Offices (1987)) a két 40 bp-os hibridizált oligonukleotid fragmenssel ligáltuk, és a kapott 982 bpáos fragmenst a BglII-vel és Xhol-gyel hasított pCIB4610-be ligáltuk. Az egyik 40 bp-os fragmenst a KE106A28 és a KE107A28 oligonukleotidok hibridizálásával kaptuk, és Xhol/Ncol ragadós végei vannak, a másik 40 bp-os fragmenst a KE108A28 ás ·· · · ·
-52ΚΕ105Α28 hibridizálásával kaptuk, és ennek BstXI/BamHI ragadós végei vannak.
KE106A28: 5'-TCG AGG GTA CCG AGC TCT AGA TCT GCT GCC CAA
ACT AAC TC-3' (23. azonosítószámú szekvencia)
KE107A28: 5'-CAT GGA GTT AGT TTG GGC AGC AGA TCT AGA GCT
CGG TAC CC-3' (24. azonosítószámú szekvencia)
KE108A28: 5'-CTG GTA AAG GCG GCC GCA TCG ATT AAG TCG ACC
CGC GGG-3' (25. azonosítószámú szekvencia)
KE105A28: 5'-GAT CCC CGC GGG TCG ACT TAA TCG ATG CGG CCG
CCT TTA CCA GGA GA-3' (26. azonosítószámú szekvencia)
A pCIB4610 vektor egy 19 aminosavból álló egér endoplazmatikus retikulum szignálpeptid szekvenciát tartalmaz a CaMV 35S promoter és a CaMV 35S terminátor szekvenciák között. A pCIB4610 vektort a BamHI-vel és HptI-vel hasított pCIB4600 és egy 83 bp hosszú PCR-rel előállított és BamHI-vel és Hpal-vel hasított fragmens ligálásával állítottuk elő. A PCR-rel előállított fragmenst templátként a pCIB4600-t alkalmazva és a KE102A28 és KE101A28 PCR-primereket felhasználva hoztuk létre. A pCIB4610 a pCIB4600-tól csak a CaMV 35S promotert követő nem transzlálódó vezárrégióban különbözik. A pCIB4610 egy AACA ATG (27. azonosítószámú szekvencia) növényi konszenzus transzlációs iniciációs szekvenciát tartalmaz, ahol az ATG a transzláció startpontja, és a pCIB4600 pedig egy TCCG ATG (28. azonosítószámú szekvencia) szekvenciát tartalmaz.
KE102A28: 5'-CGA AGT TAA CAG ATC TAG AGC TCG G-3' (29.
azonosítószámú szekvencia)
KE101A28: 5’-CGG GAT CCA ACA ATG GGA TGG AGC TGG ATC TT-3' (
30. azonosítószámú szekvencia) ··: ι • « ·
-53A pCIB4600 vektort BamHI-vel és Sacl-gyel hasított pCTB710
CaMV 35S expressziós vektor származékának (Rothstein, et al.
(1987) Gene 53:153-161) és egy endoplazmatikus retikulum szignálpeptidet kódolo 86 bp-os BamHI - SacI fragmens (Rabat et al. , US Dept Health and Humán Services, US Government Printing Offices (1987) ) ligálásával . állítottuk elő. A 86 bp-os fragmens szekvenciája a következő :
5'-GAT CCA ACA ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG T
CA GTT GTT ACC CTA CCT CGA CCT AGA AAG AGA AGG AGG ACA
GTG GAG CTG CAG GTG TCC ATT GCC TAC TCG AGG GTA CCG AGC
TCC TCG ACG TCC ACA GGT AAC GGA TGA GCT CCG ATG GC-3' (31. azonosítószámú szekvencia) öt CRW monoklonális vonalból expressziós vektorba klónozott variábilis könnyű és nehézlánc régiók a következő szerkezeteket hozták létre:
pCIB4613: 3B1 nehézlánc variábilis régió
PCIB4614: 3B1 könnyűlánc variábilis régió
pCIB4615: 2B5 nehézlánc variábilis régió (NRRL B-21216)
pCIB4616: 2B5 könnyűlánc variábilis régió (NRRL B-21217)
pCIB4609: 17F6 nehézlánc variábilis régió (NRRL B-21215)
pCIB4617: 17F6 könnyűlánc variábilis régió (NRRL B-21218)
pCIB4637: 10B6 nehézlánc variábilis régió (NRRL B-21279)
pCIB4625: 10B6 könnyűlánc variábilis régió (NRRL B-21219)
pCIB4635: 14G1 nehézlánc variábilis régió (NRRL B-21277)
pCIB4636: 14G1 könnyűlánc variábilis régió (NRRL B-21278)
pCIB4631: 3B1 könnyű- és nehézlánc variábilis régió (NRRL
B-21220)
-54··· ·
Azokat a fentebb felsorolt expressziós vektorokat, melyek megnevezése után a deponálás száma áll, 1994 mércius 7-en helyeztük letétbe az Agricultural Research Service-nél, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Régiónál Research Center, 1815 North University Rtreet, Peoria, Illinois 61604, USA, a pCIB4637, pCIB4635 és pCIB4636 kivételével, melyeket 1994. június 3-án helyeztünk letétbe.
A 3. Táblázat a variábilis régiókra vonatkozó szekvenciák azonosító számait tartalmazzák. A pCIB4613, pCIB4617, pCIB464625, pCIB4637, pCIB4635 és pCIB4636 esetében a szekvenciák a teljes variábilis régiót képviselik a variábilis régió első leolvasási régiójának első kodonjától kezdődően a negyedik leolvasási régió utolsó kodonjával bezárólag. A pCIB4609-ben a variábilis régió nem teljes, a kódoló szekvencia 5' vége csonkolt, és a szekvencia a variábilis régió második CDR-régiójában kezdődik.
3. Táblázat
Az antitestlánc DNS-szekvenciák listája
1 . azonosítósz. szekv. 3B1 nehézlánc variábilis régió DNS
2 . azonosítósz. szekv. 3B1 nehézlánc variábilis régió protein
3 . azonosítósz. szekv. 3B1 könnyűlánc variábilis régió DNS
4 . azonosítósz. szekv. 3B1 könnyűlánc variábilis régió protein
5 . azonosí tós z . szekv. 2B5 nehé zlánc variábilis régió DNS
6 . azonosítósz . szekv. 2B5 nehézlánc variábilis régió protein
7 . azonosítósz . szekv. 2B5 könnyűlánc variábilis régió DNS
8 . azonosítósz . szekv. 2B5 könnyűlánc variábilis régió protein
9 . azonosítósz. szekv. 17F6 nehézlánc variábilis régió DNS
10 . azonosítósz . sze kv. 17F6 nehézlánc variábilis régió protein
• ·· ···· ·
-5511. azonosítósz. szekv. 17F6 könnyűlánc variábilis régió DNS
12. azonosítósz. szék. 17F6 könnyűlánc variábilis régió protein
13 . azonosítósz . szekv. 10B6 nehézlánc variábilis régió DNS
14 . azonosítósz. szekv. 10B6 nehézlánc variábilis régió protein
15 . azonosítósz. szekv. 10B6 könnyűlánc variábilis régi ó DNS
16 . azonosítósz . szék. 10B6 könnyűlánc variábilis régió protein
17 . azonosítósz . szekv. 3B1 egyláncú antitest DNS
18 . azonosítósz . szekv. 3B1 egyláncú antitest protein
44 . azonosítósz. szekv. 14G1 nehézlánc variábilis régió DNS
45 . azonosítósz. szekv. 14G1 nehézlánc variábilis régió protein
46 . azonosítósz . szekv. 14G1 könnyűlánc variábilis régió DNS
47 . azonosítósz . szék. 14G1 könnyűlánc variábilis régió protein
4.2. DNS oligomerek szintézise:
DNS oligomereket szintetizáltunk egy Applied Biosystems 380B modell DNS szintetizálót és standard eljárásokat alkalmazva. Az oligomereket javított SSCAF3 ciklust alkalmazva egy 0,2pmol, szélespórusú, kisléptékű ABI oszlopon állítottuk elő. A záró eljárás a tritiles futtatás volt, és az oligomereket az oszlopról a 380B automata hasító ciklusát alkalmazva hasítottuk le. Az oligomereket feleslegben lévő ammónium-hidroxidban (NH.OH) 55°C-on
8-12 óra alatt blokkoltuk. AZ oligomereket ezután nitrogéngázt alkalmazó eveporátorban szárítottuk. Befejezés után az oligomeeket 0,25-0,5 ml ionizált vízbe szuszpendáltuk.
4.3. Szintetikus DNS oligomerek tisztítása:
Minden oligomerből egy alikvot mennyiséget azonos térfogatú kék festék/formamid eleggyel kevertünk össze, úgy hogy a végső oldat 0,05% brómfenol kéket, 0,15% xilén-cianol FF-t és 25% » · · · · • ·
-56alkaImaztunk lokalizálására, méretű kimetss fragmens ttük. A formamidot tartalmazzon. Ezt az elegyet 95°C-on 10 percig hevítjük, hogy denaturáljuk az oligomereket. A mintákat ezután 7M ureát tartalmazó 12%-os poliakrilamid-urea gélre (Sambrook et al.) vittük fel. 300-400 volton 3-4 órán át tartó elektroforézis után, melyet Vertical· Slab Gél Unit (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA) segítségével végeztünk el, UV megvilágítást gélen lévő megfelelő majd egy borotvapengével tisztított gélfragmenst összeaprítottuk, és 0,4M LiCl-t tartalmazó ImM EDTA (pH 8) pufferben egy éjszakán át 37°C-on inkubáltuk.
Ezután a következő eljárások valamelyikét alkalmaztuk az oligomerek izolálására a géldarabokról: Gel/X mikroporusos polietilén filter egységek (Genex Corp., Gaithersburg) vagy a Millipore ultrafree-MC 0,45 mikronos filter egységeinek alkalmazásával. A tisztított oligomereket etanollal kicsaptuk, mikrofugában 20 percen át 4°C-on centrifugálva kinyertük, és végül TE-be (lOmM Tris, IMm EDTA, pH 8,0) újraszuszpendáltuk. A koncentrációt 50ng/pl-re állítottuk be 260nm-en leolvasott abszorpció alapján.
4.4. Az oligomerek kinázos kezelése:
Mindegyik 20 μΙ-es kináz reakcióelegybenben egy pikomól tisztított oligomert használtunk 7,0 mM Tris, pH7,5, lOmM KC1, ImM MgCl., 0, 5mM DTT, 50pg/ml BSA, 3000pCi (3 picomól) :-Ρ-γ-ΑΤΡ és 3 egység polinukleotid kináz tartalmú reakcióelegyet 1 órán át 37°C-on fenol/kloroform extrakció és három etanolos kicsapés követett, melyhez karrierként glikogént használtunk (Tracy, Prep. Biochem. 11:251-268 (1981) ) .
pufferben. A kináz inkubáltuk, melyet
-57• · · · · • * · · · négy óra alatt.
fenol/klorofo rmma1
4.5. Az oligomerek hibridizálása a közvetlen klónozáshoz:
A hibridizálandó oligomereket összegyűjtöttük (l-20pg össz DNS), és kinázzal kezeltük 37°C-on 1 órán át IX Promega ligálási pufferban, mely 30mM Tris-HCl-t, pH 7,8; lOmM MgCl.-t, lOmM DTT-t és ImM dATP-t tartalmazott. A reakcióban a jelenlévő össz DNS mennyiségétől függően 1-20 egység T4 polmukleotid kinázt alkalmaztunk. .A kinázos reakciót a reakcióelegy öt perces forróvízbe helyezésével állítottuk le. Az összegyűjtött oligomerek 50-100μ1 térfogatúak voltak, miutána végső sókoncentrációkat a hibridizációs pufferrel lOOmM NaC-re, 120mM Tns-re, pH 7,5, és lOmM MgCl,-re állítottuk be. A kinázzal kezelt és kezeletlen oligomereket összeöntöttűk, és forró vízfürdőben felmelegítettük, majd hagytuk, hogy lassan szobahőmérsékletűre hűljön körülbelül
A hibridizálódott oligomereket ezután xtraháltuk, etanollal kicsaptuk, és újra szuszpendáltuk 17 1 TE-be (lOmM Tris, ImM EDTA, pH 8,0). Ezzel a
-gy literrel állítottunk össze (végkoncentrációk = 30mM Tris-HCl, pH7,8, lOmM MgCl., lOmM DTT, ImM ATP, és 3 egység T4 DNS ligáz (Promega,
Madison WI) . A ligálódást körülbelül 2 órás szobahőmérsékleten történő inkubálással tettük lehetővé. A hibridizált/ligált fragmenseket általánosan 2%-os Nusieve agarózon (FMC BioProdacts, Rockland, ME) tisztítottuk mielőtt és/vagy miután restrikciós enzimekkel hasítottuk a vektorokba klónozás előtt. 201 térfogatú ligálási reakcióelegyet állítottunk össze mindegyik fragmensnek a DNS ekvimoláris mennyiségeinek megfelelő 10Ong-50Ong-jának alkalmazásával 30mM Tris-HCl, pH7,8, lOmM MgCl,, lOmM DTT, ImM végtérfogatú ligálási reakcióelegyet
ATP, és 3 egység T4 DNS ligáz (Promega, Madison, WI) tartalmú • ·· ····· • c · · · • · · · · · * ···· · · · ··· • · · « *
-58oldatban.
inkubáltuk sejteket (Sambrook tartalmazó
A iigálási elegyet 2 órán át szobahőmérsékleten Ligálás után a DNS-sel fagyasztott kompetens E. coli transzformáltunk standard eljárásokat alkalmazva et ai.) , és a transzformánsokat 100gg/ml ampicillint LB-agaron szelektáltuk (Sambrook et al.) (lásd lentebb).
5. Példa: Egyláncú antitest (SCA) molekula szerkesztése
A pCIB4631 a CRW BBMV-kre specifikus egyláncú antitest (SCA) génjét tartalmazza az antitest nehézlánc génjeinek konstans régióihoz fúzicnálva. A SCA gén a 3B1 antitest könnyű- es nehéz Láncaiból származó variábilis fragmenseket (a CRW BBMV-ra specifikus 3B1 monoklonális antitest vonalból) tartalmazza a L9 aminosavból álló endoplazmatikus retikulum szignál· szekvenciával fuzionálva. A könnyű és nehéz Fv-fragmens között egy 10 aminosavas (GGGGSGGGGS; 32. azonosítószámú szekvencia) doménlinker van (Huston et al . , PNAS 85:5879-5883 (1988)). A pCIB4631-t egy 4,1 kb-os Xbal-Xhol fragmens (Fv: konstans nehézlánc: CaMV 35S terminátor régió: pCIE4613-ból származó vektortragmens), egy 1,4 kB-os Xbal/BglLL fragmens (CaMV 35S promoter: pCIB4614-ből származó könnyű Fv fragmens) és egy BglII/XhoI ragadós restrikciós enzimhelyekkel rendelkező hibridizált 36 bázispáros linker fragmens ligálásával állítottuk elő. A KE147A28 és KE182A28 oligonukleotidok egymáshoz hibridizálásával hoztuk létre a 36 bázispáros inkert:
KE147A28: 5'-GAT CTG GTG GCG GTG GCT CGG GCG GTG GTG GGT CGC3' (33. azonosítószámú szekvencia)
KE182A28: 5'-TCG AGC GAC CCA CCA CCG CCC GAG CCA CCG CCA CCA3' (32. azonosítószámú szekvencia) • · « · • · · · · « * • · · ·
-59♦ ·*·
Az oligomereket a fentebb leírt módon 12%-os poliakrilamid/7M urea gélen tisztítottuk, és UV-megvilágítást alkalmaztunk, hogy a megfelelő méretű oligomereket kivágjuk standard eljárásokat alkalmazva. Az oligonukieotidokat a fentebb leírt módon kmazzal kezeltük és hibridizáltuk.
A pCIB4631 expressziós vektort 1994. március 7-én helyeztük letétbe az Agricultural Research Service-nel, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Régiónál Research Center, 1815 North University Rtreet, Peoria, Illinois 61604, USA, NRRL B-21220 számon.
6. példa: A SCA kötő proteinek jellemzése:
Egyláncú antitest proteineket expresszáltunk kukorica protoplasztokban, és western folt elemzéssel és immunmetszetekben a CRW középbél izolált keresztmetszeteivel (Bravó et al . 1992, J.
of Invert. Path. 60:237-246, Bravó et al . 1992, J. of Invert.
Path. 60:247-253) kimutattuk, hogy kötődnek a CRW BBMV proteinekhez.
6.1. Kukorica sejtszuszpenzió protoplasztjainak izolálása:
Egy Ciba Seeds kukorica beltenyésztett vonalból (B73 típus) vagy alternatív lehetőségként Black Mexican Sweet éretlen embriókultúrából származó embriogén szuszpenzió kultúrát tartottunk fenn N6 alaptápközegben (Chu et al., 1975), mely 3% szacharózzal és 2mg/l 2,4-D-vel volt kiegészítve, 27°C-on rázókeverőben 130rpm-nél és hetenként altenyészeteket készítve. A szuszpenzió sejtjeit 1-2 nappal az altenyészet készítése után összegyűjtöttük, és enzimoldatba (3%-os celluláz RS + 1%-os macerozim RIO KMC-ben feloldva, KMC: 8,7 g/l KC1, 12,5g/l CaCl , ··· · · • · · · · · * ···«· · * ·««· • · · · ·
-6016,4g/l MgSO,, 5g/l MES, pH 5,7) újra szeszpendáituk 2ml tömörített sejt térfogat per 20 ml enzimoldat arányban. A sejtek alikvotjait 100 x 25 mm-es Petri-csészékbe osztottuk, és négy órán át szobahőmérsékleten rázókeverőben 50rpm-mel inkubáltuk.
6.2. A protoplasztok transzformálása:
Közvetlenül az izolálás után a protoplasztokat 6 millió/ml sűrűséggel RS pufferba (0,45M mannitol, 15mM CaCl, 0,l%MES, pH5,7) szuszpendáltuk. Fél ml-es alikvotokat helyeztünk 17 x lOOmm-es polisztirén csövekbe, melyhez 50pg pCIB4631 DNS-t 50gg CaMV 35S GUS-t, úgymint pB1221-et (Clontech Laboratories, Inc.,
Palo Alto, CA) adtunk transzformációs kontrollként. Fél ml PEG oldatot (4 0% PEG 6000, 0,4M mannitol, 0,lM Ca(NO;),) adtunk minden kémcsőbe, és a protoplasztokat óvatos keveréssel hozzákevertük. 30 perces szobahőmérsékleten történő inkubálás után a protoplasztokat lépésenként ötperces intervallumokkal Imi, 2ml, 5ml és 10ml W5-tel (9,0g/l NaCl, 18,5g/l CaCl,, 0,37g/l KC1, 0,9g/l glukóz, pH 5,6), ülepítettük, és szélesztő tápközegbe (MS sók, B5 vitaminok, 3%-os szacharóz, 2mg/l 2,4-D, 0,3M mannitol) reszuszpendáltuk 2 x 10 protoplaszt/ml sűrűséggel. A protoplasztokat 26°C-on sötétben inkubáltuk. 18-22 óra elteltével a protoplasztokot Eppendorfcsövekbe gyűjtöttük, ülepítettük, és 0,4 ml extrakciós pufferba (lOOmM ΚΗΡΟ,, pH 7,8, ImM DTT) szuszpendáltuk. A mintákat ultrahanggal kezeltük 10 másodpercig, és a törmeléket centrifugálással kicsaptuk.
6.3. Egyláncú antitest kötődése a CRW BBMV-hez:
Bélboholy határoló membrán vezikulumokat preparáltunk a korábban leírt módon, és elektroforetizáltuk 8-16%-os akrilamid SDS protein géleken (Novex, San Diego, CA) . A proteineket • · · A · • · » · · · » * · · · · * · ··» · • ·« · ·
-61nitrocellulózra (Burnette, W.N., Western Blotting, 112:195 (1981)) vittük át, és hagytuk, hogy az egyszálú antitest proteineket tartalmazó kukorica protoplaszt extraktumokhoz kötődjék. A pCIB4631 által kifejezett CRW BBMV-specifikus 3B1 egyláncú antitest protein ugyanolyan molekulatömegű BBMV proteinhez kötődik, mint az eredeti 3B1 monoklonális antitest. A kukorica protoplasztokban kifejezett egyláncú antitestről azt is kimutattuk, hogy kötődik a CRW középbél keresztmetszeteihez az immunmetszetes kísérletekben (Bravó et al. 1992, J. of Invert.
Pach. 60:237-246, Bravó et al . 1992, J. of Invert. Path. 60:2472 53) .
7. példa: CRW specifikus immunotoxin előállítása
Egy CRW BBMV specifikus egyláncú antitestet fúzionáltunk a
Pseudomonas A exotoxinjának toxikus doménjéhez. A Pseudomonas A exotoxint már alkalmazták rekombináns hibrid antitest-toxin fúziós proteinek előállítására rák és immunbetegségek kezelése céljából (Pastan, I. és FitzGerald, D., 1989, J. Bioi. Chem. 264:1515715160, és Pastan, I et al. Annu. Rév. Biochem. 1992, 61:331-54).A
Pseudomonas exotoxin szerkezete jól jellemzett, és hatásmódja ismert. Az antitest hibrid toxinok, mint inszekticid hatóanyagok ötlete új, és ilyen típusú megközelítésre még nem volt példa.
A Pseudomonas exotoxin (PE) egy Pseudomonas aeruginosa által szekretált egyláncú toxin. Elpusztítja a sejteket a transzlációs elongációs faktor 2 (EF-2) íreverzibilis ADP-ribozilálása és inaktiválása által. A PE szerkezet jól jellemzett (Chaudhary, V.K. et al., 1990, J. Bioi. Chem. 265:16303-16310), és három doménből áll. Az la dómén felelős a sejtfelismerésért és a PE célsejtekhez történő kötődésért, a II dómén szükséges az ADP-riboziláló
-62• ·· • · · • · · · » ·« · · · • · · ·«·· · > · ♦ · » • ·· · aktivitás citoszolba juttatásáért, és a III dómén képviseli az ADP-riboziláló aktivitást. Amikor a toxin bejut a sejtbe, endocιtotikus vezikulumok által internalizálódik, ahol· a lehasadas megtörténik létrehozva egy 37kD-os III domént, az aktivált toxint. Az la dómén deléciója eltávolítja a sejtkötő domént, és egy 40kDa-s, rendkívül alacsony celluláris citotoxicitású protein (PE40) jön létre. Már fúzionáltak antitesteket PE40-nel, hogy rekombináns immuntoxinokat hozzanak létre rák kezelésére. Feltételezhető, hogy a fúzionált antitest-PE40 kötődését receptorközvetített endocitózisos internálizáció követ a PE40 aktiválása érdekében, és az ezt követően a citoszolba jut.
A PE toxikus domént a CRW 3B1 egyláncú antitest nehézlánc fragmensének -COOH terminálisához fuzionáltuk, mivel kimutattuk, hogy a PE40 -NH2 terminálissal történő fúziók megőrzik a citotoxicitást . Úgy is meg lehet tervezni a fúziót, hogy az egyláncú antitest a PE40 -COOH terminálisához legyen fúzionálva (Prior et al . Cell Vol. 64:1017-1023) . Egyláncú antitest fúziókat állítottunk elő, és E. coli expressziós vektorokban teszteltük, pFLAG expressziós vektort alkalmazva, mely egy IPTG indukálható tac promotert tartalmaz, melyet egy ompA szignálpeptidet kódoló szekvencia követ, mely a periplazmába történő szekrécióért felelős, és a nyolc aminosavas FLAG epitop, mely lehetővé teszi a rekombináns protein antitest affinitás kromatográfiás tisztítását. Az egyláncú antitest fúziós proteineket a FLAG expressziós vektorból tisztítottuk. A tisztított SCA fúziós proteineket beletettük a gabona gyökérféreg táplálékába vizsgálatokhoz.
aktivitási ·«·· • · · k · • · · · « « · ···· · · · ···· » ·« · *
-63PE4O-nel fúzionál·t egyláncú antitestet állítottunk elő egy kb. 1,2 kB-os, PE40 tartalmú SphI/EcoRI fragmens és egy 790 bp-os,
3B1 egyláncú antitestet kódoló HindlII/Sphl fragmens ligalasával az 5,37 kB-os HindiII/EcoRI-gyei hasított pFLAG vektorba (IBI, New Haven, CT). A PE40 fragmenst a pWW20-ból, egy Pseudomonas A exotoxin toxikus doménjét egy indukálható Lac promoter kontrollja alatt tartalmazó pUC9 vektorból nyertük (Wels et al . 1992, Cancer
Research 52:6310-6317) . A 700 bp-os, 3B1 egyláncú antitest génjét tartalmazó fragmenst PCR-rei állítottuk elő templátként pCIP4631-t alkalmazva.
NC200: 5'-CGA AGC TTG ACA TTG TGC TGA CCC AG-3' (35. azonosítószámú szekvencia)
NC202: 5'-GCC CTC TAG AAG CAT GCC TGA GGA GAC GGT GAC TGA3' (36. azonosítószámú szekvencia)
8. példa: Transzformálás és expresszió növényekben
Toxin doménekhez fuzionált antitest doméneket tartalmazó hibrid toxinokat transzformálunk növényekbe általánosan ismert módszereket alkalmazva, ami a WO 93/07278, 08/008006 számú közzétételi iratokból ismerhető meg. Toxinokhoz fúzionált, két független antitestláncból vagy antitestdoménből álló bimer toxinokat expresszáltunk és szereltünk össze növényekben az általános sejtes processzálást alkalmazva. Az egyláncú antitesttoxin proteineket vagy növényi citoplazmában expresszáljuk a növényi apoplasztot, vagy a celluláris toxicitással rendelkező' hibrid toxinok esetében a növényi sejten belüli sejtszervecskéket megcélozva (Taviadoraki et al . 1993, Natúré 366:469-472; Owen et al . 1992, Bio/Technology 10:790-794 ; Firek et al . 1993, Plánt
-64• ·· ···· · • · · · · • · · · · · « ···· · · · ···· • ·· < »
Molecular Biology 23:861-870). A szakirodalomból· ismert technikákat alkalmaztuk, hogy a proteinekkel a klóroplasztzszt vagy a vakuólumot az endoplazmatikus retikulumon keresztül megcélozzuk. A vakuolans irányító szignálokat karboxiitermmalis propolipeptidek formájában a szakirodalomban már leírták (Bednarek
S. et al . 1991, Plánt Cell 3:1195-1206; Neuhaus J-M et al . 1991,
PNAS 88:10362-10366; Bednarek S. et al . 1992, Plánt Mól. Bioi .
20:133-150; Chrispeels M.J. et al . 1992, Cell 68:613-616; Nak.amura
K. et al. 1993, Plánt Phisiol. 101:1-5; Dombrowski J. E. et al .
1993, Plánt Cell 5:587-596; Schroerder M.R. et al . 1993, Plánt
Physiol. 101:451-458). A kloroplasztiszcélzó szignálokat Nterminális tranzitpeptidek formájában az irodalom leírja (Van Den Broeck G. et al . 1 985, Natúré 313:358-363; Smeekens S. et al.
1987, Plánt Mól. Bioi. 9:377-388; Szabó L.J. et al. 1987, a
Növényi DNS Fertőző Ágensek-ben (Plánt DNA Infectious Agents, szerk.: T. Hohn és J. Schell, Springer Verlag, Wein, New York, 321-339; Keegstra K. et al . 1989, Annu. Rév. Plánt Physiol. Plánt
Mól. Bioi. 40:471-501) .
A találmány olyan toxinmolekulák létrehozására szolgáló anyagot és eljárásokat szolgáltat, melyek egy adott rovarra irányulnak. Különösen olyan rovarokra irányulnak, melyeknél a Bt endotoxinok toxinkötő és citotoxikus hatásai nem érvényesülnek. Tovvábbá olyan toxinmolekulákat állítunk elő, melyek egy adott rovarkártevőre specifikusak.
A leírásban említett összes publikáció és szabadalmi bejelentés azon szakterület szakembereinek tudásszintjét jelzi, melyre a találmány vonatkozik. Az összes publikáció és szabadalmi bejelentés referenciaaként ugyanolyan mértékben beépül a • · • « · · ·
-65bejelentésbe, mintha minden egyes publikációnál és szabadalmi bejelentésnél ezt külön-külön kifejezetten jeleztük volna. Bár a fenti találmányt a jobb megértés céljából ábrákkal és példákkal valamennyire részletesen leírtuk, nyilvánvaló hogy az igénypontok oltalmi körén belül bizonyos változtatások és módosítások tehetők.
9. példa: Készítmény kiszerelési példák
A követkéző kiszerelési példákban a hatóanyag a 7. szerint előállított tisztított SCA fúziós protein.
Al. Nedvesedő porok példa
a) b) o)
Hatóanyag 25% 50% 7 5%
nátrium-lignoszulfonát 5% 5% -
nátrium-lauril-szulfát 3% - 5%
nátrium-diizobutil-naftálin-szulfonát - 6% 10%
oktilfenol-polietilénglikol-éter - 2% -
(7-8 mól etilén-oxid)
nagymértékben diszpergált kovasav 5% 10% 10%
kaolin 62% 27% -
A spórákat alaposan összekevertük egy megfelelő malomban teljesen kapva, mely vízzel hígítható szuszpenziót nem érjük el.
A2. Emulgeálható koncentrátum Hatóanyag oktil-fenol-polietilénglikol-éter kaicium-dodecil-benzol-szulfonát az adjuvánsokkal, megőröltük egy míg a kívánt és az elegyet nedvesedő port koncentrációjú
10%
3%
3% ricinusolaj-pcliglikol-éter (36 mól etilér.-oxid)
4% • · • · ·
-66ciklohexanon 30% xilén elegy 50%
A kívánt koncentrációjú emulzió ennek a koncentrátumnak a vizes hígításával kapható.
A3. Porok b:
5;
95'
9;
hatóanyag talkum kaolin
Az alkalmazható por a hatóanyag és a hordozók összekeverésével és megfelelő malomban történő őrléssel kapható.
A4 . Extrudált granulátum hatóanyag 10% nátrium-lignoszulfát 2% karboximetil-cellulóz 1% kaolin 87%
A hatóanyagot vagy kombinációt összekevertük és megőröltük az adjuvánssal, és a keveréket ezután vízzel nedvesítettük. A keveréket extrudáltuk, granuláltuk és légárammmal szárítottuk.
A5 . Bevont granulátum hatóanyag 3% polietilénglikol (mól. tömeg 200) 3% kaolin 94%
A hatóanyagot vagy kombinációt egyenletesen a keverőbe adagoljuka polietilénglikollal átitatott kaolinhoz. ílymódon nem poros bevont granulátumokat kapunk.
A6 . Szuszpenzió koncentrátum Hatóanyag
40% • · • · · · ·
-67etilénglikol 10% nonil-fenol-polietilengiikol-éter (15 mól etilénoxid) 6% nátnum-lignoszulfonát 10% karboxi-metil-cellulóz 1%
37%-os vizes formaldehid-oldat 0,2% szilikonolaj 75%-os vizes oldata 0,8% ví z 32 %
A hatóanyagot vagy kombinációt közvetlenül az adjuvánssal keverjük össze, és így egy olyan koncentrátumot kapunk, melyből vízzel hígítva kívánt koncentrációjú szuszpenziók nyerhetők.
-68Szekvencialista (1) Általános információk: (i) Bejelentő:
(A) Név: Ciba-Geigy AG.
(B) Utca: Klybeckstr . 141 •
(C) Város: Bázel
(E) Ország: Svájc
(F) Postai irányítós zám: 4002
(G) Telefon: +41 61 69 11 11
(H) Telefax: + 41 61 6 9 6 79 76
(I) Telex: 962 991
(ii) A találmány címe: Rovar bél proteinekhez antitestek és alkalmazásuk (iii) A szekvenciák száma: 49 (iv) Számítógéppel feldolgozható forma:
kötődő
(A) Hordozó típusa: flopi lemez
(B) Számítógép : IBM PC kompatibilis
(C) Operációs rendszer: : PC-DOS/MS-DOS
(D) Szoftver: Patentln Release #1.0,
Version #1,25 (EPO)
(2) Információk az 1. azonosítószámú szekvenciához (i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 357 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNS
-69(ix) Jellegzetességei:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Elhelyezkedés: 1..357 (C) Egyéb mnf ormációk: /megjegyzés= pCIBl613-ból származó 3B1 nehézlánc variábilis régió (xi) A szekvencia leírása: 1. azonosítószámú szekvencia:
CAG GTC Gin Val 1 AAA CTG CAG GAG TCT GGT GGA GGA TTG GTG CAG CCT AAA GGG 48
Lys Leu Gin 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Lys 15 Gly
TCA TTG AAA CTC TCA TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AAT AAC TTC 96
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Alá Alá Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Phe
20 25 30
GCC ATG AAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTG GAA TGG GTT 144
Alá Met Asn Trp Val Arg Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
GCT CGC ATA AGA AGT AAA AGT AAT AAT TAT GCA ACA TCT TAT GGC GAT 192
Alá Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Alá Thr Ser Tyr Glv Asp
50 55 60
TCA GTG AAA GAC AGG TTC ACC GTC TCC AGA GAT GAT TCA CAA AGC ATG 240
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gin Ser Met
65 70 75 80
TTC TAT CTG CAA ATG AAC AAC TTG AAA ACT GAG GAC ACA GCC ATG TAT 288
Phe Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Alá Met Tyr
85 90 95
TAC TGT GTG AGG GTA GTA TAC GGT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA 336
Tyr CyS Val Arg Val Val Tyr Gly Alá Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100
105
110 ·· · ·
-70ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 (2) Információk az 2. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 119 aminosav (B) Típusa: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein
(xi ) A szekve nci a leírása: 2 . azonosítc /számú SZS
Gin Val Lys Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Lys Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Alá Ma Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Phe
20 25 30
Alá Met Asn Trp Val Arg Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Alá Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Alá Thr Ser Tyr Gly Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gin Ser Met
65 70 75 80
Phe Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Alá Met Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg Val Val Tyr Gly Alá Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 UO
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 (2) Információk az 3. azonosítószámú e kvenc i áho z:
-71(i) Szekvenciajellenzők :
(A) Hossza: 333 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNS (ix) Jellegzetességei:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Elhelyezkedés: 1..333 (C) Egyéb mnformációk: /megjegyzés^ pCIB4614-ből származó 3B1 könnyűlánc variábilis regió (í/21Fv Ab) (xí) A szekvencia leírása: 3. azonosítószámú szekvencia:
GAC Asp 1 ATT lle GTG Val CTG Leu ACC CAG TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG 48
Thr Gin 5 Ser Pro Alá Ser 10 Leu Alá Val Ser Leu 15 Gly
CAG AGG GCC ACC ATC TCC TGC AGA GCC AGC GAA AGT GTT GAT CAT TAT 96
Gin Arg Alá Thr lle Ser Cys Arg Alá Ser Glu Ser Val Asp His Tyr
20 25 30
GAC ATT AGT TTT ATG AAC TGG TTC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC 144
Asp He Ser Phe Met Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro
40 45
AAA CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAC CAA GGA TCC GGG GTC CCT GCC 192
Lys Leu Leu 50 lle Tyr Alá Alá 55 Ser Asn Gin Gly Ser Gly 60 Val Pro Alá
AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC AGC CTC AAC ATC CAT 240
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn lle His
65 70 75 80
CCT ATG GAG GAG GAT GAT ACT GCA ATA TAT TTC TGT CAG CAA AGT AGG 288
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Alá He Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Arg
85 90 95
• ·
-72CTG GAA ΑΤΑ ΑΛΑ 333
Leu Glu Ile Lys
110 szekvenciához:
GAA CTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC ACG
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr
100 105 (2) Információk az 4. azonosítószámú (i) Szekvenciaιellemzők:
(A) Hossza: lil aminosav (B) Típusa: aminosav (D) Tooolócia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) A szekvencia leírása: 4. azonosítószámú szekvencia:
Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Alá Ser Leu Alá Val Ser Leu Gly 15 10 15
Gin Arg Alá Thr Ile Ser Cys Arg Alá Ser Glu Ser Val Asp His Tyr 20 25 30
Asp Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro
40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Alá Alá Ser Asn Gin Gly Ser Gly Val Pro Alá 50 55 50
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His 65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Alá Ile Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Arg 85 90 95
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys 100 105 110 • · · (2) Információk az 5. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 372 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egvláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNS (i x) Jellegzetességei:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Elhelyezkedés: I..372 (C) Egyéb mnformációk: /megjegyzés= pCIB4615-ből származó 2B5 nehézlánc variábilis régió (xi) A szekvencia leírása: 5. azonosítószámú szekvencia:
CAG GTG CAA CTG CAG GAG TCT GGA GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGT 48
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
TCT CTG AGA CTC TCC TGT GCA ACT TCT GGG TTC ACC TTC ACT GAT TAC 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Alá Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
TAT ATG ACC TGG GTC CGC CAG CCT CCA GGA AAG GCA CTT GAG TGG TTG 144
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Alá Leu Glu Trp Leu
35 40 45
GGT TTT ATT AGA CAC AAA GCT AAT GGT TAC ACA ACA GAA TAC AGT GCA 192
Gly Phe Ile Arg His Lys Alá Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Alá
50 55 60
TCT GTG AAG GGT CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAT AAT TCC CAA AAC ATC 240
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gin Asn Ile
65 70 75 80
-Ζ4288
CTC Leu TAT Tyr CTT te; CAA Gin ATG AAC ACC CTG AGA GCT GAG GAC AGT GCC ACT TAT
Met Asn 85 Thr Leu Arg Alá 90 Glu Asp Ser Alá Thr 95 Tyr
TAC TGT GCA AGA GAT ATA TGC TAT GGT TAC GAC GTT GGG GCT CTG GAC
Tyr Cys Alá Arg Asp Ile Cys Tyr Gly Tyr Asp Val Gly Alá Leu Asp
100 105 110
TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
336
372 (2) Információk az 6. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 124 aminosav (B) Típusa: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) A szekvencia leírása: 6. azonosítószámú szekvencia
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Alá Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Alá Leu Glu Trp Leu •35 40 45
Gly Phe Ile Arg His Lys Alá Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Alá 50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gin Asn Ile 65 70 75 80 • ·
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Thr Leu Arg Alá Glu Asp Ser Alá Thr Tyr 85 90 95
Tyr Cys Alá Arg Asp Ile Cys Tyr Gly Tyr Asp Val Gly Alá Leu Asp 100 105 110
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 (2) Információk a 7. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 330 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNS (ix) Jellegzetességei:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Elhelyezkedés: 1..330 (C) Egyéb innformációk: /megjegyzés^ pCIB4616-ból származó 2B5 könnyűlánc variábilis régió (xi) A szekvencia leírása: 7. azonosítószámú szekvencia:
GAT Asp 1 ATC Ile GTG ATG ACC Thr 5 CAG TCT Gin Ser CCT Pro GCT TCC TTA GCT ATA TCT CTG GGG 48
Val Met Alá Ser 10 Leu Alá Ile Ser Leu 15 Gly
CAG AGG GCC ACC ATC TCA TAC AGG GCC AGC AAA AGT GTC AGT ACA TCT 96
Gin Arg Alá Thr Ile Ser Tyr Arg Alá Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
GGC TAT AGT TAT ATG CAC TGG AAC CAA CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC 144
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro
35 40 45
AGA CTC CTC ATC TAT CTT GTA TCC AAC CTA GAA TCT GGG GTC CCT GCC 192
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Alá
AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA
Arg 65 Phe Ser Gly Ser Gly 70 Ser Gly Thr
CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC
Pro Val Glu Glu Glu 85 Asp Ma Ma Thr
GAG CTT ACA CGT TCG GAG GGG GGA CCA
Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro
100
GAC TTC ACC CTC AAC ATC CAT 240
Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 80
75
TAT TAC TGT CAG CAC ATT AGG 288
Tyr Tyr Cys Gin His Ile Arg
90 95
MG CTG GAA ATA AAA 330
Lys Leu Glu Ile Lys
110
(2) Információk a 8. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 110 aminosav (B) Típusa: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) A szekvencia leírása: 8. azonosítószámú szekvencia:
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Alá Ser Leu Alá Ile Ser Leu Gly 15 10 15
Gin Arg Ma Thr Ile Ser Tyr Arg Ma Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro 35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ma 50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80
-77Pro Val Glu Glu Glu Asp Alá Alá Thr Tyr Tyr Cys Gin His Ile Arg S5 90 95
Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 (2) Információk a 9. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciáieliemzők:
(A) Hossza: 165 bázispár
(B) Típusa: nukleinsav
(C) Száltípus: egyláncú
(D) Topológia: lineáris
(il) Molekulatípus: cDNS
(IX) Jellegzetességei:
(A) Név/Kulcs: CDS
(B) Elhelyezkedés: 1..165
(C) Egyéb mnf ormációk: /megjegyzés= 17F6
variábilis régió (xi) A szekvencia leírása: 9. azonosítószámú szekvencia:
TCT Ser 1 GTG Val AAA Lys GGC Gly AGA TTC ACT ATT TCA AGA GAT GAT TCA CAA AGT ACT 48
Arg Phe 5 Thr Ile Ser Arg 10 Asp Asp Ser Gin Ser 15 Thr
GTC TAC CTG GAG ATG AAC ACG CTA AGA GAG GAA GAC ACT GCC ACT TAT 96
Val Tyr Leu Glu Met Asn Thr Leu Arg Glu Glu Asp Thr Alá Thr Tyr
20 25 30
TAT TGT TGT AGA GGG GGG GAG GAG GGG TTT CCT TAC TGG GGG CAA GGG 144
Tyr Cys Cys Arg Gly Gly Glu Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly
40 45 • ·
-78ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA Thr Leu Val Thr Val Ser Alá
55
165 [2) Információk a 10. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 55 aminosav (B) Típusa: aminosav (D) Topológia: lineáris
(11) Mc 'lekula' típus: pro tel n
(xi) A szekvencia le ;í rá s a : 10 . azono sít ós z ámú szekvencia
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gin Ser Thr
1 5 10 15
Val Tyr Leu Glu Met Asn Thr Leu Arg Glu Glu Asp Thr Alá Thr Tyr
20 25 30
Tyr Cys Cys Arg Gly Gly Glu Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly
40 45
Thr Leu Val Thr Val Ser Alá 50 55 ) Információk a 11. azonosítószámú szekvenciához (i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 339 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNS (ix) Jellegzetességei:
-79(A) Név/Kulcs: CDS (B) Elhelyezkedés: 1..339 (C) Eavéb ir.nf ormációk: /megjegyzés^ 17F6 könnyűianc variábilis régió
( xi) A szekvencia leírása: 11 . azonosítószámú szekvencia:
GAC ATC GTG CTG ACC CAA TCT CCA TCC TCC CTG AGT GTG TCA GTA GGA 48
Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
GAG AAG GTC ACC ATG AGC TGC AAG TCC AGT CAG AGT CTT TTC GAC AGT 96
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Phe Asp Ser
20 25 30
GGA AAT CAA AAG AAC TCC TTG GCC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG CAG 144
Gly Asn Gin Lys Asn Ser Leu Alá Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin
35 40 45
CCT CCT AAA CTA TTG ATC TAC GGG ACA TCC ACT AGG GAT TCT GGG GTC 192
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val
50 55 60
CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GGG ACC GAT TTC ACT CTT ACC 240
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
ATC AGT GGT ATA CAG GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TAC TGT CAG AAT 288
Ile Ser Gly Ile Gin Alá Glu Asp Leu Alá Val Tyr Tyr Cys Gin Asn
85 90 95
GAT CAT TAT TAT CCG TTC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAG ATA 336
Asp His Tyr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
AAA
Lys
339 • · · · ·
-80(2) Információk a L2. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajeliemzők:
(A) Hossza: 113 aminosav (3) Típusa: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (:<i) A szekvencia leírása: 12. azonosítószámú szekvencia
Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Phe Asp Ser
25 30
Gly Asn Gin Lys Asn Ser Leu Alá Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Arg Asp Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
Ile Ser Gly Ile Gin Alá Glu Asp Leu Alá Val Tyr Tyr Cys Gin Asn 85 30 95
Asp His Tyr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110
Lys (2) Információk a 13. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajeliemzők:
(A) Hossza: 357 bázispár ·· · ·
-81(B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNS (iii) Hipotetikus: nem (ív) Antiszensz: nem (ix) Jellegzetességei:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Elhelyezkedés: 1..357 (C) Egyéb innformációk: /megjegyzés= 10B6 nehézián variábilis régió (xi) A szekvencia leírása: 13. azonosítószámú szekvencia
GAG Glu 1 GTG AAG GTG GAT Asp 5 GAG AGT GGG GGA GGC TTG GTG AGG CCT GGA AAT 48
Val Lys Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Asn
10 15
TCT CTG AAA CTC TCC TGT GAA ACC TCG GGA TTC ACT TTC AGT TAT TAT 96
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
TGG ATG CAC TGG CTT CGC CAG CCT CCA GGG AAG AGG CTG GAG TGG ATT 144
Trp Met His Trp Leu Arg Gin Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
GCT GTG ATT AAA GTC AAA TCT GCT AAT TAT GGA TCA AAT TAT GCA GAG 192
Alá Val Ile Lys Val Lys Ser Alá Asn Tyr Gly Ser Asn Tyr Alá Glu
50 55 60
TCT GTG AAA GGC AGA TTC ACT ATT TCA AGA GAT GAT TCA AAT AGC GGT 240
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Asn Ser Gly
··· ·
GTC TAC CTG CAG ATG AAC AGA TTA AGA GAA GAA GAC ACT GCC
Val Tyr Leu Gin Met 85 Asn Arg Leu /Arg Glu 90 Glu Asp Thr .Ma
TAT TGT AGT AGA GGG GGG GCC CCC GGG TTT CCT TAT TGG GGC
Tyr Cys Ser Arg Gly Gly Alá Pro Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
ACT TAT 2S8
Thr Tyr
CAA GGG 336
Gin Gly
ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA
Thr Leu Val Thr Val Ser Ma
115
(2) Információk a 14. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 119 aminosav (B) Típusa: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) A szekvencia leírása: 14. azonosítószámú szekvencia
Glu Val Lys Val Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Asn 15 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr 20 25 30
Trp Met His Trp Leu Arg Gin Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp lle 35 40 45
Alá Val lle Lys Val Lys Ser Alá Asn Tyr Gly Ser Asn Tyr Alá Glu 50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lle Ser Arg Asp Asp Ser Asn Ser Gly 65 70 75 80
-83• « • ··
Val Tyr Leu Gin Met Asn Arg 85 Leu Arg Glu Glu 90 Asp Thr Alá Thr 95 Tyr
Tyr Cys Ser Arg Gly Gly Alá Pro Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Alá
115
2) Információk a 15. az onosítószámú s ze kvenciáho z :
(1 Szekvenciajellemzők :
(A) Hossza: 339 bázispár
(B) Típusa: nukleinsav
(C) Száltípus: egyláncú
(D) Topológia: lineáris
(ii) Molekulatípus: cDNS
(ix) Jellegzetességei:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Elhelyezkedés: 1..339 (C) Egyéb ínnformációk: /megjegyzés= 10B6 könnyűlánc variábilis régió (xi) A szekvencia leírása: 15. azonosítószámú szekvencia:
GAT ATC GTG ATC ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTA AGT GTG TCT TTA GGA 48
Asp Ile Val Ile Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
GAG AAG GTC ACT TTG AGC TGC AAG TCC AGT CAG AGT CTG TTT ACC GGT 96
Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Phe Thr Gly
20 25 30
GGA GAT CAA AAG AAC TCC TTG GCC TGG TAC CAG CAG AAA GCA GGG CAG 144
Gly Asp Gin Lys Asn Ser Leu Alá Trp Tyr Gin Gin Lys Alá Gly Gin
35 40 45
» · ·· ·
CCT Pro CCT Pro 50 AGA CTG TTG ATC TAC GGG ACT TCC ACT AGG GAA TCT GGG Gly GTC Val 192
Arg Leu Leu Ile Tyr 55 Gly Thr Ser Thr Arg Glu 60 Ser
CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGA TCT GGA ACC GAT TTC ACT CTT GCC 240
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Alá
65 70 75 80
ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAA GAC CTG GCA GGT TAT TAC TGT CAG AAT 288
Ile Ser Ser Val Gin Alá Glu Asp Leu Alá Gly Tyr Tyr Cys Gin Asn
85 90 95
GAT CAT AGT TAT CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACA ATG TTG GAA GTA 336
Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Met Leu Glu Val
100 105 110
ΑΑΑ 339
Lys (2) Információk a 16. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 113 aminosav (B) Típusa: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) A szekvencia leírása: 16. azonosítószámú szekvencia
Asp Ile Val Ile Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Phe Thr Gly 20 25 30
Gly Asp Gin Lys Asn Ser Leu Alá Trp Tyr Gin Gin Lys Alá Gly Gin 35 40 45 • ·
Pro Pro Arg 50 Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Alá
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gin Alá Glu Asp Leu Alá Gly Tyr Tyr Cys Gin Asn
85 90 95
Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Met Leu Glu Val
100 105 110
Lys (2) Információk a 17. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvencia j el lerázok :
(A) Hossza: 1797 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNS (ix) Jellegzetességei:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Elhelyezkedés: 1..1797 (D) Egyéb innformációk: /megjegyzés= a pCIB4631-ből származó 3B1 egyláncú antitest (xi) A szekvencia leírása: 17. azonosítószámú szekvencia:
ATG GGA TGG AGC TGG ATC TTT CTC TTC CTC CTG TCA GGA GCT GCA GGT Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Alá Alá Gly
Met • · · · ·
GTC CAT TGC CTA CTC GAG GAC ATT GTG CTG
Val His Cys Leu Leu Glu Asp Ile Val Leu
20 25
TTG GCT GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC
Leu Alá Val Ser Leu Gly Gin Arg Alá Thr
35 40
GAA AGT GTT GAT CAT TAT GAC ATT AGT TTT
Glu Ser 50 Val Asp His Tyr Asp 55 Ile Ser Phe
AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC
Lys 65 Pro Gly Gin Pro Pro 70 Lys Leu Leu Ile
GGA TCC GGG GTC CCT GCC AGG TTT AGT GGC
Gly Ser Gly Val Pro 85 Ma Arg Phe Ser Gly 90
TTC AGC CTC AAC ATC CAT CCT ATG GAG GAG
Phe Ser Leu Asn 100 Ile His Pro Met Glu 105 Glu
TTC TGT CAG CAA AGT AGG GAA CTT CCG TAC
Phe Cys Gin 115 Gin Ser Arg Glu Leu 120 Pro Tyr
ACG CTG GAA ATA AAA CGG GCT GAT GCT GCA
Thr Leu 130 Glu Ile Lys Arg Ma 135 Asp Ma Ma
GGT GGC TCG GGC GGT GGT GGG TCG CTC GAG
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu
145 150
ACC CAG TCT CCA Pro 30 GCT Ma TCT Ser 96
Thr Gin Ser
ATC TCC TGC ACA GCC AGC 144
Ile Ser Cys 45 Arg Ma Ser
ATG AAC TGG TTC CAA CAG 192
Met Asn 60 Trp Phe Gin Gin
TAT GCT GCA TCC AAC CAA 240
Tyr 75 Ma Ma Ser Asn Gin 80
AGT GGG TCT GGG ACA GAC 288
Ser Gly Ser Gly Thr 95 Asp
GAT GAT ACT GCA ATA TAT 336
Asp Asp Thr Ma 110 Ile Tyr
ACG TTC GGA GGG GGG ACC 384
Thr Phe Gly Gly Gly 125 Thr
CCA ACT AGA TCT GGT GGC 432
Pro Thr 140 Arg Ser Gly Gly
CAG GTC AAA CTG CAG GAG 480
Gin Val Lys Leu Gin Glu
155 160
TCT GGT GGA GGA TTG GTG CAG CCT AAA GGG TCA TTG AAA CTC TGA TGT 528
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys
165 170 175
GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AAT AAC TTC GCC Alá ATG AAC TGG GTC CGC Met Asn Trp Val Arg 190 576
Alá Alá Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Phe 185
180
CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTG GAA TGG GTT GCT CGC ATA AGA AGT AAA 624
Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Alá Arg Ile Arg Ser Lys
195 200 205
AGT AAT AAT TAT GCA ACA TCT TAT GGC GAT TCA GTG ztAA GAC AGG TTC 672
Ser Asn Asn Tyr Alá Thr Ser Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe
210 215 220
ACC GTC TCC AGA GAT GAT TC?. CAA AGC ATG TTC TAT CTG CAA ATG AAC 720
Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gin Ser Met Phe Tyr Leu Gin Met Asn
225 230 235 240
AAC TTG AAA ACT GAG GAC ACA GCC ATG TAT TAC TGT GTG AGG GTA GTA 768
Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Alá Met Tyr Tyr Cys Val Arg Val Val
245 250 255
TAC GGT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC 816
Tyr Gly Alá Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
260 265 270
TCA GCC AAA ACG ACA CCC CCA TCT GTC TAT CCA CTG GCC CCT GGA TCT 864
Ser Alá Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Alá Pro Gly Ser
275 280 285
AGA TCT Arg Ser GCT GCC CAA ACT AAC Asn 295 TCC Ser ATG GTG ACC CTG GGA TGC CTG GTC 912
Ma Alá Gin Thr Met Val Thr Leu 300 Gly Cys Leu Val
290
AAG GGC TAT TTC CCT GAG CCA GTG ACA GTG ACC TGG AAC TCT GGA TCC 960
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
305 310
315
320
CTG TCC AGC GGT GTG CAC ACC TTC CCA GCT GTC CTG CAG TCT GAC CTC 1008
Leu Ser Ser Gly Val 325 His Thr Phe Pro Alá Val 330 Leu Gin Ser Asp 335 Leu
TAC ACT CTG AGC AGC TCA GTG ACT GTC CCC TCC AGC ACC TGG CCC AGC 1056
Tyr Thr Leu Ser 340 Ser Ser Val Thr Val Pro Ser 345 Ser Thr Trp 350 Pro Ser
GAG ACC GTC ACC TGC AAC GTT GCC CAC CCG GCC AGC AGC ACC AAG GTG 1104
Glu Thr Val Thr 355 Cys Asn Val Alá 360 His Pro Alá Ser Ser 365 Thr Lys Val
GAC AAG AAA ATT GTG CCC AGG GAT TGT GGT TGT AAG CCT TGC ATA TGT 1152
Asp Lys 370 Lys Ile Val Pro Arg 375 Asp Cys Gly Cys Lys 380 Pro Cys Ile Cys
ACA GTC CCA GAA GTA TCA TCT GTC TTC ATC TTC CCC CCA AAG CCC AAG 1200
Thr 385 Val Pro Glu Val Ser 390 Ser Val Phe Ile Phe 395 Pro Pro Lys Pro Lys 400
GAT GTG CTC ACC ATT ACT CTG ACT CCT AA.G GTC ACG TGT GTT GTG GTA 1248
Asp Val Leu Thr Ile 405 Thr Leu Thr Pro Lys Val 410 Thr Cys Val Val 415 Val
GAC ATC AGC AAG GAT GAT CCC GAG GTC CAG TTC AGC TGG TTT GTA GAT 1296
Asp Ile Ser Lys 420 Asp Asp Pro Glu Val Gin Phe 425 Ser Trp Phe 430 Val Asp
GAT GTG GAG GTG CAC ACA GCT CAG ACG CAA CCC CGG GAG GAG CAG TTC 1344
Asp Val Glu Val 435 His Thr Alá Gin 440 Thr Gin Pro Arg Glu 445 Glu Gin Phe
AAC AGC ACT TTC CGC TCA GTC AGT GAA CTT CCC ATC ATG CAC CAG GAC 1392
Asn Ser 450 Thr Phe Arg Ser Val 455 Ser Glu Leu Pro Ile 460 Met His Gin Asp
TGG CTC AAT GGC AAG GAG TTC AAA TGC AGG GTC AAC AGT GCA GCT TTC 1440
Trp 465 Leu Asn Gly Lys Glu 470 Phe Lys Cys Arg Val 475 Asn Ser Alá Alá Phe 480
• · • · · · ·
CCT GCC CCC ATC GAG AAA Lys ACC ATC TCC Thr Ile Ser AAA Lys 490 ACC AAA GGC AGA. CCG AAG 1488
Pro Alá Pro Ile Glu 485 Thr Lys Gly Arg Pro 495 Lys
GCT CCA CAG GTG TAC ACC ATT CCA CCT CCC AAG GAG CAG ATG GCC AAG 1536
Alá Pro Gin Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gin Met Alá Lys
500 505 510
GAT AAA GTC AGT CTG ACC TGC ATG ATA ACA GAC TTC TTC CCT GAA GAC 1584
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp
515 520 525
ATT ACT GTG GAG TGG CAG TGG AAT GGG CAG CCA GCG GAG AAC TAC AAG 1632
Ile Thr Val· Glu Trp Gin Trp Asn Gly Gin Pro Alá Glu Asn Tyr Lys
530 535 540
AAC ACT CAG CCC ATC ATG AAC ACG AAT GGC TCT TAC TTC GTC TAC AGC 1680
Asn Thr Gin Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
545 550 555 560
AAG CTC AAT GTG CAG AAG AGC AAC TGG GAG GCA GGA AAT ACT TTC ACC 1728
Lys Leu Asn Val Gin Lys Ser Asn Trp Glu Alá Gly Asn Thr Phe Thr
565 570 575
TGC TCT GTC TTA CAT GAG GGC CTG CAC AAC CAC CAT ACT GAG AAG AGC 1776
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
580 585 590
CTC TCC CAC TCT CCT GGT AAA 1797
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
595 (2) Információk a 18. azonosítószámú szekvenciához:
« ·
-.90(i) Szekvencia^ellemzők :
(A) Hossza: 599 aminosav (B) Típusa: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) A szekvencia leírása: 18. azonosítószámú szekvenci
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Alá Alá Gly 15 10 15
Val His Cys Leu Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Alá Ser 20 25 30
Leu Alá Val Ser Leu Gly Gin Arg Alá Thr Ile Ser Cys Arg Alá Ser
40 45
Glu Ser Val Asp His Tyr Asp Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gin Gin 50 55 60
Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Alá Alá Ser Asn Gin ' 65 70 75 80
Gly Ser Gly Val Pro Alá Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95
Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Alá Ile Tyr 100 105 110
Phe Cys Gin Gin Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125
Thr Leu Glu Ile Lys Arg Alá Asp Alá Alá Pro Thr Arg Ser Gly Gly 130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Gin Val Lys Leu Gin Glu
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys
165 170 175
-91Ala Alá Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Phe Alá Met Asn Trp Val Arg 180 185 190
Gin Alá Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Alá Arg Ile Arg Ser Lys ]_95 200 205
Ser Asn Asn Tyr Alá Thr Ser Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe 210 215 220
Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Gin Ser Met Phe Tyr Leu Gin Met Asn 225 230 235 240
Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Alá Met Tyr Tyr Cys Val Arg Val Val 245 250 255
Tyr Gly Alá Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 260 265 270
Ser Alá Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Alá Pro Gly Ser 275 280 285
Arg Ser Alá Alá Gin Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val 290 295 300
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
305 310 315 320
Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Alá Val Leu Gin Ser Asp Leu
325 330 335
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser 340 345 350
Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Alá His Pro Alá Ser Ser Thr Lys Val 355 360 365
Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys 370 375 380 • ·
-92Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
385 390 395 400
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
405 410 415
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gin Phe Ser Trp Phe Val Asp 420 425 430
Asp Val Glu Val His Thr .Ma Gin Thr Gin Pro Arg Glu Glu Gin Phe 435 440 445
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gin Asp 450 455 460
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Alá Alá Phe
465 470 475 480
Pro Alá Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
485 490 495
Alá Pro Gin Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gin Met Ma Lys 500 505 510
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Mp 515 520 525
Ile Thr Val Glu Trp Gin Trp Asn Gly Gin Pro Ma Glu Asn Tyr Lys 530 535 540
Asn Thr Gin Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser 545 550 555 560
Lys Leu Asn Val Gin Lys Ser Asn Trp Glu Ma Gly Asn Thr Phe Thr 565 570 575
-93Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser 580 585 590
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 595 (2) Információk a 19. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 101 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: másik nukleinsav (A) Leírás: a pCIB4612 lOibp-os Styl/BglII fragmensének előállításához alkalmazott KE109A28 oligonukleotid (xi) A szekvencia leírása: 19. azonosítószámú szekvencia:
CAAGGACGAG TATGAACGAC ATAACAGCTA TACCTGTGAG GCCACTCACA 50
AGACATCAAC TTCACCCATT GTCAAGAGCT TCAACAGGAA TGAGTGTTAG G 101 (2) Információk a 20. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 101 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: másik nukleinsav (A) Leírás: a pCIB4612 lOlbp-os Styl/BglII fragmensének előállításához alkalmazott KE110A28 oligonukleotid (xi) A szekvencia leírása: 20. azonosítószámú szekvencia:
» • · · · · ·
-94GATCCCTAAC ACTCATTCCT GTTGAAGCTC TTGACAATGG GTGAAGTTGA 50
TGTCTTGTGA GTGGCCTCAC AGGTATAGCT GTTATGTCGT TCATACTCGT C 101 (2) Információk a 21. azonos!tószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 72 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: másik nukleinsav (A) Leírás: a pCIB4612 71bp-os Xhol/Ddel fragmensének előállításához alkalmazott KE111A28 oligonukleotid (xi) A szekvencia leírása: 21. azonosítószámú szekvencia:
TCGAGGGTAC CGAGCTCTAG ATCTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA 50
GCAGTTAACA TCTGGAGGTG CC 72 (2) Információk a 22. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 71 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: másik nukleinsav (A) Leírás: a pCIB4612 71bp-os Xhol/Ddel fragmensének előállításához alkalmazott KE112A28 oligonukleotid (xi) A szekvencia leírása: 22. azonosítószámú szekvencia:
TGAGGCACCT CCAGATGTTA ACTGCTCACT GGATGGTGGG AAGATGGATA 50
CAGATCTAGA GCTCGGTACC C 71 (2) Információk a 23. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
• · • · · · · » · • · · · ·
(A) Hossza: 41 bázispár
(B) Típusa: nukleinsav
(C) S zált ípus: egyláncú
(D) Topológia: lineáris
(ii) Molekulatípus: másik nukleinsav (A) Leírás: a pCIB4611 40bp-os Xhol/Ncol fragmensének előállításához alkalmazott KE106A28 oligonukleotid (xi) A szekvencia leírása: 21. azonosítószámú szekvencia:
TCGAGGGTAC CGAGCTCTAG ATCTGCTGCC CAAACTAACT C 41 (2) Információk a 24. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 41 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: másik nukleinsav (A) Leírás: a pCIB4611 40bp-os Xhol/Ncol fragmensének előállításához alkalmazott KE107A28 oligonukleotid (xi) A szekvencia leírása: 24. azonosítószámú szekvencia:
CATGGAGTTA GTTTGGGCAG CAGATCTAGA GCTCGGTACC C 41 (2) Információk a 25. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 39 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: másik nukleinsav
-96(A) Leírás: a pCIB4611 40bp-os BstXI/BamHI fragmensének előállításához alkalmazott KE108A28 oligonukleotid (xi) A szekvencia leírása: 25. azonosítószámú szekvencia:
CTGGTAAAGG CGGCCGCATC GATTAAGTCG ACCCGCGGG 39 (2) Információk a 26. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 47 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: másik nukleinsav (A) Leírás: a pCIB4611 40bp-os BstXI/BamHI fragmensenek előállításához alkalmazott KE105A28 oligonukleotid (xi) A szekvencia leírása: 26. azonosítószámú szekvencia:
GATCCCCGCG GGTCGACTTA ATCGATGCGG CCGCCTTTAC CAGGAGA 47 (2) Információk a 27. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 7 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: másik nukleinsav (A) Leírás: növényi konszenzus transzláció iniciáló szekvencia a pCIB4610-hez (xi) A szekvencia leírása: 21. azonosítószámú szekvencia:
AACAATG 7 (2) Információk a 28. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
I
(A) Hossza : 7 bázispár
(B) Típusa: nukleinsav
(C) Száltípus: : egyláncú
(D) Topológia: : lineáris
ii) Mól ekulatípus: : másik nukleinsav
(A) Leírás: növényi konszenzus transzláció micialó szekvencia a pCIB4600-hez (xi) A szekvencia leírása: 28. azonosítószámú szekvencia:
TCCGATG 7 (2) Információk a 29. azonos!tószámú szekvenciához:
(í) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 25 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: másik nukleinsav (A) Leírás: KE102A28 PCR primer a pCIB4610 83bp-os fragmensének előállítására (xi) A szekvencia leírása: 29. azonosítószámú szekvencia:
CGAAGTTAAC AGATCTAGAG CTCGG 25 (2) Információk a 30. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 32 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: másik nukleinsav • · · · ·
I
-98(A) Leírás: ΚΕ101Α28 PCR primer a pCIB4610 83bp-os fragmensének előállítására (xi) A szekvencia leírása: 30. azonosítószámú szekvencia:
CGGGATCCAA CAATGGGATG GAGCTGGATC TT 32 (2) Információk a 31. azonosítószámú szekvenciához:
(1) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 164 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: másik nukleinsav (A) Leírás: Egy endoplazmatikus retikulum szignál peptidet kódoló oligonukleotid Kábát et al.tól, 1987 (xi) A szekvencia leírása: 31. azonosítószámú szekvencia:
GATCCAACAA TGGGATGGAG CTGGATCTTT CTCTTCCTCC TGTCAGTTGT 50
TACCCTACCT CGACCTAGAA AGAGAAGGAG GACAGTGGAG CTGCAGGTGT 100
CCATTGCCTA CTCGAGGGTA CCGAGCTCCT CGACGTCCAC AGGTAACGGA 150
TGAGCTCCGA TGGC 164
(2) Információk a 32. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 10 aminosav (B) Típusa: aminosav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (v) Fragmenstípus: belső (ix) Jellegzetességei:
-99(A) Név/Kulcs: Dömén (B) Elhelyezkedés: 1..10 (C) Egyéb innformációk: /megjegyzés= 10 aminosavas dómén linker a nehéz és könnyű Fv fragmensek között (xi) A szekvencia leírása: 32. azonosítószámú szekvencia:
(2) Információk a 33. azonosítószámú szekvenciához:
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
5 10 (i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 36 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: másik nukleinsav (A) Leírás: KE147A28 oligonukleotid a pCIB4631-nél alkalmazott a 36 bp-os linker előállítására (xi) A szekvencia leírása: 33. azonosítószámú szekvencia:
GATCTGGTGG CGGTGGCTCG GGCGGTGGTG GGTCGC 36 (2) Információk a 34. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 36 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: másik nukleinsav (A) Leírás: KE182A28 oligonukleotid a pCIB4631-nél alkalmazott 36 bp-os linker előállítására (xi) A szekvencia leírása: 34. azonosítószámú szekvencia:
-10 0TCGAGCGACC CACCACCGCC CGAGCCACCG CCACCA 36 (2) Információk a 35. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajeliemzők:
(A) Hossza: 26 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száitípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: másik nukleinsav (A) Leírás: NC200 ?CR-primer a 3B1 egyláncú antitest kódoló szekvenciát tartalmazó 700 bp-o-os fragmens előállítására a PE40-hez történő fúzióhoz (xi) A szekvencia leírása: 35. azonosítószámú szekvencia:
CGAAGCTTGA CATTGTGCTG ACCCAG 26 (2) Információk a 36. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 36 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: másik nukleinsav (A) Leírás: NC202 PCR-primer a 3B1 egyláncú antitest kódoló szekvenciát tartalmazó 700 bp-o-os fragmens előállítására a PE40-hez történő fúzióhoz (xi) A szekvencia leírása: 36. azonosítószámú szekvencia:
GCCCTCTAGA AGCATGCCTG AGGAGACGGT GACTGA 36 (2) Információk a 37. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajeliemzők:
(A) Hossza: 29 bázispár
-101(B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: másik nukleinsav (A) Leírás: NC92 PCR-primer az antitest gének ampli fίkáció j ához (xi) A szekvencia leírása: 37. azonosítószámú szekvencia:
GTCTCGAGGA YATYSWGMTS ACCCARTCT 29 (2) Információk a 38. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 29 bázispár
(B) Típusa: nukleinsav
(C) Száltípus: egyláncú
(D) Topológia: lineáris
Molekulatípus: másik nukleinsav
(A) Leírás: NC130 PCR-primer az antitest amplifikációj ához (xi) A szekvencia leírása: 38. azonosítószámú
GCAGATCTAG TTGGTGCAGC ATCAGCCCG (2) Információk a 39. azonosítószámú szekvenciához (i) Szekvenciaje1lemzők:
(A) Hossza: 30 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: másik nukleinsav gének szekvencia:
(A) Leírás: NC91 PCR-primer az antitest gének amplifikációj ához
-102, · · ····· • · · · ·
Ζ··· * · ·* ···· • · · * * (xi) A szekvencia leírása: 39. azonosítószámú szekvencia:
GTCTCGAGCA GGTSMARCTG CAGSAGTCWG 30 (2) Információk a 40. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 29 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: másik nukleinsav (A) Leírás: NC114 PCR-primer az antitest gének amplifikációj ához (xi) A szekvencia leírása: 40. azonosítószámú szekvencia:
GCAGATCTAG ATCCAGGGGC CAGTGGATA 29 (2) Információk a 41. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 32 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: másik nukleinsav (A) Leírás: NC111 PCR-primer az antitest gének amplifikációj ához (xi) A szekvencia leírása: 41. azonosítószámú szekvencia:
GCAGATCTGC AGGAGACGAG GGGGAAGACA TT 32 (2) Információk a 42. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 29 bázispár (B) Típusa: nukleinsav » · · » · ·
I · · · ·
-103(C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: másik nukleinsav (A) Leírás: NC117 PCR-primer az antitest gének amplifikációj ához (xi) A szekvencia leírása: 42. azonosítószámú szekvencia:
GCAGATCTGC AGCCAGGGAC CAAGGGATA 29 (2) Információk a 43. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 22 aminosav (B) Típusa: aminosav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (iii) Hipotetikus: nem (v) Fragmenstípus: belső (ix) Jellegzetességei:
(A) Név/Kulcs: Dömén (B) Elhelyezkedés: 1..22 (C) Egyéb innformációk: /megjegyzés= alternatív dómén linker a nehéz és könnyű Fv fragmensek között (xi) A szekvencia leírása: 43. azonosítószámú szekvencia: Gly Pro Gly Pro Ser Tre Pro Pro Tre Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro
10 15
Thr Pro Ser Gly Pro Gly (2) Információk a 44. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
k · · * ·
-104(A) Hossza: 357 bázispár (3) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (genomiális) (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: nem (ix) Jellegzetességei:
(A) Név/Kulcs: CDS
(B) Elhelyezkedés: 1..357
(C) Egyéb inniormációk: /meg j egyzés = a pCIB4 635-ből
származó 14G1 nehézlánc variábilis régió
(xi) A szekvencia leírása: 44. azonosítószámú szekvencia:
GAG Glu 1 GTG AAG CTT GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTG AGG CCT GGA AAT 48
Val Lys Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Arg Pro Gly Asn 15
TCT CTG AAA CTC TCC TGT GTT ACC TCG GGA TTC ACT TTC AGT AAC TAC 96
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
CGG ATG CAC TGG CTT CGC CAG CCT CCA GGG A4G AGG CTG GAG TGG ATT 144
Arg Met His Trp Leu Arg Gin Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
GCT GTA ATT ACA CTC AAA TCT GAT AAT TAT GGA ACA ATT TAT GCA GAA 192
Alá Val Ile Thr Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Gly Thr Ile Tyr Alá Glu
50 55 60
TCT GTG AAA GGC AGA TTC ACC ATT TCA AGA GAA GAT TCA GAA AGC AGC 240
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Glu Ser Ser
65 70 75 80
-105-
ATC TAC CTG CAG ATG AAC Leu Gin Met Asn AGA Arg GAC Asp TTA AGA GAG GAA. GAC ACT GCC ACT TAT Alá Thr Tyr 288 336
Ile TAC Tyr Tyr TGT Cys Leu Arg Glu Glu Asp Thr
AGT Ser 85 TGG Trp 90 GGG Gly 110 95 CAA Gin GGG Gly
AGA GGT AGT Ser GGA Gly 105 Phe CCT Pro TAT Tyr TGG Trp
Arg 100 Glv
ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 357
Thr Leu Val Thr Val Ser Alá
115
2) Információk a 4 5 . az ono 3 1 L ónz ámú s ze kve nciához
(ι) Szekvenciajellemzők :
(A) Hossza: 119 aminosav (B) Típusa: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) A szekvencia leírása: 45. azonosítószámú szekvencia:
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Asn 15 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Arg Met His Trp Leu Arg Gin Pro Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Alá Val Ile Thr Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Gly Thr Ile Tyr Alá Glu 50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asp Ser Glu Ser Ser 65 70 75 80
Ile Tyr Leu Gin Met Asn Arg Leu Arg Glu Glu Asp Thr Alá Thr Tyr 85 90 ·· · · · ·
-10 6Tyr Cys Ser Arg Gly Ser Asp Trp Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Alá 115 (2) Információk a 46. azonosítószámú szekvenciához (i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 339 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (genomiális) (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: nem (ix) Jellegzetességei:
(A) Név/Kulcs: CDS (B) Elhelyezkedés: 1..339 (C) Egyéb innformációk: /megjegyzés= származó 14G1 könnyűlánc variábilis régió (xi) A szekvencia leírása: 46. azonosítószámú a pCIB4636-ből szekvencia:
GAT ATT Asp Ile 1 GTG ATG ACC Val Met Thr 5 CAG TCT CCA TCC Ser TCC CTG AGT GTG TCA GCA GGA 48
Gin Ser Pro Ser 10 Leu Ser Val Ser Alá 15 Gly
GAG AAG GTC ACT ATG AAC TGC AAG TCC AGT CAG AGT CTG TTA AAT AGT 96
Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser
25
-107-
GGA AAT CAA Gly Asn Gin AAG Lys CAC TAC TTG GCC TGG TAC CAG CAG AAA CCA. GGC CAG 14 4
His Tyr Leu Alá Trp 40 Tyr Gin Gin Lys 45 Pro Gly Gin
35
CCT CCT AAA CTG TTG ATC TAC GGG GCA TCC ACT AGG CAA TCT GGG GTC 192
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Alá Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
CCT GAT CGC TTC ACA GGC AGT GGG TCT GGA ACC GAT TTC ACT CTT ACC 240
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
ATC AGC AGT GTG CAG GCT GAA GAC CTG GCA GTT TAT TTC TGT CAG AAT 288
Ile Ser Ser Val Gin Alá Glu Asp Leu Alá Val Tyr Phe Cys Gin Asn
85 90 95
GAT CGT AGT TAT CCG TTC ACA TTC GCC TCG GGG ACA. AAG TTG GAA ATA 336
Asp Arg Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Alá Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
ΑΑΑ 339
Lys (2) Információk a 47. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajeiiemzők:
(A) Hossza: 113 aminosav (B) Típusa: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) A szekvencia leírása: 47. azonosítószámú szekvencia
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Alá Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 ···· · • ·
-103··
Gly Asn Gin 35 Lys His Tyr Leu Alá Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin
40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gin Alá Glu Asp Leu Alá Val Tyr Phe Cys Gin Asn
85 90 95
Asp Arg Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Alá Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys (2) Információk a 48. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
(A) Hossza: 32 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípus: egyláncú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: másik nukleinsav (A) Leírás: DB91 PCR-primer az antitest gének ampli fikációjához (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 48. azonosítószámú szekvencia:
ACGTCTCGAG GARGTGAAGC TKRWKGARWC TG 32 (2) Információk a 49. azonosítószámú szekvenciához:
(i) Szekvenciajellemzők:
-109• ·· ···· · • · · · ·
(A) Hossza: 34 bázispár
(B) Típusa: nukleinsav
(C) S záltípus: egyláncú
(D) Topológia: lineáris
Mól ekulatípus: másik nu
(A) Leírás: DB114 PCR-primer az antitest gének amplifikációj ához (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 49. azonosítószámú szekvencia:
CAATTCGCAT ATGAGATCCA GGGGCCAGTG GATA

Claims (52)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Antitest vagy fragmense, mely egv célrovar belehez kötődik, de nem kötődik emlős bélboholy határoló membránokhoz vagy növényi mikroszómákhoz.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti antitest, ahol az említett antitest egy monoklonális antitest vagy ennek egy kötőfragmense.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti monoklonális antitest vagy fragmense, ahol az említett monoklonális antitest vagy kötőfragmense a rovarok bélboholy határoló membránjaihoz kötődik.
  4. 4. Az 1 . vagy 2. igénypont szerinti monoklonális antitest, ahol az említett célrovar a Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thisanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera és Trichoptera rendek közül kerül kiválasztásra.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti monoklonális antitest, ahol az említett célrovar nyugati gabona gyökérféreg.
  6. 6. A 5. igénypont szerinti monoklonális antitest, ahol az említett antitest a 2B5, 3B1, 10B6, 17?6, 14G1 és 16E4 közül van kiválasztva.
  7. 7. DNS-szekvencia, mely a 2-6. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális antitestet vagy az említett monoklonális antitest kötőhelyét kódolja.
  8. 8 . A 7. igénypont szerinti DNS-szekvencia, ahol az említett DNS-szekvencia az 1.,3., 5., 7.,
  9. 9., 11., 13., 15., 17., 44. vagy
    46. azonosítószámú DNS-szekvenciák közül került kiválasztásra.
    « · · · ·
    -1119. A 7. vagy 8. igénypont szerinti DNS-szekvencia, ahol az említett DNS-szekvencia egy toxin részt kódoló DNS-szekvenciával működőképesen van összekapcsolva.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti DNS-szekvencia, ahol az említett toxin rész Bacillus toxinok, Pseudomonas exotoxin, fitolakcrn, gelomn, ribonukleázok vagy ribozim inaktiváló proteinek közül van kiválasztva.
  11. 11. A 7-10. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvencia, ahol az említett DNS-szekvencia egy növényi genom része.
  12. 12. Hibrid toxin, mely egy célrovar beléhez kötődő, de emlős bélboholy határoló membránokhoz vagy növényi mikroszómákhoz nem kötődő antitestből vagy fragmenséből áll működőképesen összekapcsolva egy toxinrésszel.
  13. 13. Hibrid toxin molekula, ahol az említett molekula a 2. igénypon szerinti monoklonális antitestből vagy monoklonális antitest kötő fragmensből áll működőképesen összekapcsolva egy toxinrésszel .
  14. 14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti hibrid toxin, ahol az említett toxin rész Bacillus toxinok, Pseudomonas exotoxrn, fitolakcin, gelonin, ribonukleázok vagy ribozim inaktiváló proteinek közül van kiválasztva.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti hibrid toxin, ahol az említett Bacillus toxin Bacillus endotoxinok és vegetatív inszekticid proteinek közül van kiválasztva.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti hibrid toxin, ahol az említett
    Bacillus endotoxin egy Bt endotoxin.
    -11217. A 12. igénypont szerinti hibrid toxin, ahol az monoklonális antitest a 2-6. igénypontok bármelyike antitest.
  17. 18. A 17. igénypont szerinti hibrid toxin, ahol az monoklonális antitest vagy kötő régiója rovar bélboholy membránokhoz kötődik.
  18. 19. A 18. igénypont szerinti hibrid toxin, ahol az monoklonális antitest a 2B5, 3B1, 10B6, 17F6, 14G1 és 1 ·· ··*· · • · · • · · » » emí í te 11 szerinti említett határoló említett
    6E4 közül van kiválasztva.
  19. 20. DNS szekvencia, mely a 12-19. igénypontok bármelyike szerinti hibrid toxint kódolja.
  20. 21. A 20. igénypont szerinti DNS-szekvencia, mely a növényi genom része.
  21. 22. DNS-szekvencia, mely egy olyan DNS-szekvenciából álló első expressziós kazettát tartalmaz, mely egy növényben történő expresszió irányítására képes promotert kódol működőképesen összekapcsolva egy monoklonális antitest könnyűláncát vagy az antitest kötődoménjét kódoló DNS-szekvenciával, ahol az említett monoklonális antitest egy célrovar beléhez kötődik.
  22. 23. A 22. igénypont szerinti DNS-szekvencia, ahol az említett kazetta tartalmaz továbbá egy toxin részt kódoló DNSszekvenciát működőképesen összekapcsolva a monoklonális antitest könnyűláncát vagy az antitest kötődoménjét kódoló DNSszekvenciával .
  23. 24. DNS-szekvencia, mely egy olyan DNS-szekvenciából álló második expressziós kazettát tartalmaz, mely egy növényben történő expresszió irányítására képes promotert kódol • *
    -113működőképesen összekapcsolva egy monoklonális antitest nehéziáncát vagy az antitest kötődoménjét kódoló DNS-szekvenciával, ahol az említett monoklonális antitest egy célrovar beléhez kötődik.
  24. 25. A 24. igénypont szerinti DNS-szekvencia, ahol az említett kazetta tartalmaz továbbá egy toxin részt kódoló DNSszekvenciát működőképesen összekapcsolva a monoklonális antitest nehézláncát vagy az antitest kötődoménjét kódoló DNSszekvenciával .
  25. 26. A 22-25. igénypont bármelyike szerinti DNS-szekvencia, mely tartalmaz továbbá egy növényben működőképes terminációs szekvenciát.
  26. 27. A 23. vagy 26. igénypont szerinti DNS-szekvencia, ahol az említett toxinrész a Bacillus toxinok, Pseudomonas endotoxin, fitolakcin vagy ribonukleázok közül van kiválasztva.
  27. 28. A 22-27. igénypont bármelyike szerinti DNS-szekvencia, ahol az említett DNS növényi genom része.
  28. 29. A 7-11. és 20-21. igénypontok bármelyike szerinti DNSszekvenciával transzformált növényi sejt.
  29. 30. A 22-28. igénypontok bármelyike szerinti DNSszekvenciával transzformált növényi sejt.
  30. 31. A 7-11. és 20-21. igénypontok bármelyike szerinti DNSszekvenciával transzformált növény és utódai.
  31. 32. A 22-28. igénypontok bármelyike szerinti DNSszekvenciával transzformált növény és utódai.
  32. 33. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális antitestet kifejező növény és utódai.
  33. 34. Az 12-19. igénypontok bármelyike szerinti hibridtoxint kifejező növény és utódai.
    • »
    -11435. A 31-34. igénypontok bármelyike szerinti növény, mely egy kukorica növény.
  34. 36. A 31-35. igénypontok bármelyike szerinti növény, mely egy hibrid növény.
  35. 37. A 31-36. igénypontok bármelyike szerinti növény szaporító anyaga, mely egy védőbevonattal van ellátva.
  36. 38. A 37. igénypont szerinti szaporítóanyag, mely a herbicidek, inszekticidek, fungicidek, baktencidek, nematicidek, puhatestűek elleni szerek vagy ezek keverékei által alkotott csoportból kiválasztott készítményt tartalmaz.
  37. 39. A 37. vagy 38. igénypont szerinti szaporítóanyag azzal jellemezve, hogy magból áll.
  38. 40. A 7-11. és 20-21. igénypontok bármelyike szerinti DNSszekvenciák legalább egyikével transzformált rekombináns mikroorganizmus.
  39. 41. A 22-28. igénypontok bármelyike szerinti izolált DNSszekvenciák legalább egyikével transzformált rekombináns mikroorganizmus.
  40. 42. Rekombináns mikroorganizmus, mely legalább egy olyan hibrid toxint kódoló DNS molekulát tartalmaz, mely egy célrovar beléhez kötődő, de emlős bélboholy határoló membránokhoz vagy növényi mikroszómákhoz nem kötődő antitestet vagy fragmensét tartalmazza működőképesen egy toxin részhez kapcsolva, ahol az említett monoklonális antitestet kódoló DNS egy, az
    1.,3.,5.,7.,9.,11.,13.,15.,17.,44 és 46. azonosítószámú szekvenciákból álló csoportból kiválasztott szekvenciát tartalmaz.
    • « » « · ···«
    -11543. A 40-42. igénypontok szerinti rekombináns mikroorganizmus, ahol az említett rekombináns mikroorganizmus a baktériumok, úgymint Bacillus, Caulobacter, Agmenellum,
    Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas,
    Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius,
    Agrobacterium, Acetobacter, Lactobaci1lus, Arthrobacter,
    Azotobacter, Leuconostoc és Alcaligenes; gombák, különösen élesztő, úgymint Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula és Aureobasidium, és vírusok, úgymint Autographica californica nukleáris polihedrózis vírus által alkotott csoportból van kiválasztva.
  41. 44. Rovarellenes készítmény, mely a 40-43. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns mikroorganizmust tartalmazza inszekticid-hatékony mennyiségben egy megfelelő hordozóval együtt.
  42. 45. Rovarellenes készítmény, mely a 12-19. igénypontok bármelyike szerinti izolált hibrid toxin molekulát tartalmazza inszekticid-hatékony mennyiségben egy megfelelő hordozóval együtt.
  43. 46. Növényi szaporítóanyag, mely a 44-45. igénypontok bármelyike szerinti rovarellenes készítménnyel van kezelve.
  44. 47. A 46. igénypont szerinti szaporítóanyag azzal jellemezve, hogy egy növény mag.
  45. 48. Eljárás egy gazdaszervezet stabil transzformálására, mely során a 7-10., 21., 23-25., 27-29. igénypontok bármelyike szerinti szekvenciának megfelelő DNS szekvenciát építünk be az említett gazdaszervezet genomjába.
  46. 49. A 33. igénypont szerinti eljárás, ahol a gazdaszervezet egy mikroorganizmus.
    ·· ····
    -11650. A 33. igénypont szerinti eljárás, ahol a gazdaszervezet egy növény.
  47. 51. Eljárás az 1. igénypont szerinti antitestet vagy monoklonális antitestet termelő hibridóma sejtvonal előállítására, mely során
    a) rovarbeleket, különösen rovar bélboholy határmembránokat alkalmazunk antigénként;
    b) egy donor állatot immunizálunk az említett antigénnel;
    c) egy immunkompetens B-sejtet izolálunk az immunizált donor állatból;
    d) az említett immunkompetens B-sejtet fuzionáljuk egy folyamatos sejtosztódásra képes tumor sejtvonallal;
    e) a kapott fúziós terméket izoláljuk, megfelelő tápközegben tenyésztjük, és a pozitív hibrid sejteket továbbklónozzuk; és
    f) a klónozott hibrid sejteket szkríneljük a kívánt tulajdonságú monoklonális antitestek termelésére.
  48. 52. Eljárás a 11-20. igénypontok szerinti hibrid antitesttoxin molekulák előállítására, mely során az antitest variábilis régióját klónozzuk és az említett régiót a toxin részhez kapcsolj uk.
  49. 53. Eljárás monoklonális antitest vagy fragmense előállítására, mely a célrovar bélboholy határmembrán vezikulumaihoz kötődik, mely során az említett antitestet termelő hibridóma sejtvonalat megfelelő tenyésztőközegben növesztjük in vivő vagy in vitro, és a kapott antitesteket izoláljuk.
  50. 54. Eljárás az 1. igénypont szerinti monoklonális antitestet kódoló DNS-szekvencia előállítására, mely során a hibridóma
    117sejtekből a megfelelő antitest géneket a konstans régióban lévő konzervatív DNS-szekvenciákhoz illeszkedő primereket és a variábilis régiók leolvasási régióit alkalmazva klónozzuk.
  51. 55. A 2-6. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális antitestet termelő hibridóma sejtvonal.
  52. 56. Az 55. igénypont szerinti hibridóma sejtvonal, mely ATCC HB 11616, HB11617, HB11618, HB11619 és HB11620 számon lett letétbe helyezve.
HU9603526A 1994-06-28 1995-06-20 Antibodies with bind to insect gut proteins and their use HUT76089A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US26764194A 1994-06-28 1994-06-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUT76089A true HUT76089A (en) 1997-06-30

Family

ID=23019624

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9603526A HUT76089A (en) 1994-06-28 1995-06-20 Antibodies with bind to insect gut proteins and their use

Country Status (16)

Country Link
US (2) US5686600A (hu)
EP (1) EP0804579A1 (hu)
JP (1) JPH11505401A (hu)
CN (1) CN1151759A (hu)
AU (1) AU696661B2 (hu)
BG (1) BG101171A (hu)
BR (1) BR9508154A (hu)
CA (1) CA2193859A1 (hu)
CZ (1) CZ382196A3 (hu)
EE (1) EE9600192A (hu)
HU (1) HUT76089A (hu)
MX (1) MX9700007A (hu)
NZ (1) NZ287124A (hu)
PL (1) PL318164A1 (hu)
SK (1) SK166996A3 (hu)
WO (1) WO1996000783A1 (hu)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0879293A1 (de) * 1996-02-08 1998-11-25 Institut Für Pflanzengenetik Und Kulturpflanzenforschung Kassetten zur expression von lagerstabilen proteinen in pflanzen
CA2286284A1 (en) * 1997-04-03 1998-10-08 Novartis Ag Plant pest control
US7011835B1 (en) 1997-07-10 2006-03-14 Research Development Foundation Targeted destruction of pests
US6013510A (en) * 1997-09-25 2000-01-11 Becton, Dickinson And Company Identification of a DNA region potentially useful for the detection of Mycobacterium kansasii
US7250494B2 (en) * 1998-06-15 2007-07-31 Biosynexus Incorporated Opsonic monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of Gram positive bacteria
US6187558B1 (en) 1998-06-24 2001-02-13 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Invertebrate intestinal mucin cDNA and related products and methods
CA2331921A1 (en) * 1998-06-24 1999-12-29 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. A novel invertebrate intestinal mucin cdna and related products and methods
BR9915543A (pt) * 1998-10-16 2001-08-14 Fraunhofer Ges Forschung Resistência a doenças por plantas mediada por patogenicidas moleculares
WO2001058955A1 (en) * 2000-02-10 2001-08-16 Research Development Foundation Targeted destruction of pests
US9522217B2 (en) 2000-03-15 2016-12-20 Orbusneich Medical, Inc. Medical device with coating for capturing genetically-altered cells and methods for using same
US9364565B2 (en) 2000-03-15 2016-06-14 Orbusneich Medical, Inc. Medical device with coating for capturing genetically-altered cells and methods of using same
US7465790B2 (en) * 2000-10-09 2008-12-16 Isis Innovation, Inc. Therapeutic antibodies
AU9399501A (en) 2000-10-09 2002-04-22 Isis Innovation Therapeutic antibodies
US6716421B2 (en) 2001-03-05 2004-04-06 University Of Florida Research Foundation, Inc. Devices and methods for eliminating termite colonies
US7030156B2 (en) 2001-03-05 2006-04-18 University Of Florida Research Foundation, Inc Devices and methods for eliminating termite colonies
US6969512B2 (en) 2001-03-05 2005-11-29 The University Of Florida Research Foundation, Inc. Devices and methods for eliminating termite colonies
EP1572866A4 (en) * 2001-03-23 2008-01-16 Syngenta Participations Ag INSECT NUCLEAR RECEPTOR GENES AND USES THEREOF
GB0119274D0 (en) * 2001-08-08 2001-10-03 Univ Durham Fusion proteins for insect control
US20040052779A1 (en) * 2001-12-21 2004-03-18 Stinson Jeffrey R. Opsonic monoclonal and chimeric antibodies specific for lipoteichoic acid of Gram positive bacteria
US20040063912A1 (en) * 2002-03-15 2004-04-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Central airway administration for systemic delivery of therapeutics
US20040016004A1 (en) * 2002-04-01 2004-01-22 Raitano Arthur B. Nucleic acid and corresponding protein entitled 238P1B2 useful in treatment and detection of cancer
EP2090591A3 (en) * 2002-04-22 2009-10-28 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Antibodies, recombinant antibodies, recombinant antibody fragments and fusions mediated plant disease resistance against fungi
US8029803B2 (en) * 2002-06-20 2011-10-04 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8025873B2 (en) * 2002-06-20 2011-09-27 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US8007805B2 (en) * 2003-08-08 2011-08-30 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens
EP1948802A4 (en) * 2005-10-13 2009-01-14 Virexx Medical Corp CHIMERIC ANTIGEN WITH HEPATITIS C VIRUS POLYPEPTIDE AND FC FRAGMENT FOR CALLING UP AN IMMUNE RESPONSE
US8415271B2 (en) * 2007-04-21 2013-04-09 Uxmal S.A. Biofertilizer formulation
US7879326B2 (en) * 2007-06-15 2011-02-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Human neutralizing monoclonal antibodies to H5N1 influenza A virus
US20090148904A1 (en) * 2007-11-13 2009-06-11 Mayfield Stephen P Production of cytotoxic antibody-toxin fusion in eukaryotic algae
JP5851842B2 (ja) 2009-01-12 2016-02-03 サイトムエックス セラピューティクス, インク.CytomX Therapeutics, Inc. 改変した抗体組成物、それを作製および使用する方法
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
EP3415010A1 (en) * 2017-06-13 2018-12-19 Agrosavfe Nv Insect-controlling polypeptides and methods

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5290914A (en) * 1988-04-28 1994-03-01 Mycogen Corporation Hybrid diphtheria-B.t. pesticidal toxins
US5196320A (en) * 1989-09-20 1993-03-23 Abbott Biotech, Inc. Method of producing engineered binding proteins
US5202422A (en) * 1989-10-27 1993-04-13 The Scripps Research Institute Compositions containing plant-produced glycopolypeptide multimers, multimeric proteins and method of their use
EP0438312A3 (en) * 1990-01-19 1992-07-01 Merck & Co. Inc. Recombinant human anti-cd18 antibodies
US5143905A (en) * 1990-05-03 1992-09-01 The Regents Of The University Of California Method and means for extending the host range of insecticidal proteins
US5665595A (en) * 1991-06-07 1997-09-09 Dowelanco Immunoglobulins against insect tissue
DE59205079D1 (de) * 1991-07-25 1996-02-29 Ciba Geigy Ag Immunologisches Nachweisverfahren

Also Published As

Publication number Publication date
BG101171A (en) 1997-10-31
NZ287124A (en) 1999-04-29
PL318164A1 (en) 1997-05-26
JPH11505401A (ja) 1999-05-21
AU2573595A (en) 1996-01-25
CN1151759A (zh) 1997-06-11
CA2193859A1 (en) 1996-01-11
EP0804579A1 (en) 1997-11-05
US5686600A (en) 1997-11-11
AU696661B2 (en) 1998-09-17
EE9600192A (et) 1997-06-16
MX9700007A (es) 1997-04-30
US6069301A (en) 2000-05-30
BR9508154A (pt) 1998-07-14
WO1996000783A1 (en) 1996-01-11
SK166996A3 (en) 1997-08-06
CZ382196A3 (cs) 1998-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU696661B2 (en) Antibodies which bind to insect gut proteins and their use
JP4389075B2 (ja) 広域スペクトルのデルタ−エンドトキシン
RU2196824C2 (ru) Новые пестицидные протеины и штаммы
CA2032481C (en) Prevention of bt resistance development
KR101156893B1 (ko) 살충 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열들
DE69937459T2 (de) Verbesserte expression von insektizid-protein cry3b in pflanzen
US7655838B2 (en) Insect inhibitory Bacillus thuringiensis proteins, fusions, and methods of use therefor
JP2001524817A (ja) 植物病原体抑制
AU620388B2 (en) Methods for improving the efficacy of insect toxins
JP2001507208A (ja) 害虫に対して有効な毒素
US5665595A (en) Immunoglobulins against insect tissue
US11761015B2 (en) Binary insecticidal Cry toxins
US6855873B1 (en) Recombinant plant expressing non-competitively binding Bt insecticidal cryatal proteins
WO2017176688A1 (en) Insecticidal cry toxins
US5908970A (en) Recombinant plant expressing non-competitively binding Bt insecticidal crystal proteins
AU2015372474A1 (en) Modified Cry1Ca toxins useful for control of insect pests
JP2003503060A (ja) ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）由来の殺虫性タンパク質およびその共同作用性複合物

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee